專利名稱：高靈敏度人性別鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，是一種利用PCR技術(shù)對(duì)人性別進(jìn)行鑒定的高靈敏度方法。
本發(fā)明是建立在多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)基礎(chǔ)上的。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的英文名稱為Polymerase Chain Reaction，一般文獻(xiàn)中都縮寫(xiě)為PCR(以下也以PCR表示多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。PCR是利用一對(duì)寡核苷酸引物(以下簡(jiǎn)稱引物)，在離體條件下對(duì)大量DNA中的特定的微量DNA進(jìn)行擴(kuò)增的一種技術(shù)。通過(guò)PCR反應(yīng)，一般在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)可以使特定的DNA擴(kuò)增到10'倍以上，從而可以很方便地進(jìn)行檢測(cè)或做進(jìn)一步的分析。PCR技術(shù)已由美國(guó)的K.B.Mullis在美國(guó)申請(qǐng)了專利并獲批準(zhǔn)，專利號(hào)為4683202，專利名稱為“Process forAmplifying Nucleic Acid Sequences”，即“擴(kuò)增核酸順序的方法”。
利用PCR技術(shù)，美國(guó)的S.C.Kogan等曾對(duì)人的性別進(jìn)行了鑒定(New England J.Medicine，317985-990，1987)。但他們的方法存在如下不足之處(1)DNA擴(kuò)增效率較低，因而檢測(cè)靈敏度不高，進(jìn)行人性別鑒定時(shí)，只有用40皮克(pg)以上的人DNA才有效。這樣的靈敏度使得不少應(yīng)用受到限制，如司法中對(duì)極少量的人體或殘留物的性別鑒定;又如通過(guò)對(duì)母體外周血對(duì)胎兒進(jìn)行性別鑒定等。(2)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生的用于判斷男女性別的DNA片段為154bp，這樣的DNA片段與被檢測(cè)樣品中可能存在的一些物質(zhì)如RNA片段，在進(jìn)行常規(guī)的瓊脂糖電泳時(shí)不易分開(kāi)，從而影響對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確判斷。
本發(fā)明的目的是通過(guò)設(shè)計(jì)新的核苷酸引物，對(duì)利用PCR技術(shù)進(jìn)行人性別鑒定的方法加以改進(jìn)，以提高鑒定的靈敏度和正確性。
鑒定人性別的方法基本步驟包括，對(duì)被測(cè)DNA樣品采用測(cè)定男性特異性的PCR擴(kuò)增技術(shù)和測(cè)定人特異性的PCR擴(kuò)增技術(shù)，然后通過(guò)檢測(cè)擴(kuò)增后的DNA情況判斷被測(cè)樣品的人性別。但Kogan等人在PCR擴(kuò)增技術(shù)中所用的引物經(jīng)計(jì)算機(jī)分析，發(fā)現(xiàn)其核苷酸順序設(shè)計(jì)不夠合理。本發(fā)明設(shè)計(jì)了兩對(duì)新的核苷酸引物，從而有效地克服了Kogan方法的不足。
本發(fā)明用來(lái)擴(kuò)增男性特異性DNA片段的一對(duì)引物稱為Y3和Y4。Y3的核苷酸順序?yàn)?′-d(CCCAGCCTTTCCAGTCAATGATT)-3′;Y4的核苷酸順序?yàn)?′-d(ATGGACTCAAATTGAAAGGGCTC)-3′。使用引物Y3和Y4，按美國(guó)專利4683202中所描述的方法(即PCR方法)對(duì)男性或女性DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增，男性DNA樣品會(huì)產(chǎn)生446bp的DNA片段(實(shí)際包含有從441bp到450bp的各種DNA片段，簡(jiǎn)記為446bp，下同)，而女性DNA樣品不會(huì)產(chǎn)生這種DNA片段。通過(guò)檢測(cè)擴(kuò)增后的樣品中有或無(wú)446bp的DNA片段，就可對(duì)原樣品是男性DNA還是女性DNA做出判斷。對(duì)于男性DNA和女性DNA混雜的樣品，用引物Y3和Y4擴(kuò)增后也會(huì)產(chǎn)生446bp的DNA片段。因此對(duì)未知的DNA樣品用Y3和Y4進(jìn)行擴(kuò)增，如果擴(kuò)增后的樣品中能檢測(cè)出446bp的DNA片段，則可判斷原樣品有男性DNA;而如果擴(kuò)增后的樣品中不能檢測(cè)出446bp的DNA片段，則可判斷原樣品中無(wú)男性DNA。
