專利名稱：天然茶氨酸的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種天然茶氨酸的制備方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
茶氨酸(N-乙基卞谷氨酰胺)是茶葉特有的一種氨基酸，是綠茶中有效的呈味 物質(zhì)，其含量直接決定茶葉的品質(zhì)。此外，茶氨酸還具有降血壓、抗腫瘤、保 護(hù)神經(jīng)、放松、抗抑郁、抗疲勞、提高免疫力、減輕體脂等作用。因此，茶氨 酸越來越受到人們的重視，并有望添加于食品和藥物中開發(fā)出新型的功能食品 和功能藥物。
迄今為止，茶氨酸的制造方法，主要有三種。第一，是從茶葉中提取的方 法。但由于干茶葉中的茶氨酸含量?jī)H有1.5%左右，且光合作用會(huì)使茶氨酸損失 一部分，致使產(chǎn)量很低。隨后，便發(fā)明了適合于工業(yè)化生產(chǎn)的第二種方法，即 化學(xué)有機(jī)合成茶氨酸的方法。但該法可能會(huì)殘留毒性物質(zhì)，且生成物包括D、 L-型茶氨酸異構(gòu)體，需要進(jìn)行拆分才能得到L型產(chǎn)品，使得分離精制操作復(fù)雜。 第三種制造方法，是利用微生物酶法進(jìn)行生產(chǎn)。目前報(bào)道了利用來自假單孢菌 屬的谷氨酰胺酶的，谷氨?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，由L-谷氨酰胺和乙胺合成茶氨酸的酶 法和固定化酶法，以及2005年公開的利用來自香茅醇假單孢菌GEA和2007年 公開的利用來自芽孢桿菌屬、霉菌或酵母菌中的1種或2種以上的谷氨酰胺酶 酶法生產(chǎn)。但利用谷氨酰胺酶酶法生產(chǎn)存在著因谷氨酰胺酶的水解反應(yīng)而在生 產(chǎn)茶氨酸的同時(shí)，還生成副產(chǎn)物谷氨酸，而使茶氨酸的精制變得復(fù)雜的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是鑒于上述問題而完成的發(fā)明，其目的在于提供有效的制備茶氨酸 的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一株產(chǎn)生Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的菌株，其分類命名為枯草 芽孢桿菌(Bacz7/wsrato'fc) SK11.004，已保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保 藏編號(hào)CCTCCNO: M 208083。
一種天然茶氨酸的制備方法 (1)制備粗酶粉使用枯草芽孢桿菌SK11.004為出發(fā)菌株；
培養(yǎng)基，以g/L計(jì)為蔗糖25、胰蛋白胨5、玉米漿15 、 MgS(V7H2O0.5、 K2HP04 1， pH7.0; 37°C， 200 rpm的條件下培養(yǎng)16 h;冷凍離心，制得的發(fā)酵 液上清液，即為粗酶液；
將粗酶液進(jìn)行濃縮后，按酶液:酒精體積比4:1的比例添加酒精進(jìn)行沉淀，
將沉淀后的蛋白冷凍干燥，即得粗酶粉；
(2) 酶反應(yīng)制備天然茶氨酸使用制得的粗酶粉，以0.2U/mL加入到含谷 氨酰胺0.02M、乙胺0.15-0.25M的pH 9 10.5、 lOOmM Na2B407-NaOH硼酸鈉
緩沖液中，在35 40'C下進(jìn)行2小時(shí)的酶反應(yīng)，合成了茶氨酸；
(3) 茶氨酸的精制將酶反應(yīng)液通過減壓濃縮除去乙胺后，再依次使用 001x7的732強(qiáng)酸性苯乙烯系陽(yáng)離子交換樹脂，201x7的717強(qiáng)堿性陰離子交換 樹脂，和乙醇處理得到茶氨酸的精制品。
本發(fā)明的有益效果發(fā)明人等為了解決上述問題，從中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵制品中 分離篩選得到一株新型的可用于生產(chǎn)茶氨酸的菌株，其所產(chǎn)的Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶， 在pH9 10.5、 35 4(TC的條件下，通過作用于谷氨酰胺和乙胺，可以高效的 生產(chǎn)茶氨酸，轉(zhuǎn)化率可達(dá)80%以上。
本發(fā)明的酶法制備茶氨酸的方法具有反應(yīng)時(shí)間短、酶活性源制備簡(jiǎn)單、能 使茶氨酸的生產(chǎn)簡(jiǎn)單，以及產(chǎn)品安全可靠的優(yōu)點(diǎn)，適于進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。 生物材料樣品保藏
