用于牛、羊x/y精子快速分離的uty抗體納米顆粒的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及家畜快速擴(kuò)繁領(lǐng)域，具體涉及一種用于牛、羊Χ/Υ精子快速分離的UTY 抗體納米顆粒的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 家畜性別控制（性控)一旦能為人類精確掌握，畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益就會(huì)成倍增長。 在正常情況下，哺乳動(dòng)物由攜帶Υ染色體的精子(Υ精子)與卵子結(jié)合受精，這種受精卵就向 雄性發(fā)育；而由攜帶X染色體的精子(X精子)與卵子結(jié)合，受精卵即向雌性發(fā)育。因此，性的 發(fā)育方向取決于參加受精的精子類型，人為地選用某一類精子與卵結(jié)合受精就可以達(dá)到控 制家畜性別的目的。
[0003] 常見的性別控制方法有Χ、Υ精子分離法和早期胚胎性別鑒定法。由于早期胚胎性 別鑒定法需要從胚胎上取下少量卵裂后的細(xì)胞，或多或少會(huì)對(duì)胚胎造成一定的損傷，會(huì)導(dǎo) 致受胎率下降，還需要顯微操作儀等昂貴的儀器設(shè)備和嫻熟的顯微操作技術(shù)，從而制約了 該技術(shù)的廣泛應(yīng)用;而Χ、γ精子分離法在受精時(shí)就可以人為控制動(dòng)物的性別，避免了胚胎的 后期損傷，操作相對(duì)簡單，因此只要能分離得到理想的X或Υ精子，在生產(chǎn)上有選擇性的輸精 即可控制動(dòng)物后代的性別。
[0004] 流式細(xì)胞儀分離Χ/Υ精子需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)操作人員，并且精液在前期 處理時(shí)會(huì)受到紫外線照射、機(jī)械損傷等損害。采用對(duì)Υ精子具有特異性抗體進(jìn)行精液分離， 由于Χ、γ精子處在同一液體環(huán)境下，極易降低分離效率，同時(shí)在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下可對(duì)X精子 產(chǎn)生一定的負(fù)面作用，所以提高抗體的特異性，減少其在X精子上的聚集，有望進(jìn)一步提高 Χ、γ精子分離效率。
[0005] 納米顆粒是尺寸在1~lOOOnm的顆粒，納米顆粒可以將抗體包裹在納米顆粒之中 或吸附在其表面，與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，在細(xì)胞攝取作用下進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)安全高 效的靶向抗體輸送。雄性特異性組織相容性抗原(H-Y抗原)是由Y染色體上的基因編碼，在 雄性動(dòng)物細(xì)胞中普遍表達(dá)(包括Y型精子、胚胎和滋養(yǎng)層細(xì)胞）。目前采用細(xì)胞毒性T淋巴細(xì) 胞檢測(cè)到H-Y抗原有多個(gè)抗原表位即抗原肽，這些肽由染色體上一段特異的DNA編碼，并從 胞內(nèi)蛋白分離出來，由主要組織相容性復(fù)合分子結(jié)合呈遞在細(xì)胞表面。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于牛、羊X/Y精子快速分離的UTY抗體納米顆粒的制 備方法及應(yīng)用。
[0007] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
[0008] -種用于牛、羊X/Y精子快速分離的UTY抗體納米顆粒的制備方法，包括以下步驟：
[0009] 1)構(gòu)建Y精子Η-Y抗原原核表達(dá)系統(tǒng)，所述原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的目的基因?yàn)閁TY基 因的編碼序列；
[0010] 2)利用步驟1)構(gòu)建的Y精子H-Y抗原原核表達(dá)系統(tǒng)制備Y精子UTY抗原重組蛋白；
[0011] 3)利用Υ精子UTY抗原重組蛋白制備抗Υ精子UTY抗原的單克隆抗體；
[0012] 4)將所述單克隆抗體用胃蛋白酶進(jìn)行酶切，然后將酶切得到的UTY抗體的抗原結(jié) 合片段Fab '（ 即UTY抗體的Fab '片段)進(jìn)行分離；