本發(fā)明中用來(lái)擴(kuò)增人特異性DNA片段的另一對(duì)引物稱為A1和A2，A1的核苷酸順序?yàn)?′-d(TAATCCCAGCACTTTGGGAGGC)-3′;A2的核苷酸順序?yàn)?′-d(CCACCACGCCCAGCTAATTTTT)-3′。使用引物A1和A2，按美國(guó)專利4683202中所描述的方法對(duì)男性或女性DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增，不論是男性DNA樣品還是女性DNA樣品都會(huì)產(chǎn)生124bp的DNA片段(實(shí)際包含有從122bp到126bp的各種DNA片段，簡(jiǎn)記為124bp，下同)。因此對(duì)未知的DNA樣品用A1和A2擴(kuò)增，如果擴(kuò)增后的樣品中能檢測(cè)出124bp的DNA片段，則可判斷原樣品中含有人DNA(不論男性或女性);如果擴(kuò)增后的樣品中不能檢測(cè)出124bp的DNA片段，則可判斷原樣品中無(wú)人DNA(不論男性或女性)。
同一個(gè)DNA樣品分成兩份后分別用Y3和Y4擴(kuò)增以及A1和A2擴(kuò)增，檢測(cè)其中有無(wú)446bp的DNA片段或(和)124bp的片段，稱為外參照法。同一個(gè)DNA樣品作為一份使用Y3和Y4時(shí)也使用A1和A2進(jìn)行擴(kuò)增，再檢測(cè)其中有無(wú)446bp的DNA片段或(和)124bp的DNA片段，稱為內(nèi)參照法。使用外參照法或內(nèi)參照法，男性DNA可檢測(cè)出446bp和124bp兩種DNA片段;女性DNA只能檢測(cè)出124bp的DNA片段而不能檢測(cè)出446bp的DNA片段。對(duì)于未知DNA樣品，使用外參照法或內(nèi)參照法，如能檢測(cè)出446bp和124bp兩種DNA片段，則可判斷原樣品中含有男性DNA;如能檢測(cè)出124bp的DNA片段而不能檢測(cè)出446bp的DNA片段，則可判斷原樣品中含有女性DNA而不含男性DNA;如不能檢測(cè)出446bp和124bp的DNA片段，則可判斷原樣品中不含人DNA。
引物Y3、Y4、A1和A2，只要按上述的核苷酸順序，可用各種化學(xué)的、生物的或其他的方法合成;合成可以人工進(jìn)行或用自動(dòng)化合成儀。例如，可使用Applied Biosystems公司381A型號(hào)的DNA自動(dòng)合成儀并按制造者的說(shuō)明書(shū)所述的方法進(jìn)行合成。
DNA樣品可以是純化的、未純化的或部分純化的。例如，人的鮮血只要放入水中煮沸5分鐘，即可用于擴(kuò)增反應(yīng)。
擴(kuò)增反應(yīng)的條件相當(dāng)廣，按美國(guó)專利4683202中所述的各種條件均可。
446bp或(和)124bpDNA片段的檢測(cè)和定量可用層析法、電泳法、熒光光度法或其它方法。例如，可用普通的瓊脂糖電泳來(lái)分離DNA片段后用溴乙錠染色，用紫外光照射下的紅色熒光來(lái)檢測(cè)和定量。
使用本發(fā)明鑒定人性別具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)只要4皮克(pg)人DNA就可以正確地進(jìn)行性別鑒定，靈敏度比現(xiàn)有的方法高十倍以上。這種靈敏度相當(dāng)于用一個(gè)細(xì)胞就可進(jìn)行性別鑒定。(2)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生的用于判斷男女性別的DNA片段為446bp，與樣品中的物質(zhì)如RNA片段，用常規(guī)的瓊脂糖電泳能很好地分離，從而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果很易判斷。(3)能檢出混合在大量女性DNA中的微量男性DNA。例如十萬(wàn)份女性DNA中混有一份男性DNA的樣品也可被檢出，這對(duì)于用母體外周血來(lái)鑒別胎兒的性別非常有利。而用Kogan的方法，只能檢出一千份女性DNA中混有一份男性DNA的樣品。(4)由于方法靈敏度高，因而只要很少的樣品就可鑒定，這就使得樣品的預(yù)處理非常方便。