專利名稱：鳥類端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的制作方法
鳥類端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶
本發(fā)明特別地涉及新的重組端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶、編碼它們的核酸分 子、包含所述的核酸分子的細胞以及這些細胞用于生產(chǎn)所需的物質(zhì)的 用途。
在1965年，L， Hayflick發(fā)現(xiàn)細胞具有程序性死亡時刻。作為衰老 的一種解釋，他提出人類細胞可以分裂的次數(shù)是有限的(ExpCellRes， 1965 Mar; 37:614-36)?，F(xiàn)在，這被認為是由端粒在細胞分裂時縮短引 起的。染色體被由保守的、銜接重復(fù)的、非編碼的，六聚體DNA序列 組成的并和單鏈及雙鏈接和蛋白連接的端粒蓋帽。端粒負責(zé)基因組穩(wěn) 定性功能，特別是染色體末端的復(fù)制。成功的染色體末端復(fù)制同時依 賴于獨特的端粒結(jié)構(gòu)和專門的酶端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶，其為一種具有反轉(zhuǎn) 錄酶酶活性的核蛋白質(zhì)。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶能延長端粒重復(fù)陣列，允許 互補子鏈的延長復(fù)制。在缺少端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的細胞中，端粒DNA在 連續(xù)分裂中縮短，因為一旦起始RNA引物被除去后，DNA合成酶不 能完全復(fù)制染色體的末端。許多研究報道了所謂的"端粒鐘"是一個 人類細胞壽命的重要特征。細胞衰老的端粒假說提出端粒的縮短與端 粒酶反轉(zhuǎn)錄酶剩余活性的缺少有關(guān)，并引起染色體不穩(wěn)定性，導(dǎo)致衰 老、凋亡相關(guān)。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶活性在體內(nèi)發(fā)育期間在體細胞譜系中 和在與體外端?？s短相關(guān)的原代細胞中下調(diào)。相反，端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶 活性的上調(diào)或紊亂發(fā)生在轉(zhuǎn)化細胞和腫瘤中?？寺『脱芯苛藖碜詭追N 哺乳動物和一種兩棲動物的端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(TERT) cDNA (Nakamura
等人，1997， Science 277， 955-959; Greenberg等人，1998， Oncogene 16， 1723-1730)。
因為TERT在細胞中的過表達會引起所述的細胞無限增殖，人們 提出了 TERT用于產(chǎn)生細胞系的用途(McSharry等人，2001 JGenVirol， 82， 855-63)。然而，TERT的活性是受物種限制的。例如，人類的TERT 和鳥的端粒維持裝置是不相容的(Michailidis等人，2005， Biochem Biophys Res Commun， 335 (1)， 240-6)。因此，為了研究鳥類和更多
特別是鴨科細胞系，需要可在這些特定細胞中執(zhí)行功能的TERT。
真核細胞系是用于制備病毒疫苗和許多生物技術(shù)產(chǎn)品的基礎(chǔ)。在 細胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的生物制品包括酶、激素、免疫生物制品(單克隆抗 體、白細胞介素、淋巴因子)和抗癌劑。盡管許多較簡單的蛋白可以 使用細菌細胞生成，更復(fù)雜的糖基化蛋白目前必須在真核細胞中制備。
鳥類細胞系特別有用，因為在藥物合成中所用的許多病毒能夠在 其中復(fù)制。更值得注意的是，多種病毒只能在鳥類細胞中生長。例如
修飾的安卡拉病毒(Modified Vims Ankara, MVA)，其不能在大多數(shù) 哺乳動物細胞中生長。七十年代早期，這個來源于痘苗病毒通過超過 500次在CEF中傳代的痘病毒就被用于預(yù)防接種免疫缺陷型人群以抗 天花?，F(xiàn)在，MVA主要用作基因治療和免疫治療目的的載體。例如， MVA用作MUCI基因的載體，用于預(yù)防接種患者以抗表達該抗原的腫 瘤(Scholl等人，2003， JBiomedBiotechnol, 2003， 3， 194-201)。載 有編碼HPV抗原基因的MVA還被用作高度宮頸損傷治療性處理的載 體。近來，MVA己成為用于制備對新出現(xiàn)疾病的預(yù)防性處理劑或可能 的生物武器比如西尼羅河病毒和炭疽的備選載體。
因此，需要一種新的能無限增殖鳥類細胞特別是鴨科細胞的端粒 酶反轉(zhuǎn)錄酶。
