專利名稱：肉鴿性別鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景目前，雛鴿的性別有根據(jù)初生重、腳趾長短比較、翻缸等經(jīng)驗與方法判 斷，缺乏科學依據(jù)的同時，準確率也不高。鳥類的CHD基因，即染色體螺旋蛋白基因(chromo-helicase-DNAbinding gene)位于性染色體上，在非平胸鳥類中存在兩個同源拷貝CHD-W和CHD-Z， 其中CHD-W為W連鎖，CHD-Z為Z連鎖。在大多數(shù)鳥類，此基因的外顯子高 度保守，而內(nèi)含子在兩性間突變較大，因此可以根據(jù)公母間內(nèi)含子長度不同 進行性別鑒定。由于肉鴿雌性為ZW型，雄性為ZZ型，因此根據(jù)內(nèi)含子兩端外顯子設(shè)計 跨內(nèi)含子的上下游引物，進行PCR擴增，再對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測時，在 雌性可以得到不同長度的片段，而在雄性只能得到相同長度的片段。Griffiths 等(1998)根據(jù)CHD基因設(shè)計了P2、 P8引物對，證實可以鑒定笑翠鳥、歐洲 食蜂鳥、深紅玫瑰鸚鵡、雨燕、雞、八哥、藍冠山雀等27種鳥類的性別。另 外，鳥類性別鑒定所用的基因組DNA大多是從血液樣本中提取，易對動物造 成傷害。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種簡單、準確、快速、無傷害的肉鴿性別鑒定方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是通過原雞和小天鵝CHD基因內(nèi)含子兩端的外顯子 序列比對，在兩端外顯子上分別設(shè)計上下游引物Psf : 5，CAAGGATGAGAAACTGTGCAA3，； Psr: 5， GAATATCTTCTGCTCCTACTG3，； 再以Psf/Psr引物擴增肉鵒羽髓基因組DNA的Z和W染色體上的CHD基因， 最后經(jīng)過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染，根據(jù)帶型判斷性別，其中雌性為 兩條帶，雄性為一條帶。本發(fā)明利用CHD基因內(nèi)含子在Z、 W染色體上長度差異，設(shè)計跨內(nèi)含 子引物，根據(jù)PCR擴增產(chǎn)生不同的帶型來判斷肉鴿的性別。本發(fā)明只需掌握 一般的PCR技術(shù)和聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染操作，就可進行鑒定，重復(fù)性 強，準確率高(100%， n=280)。另夕卜，本發(fā)明利用羽髓提取肉鵒基因組DNA， 再經(jīng)過PCR擴增進行性別鑒定，能將對肉鴿的傷害減到最小，并能盡早準確 判定肉鴿性別，不僅有利于肉鴿育種計劃的進行，還有利于肉鴿的集約化生 產(chǎn)，提高肉鴿經(jīng)濟效益。本發(fā)明在對肉鴿羽髓基因組DNA W和Z染色體上CHD基因內(nèi)含子進 行擴增時，采用10ul體系取1 ul 10XPCRBuffer、 1.5mMMgCl2、 200pM dNTP、 5pmo1引物、100ng肉鴿羽髓基因組DNA和0.5U Taq DNA聚合酶，加雙蒸水補至iow。另，本發(fā)明肉鴿羽髓基因組DNA的提取方法是取肉鵒頸部或翅部羽 毛，將末端羽髓部剪碎，置于1.5ml指形管，加600^1裂解液，37"C處理3h; 然后加入5"蛋白酶K， 55'C水浴過夜后，再加入等體積的Tris飽和酚、等 體積酚-氯仿-異戊醇和等體積氯仿-異戊醇各抽提1次；得到的上清用2.5倍 體積冷無水乙醇沉淀DNA， 70°/。冰乙醇洗兩次，室溫干燥，300lUTE37。C 溶解過夜，4"C保存?zhèn)溆谩?br>

圖1為肉鴿CHD基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖。
具體實施方式
1、肉鴿羽髓DNA的提取(1)取肉鴿頸部或翅部羽毛3-5根，將末端羽髓部剪碎，置于1.5ml指形管，力Q 600jil裂解液(50m MTris-HCl， lOOMm EDTA, lOOMm NaCl， 0.5% SDS,pH8.0)， 37t:處理3h，然后加入5 u 1蛋白酶K (20mg/ml)， 55。C水浴 過夜；(2) 加入等體積的Tris飽和酚，溫和搖動30min， 12000rpm離心10min， 吸取上清液于1.5ml離心管內(nèi)；(3) 加入等體積酚-氯仿-異戊醇(25: 24: 1)，溫和搖動10min， 12000rpm 離心10min，吸取上清于另一干凈離心管內(nèi)；(4) 加入等體積氯仿-異戊醇(24: 1),溫和搖動10min， 12000rpm離 心10min，吸上清于另一干凈離心管內(nèi)；(5) 2.5倍體積冷無水乙醇沉淀DNA， 70%冰乙醇洗兩次，室溫干燥， 300ulTE37'C溶解過夜，4"C保存?zhèn)溆谩?