[0013] 5)制備包含F(xiàn)ab'片段的磷酸鈣納米顆粒。
[0014] 所述目的基因采用反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增得到，擴(kuò)增的模板為提取自?；蜓虻木又械?總 RNA〇
[0015] 所述擴(kuò)增采用的引物為：
[0016] 上游引物：5 ' -CAGAATTCACTTGGAAATTTGTTGTT-3 ' ；
[0017] 下游引物：5 ' -ATCTCGAGAAAGAGGTA ATCGTTACA-3 '。
[0018]所述原核表達(dá)系統(tǒng)是以Pet_28a質(zhì)粒與所述目的基因經(jīng)基于限制性內(nèi)切酶EcoR I 及Xho I的雙酶切法構(gòu)建重組載體并轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞而得到。
[0019] 所述步驟4)具體包括以下步驟:將所述單克隆抗體以及胃蛋白酶加入酶切緩沖液 中，并于37 °C酶切1~2h，所述單克隆抗體與胃蛋白酶的質(zhì)量比為80~100:1，利用碘乙酸鈉 終止酶切反應(yīng)后通過柱層析分離得到UTY抗體的Fab '片段。
[0020] 所述步驟5)具體包括以下步驟:將分離得到的UTY抗體Fab'片段加入磷酸鈣納米 顆?；鞈乙褐?，UTY抗體Fab'片段加入的終濃度為80~100yg/mL，然后于20~25°C條件下震 蕩吸附0.5~lh，再于4~8°C條件下震蕩吸附1~2h，得到包含UTY抗體Fab'片段的磷酸鈣納 米顆粒。
[0021] 所述磷酸鈣納米顆?；鞈乙褐械牧姿徕}納米顆粒為針狀，粒徑大小在50~80nm。
[0022] 上述用于牛、羊X/Y精子快速分離的UTY抗體納米顆粒在牛、羊快速擴(kuò)繁中的應(yīng)用。 [0023]本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0024]本發(fā)明利用UTY抗體的Fab'片段與磷酸鈣納米顆粒制備得到UTY抗體靶向納米顆 粒，具有在Y精子表面和進(jìn)入其內(nèi)部進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的能力，從而導(dǎo)致精液中Y精子凝集， 經(jīng)過離心即可得到高比例的X精子的精液。由于1):UTY抗體Fab'片段具有相對(duì)分子質(zhì)量小、 特異性強(qiáng)和免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)；以及2):磷酸鈣具有生物相容性、生物降解性、可吸收性、無 毒廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)。故本發(fā)明具有X、Y精子分離簡單、快速、廉價(jià)及效率高等特點(diǎn)。與現(xiàn)有技術(shù)相 比，本發(fā)明制備以及分離的操作簡單，不需要昂貴的儀器設(shè)備，分離后的精子中X精子的比 例達(dá)到80~95 %，且對(duì)分離得到的X精子損害極小。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明。
[0026] 申請(qǐng)人經(jīng)過嚴(yán)格對(duì)比發(fā)現(xiàn)抗原肽UTY在綿羊、山羊和牛上雄性來源的細(xì)胞同源性 極高，隨后將其編碼基因作為Η-Y抗原的候選基因，該候選基因位于Υ染色體的非重組區(qū)，僅 在雄性組織中表達(dá)。因此，實(shí)驗(yàn)建立了包裹單克隆抗體的納米顆粒平臺(tái)，并將針對(duì)Υ精子高 表達(dá)的UTY抗原具有高度特異性的單克隆抗體(ant i-UTY)的抗原結(jié)合片段Fab'進(jìn)行分離， 然后將其和納米顆粒交聯(lián)形成UTY抗原特異性的單克隆抗體納米顆粒。
[0027] 一.UTY抗體納米顆粒的制備
[0028] 1.克隆UTY基因