在整個申請中使用的"一個(種)"意思是"至少一個(種)"、"至 少第一個(種)"、"一個(種)或多個(種)"或"多個(種)"所提及 的組分或步驟，除非內(nèi)容另有清楚地規(guī)定。例如，"一個細胞"包括多 個細胞，包括其混合物。
本文中任何部分所用的"和/或"包括含義"和"、"或"和"所 有由該詞語連接的要素的所有或任何其他的組合"。
本文使用的"包括"和"包含"指產(chǎn)品、組合物和方法包括提及 組分或歩驟，但并不排除其他的。當(dāng)使用"基本上由……組成"來定 義產(chǎn)品、組合物和方法時，是指排除其他任何具有實質(zhì)意義的組分或 步驟。因此，基本上由所述的組分組成的組合物并不排除痕量污染物 和藥用載體。"由……組成"指排除高于痕量的其他組分或步驟。
本發(fā)明涉及一種分離的，和/或重組多肽，其包括具有與SEQID NO: 1至少60%的氨基酸序列同一性(identity)的氨基酸序列。在本
發(fā)明一個更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明中的多肽包含與SEQ ID NO:l 至少有70%、優(yōu)選地至少80%、甚至更優(yōu)選地至少90%氨基酸序列同 一性的氨基酸序列。在一個更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽包括 SEQIDNO: l中列出的氨基酸序列。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽具有TERT活性，和在 本發(fā)明的更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽的表達可使屬于鴨科的 細胞無限增殖(immortalization)。
本文使用的"分離的"和/或"重組"意思是所指的核酸分子、 DNA、 RNA、多肽或蛋白質(zhì)由人類以該形式制備，從而它們自然的體 內(nèi)細胞環(huán)境中分離。由于人工干預(yù)，本發(fā)明的重組DNA、 RNA、多肽 和蛋白質(zhì)在本文描述的方式下具有它們自然存在的DNA、 RNA、多肽 和蛋白質(zhì)所沒有的用途。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的多肽的分離的核 酸分子。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，編碼本發(fā)明的多肽的核酸分 子包括與如在SEQ ID NO: 2中列出的基本上相同的核苷酸序列。編 碼本發(fā)明的多肽的優(yōu)選的核酸分子包括與如在SEQ ID NO: 2中列出 的相同的核苷酸序列。
本文使用的"基本上相同的核苷酸序列"指與所指的多核苷酸具 有足夠同一性的核酸分子，其在中等嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件下會與所指的核 苷酸雜交。在一個實施方案中，具有基本上與所指的核苷酸序列相同 的核酸分子編碼與SEQIDNO: 1中列出的基本上相同的氨基酸序列。 在另一個實施方案中，具有基本上與所指的核苷酸序列相同的核酸分 子與在SEQ ID NO: 2中列出的核苷酸序列具有至少70%、更優(yōu)選至 少90%、更加優(yōu)選至少95%的同一性。
雜交指核酸的互補鏈(即，正義鏈反義鏈或探針目標(biāo)DNA) 彼此通過類似于染色體DNA中自然存在的鍵的氫鍵結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以容易地改變使目標(biāo)DNA與指定探針雜交的嚴(yán)謹(jǐn)水平。
本文使用的"嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交"指一些條件，在該條件下聚核酸雜交 體是穩(wěn)定的。如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，雜交體的穩(wěn)定性反映在雜交 體的解鏈溫度(Tm)。通常，雜交體的穩(wěn)定性是鈉離子濃度和溫度的
函數(shù)。典型地，所述的雜交反應(yīng)在較低嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下進行，然后在改 變的、較高嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下洗滌。所述的雜交嚴(yán)謹(jǐn)性是指這樣的洗滌條 件。
本文使用的術(shù)語"中等嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交"是指一些條件，該條件允許
目標(biāo)DNA與具有與該目標(biāo)DNA約60%的同一性，優(yōu)選約75%的同一 性，更優(yōu)選為約85%的同一性的互補核酸結(jié)合；與目標(biāo)DNA具有大于 約90%的同一性是特別優(yōu)選的。優(yōu)選地，中等嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件是相當(dāng)于在 42。C下，在50%甲酰胺、5*Denhart's溶液、5 *SSPE、 0.2% SDS下雜 交，接著在65"C下，在0.2*88 ￡， 0.2% SDS下洗滌的條件。