例如以人的血液為鑒定的樣品，只要把血液加入水中煮沸，就可直接用于PCR反應(yīng)，而以往的方法至少要先去除血液中的紅細(xì)胞才能用于PCR反應(yīng)。(5)本方法中用于判斷男女性別的PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物DNA片段為446bp，用于參照(即男女都會(huì)產(chǎn)生的)的PCR擴(kuò)增后的DNA片段為124bp，這使得我們可以把鑒定實(shí)驗(yàn)和參照實(shí)驗(yàn)放在同一個(gè)試管中進(jìn)行(即作內(nèi)參照)，這樣實(shí)驗(yàn)誤差小，還可節(jié)省近一半的實(shí)驗(yàn)成本和操作工作量。
實(shí)施例1一、樣品制備分別取男、女肌內(nèi)組織各一塊，置于離心管中，取玻璃棒搗碎，分別加入16毫升STE溶液(Nacl 100mM，Tris·cl 10mM EDTA 1mM pH8.0)，Proteinase K 200微升(100mg/ml)，SDS溶液800μl(10%水溶液)經(jīng)60℃2小時(shí)消化后，加入等體積平衡酚，混合均勻，5Krpm離心5分鐘，取水相，加入等體積酚一氯仿液(平衡酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1，混合均勻，5Krpm離心5分鐘，取水相，加入等體積氯仿(氯仿∶異戊醇＝24∶1)，混合均勻，5Krpm離心5分鐘，取水相，加入兩倍體積的預(yù)冷至-20℃的無(wú)水己醇，挑出沉淀，70%乙醇洗滌兩次，真空抽干，溶于TE溶液(Tris·cl 10mM，EDTA 1mM，pH8.0)。紫外光譜法測(cè)定，按照1.0 OD898＝50μg/ml DNA計(jì)算，確定DNA濃度。
二、反應(yīng)液配方5×PCR緩沖液Tris·cl 125mM pH8.10 (NH4)2SO4125mM Mgcl212.5mM BSA 1mg/ml Formamide 2.5%
混合液dATP dCTP dGTP TTP都購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，以24mM Tris.cl(pH8.10)配成各2mM的
混合液引物Y3、Y4由Applied Biosystems公司的381A型DNA自動(dòng)合成儀合成。分別溶于TE緩沖液(同前)成10μM母液。
耐熱DNA多聚酶由復(fù)旦大學(xué)遺傳所自己純化的FD DNA Polymerase。
三、反應(yīng)過(guò)程1、按下列順序配制反應(yīng)系統(tǒng)加入滅菌重蒸水20μl至500μl Eppendorf管加入5×PCR緩沖液8μl，加入Primer各個(gè)1μl，加入
4μl，加入樣品DNA5ul(樣品1400ng ♀DNA+40pg ♂DNA)(樣品2400ng ♀DNA2、混合均勻后量92.5℃水浴保溫7分鐘。
3、冷卻至室溫后加FD DNA Polymerase 2單位，混勻，加液體石蠟50μl，短時(shí)離心使分層良好。
4、按下述條件進(jìn)行30次循環(huán)92.5℃水浴30秒 55℃水浴30秒 70℃水浴90秒5、30次循環(huán)后置70℃水浴5分鐘。
四、產(chǎn)物檢測(cè)樣品冷卻至室溫后取下層水相10μl，加2μl 50%蔗糖水溶液，電泳。電泳條件如下2%Agarose TAE電泳緩沖液 5v/cm 1.5小時(shí)五、結(jié)果及討論樣品1經(jīng)擴(kuò)增后有446bp的DNA片段。
樣品2無(wú)擴(kuò)增446bp的DNA片段。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明利用“高靈敏度人性別鑒定方法”，可以檢測(cè)出混在大量女性DNA中的少量男性DNA。
例2 一、樣品制備從正常男性和女性各取得外周血5μl，分別加入滅菌雙蒸水1ml，沸水浴5分鐘，各取5μl作為樣品，在40μl PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以A1、A2擴(kuò)增產(chǎn)物為內(nèi)參照，Y3、Y4擴(kuò)增產(chǎn)物判斷結(jié)果。
二、反應(yīng)配方5×PCR緩沖液Tris.cl 125mM pH8.10 (NH4)2SO4125mM Mgcl212.5mM BSA 1mg/ml Formanide 25%
混合液dATP dCTP dGTP TTP都購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，以24mM Tris·cl(pH8.10)配成各2mM的