[0029] 由于牛、綿羊和山羊之間UTY基因序列高度保守，其編碼區(qū)為3319bp，編碼1079個(gè) 氨基酸。因此，設(shè)計(jì)針對(duì)該基因編碼區(qū)的PCR引物，就可以獲得UTY基因的cDNA。同時(shí)在設(shè)計(jì) 上下游引物時(shí)，添加限制性內(nèi)切酶EcoR I及Xho I雙酶切位點(diǎn)。上游引物為5'-CA GAATTC 八(：11^6厶厶厶1'11^1^61'1'-3'，下游引物為5'-厶了 CTCGAG AAAGAGGTA ATCGTTACA-3'，引物序列 中下劃線部分為酶切位點(diǎn)。用RNA提取試劑盒從綿羊（小尾寒羊，寶雞市麟游縣原種羊場(chǎng)， 2013年10月）、山羊(關(guān)中奶山羊，西北農(nóng)林科技大學(xué)奶山羊場(chǎng)，2013年10月）和牛（中國荷斯 坦種公牛，楊凌法斯特奶牛場(chǎng)，2013年10月）的精子細(xì)胞中提取RNA，純化、稀釋后(分子克隆 實(shí)驗(yàn)指南(第4版））進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，將擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行DNA序列測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種UTY基因序 列同源性達(dá)98%以上，而氨基酸序列無差異，因此，抗體是綿羊、山羊和牛通用的。
[0030] 2.酶切Pet_28a載體并與目的基因相連
[0031]將擴(kuò)增的UTY基因片段用EcoR I及Xho I雙酶切，回收目的片段，與用相同限制性 內(nèi)切酶消化的pET-28a載體片段按摩爾比4:1的比例，在T4DNA連接酶催化下，4°C連接過夜， 然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞，在含卡那霉素25mg/L的LB瓊脂板上置37°C溫育 15h。隨機(jī)挑取單個(gè)克隆，經(jīng)增菌后，提取重組質(zhì)粒(OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒，D6922-01)，用 EcoR I及Xho I雙酶切鑒定。電泳后發(fā)現(xiàn)酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期的完全一致(預(yù)期片段3290bp 和5340bp)。
[0032] 3.重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
[0033]將上述經(jīng)酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞， 挑取單個(gè)克隆，接種于5mL含卡那霉素50mg/L的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。次日以1: 100比例(體積比）分別轉(zhuǎn)接于2mL含卡那霉素50mg/L的LB培養(yǎng)液中，37°C繼續(xù)培養(yǎng)3h，生長 至對(duì)數(shù)期。加入IPTG(異丙基硫代半乳糖苷）至終濃度0.3mmol/L，于30°C條件下誘導(dǎo)培養(yǎng) 3h，再以5000r/min離心3min收菌，收集的菌體lmL加100yL蒸餾水重懸，然后再加100yL的 loading bufTer(SDS凝膠加樣緩沖液)煮沸，然后進(jìn)行SDS-PAGE(5%濃縮膠，12%分離膠）， 鑒定重組質(zhì)粒表達(dá)情況(根據(jù)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第4版），鑒定依據(jù)是蛋白雜交western-blot) 。 通過 western-blot 發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白 大小為llOKDa， 與預(yù)期的大小相符合。 [0034] 4.重組蛋白的純化
[0035]將表達(dá)陽性的原菌液以1:100(體積比）的比例接種于含卡那霉素50mg/L的LB培養(yǎng) 液中，37°C振蕩培養(yǎng)至A6q() = 0.5。取出培養(yǎng)物置室溫冷卻，加入IPTG至終濃度為0.2mmol/L， 于30°C條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)5h。離心（5 000r/min，3min)收菌，加入roS(含0.8%NaCl，0.02% 1((：1，0.144%恥2冊(cè)〇4,0.024%1012?〇4 411 = 7.6)離心漂洗菌體。將菌體沉淀重懸于211^冰預(yù) 冷的裂解