本發(fā)明的核酸分子可以是RNA、 cDNA或基因組序列或混合型。 當(dāng)適當(dāng)時，為了增強在宿主細胞中的表達，其可以包含一個或多個天 然的、異源的(例如兔-球蛋白基因的內(nèi)含子等)或合成來源的內(nèi)含子。
本發(fā)明還涉及載有本發(fā)明的核酸分子的載體。
本文使用的術(shù)語"載體"應(yīng)理解為質(zhì)?；虿《驹吹妮d體，并且任
選地這樣的載體與一種或多種改善所述的載體的轉(zhuǎn)染效率和/或穩(wěn)定
性和/或保護體內(nèi)所述的載體抵御宿主生物免疫系統(tǒng)的物質(zhì)組合。這
些物質(zhì)廣泛地記載在文獻中，是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易得到的(參見例
如Feigner等人，1987， Proc. West. Pharmacol. Soc. 32， 115-121;
Hodgson禾口 Solaiman， 1996, Nature Biotechnology 14， 339-342; Remy
等人，1994， Bioconjugate Chemistry 5， 647-654)。作為例證，但不受
限制，它們可以是聚合物、脂質(zhì)、特別是陽離子脂質(zhì)、脂質(zhì)體、核或
病毒蛋白質(zhì)或中性類脂。這些物質(zhì)可以單獨或組合使用。這些化合物
的實例特別地在專利申請WO 98/08489、 WO 98/17693、 WO 98/34910、
WO 98/37916、 WO 98/53853、 EP 890362或WO 99/05183中可找到。
一個可以想到的組合是質(zhì)粒重組體載體與陽離子脂質(zhì)(DOGS、
DC-CHOL、精胺-膽固醇、精脒-膽固醇等)和中性類脂(DOPE)的組 合。
在本發(fā)明的內(nèi)容中可使用的質(zhì)粒的選擇相當(dāng)多。它們可以是克隆 載體和/或表達載體。通常，它們是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，且其中 很多是市售獲得的，但是也有可能通過基因工程技術(shù)構(gòu)建或修飾它們。 可以提及，例如，來源于pBR322 (GibcoBRL)、 pUC (GibcoBRL)、
pBluescript (Stratagene)、 pREP4、 pCEP4 (Invitrogene)或pPoly (Lathe
等人，1987， Gene 57， 193-201)的質(zhì)粒。優(yōu)選的，在本發(fā)明的內(nèi)容中 所用的質(zhì)粒包含復(fù)制起點，以保證引發(fā)生產(chǎn)細胞和/或宿主細胞中的 復(fù)制(例如，對于要在大腸桿菌中產(chǎn)生的質(zhì)粒可以選擇ColEl起點，如 果期望在哺乳動物宿主細胞中自我復(fù)制，可以選擇oriP/EBNAl體系，
Lupton禾口 Levine， 1985， Mol. Cell. Biol. 5， 2533-2542; Yates等人， Nature 313， 812-815)。其可包括包括在指定細胞中改善其保持和/或 其穩(wěn)定性的另外的元件(促進質(zhì)粒單一性保持的cer序列(Summers 和Sherrat， 1984， Cell 36， 1097-1103)，整合入細胞基因組的序列)。
至于病毒載體，可以想到其來源于下述的載體痘病毒(痘苗病 毒，特別是MVA、金絲雀痘等)、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、a 病毒、泡沫病毒或腺伴隨病毒。優(yōu)選地使用不可復(fù)制的載體。從這點 考慮，腺病毒載體最特別適于進行本發(fā)明。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，根據(jù)本發(fā)明的載體進一歩包 含在宿主細胞中表達本發(fā)明的核酸分子所需元件。
用于表達所需元件包含一組可以允許將核苷酸序列轉(zhuǎn)錄為RNA以 及將mRNA翻譯成多肽的元件，特別是在所述的細胞中有效的啟動子 序列和/或調(diào)節(jié)序列，和任選的對于所述的多肽在目標(biāo)細胞表面分泌 或表達所需的序列。這些元件可能是可調(diào)型的或組成型的。當(dāng)然，所 述的啟動子適于選定的載體及宿主細胞?？梢蕴峒?，例如PGK(磷酸 甘油酸激酶)、MT (金屬硫蛋白；Mclvor等人，1987， Mol. Cell Biol. 7， 838-848)、 a-1-抗胰蛋白酶、CFTR基因的真核啟動子，編碼肌肉肌 酸激酶、肌動蛋白肺表面活性物質(zhì)、免疫球蛋白或3-肌動蛋白基因的 啟動子(Tabin等人，1982， Mol. Cell Biol. 2， 416-436)， SRa (Takebe 等人，1988， Mol. Cell. 8， 466-472)、 SV40病毒(猿猴病毒)早期啟 動子，RSV (勞斯肉瘤病毒)LTR， MPSV啟動子，TK-HSV-1啟動子， CMV病毒(細胞巨化病毒)早期啟動子，痘苗病毒啟動子p7.5KpH5R、 pKlL、 p28、 pll和腺病毒啟動子E1A和MLP或所述的啟動子的組合。 細胞巨化病毒(CMV)早期啟動子是最特別優(yōu)選的。