上述茶氨酸生產(chǎn)菌是本發(fā)明人等首次發(fā)現(xiàn)鑒定的新型菌株，分類命名為枯 草芽孢桿菌(5a"7/^swZ^7&) SK11.004，保藏機(jī)關(guān)名稱中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏 中心，地址中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏日期2008年07月10日，保藏編號(hào) CCTCCNO: M 208083。


圖1用枯草芽孢桿菌SK11.004所產(chǎn)的"谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶作用于谷氨酰胺和乙 胺合成茶氨酸時(shí)的氨基酸測(cè)定結(jié)果。glu:谷氨酸，gln:谷氨酰胺，the:茶氨酸。
具體實(shí)施例方式
下面，詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不受限于下述實(shí) 施方式，在不改變其要點(diǎn)的前提下，可做各種改變進(jìn)行實(shí)施。另外，本發(fā)明的 技術(shù)范圍延及均等的范圍。
本發(fā)明的茶氨酸是指N-乙基-，谷氨酰胺，是茶葉特有的一種氨基酸，是綠 茶中有效的呈味物質(zhì)，可以用作品質(zhì)、風(fēng)味改良劑及功能食品添加劑。
本發(fā)明中使用的乙胺衍生物，可以列舉乙胺、乙胺鹽酸鹽等。
本發(fā)明所用的枯草芽孢桿菌SK 11.004是由本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)的新菌株，是具 有產(chǎn)生Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的茶氨酸生產(chǎn)菌。另外，本發(fā)明所用的枯草芽孢桿菌SK 11.004鑒定，是通過根據(jù)一定法則的菌類學(xué)性質(zhì)、生物化學(xué)性質(zhì)的分析和16s RNA序列的測(cè)定而得出的。
本發(fā)明的Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶是來自枯草芽孢桿菌SK11.004的酶。該酶在堿性 條件下，水解活性很低，而其谷氨?；D(zhuǎn)移活性很高，大大優(yōu)于谷氨酰胺酶。 該反應(yīng)的酶活性源可直接使用發(fā)酵液上清液或各種處理樣品，例如經(jīng)超濾、酒精沉淀或精制等所得的酶制品。
本發(fā)明中的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性，是通過使酶作用于Y-谷氨酰對(duì)硝基苯胺和 雙甘肽，定量所生成的對(duì)硝基苯胺而測(cè)定。該酶的單位定義為每1分鐘生成
lpmol對(duì)硝基苯胺的酶量。
實(shí)施例l產(chǎn)谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶菌的分離
采用中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵制品蝦醬，取少許加入到分離培養(yǎng)基中(以g/L計(jì))葡 萄糖20、酵母膏15、玉米漿IO、 MgSO4.7H2O0. 5、 K2HP041， pH7.0。在37。C， 200rpm的條件下培養(yǎng)24h，經(jīng)稀釋涂布后，獲得純培養(yǎng)物，37。C培養(yǎng)30h，得到 20株酶活較高的菌株，選定一株酶活可達(dá)2U/mL的菌株SK11.004為實(shí)驗(yàn)菌株。
實(shí)施例2粗酶粉的制備
使用實(shí)施例1所得到的枯草芽孢桿菌SK11.004,在發(fā)酵培養(yǎng)基中(以g/L 計(jì)):蔗糖25、胰蛋白胨5、玉米槳15、 MgSO4'7H2O0.5、 K2HP041， pH7.0， 37°C， 200rpm的條件下培養(yǎng)16h，冷凍離心，制得發(fā)酵液上清液，即為粗酶液。 將粗酶液進(jìn)行濃縮后，按酶液:酒精-4:l(V:V)比例添加酒精，將沉淀后的蛋白冷 凍干燥，即得粗酶粉。
實(shí)施例3酶反應(yīng)
使用實(shí)施例2的粗酶粉，以0.2U/mL加入到含谷氨酰胺0.02M、乙胺0.15M 的100mM硼酸鈉緩沖液(Na2B407-NaOH、 pHIO)中，在37。C下進(jìn)行2小時(shí)的 酶反應(yīng)，合成了茶氨酸。
實(shí)施例4茶氨酸產(chǎn)量的測(cè)定
將實(shí)施例3中進(jìn)行的酶反應(yīng)液經(jīng)TCA沉淀、稀釋，通過安捷倫液相色譜儀， 分別對(duì)茶氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸進(jìn)行定量。分析條件如下儀器型號(hào)AgllOO， 色譜柱(250X4.6) mm 5pm ODS HYPERSIL，柱溫40°C。
實(shí)施例5芽孢桿菌SK 11.004培養(yǎng)條件的優(yōu)化