混合液。
引物Y3Y4A1A2以Applied Biosystems公司381A型DNA自動(dòng)合成儀合成，分別溶于TE緩沖液(同前)成10μM母液。
耐熱DNA多聚酶由復(fù)旦大學(xué)遺傳所自己純化的FO DNA Polymerase三、反應(yīng)過(guò)程1、按下列順序配制反應(yīng)系統(tǒng)加入滅菌重蒸水18μl至500μl Eppendorf，加入5×PCR緩沖液8μl，加入Y3、Y4、A1、A2各1μl加入dNTP24μl，加入樣品5μl2、混合均勻后置92.5℃水浴保溫7分鐘3、冷卻至室溫后加FD DNA Polymerase 4單位 混勻，加液體石蠟50μl，短時(shí)離心，使分層良好。
4、按下述條件進(jìn)行30次循環(huán)92.5℃水浴30秒 55℃水浴30秒 70℃水浴210秒5、30次循環(huán)后置70℃水浴5分鐘四、產(chǎn)物檢測(cè)樣品冷卻至室溫后取下層水相10μl，加2μl50%蔗糖水溶液，電泳。
電泳條件如下2%Agarose TAE電泳緩沖液，5v/cm 1.5小時(shí)五、結(jié)果及討論樣品1(男性鮮血)經(jīng)擴(kuò)增后同時(shí)有446bp 12bp的DNA片段樣品2(女性鮮血)經(jīng)擴(kuò)增后只有124bp的DNA片段本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明利用“高靈敏度人性別鑒定方法”可以準(zhǔn)確判定樣品DNA為男性或女性;參照的DNA片段與判斷性別的DNA片段能很好地分離，從而實(shí)驗(yàn)結(jié)果容易判斷;采用簡(jiǎn)單的提取DNA的方法而獲得的樣品，經(jīng)PCR后不影響結(jié)果判斷，都證明本方法的優(yōu)越。
權(quán)利要求
1.一種鑒定人性別的方法，其步驟包括，對(duì)同一個(gè)被測(cè)DNA樣品，分成兩份后分別或者作為一份同時(shí)采用測(cè)定男性特異性的PCR擴(kuò)增技術(shù)和測(cè)定人特異性的PCR擴(kuò)增技術(shù)，然后通過(guò)檢測(cè)擴(kuò)增后的DNA情況判斷人性別，其特征在于(1)測(cè)定男性特異性的PCR擴(kuò)增技術(shù)中采用了一對(duì)核苷酸引物Y3和Y4，其核苷酸順序Y3為5′-d(CCCAGCCTTTCCAGTCAATGATT)-3′，Y4為5′-d(ATGGACTCAAATTGAAAGGGCTC)-3′；(2)測(cè)定人特異性的PCR擴(kuò)增技術(shù)中采用了另一對(duì)核苷酸引物A1和A2，其核苷酸順序A1為5′-d(TAATCCCAGCACTTTGGGAGGC)-3′，A2為5′-d(CCACCACGCCCAGCTAATTTTT)-3′。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定人性別的方法，其特征在于對(duì)經(jīng)PCR技術(shù)擴(kuò)增的DNA樣品進(jìn)行如下檢測(cè)判斷(1)如能檢測(cè)出446bp(實(shí)際為441bp～450bp之間，簡(jiǎn)記為446bp，下同)和124bp(實(shí)際為122bp～126bp之間，簡(jiǎn)為為124bp，下同)兩類DNA片斷，則可確定樣品中含有男性DNA;(2)如能檢測(cè)出124bp的DNA片斷，而檢測(cè)不出446bpDNA片斷，則可確定樣品中只含有女性DNA，而不含有男性DNA;(3)如不能檢測(cè)出446bp和124bp兩類DNA片斷，則可確定樣品中不含人DNA。
全文摘要
本發(fā)明屬生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，是一種利用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)對(duì)人性別進(jìn)行鑒定的高靈敏度方法。其步驟包括對(duì)同一被測(cè)DNA樣品，采用測(cè)定男性特異性和人特異性的PCR擴(kuò)增技術(shù)，然后檢測(cè)擴(kuò)增后的DNA情況，判斷人性別。其中所用的兩對(duì)引物Y
文檔編號(hào)A61B10/00GK1049602SQ90102940
公開(kāi)日1991年3月6日 申請(qǐng)日期1990年9月25日 優(yōu)先權(quán)日1990年9月25日
發(fā)明者毛裕民, 劉堅(jiān), 唐榕 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)