根據(jù)優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明中的載體進一步包含兩個與包含在 細胞基因組中基因組的天然目標(biāo)DNA序列區(qū)域內(nèi)的序列部分同源的
序列。所述的同源序列的存在允許本發(fā)明的核酸分子通過同源重組位 點特異性插入到目標(biāo)DNA序列中。
術(shù)語"同源重組"指兩個DNA分子在基本上相同的核苷序列位點 之間交換DNA片段。優(yōu)選地，載體中的同源序列與目標(biāo)序列的區(qū)域是 100%同源的。但是，可以使用較低的序列同源性。因此，可以使用的 序列同源性低至約80%。
載體中的同源序列包括至少25bp的載體，較長的區(qū)域是優(yōu)選的， 至少500 bp，更優(yōu)選至少5000 bp。
根據(jù)本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案，所述的核酸分子在載體中 被同源序列包圍。
本文使用的"包圍"指所述的同源序列之一位于本發(fā)明的核酸分 子的上游，所述的同源序列之一位于本發(fā)明的核酸序列的下游。本文 使用的"包圍"不一定指兩個同源序列直接連接至本發(fā)明的核苷酸序 列的3'或5'端，本發(fā)明的核酸分子和同源序列可以被不限定數(shù)目的核苷 酸隔開。
本文使用的"目標(biāo)DNA序列"是用于通過與載體同源重組修飾的 細胞基因組內(nèi)的目標(biāo)區(qū)域。目標(biāo)DNA序列包括結(jié)構(gòu)基因(即，編碼多 肽的DNA序列，在真核生物的情況下包括內(nèi)含子和外顯子)，調(diào)節(jié)序 列比如增強序列，啟動子等及感興趣的基因組內(nèi)的其他區(qū)域。目標(biāo)DNA 序列還可以是一個當(dāng)被載體作為目標(biāo)時對宿主基因組功能沒有影響的 序列。
本文使用的"插入到目標(biāo)DNA序列"廣泛地指導(dǎo)致本發(fā)明的核酸 分子的插入的同源重組過程在目標(biāo)DNA序列中弓I入缺失或破壞。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員能選擇合適的同源序列以將特定的DNA序列 插入到一個細胞的基因組中。例如， 一個同源序列可以與目標(biāo)DNA序 列的一部分同源，另一個同源序列與位于所述的目標(biāo)序列的上游或下 游的DNA序列同源。根據(jù)另一個實施例， 一個同源序列可以與位于所 述的目標(biāo)DNA序列上游的DNA序列同源，另一個同源序列與位于所 述的目標(biāo)DNA序列下游的DNA序列同源。在另一個實施例中，兩個 同源序列都與位于所述的目標(biāo)DNA序列中的序列同源。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，目標(biāo)DNA序列是HPRT
(Hypoxanthine phosphorybosyl transferase,次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶) 基因。
包括疣鼻棲鴨的HPRT啟動子和HPRT基因的基因組序列列在 SEQIDNO: 3中。編碼HPRT的序列起始于在SEQIDNO:3中列出的 核酸序列的8695位點的ATG密碼子，該ATG密碼子上游的序列就是 HPRT啟動子序列。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員能選擇將本發(fā)明的核酸分子整合到HPRT基因 所需的同源序列。如在家族中不同成員之間，編碼HPRT的基因序列 在鳥類間是高度同源的，因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員能設(shè)計靶向其他鳥類 細胞的HPRT基因所需的同源序列。
根據(jù)本發(fā)明一個更優(yōu)選的實施方案，為了將本發(fā)明的核酸分子插 入HPRT啟動子下游，對同源序列進行人為改造(customized)。在該 特定的實施方案中，將本發(fā)明的核酸分子可操作地連接至細胞的內(nèi)源 性HPRT啟動子。在本發(fā)明的內(nèi)容中，"可操作地連接"指核酸分子以 允許其在細胞中表達的方式連接至啟動子。
