專(zhuān)利名稱：一種鑒定鰱魚(yú)幼苗性別的分子生物學(xué)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分子生物學(xué)，特別是一種鑒定鰱魚(yú)幼苗性別的分子生 物學(xué)方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)有著豐富的魚(yú)類(lèi)資源，其中許多魚(yú)類(lèi)在生長(zhǎng)速率上存在著性別差 異，因此，開(kāi)展這些魚(yú)類(lèi)性別決定相關(guān)基因及性別特異標(biāo)記的研究對(duì)于魚(yú) 類(lèi)性別控制具有很高的理論指導(dǎo)意義。鰱魚(yú)(i/;;; o/^/w/m/c/2^^ wo/浙/;c) 又叫白鰱、水鰱、跳鰩、鰱子，屬于鯉形目，鯉科，是著名的四大家魚(yú)之 一。著名的特產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，養(yǎng)殖歷史悠久，在我國(guó)池塘、湖泊、水庫(kù)均有 養(yǎng)殖，且養(yǎng)殖產(chǎn)量一直居我國(guó)淡水養(yǎng)殖之首。鰱魚(yú)雌性生長(zhǎng)發(fā)育快，生長(zhǎng) 迅速。目前人工雌核發(fā)育與激素性反轉(zhuǎn)結(jié)合創(chuàng)造全雌性的養(yǎng)殖群體是鰱魚(yú) 育種的主要方向。但是由于鰱第一次性成熟需3 4年，在幼苗時(shí)期根本 無(wú)法通過(guò)外觀形態(tài)來(lái)判斷其性別特征，所以怎樣從幼苗群體中，簡(jiǎn)單快速 的識(shí)別出遺傳性別成為制約鰱魚(yú)成功選育的先決條件。
RAPD技術(shù)是近幾年出現(xiàn)的，可以快速尋找分子標(biāo)記的一種有效方法。 用它在某些動(dòng)物的基因組中尋找性別標(biāo)記已有成功報(bào)道。如在虹鱒魚(yú)基因 組中找到了兩個(gè)雄性特異的分子標(biāo)記，可以作為識(shí)別雌雄的探針。Kovacs 等2000年用RAPD掃描非洲鯰魚(yú)(C/an'os gw/印/m^)雌、雄基因池，找 到兩個(gè)雄性性別相關(guān)的RAPD標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一對(duì)鰱魚(yú)雄性特異性引物序列和一對(duì)對(duì)照管家基 因引物序列。
本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種能快速鑒別鰱魚(yú)幼苗性別的方法。 本發(fā)明的技術(shù)方案是，鰱魚(yú)DNA分子鑒定性別的特異性片段，其特 征在于該特別片斷的序列命名為Hmmf。鰱魚(yú)幼苗DNA分子鑒別的雄性 特異引物，其特征在于該引物是由Hmmf序列設(shè)計(jì)合成的，該引物序列命名為Hmmfl和Hmmf2，對(duì)照管家基因引物是通過(guò)在NCBI網(wǎng)絡(luò)搜索到 的鰱魚(yú)管家基因GAPDH設(shè)計(jì)合成的，其引物序列命名為Gapdhl和 G叩dh2。 一種鑒定鰱魚(yú)幼苗性別的分子生物學(xué)方法，其特征在于利用設(shè) 計(jì)的特異引物Hmmf 1和Hmmf2 ，以及對(duì)照管家基因GAPDH的引物Gapdhl 和Gapdh2，以鰱魚(yú)個(gè)'體基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為 25pl,反應(yīng)組成為1U的TaqDNA聚合酶，2^1的dNTP， 100 200ng基因 組DNA，其中含雄性特異上下游引物及管家基因上下游引物各0.1拜ol/L， 在PCR儀上按下面的循環(huán)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增95t:預(yù)變性5min后，94 。C變性30sec， 6(TC退火30sec， 72'C延伸60sec共30個(gè)循環(huán)，最后72 。C延伸10min，擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，在 凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄，100bpDNA ladder作分子量標(biāo)記，該方 法中對(duì)照管家基因GAPDH的擴(kuò)增帶在雌雄個(gè)體中均穩(wěn)定存在，出現(xiàn)大小 為800bp目的條帶的是雄性個(gè)體，沒(méi)有條帶的即為雌性個(gè)體。本發(fā)明與現(xiàn) 有技術(shù)比較具有能對(duì)鰱魚(yú)幼苗進(jìn)行性別鑒定且鑒別準(zhǔn)確率高的顯著優(yōu)點(diǎn)。