、 設(shè)計引物通過原雞和小天鵝CHD基因內(nèi)含子兩端的外顯子序列比對，在兩端外 顯子上分別設(shè)計上下游引物Psf: 5， CAAGGATGAGAAACTGTGCAA3，； Psr: 5' GAATATCTTCTGCTCCTACTG3'3、 用得到的基因組DNA為模版進行PCR擴增PCR擴增采用10u l體系10XPCRBuffer 1 u l、MgCl2 1.5mM、dNTP200 u M、引物Psf/Psr各5 pmol、模版DNA 100ng、 Taq DNA聚合酶0.5U，加 雙蒸水至10ul。擴增程序為94°C/4min; 94°C/30s， 56°C/55s， 72。C/30min， 35個循環(huán)；72°C/10min， 4。C保存。4、 10。/。PAGE膠(聚丙烯酰胺凝膠)電泳檢測、銀染10%PAGE膠120V電泳6h，然后銀染，根據(jù)顯色的帶型判斷性別雌 性為兩條帶，雄性為一條帶，準確率高達100%。通過切膠回收、克隆測序發(fā)現(xiàn)，擴增的片段長度分別為CHD-Z 264bp， CHD-W 244bp (見圖1)。<110>揚州大學<120>肉鴿性別鑒定方法 <160〉2<210>1 <211>21 <212〉DNA <213>人工序列<220>〈223〉利用CHD基因內(nèi)含子在Z、 W染色體上長度差異，設(shè)計跨內(nèi)含子引物<400>1caaggatgag aaactgtgca a<210>2 <211>21 <212>DNA <213>人工序列<220>〈223〉利用CHD基因內(nèi)含子在Z、 W染色體上長度差異，設(shè)計跨內(nèi)含子引物<400>2gaatatcttc tgctcctact g
權(quán)利要求
1、一種肉鴿性別鑒定方法，其特征在于通過原雞和小天鵝CHD基因內(nèi)含子兩端的外顯子序列比對，在兩端外顯子上分別設(shè)計上下游引物Psf5’CAAGGATGAGAAACTGTGCAA3’；Psr5’GAATATCTTCTGCTCCTACTG3’；以Psf/Psr引物擴增肉鴿羽髓基因組DNA的Z和W染色體上的CHD基因，經(jīng)過10％聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染，根據(jù)帶型判斷性別，兩條帶為雌性，一條帶為雄性。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述肉鴿性別鑒定方法，其特征在于在對肉鴿羽髓基 因組DNAW和Z染色體上CHD基因內(nèi)含子進行擴增時，采用lOul體系 取lullOXPCR Buffer 、 1.5mMMgCl2、 200jiM dNTP、 5pmo1引物、100ng 肉鴿羽髓基因組DNA和0.5UTaqDNA聚合酶，加雙蒸水補至10^1。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述肉鴿性別鑒定方法，其特征在于肉鵒羽髓基因組 DNA的提取方法是取肉鴿頸部或翅部羽毛，將末端羽髓部剪碎，置于1.5ml 指形管，加600(il裂解液，37。C處理3h;然后加入5lU蛋白酶K， 55。C水浴 過夜后，再加入等體積的Tris飽和酚、等體積酚-氯仿-異戊醇和等體積氯仿-異戊醇各抽提1次；得到的上清用2.5倍體積冷無水乙醇沉淀DNA， 70%冰 乙醇洗兩次，室溫干燥，300iUTE37。C溶解過夜，4。C保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
肉鴿性別鑒定方法，屬于分子生物學技術(shù)領(lǐng)域。通過原雞和小天鵝CHD基因內(nèi)含子兩端的外顯子序列比對，在兩端外顯子上分別設(shè)計上下游引物Psf5’CAAGGATGAGAAACTGTGCAA3’；Psr5’GAATATCTTCTGCTCCTACTG3’；再以Psf/Psr引物擴增肉鴿羽髓基因組DNA的Z和W染色體上的CHD基因，最后經(jīng)過10％聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染，根據(jù)帶型判斷性別，其中雌性為兩條帶，雄性為一條帶。本發(fā)明只需掌握一般的PCR技術(shù)和聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染操作，就可進行鑒定，重復(fù)性強，準確率高(100％，n＝280)。
文檔編號C12Q1/68GK101333563SQ200810021280
公開日2008年12月31日 申請日期2008年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月23日
發(fā)明者丁家桐, 俞鳳燕, 輝 劉, 曼 吳, 俊 孟, 舒 張, 潘孝青, 鵬 王, 秦志艷, 鄭愛燕 申請人:揚州大學