根據(jù)該特定的實施方案，本發(fā)明的核酸分子上游的同源序列優(yōu)選 地具有與如下核酸序列有至少500個連續(xù)的堿基對(bp)，更優(yōu)選地至 少5000個連續(xù)堿基對的核酸序列同源其起始于在SEQIDNO: 3中 列出的核酸序列的位置1的核苷酸，結(jié)束于該核酸序列的位置8694的 核苷酸，條件是所述的同源序列與起始于在SEQ ID NO: 3中列出的 核酸序列的位置8695的核苷酸，結(jié)束于所述的核酸序列的位置26916 的核苷酸的核酸序列不同源。而且，該上游同源序列優(yōu)選地直接連接 根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的起始密碼子。根據(jù)本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實 施方案，本發(fā)明的核酸分子上游的同源序列包括如下核酸序列起始 于在SEQIDNO:3中列出的核酸序列的位置1383的核苷酸，結(jié)束于所 述的核酸序列的位置8694的核苷酸。例如，根據(jù)本發(fā)明的載體包括包 括如下核酸序列起始于在SEQ ID NO:4中列出的核酸序列的位置1 的核苷酸，結(jié)束于所述的核酸序列的位置11227的核苷酸。本發(fā)明的 核酸分子下游的同源序列優(yōu)選地具有與如下核酸序列有至少500個連 續(xù)的堿基對，更優(yōu)選地至少5000個連續(xù)堿基對的核酸序列同源其起 始于在SEQIDNO: 3中列出的核酸序列的位置10581的核苷酸，結(jié)
束于所述的核酸序列的位置17800的核苷酸。而且，更優(yōu)選地，本發(fā) 明的核酸分子下游的所述的同源序列包括如下核酸序列起始于在
SEQ ID NO:3中列出的核酸序列的位置10581的核苷酸，結(jié)束于所述 的核酸序列的位置17800的核苷酸。
根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的載體包括第一選擇標(biāo)記，其 中該第一選擇標(biāo)記為陽性選擇標(biāo)記，且其中所述的第一選擇標(biāo)記和本 發(fā)明的核酸分子位于所述的載體中相同區(qū)段，所述的區(qū)段由同源序列 分界(delimited )。
本文使用的術(shù)語"陽性選擇標(biāo)記"特別地指編碼只有含該基因的 細胞才能在一定條件下存活和/或生長的產(chǎn)物的基因。典型的選擇標(biāo) 記編碼對抗生素或其它毒素有抗性的蛋白質(zhì)，所述的抗生素或其它毒 素例如例如氨芐西林、新霉素、甲氨蝶呤或四環(huán)素，互補營養(yǎng)缺陷型 或提供不能從復(fù)合培養(yǎng)基中獲得的重要營養(yǎng)素。在根據(jù)本發(fā)明的一個 優(yōu)選的實施方案中，第一選擇標(biāo)記編碼對抗生素有抗性的蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案，載體中的第一選擇標(biāo)記被 抑制該標(biāo)記的序列包圍。所述的抑制第一選擇標(biāo)記的序列不包圍本發(fā) 明的核酸分子。當(dāng)載體為環(huán)狀時，抑制第一選擇標(biāo)記的序列、第一選 擇標(biāo)記和本發(fā)明的核酸分子位于轉(zhuǎn)移載體的相同區(qū)段中，所述的區(qū)段 由同源序列分界。
抑制核酸片段的序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(Nunes-Duby， S 等人(1998) Nucleic Acids Res. 26:391-406)。這些序列可以被一個或 多個特異性的酶識別，所述的酶誘導(dǎo)包含在所述的序列之間的核酸的 抑審U，這些酶被稱為"重組酶"。例如，三種熟知的抑制核酸片段的重 組酶為FLP、 ISCEI和Cre重組酶。
典型的位點特異性重組酶是Cre重組酶。Cre是噬菌體Pl的cre (環(huán)化重組)基因的38-kDa產(chǎn)物，并且是Int家族的位點特異性DNA 重組酶。Sternberg, N.等人，(1986) J. Mol. Biol. 187: 197-212。 Cre 識別Pl基因組中被稱為loxP (Pl的X-over基因座)的34bp位點，并 有效地催化成對loxP位點間的交互(reciprocal)保守的DNA重組。loxP 位點由8bp的非回文核心區(qū)域(nonpalindromic core region)兩偵U的兩 個13bp反向重復(fù)序列組成。在兩個直接重復(fù)的loxP位點之間的Cre-
介導(dǎo)的重組導(dǎo)致它們之間的DNA以共價閉合環(huán)的形式被切除。反向成
對的loxP位點之間的Cre介導(dǎo)的重組將導(dǎo)致其間的DNA倒位而非切 除。DNA的斷裂和連接限制在核心區(qū)域中不連續(xù)的位置，并且每次在 鏈上與所述的酶以瞬時磷酸酪氨酸DNA-蛋白連接方式進行。
另一個位點特異性重組酶是I-Scel。其它的內(nèi)含子歸巢核酸內(nèi)切 酶，例如I-Tlil、 I-Ceul、 I-Crel、 I-Ppol禾fl PI-PspI也可以被I-Scel代 替。許多被Belfort和Roberts列出((1997) Nucleic Acids Research 25:3379-3388)。許多這些核酸內(nèi)切酶源自細胞器基因組，其中所用密 碼子與標(biāo)準(zhǔn)的核密碼子不同。為了使用這樣的基因用于它們的核酸內(nèi) 切酶的核表達，可能需要改變編碼序列以匹配核基因。I-Scel是一個切 割其識別位點內(nèi)的DNA的雙鏈核酸內(nèi)切酶。I-Scel產(chǎn)生一個含有3'OH 懸突的4bp交錯切口。