本發(fā)明人等研究了使用實(shí)施例1中的培養(yǎng)基以外的培養(yǎng)基進(jìn)行枯草芽孢桿 菌SK11.004的培養(yǎng)。在研究了麥芽糖、乳糖、蔗糖、淀粉、糊精、果糖、谷氨 酸鈉等碳源后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用蔗糖時(shí)發(fā)酵液上清液酶活最高。在研究了魚粉
蛋白胨、胰蛋白胨、大豆粕、檸檬酸鈉、谷氨酸鈉、尿素、(NH4)2S04等氮源后，
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用胰蛋白胨可以達(dá)到最佳效果。同時(shí)研究了蔗糖、胰蛋白胨和玉 米漿最佳濃度比后發(fā)現(xiàn)，蔗糖、胰蛋白胨和玉米漿分別為25g/L、 5g/L、 15g/L 的條件下，可得到酶活達(dá)4U/mL的發(fā)酵液。
實(shí)施例6使用來自枯草芽孢桿菌SK 11.004的發(fā)酵液上清液的酶反應(yīng)條件 的最優(yōu)化。按照實(shí)施例3中的酶反應(yīng)條件，研究了使用來自枯草芽孢桿菌SK 11.004的發(fā)酵液上清液時(shí)的最適酶反應(yīng)條件，發(fā)現(xiàn)使用20mM谷氨酰胺與 200mM乙胺，在37。C， pH 10條件下反應(yīng)2時(shí)可得到最大收率80%的茶氨酸。
實(shí)施例7精制茶氨酸。從反應(yīng)液中分離精制茶氨酸是先通過減壓濃縮除去乙胺后，再依次使用001x7(732)強(qiáng)酸性苯乙烯系陽(yáng)離子交換樹脂，201x7(717) 強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂，和乙醇處理得到。
權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)生γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的菌株，其分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)SK11.004，已保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NOM 208083。
2、 一種天然茶氨酸的制備方法，其特征在于，(1) 制備粗酶粉-使用枯草芽孢桿菌SK11.004為出發(fā)菌株；培養(yǎng)基，以g/L計(jì)為蔗糖25、胰蛋白胨5、玉米漿15、 MgSO4.7H2O0.5、 K2HP04 1， pH7.0; 37°C， 200 rpm的條件下培養(yǎng)16 h;冷凍離心，制得的發(fā)酵 液上清液，即為粗酶液；將粗酶液進(jìn)行濃縮后，按酶液:酒精體積比4:1的比例添加酒精進(jìn)行沉淀， 將沉淀后的蛋白冷凍干燥，即得粗酶粉；(2) 酶反應(yīng)制備天然茶氨酸使用制得的粗酶粉，以0.2U/mL加入到含谷氨酰胺0.02M、乙胺0.15-0.25M 的pH9 10.5、 100mMNa2B4O7-NaOH硼酸鈉緩沖液中，在35 4(TC下進(jìn)行2 小時(shí)的酶反應(yīng)，合成了茶氨酸；(3) 茶氨酸的精制將酶反應(yīng)液通過減壓濃縮除去乙胺后，再依次使用 001x7的732強(qiáng)酸性苯乙烯系陽(yáng)離子交換樹脂，201x7的717強(qiáng)堿性陰離子交換 樹脂，和乙醇處理得到茶氨酸的精制品。
全文摘要
天然茶氨酸的制備方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明從中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離篩選到的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)SK11.004菌株是一株產(chǎn)谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的茶氨酸生產(chǎn)菌，保藏編號(hào)CCTCC NOM 208083；將γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶作用于谷氨酰胺和乙胺，在pH 10的條件下，能高效地生產(chǎn)茶氨酸。本發(fā)明的酶法制備茶氨酸的方法具有反應(yīng)時(shí)間短、酶活性源制備簡(jiǎn)單、能使茶氨酸的生產(chǎn)簡(jiǎn)單，以及產(chǎn)品安全可靠的優(yōu)點(diǎn)，適于進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101343618SQ20081002118
公開日2009年1月14日 申請(qǐng)日期2008年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月19日
發(fā)明者帥玉英, 濤 張, 波 江 申請(qǐng)人:江南大學(xué)