圖1為利用特異PCR法對(duì)性別特異片段的驗(yàn)證結(jié)果。在雌雄10個(gè)個(gè) 體中，對(duì)照管家基因條帶在所有個(gè)體中清晰可見(jiàn)，證明PCR擴(kuò)增程序沒(méi)有 問(wèn)題。1， 2， 3， 4， 5泳道都出現(xiàn)了大小為800bp的擴(kuò)增帶，均為雄性個(gè) 體；而6， 7， 8， 9， IO除管家基因外沒(méi)有擴(kuò)增出任何條帶，均為雌性個(gè)體。 M為100bp梯度的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。箭頭1所指為大小為800bp的雄性 特異條帶；箭頭2所指為對(duì)照基因條帶。
圖2為利用雄性特異引物和管家基因引物的鰱魚(yú)幼苗性別鑒定結(jié)果。 隨機(jī)選取13個(gè)鰱魚(yú)幼苗個(gè)體進(jìn)行性別鑒定。其中l(wèi)， 2， 3， 4， 5， 9， 10， 11八個(gè)個(gè)體的電泳帶上有一個(gè)800bp大小的條帶，為雄性個(gè)體；6， 7， 8， 11， 12五個(gè)個(gè)體在800bp位置上沒(méi)有條帶，為雌性個(gè)體。但管家基因條帶 在雌雄個(gè)體中都出現(xiàn)。M為100bp梯度的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。箭頭1所指 為大小為800bp的雄性特異條帶；箭頭2所指為管家基因條帶。
具體實(shí)施例方式
雄性特異引物的獲得以及性別特異性的驗(yàn)證性腺解剖鑒定性別后，提取雌雄個(gè)體基因組DNA，利用220條隨機(jī)引 物進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增，當(dāng)使用到隨機(jī)引物S2107時(shí)，在雄性個(gè)體中擴(kuò)增 出一個(gè)穩(wěn)定的譜帶，該帶紋在雌性個(gè)體中不存在，通過(guò)克隆和測(cè)序獲得了 一段約800bp的雄性特異片段，命名為Hmmf (其DNA序列如表1)，該 片段屬非編碼序列，將該序列在Genebank上進(jìn)行序列對(duì)比，未發(fā)現(xiàn)與之 同源的序列。該條帶艮'卩為鰱魚(yú)雄性特異條帶，測(cè)序后設(shè)計(jì)一對(duì)雄性特異引 物Hmmfl和Hmmf2，通過(guò)NCBI搜索鰱魚(yú)的GAPDH管家基因，設(shè)計(jì)一 對(duì)能作為PCR內(nèi)部對(duì)照的引物Gapdhl和Gapdh2 (其DNA序列如表2)。 利用設(shè)計(jì)好的特異引物及對(duì)照基因引物在10個(gè)已知性別的個(gè)體中進(jìn)行特 異PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖l所示，在雌雄10個(gè)個(gè)體中，對(duì)照管家基因條帶 在所有個(gè)體中清晰可見(jiàn)，證明PCR擴(kuò)增程序沒(méi)有問(wèn)題，1， 2， 3， 4, 5均 為雄性個(gè)體，泳道都出現(xiàn)了大小為800bp的擴(kuò)增帶；而6， 7， 8， 9， 10 均為雌性個(gè)體，除管家基因外沒(méi)有擴(kuò)增出任何條帶，這表明本發(fā)明設(shè)計(jì)的 引物和方法能夠用于鰱魚(yú)性別的鑒定。
鰱魚(yú)幼苗性別的鑒別
將實(shí)驗(yàn)魚(yú)斷尾取血少許(不超過(guò)0.5ml)，加至少兩倍的抗凝劑ACD， 400(h"pm離心10min，去上清；加入5ml裂解液及20嗎RNA酶，37。C溫 育3h;加蛋白酶K至終濃度10(Hig/Vl， 5(TC過(guò)夜。經(jīng)酚~ ^酚*氯仿*異 戊醇~~ 氯仿'異戊醇依次抽提，無(wú)水乙醇沉淀，70%乙醇洗滌。干燥后， 將鰱魚(yú)基因組DNA溶于TE或無(wú)菌雙蒸水中，分別編號(hào)。利用設(shè)計(jì)的雄性 特異引物和管家基因引物對(duì)13個(gè)未知性別鰱魚(yú)幼苗個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 反應(yīng)體系為25pl， lUTaq酶，2pl dNTP， 100~200ng基因組DNA，雄性特 異上下游引物及管家基因上下游引物各0.1pmOl/L。循環(huán)參數(shù)為95'C預(yù)變 性5min后，94。C變性30sec， 60。C退火30sec， 72。C延伸60sec共30個(gè) 循環(huán)，最后72。C延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化 乙錠染色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄。如圖2發(fā)現(xiàn)對(duì)照基因 GAPDH的擴(kuò)增帶在雌雄個(gè)體中均穩(wěn)定存在，8個(gè)出現(xiàn)大小為800bp目的帶 的是雄性個(gè)體，其它5個(gè)沒(méi)有條帶的即為雌性個(gè)體。