所述的酶I-Scel具有一個已知的識別位點。I-Scel的識別位點是一 個超過18bp的不對稱序列。
5' TAGGGATAACAGGGTAAT3'
3' ATCCCTATTGTCCCATTA5'
因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，抑制第一選擇標(biāo)記的 序列包括I-Scel的識別位點。
另一個位點特異性重組酶是FLP重組酶。Flp重組酶識別一個特殊 的34-bp最小位點，該位點只容許其識別序列有限的簡并(Jayamm， 1985; Senecoff等人，1988)。已經(jīng)研究了 Flp重組酶和FRT序列之間 的相互作用(Panigmhi等人，1992)。 Jayaram (1985)和Senecoff等 人(1988)給出了不同F(xiàn)RT序列的實例，Snaith等人描述了用于在不 同底物上的Flp-介導(dǎo)重組的測定(1996)。
在一個特別的實施方案中，當(dāng)本發(fā)明的載體包括抑制第一選擇標(biāo) 記的序列時，所述的載體可以有利地包含第一同源序列A和第二同源 序列B，其中同源序列A和B具有便于在它們之間進行同源重組的足 夠的長度和足夠的同源性。關(guān)于同源序列A和B，"足夠的同源性"優(yōu) 選地指這些同源序列中在至少20個堿基對，優(yōu)選至少50個堿基對， 尤其優(yōu)選至少100個堿基對，特別尤其優(yōu)選250個堿基對，最優(yōu)選至 少500個堿基對的長度上，具有至少70%，優(yōu)選80%，優(yōu)選至少90%，
尤其優(yōu)選至少95%，非常尤其優(yōu)選至少99%，最優(yōu)選至少100%的同源 性。在該實施方案中，本發(fā)明中的載體在5'-至3'-方向在本發(fā)明的核酸
分子后包括如下部分第一同源序列A、抑制第一選擇標(biāo)記的序列、
第一選擇標(biāo)記、抑制第一選擇標(biāo)記的序列和同源序列B。
根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的載體包含沒有被所述的同源 序列包圍的第二選擇標(biāo)記，其中所述的第二選擇標(biāo)記為陰性選擇標(biāo)記。 當(dāng)本發(fā)明的載體是環(huán)狀時，所述的第二選擇標(biāo)記特別有用。當(dāng)所述的 載體為環(huán)狀時，第二選擇標(biāo)記不被所述的同源序列包圍的情形指第二 選擇標(biāo)記和本發(fā)明的核酸分子沒有位于轉(zhuǎn)移載體的相同區(qū)段，所述的 區(qū)段由同源序列分界。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，其中本發(fā)明的載體包括第三 選擇標(biāo)記，其中所述的第三選擇標(biāo)記為陰性選擇標(biāo)記，并且其中所述 的第三選擇標(biāo)記位于抑制第一選擇標(biāo)記的序列之間。當(dāng)所述的載體為 環(huán)狀時，第三選擇標(biāo)記位于抑制第一選擇標(biāo)記的序列之間的情形指第 三選擇標(biāo)記和第一選擇標(biāo)記位于轉(zhuǎn)移載體的相同區(qū)段，所述的區(qū)段由 抑制第一選擇標(biāo)記的序列分界。
本文使用的術(shù)語"陰性選擇標(biāo)記"特別地指編碼在一定條件下殺 死載有該基因的細胞的產(chǎn)物的基因。這些基因特別地包括"自殺基因"。 由這些基因編碼的產(chǎn)物能轉(zhuǎn)化細胞毒素化合物中的藥物前體。許多自 殺基因/藥物前體對是目前可獲得的?？梢愿貏e地提及以下自殺基
因/藥物前體對
-I型單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-I TK)和阿昔洛韋或更昔洛韋 (GCV) (Camso等人，1993 ，P腦.Natl. Acad. Sci. USA 90， 7024-7028; Culver等人，1992， Science 256， 1550-1552; Ram等人，1997， Nat. Med. 3， 1354-1361);
-細胞色素p450和環(huán)磷酰胺(Wei等人，1994， Human Gene Therapy 5， 969-978);
-來自大腸桿菌(E. coli)的嘌呤核苷磷酸化酶和6-甲基嘌呤脫氧 核糖核苷(Sorscher等人，1994， Gene Therapy 1 ， 233-238);
-來自大腸桿菌(E. coli)的鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶和6-硫代黃 嘌呤(Mzoz和Moolten， 1993， Human Gene Therapy 4 ， 589-595)禾口
-胞嘧啶脫氨酶(CDase)及5-氟胞嘧啶(5FC)。
-FCU1和5-氟-胞嘧啶 (5FC) (W09954481)。
-FCU1-8和5-氟-胞嘧啶(5FC) (WO2005007857)。
第一、第二、第三選擇標(biāo)記可以單獨使用。例如，本發(fā)明的載體 可包含第一和第三選擇標(biāo)記但不包含第二選擇標(biāo)記，或者包含第二和 第三選擇標(biāo)記但不包含第一選擇標(biāo)記。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，將第一、第二和/或第三選 擇標(biāo)記置于其在宿主細胞中表達所需元件的調(diào)控下。
表達所需元件由一組允許核苷酸序列轉(zhuǎn)錄為RNA和將mRNA翻 譯成多肽的元件組成，特別是在所述的細胞中有效的啟動子序列和/ 或調(diào)節(jié)序列，和任選的對于所述的多肽在宿主細胞表面分泌或表達所 需的序列。這些元件可能是可調(diào)型的或組成型的。當(dāng)然，所述的啟動 子適于選擇的載體及宿主細胞?？梢蕴峒埃鏟GK (磷酸甘油酸激 酶)、MT(金屬硫蛋白；Mclvor等人，1987， Mol. Cell Biol. 7， 838-848)、 a-l-抗胰蛋白酶、CFTR基因的真核啟動子，編碼肌肉肌酸激酶、肌動 蛋白肺表面活性物質(zhì)、免疫球蛋白或P-肌動蛋白基因的啟動子(Tabin 等人，1982， Mol. CellBio1.2， 416-436)， SRa (Takebe等人，1988， Mol.Cell. 8， 466-472)、 SV40病毒(猿猴病毒)早期啟動子，RSV (勞 斯肉瘤病毒)LTR， MPSV啟動子，TK-HSV-1啟動子，CMV病毒(細 胞巨化病毒)早期啟動子，痘苗病毒啟動子p7.5KpH5R、 pKlL、 p28、 pll和腺病毒啟動子E1A和MLP或所述的啟動子的組合。細胞巨化病 毒(CMV)早期啟動子是最特別優(yōu)選的。
本發(fā)明還涉及一種被根據(jù)本發(fā)明的核酸分子或載體轉(zhuǎn)染的細胞， 以及來源于此的細胞。本文使用的術(shù)語"來源于"指從根據(jù)本發(fā)明的 核酸分子轉(zhuǎn)染的細胞中發(fā)育或分化的細胞或?qū)⑵渥鳛樽嫦鹊募毎?br> 本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的多肽、核苷酸分子和載體用于細胞無 限增殖的用途。
本發(fā)明還涉及一種包括本發(fā)明的核酸分子的細胞，其中所述的核 酸分子可操作地連接到該細胞的內(nèi)源HPRT啟動子。"可操作地連接" 指核酸分子以允許其在細胞中表達的方式連接至啟動子。在一個優(yōu)選 的實施方案中，本發(fā)明的細胞包括在SEQIDNO:4中列出的核酸序列。
本發(fā)明還涉及一種用于細胞無限增殖的方法，包括將根據(jù)本發(fā)明 的載體轉(zhuǎn)入所述的細胞的步驟。
本文使用的無限增殖的細胞指一種能在培養(yǎng)中超過35次傳代生長 的細胞。
術(shù)語傳代次數(shù)指為了保持細胞以足夠低的密度來刺激進一步生 長，將細胞群從培養(yǎng)瓶中遷移并進行繼代培養(yǎng)(傳代)過程的次數(shù)。
本文使用的術(shù)語"轉(zhuǎn)染"指本發(fā)明的細胞的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染或瞬時轉(zhuǎn)染。
術(shù)語"穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染"或"穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的"指將外源DNA引入和整合 到轉(zhuǎn)染細胞的基因組中。術(shù)語"穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子"指具有將外源DNA穩(wěn) 定地整合到基因組DNA中的細胞。
術(shù)語"瞬時的轉(zhuǎn)染"或"瞬時轉(zhuǎn)染的"指將外源DNA引入到細胞 中，其中所述的外源DNA未能整合到轉(zhuǎn)染細胞的基因組中。所述的外 源DNA在轉(zhuǎn)染細胞的核中維持幾天。術(shù)語"瞬時轉(zhuǎn)染子"指具有引入 外源DNA但未能整合該DNA的細胞。
根據(jù)本發(fā)明中的一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的細胞源自鳥類細 胞，更優(yōu)選地源自鴨科(Anatidae)或雉科(Phasianidae)的細胞。在 鴨科中，屬于棲鴨屬(Cairina genus)或鴨屬(Anas genus)的細胞是 特別優(yōu)選的。更加優(yōu)選屬于疣鼻棲鴨種(CwW"fl mo"/wto)或?qū)儆诰G 頭鴨種U，spAa(yr/z，c/zay)的本發(fā)明的細胞。
優(yōu)選地，本發(fā)明的細胞源自胚胎生物。從活生物中分離細胞的方 法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，可以使用實施例2中公開的方法。 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，所述的原代細胞是從屬于0至20 天，更優(yōu)選5至15天，甚至更優(yōu)選的11到至14天的鴨科的胚胎中分 離的。