以上均表明本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異引物和方法能夠用于鰱魚(yú)幼苗雌雄性別
的鑒別。表1 .鰱魚(yú)雄性特異片段Hmmf序列
說(shuō)明書(shū)第4/4頁(yè)
表2.鰱魚(yú)雄性特異性引物序列和管家基因引物序列
引物 序列
Hmmf 1: 5' TGCAGGTCGACGATTTCCCAGC3'
雄性特異性引物序列
Hmmf2: 5'CCATTTTCTTTCACCTCGCACC 3'
Gapdhl: 5'GCCTCCTGCACCACCAACTG3'
對(duì)照基因引物序列 ~~~~--
Gapdh2; 5， CGGAAGGCCATGCCGGTCAG3，
權(quán)利要求
1、鰱魚(yú)DNA分子鑒定性別的特異性片段，其特征在于該特異性片斷的序列命名為Hmmf。
2、 鰱魚(yú)幼畝DNA分子鑒別的雄性特異引物，其特征在于該引物是 由Hmmf序列設(shè)計(jì)合成的，該引物序列命名為Hmmfl和Hmmf2，對(duì)照管 家基因引物是通過(guò)在NCBI網(wǎng)絡(luò)搜索到的鰱魚(yú)管家基因GAPDH設(shè)計(jì)合成 的，其引物序列命名為Gapdhl和Gapdh2。
3、 一種鑒定鰱魚(yú)幼苗性別的分子生物學(xué)方法，其特征在于利用設(shè)計(jì) 的特異引物Hmmfl和Hmmf2，以及對(duì)照管家基因GAPDH的引物Gapdhl 和Gapdh2,以鰱魚(yú)個(gè)體基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25)il， 反應(yīng)組成為1U的TaqDNA聚合酶，2pl的dNTP， 100 200ng基因組DNA， 其中含雄性特異上下游引物及管家基因上下游引物各0.1pmol/L，在PCR 儀上按下面的循環(huán)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增95。C預(yù)變性5min后，94"C變性 30sec， 6CTC退火30sec， 72"延伸60sec共30個(gè)循環(huán)，最后72°。延伸 10min，擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，在凝膠成 像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄，100bp DNA ladder作分子量標(biāo)記，該方法中對(duì) 照管家基因GAPDH的擴(kuò)增帶在雌雄個(gè)體中均穩(wěn)定存在，出現(xiàn)大小為800bp 目的條帶的是雄性個(gè)體，沒(méi)有條帶的即為雌性個(gè)體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種鑒定鰱魚(yú)幼苗性別的分子生物學(xué)方法，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，本發(fā)明的目的是提供鰱魚(yú)幼苗DNA性別的特異性片段和其雄性特異引物及鑒定鰱魚(yú)幼苗性別的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是，其特異性片段的序列為Hmmf1和Hmmf2。鑒定鰱魚(yú)幼苗性別的分子生物學(xué)方法，利用設(shè)計(jì)的特異引物及對(duì)照管家基因GAPDH的引物以鰱魚(yú)個(gè)體基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25μl，在PCR儀上按30個(gè)循環(huán)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄，100bp DNA ladder作分子量標(biāo)記，出現(xiàn)大小為800bp目的條帶的是雄性個(gè)體，沒(méi)有條帶的即為雌性個(gè)體。本發(fā)明用于鰱魚(yú)幼苗性別鑒定。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101613750SQ20091006428
公開(kāi)日2009年12月30日 申請(qǐng)日期2009年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月27日
發(fā)明者夏曉華, 常重杰, 杜啟艷, 王友利, 陳建軍 申請(qǐng)人:河南師范大學(xué)