當(dāng)在本發(fā)明的方法中所用的載體包含第一選擇標(biāo)記時，第一選擇 標(biāo)記的整合允許對包含本發(fā)明的核酸分子的細胞進行選擇。因此，根 據(jù)本發(fā)明的方法可以進一步包括下述步驟將所述的細胞在僅允許包 含第一選擇標(biāo)記的細胞生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。例如，在包括抗生素的 培養(yǎng)基中。
當(dāng)在本發(fā)明的方法中所用的載體包括抑制第一選擇標(biāo)記的序列
時，根據(jù)本發(fā)明的方法可以進一歩包括以下步驟抑制來自所述的原 代細胞的基因組的第一選擇標(biāo)記。為了抑制所述的第一選擇標(biāo)記，用 編碼特異性抑制第一選擇標(biāo)記的重組酶的基因轉(zhuǎn)染所述的細胞。將所 述的基因轉(zhuǎn)入細胞的方法和載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，可 以使用在本申請的實施例4中公開的方法。
當(dāng)在本發(fā)明的方法中使用的載體包括第二選擇標(biāo)記時，根據(jù)本發(fā) 明的方法可以其進一歩包括下述步驟將所述的細胞僅允許不包含第 二選擇標(biāo)記的細胞生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所述的步驟可以與將所述的 細胞在只允許加入第一選擇標(biāo)記的細胞生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的步驟同 時進行或分別進行。
當(dāng)在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的載體是環(huán)狀時，所述的第二選擇 標(biāo)記特別有用。所述的第二選擇標(biāo)記的存在可以使同源重組過程中引 入了不包括本發(fā)明的核酸分子的轉(zhuǎn)移載體區(qū)段的細胞不能存活。
當(dāng)在本發(fā)明的方法中使用的載體包括第三選擇標(biāo)記時，根據(jù)本發(fā) 明的方法可以進一步包括將所述的細胞在不允許包括第三選擇標(biāo)記的 細胞生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的歩驟。例如，不允許包含作為第三選擇標(biāo) 記的FCU1的細胞生長的培養(yǎng)基，其包含5-氟胞嘧啶。
該步驟允許選擇存在抑制第一選擇標(biāo)記的細胞。這意味著包括抑 制第一選擇標(biāo)記的步驟也將導(dǎo)致抑制第三選擇標(biāo)記。第三選擇標(biāo)記的 存在可以使存在第一選擇標(biāo)記的細胞不能存活。
本發(fā)明更特別地涉及，但不限于細胞無限增殖的方法，其包括下 述步驟
-將包括下述組分的載體轉(zhuǎn)入細胞
被同源序列包圍的根據(jù)本發(fā)明的核酸分子。
第一選擇標(biāo)記，其中所述的第一選擇標(biāo)記是一個陽性選擇標(biāo) 記，且其中所述的第一選擇標(biāo)記被所述的同源序列包圍。
能抑制第一選擇標(biāo)記的序列。
第二選擇標(biāo)記，其不被所述的同源序列包圍，其中所述的選 擇標(biāo)記為陰性選擇標(biāo)記。
第三選擇標(biāo)記，其中所述的第三選擇標(biāo)記為陰性選擇標(biāo)記， 并且其中所述的第三選擇標(biāo)記位于抑制第一選擇標(biāo)記的序列之間。
-將所述的細胞在只允許包含第一選擇標(biāo)記的細胞生長的培養(yǎng)基中 培養(yǎng)。
-將所述的細胞在不允許包含第二選擇標(biāo)記的細胞生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
-從所述的細胞的基因組中除去第 一選擇標(biāo)記。
-將所述的細胞在不允許包括第三選擇標(biāo)記的細胞生長的培養(yǎng)基中 培養(yǎng)。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種無限增殖的細胞， 其來源于屬于疣鼻棲鴨種的動物細胞，并且其包括疣鼻棲鴨端粒酶反
轉(zhuǎn)錄酶，該反轉(zhuǎn)錄酶插入到該細胞的HPRT基因中，并受疣鼻棲鴨HPRT
啟動子調(diào)控。
本發(fā)明的細胞還可以進一步包括一個或多個允許缺損病毒繁殖的 核酸序列。"缺損病毒"指其中其復(fù)制所需一個或多個病毒基因被刪除 或喪失功能的病毒。術(shù)語"允許缺損病毒繁殖的核酸序列"指以反式 方式提供缺陷病毒生長復(fù)制功能的核酸序列。換言之，所述的核酸序 列編碼所述的缺損病毒復(fù)制和殼體化所需的蛋白質(zhì)。作為例證，為了 產(chǎn)生缺少大部分E1區(qū)域的腺病毒載體，可以用一個編碼E1區(qū)域的核 酸序列瞬時或永久轉(zhuǎn)染本發(fā)明的細胞。
本發(fā)明的細胞也可以包括編碼所需的物質(zhì)的核酸序列。本文使用 的所需的物質(zhì)可以包括，但不限于藥學(xué)活性蛋白質(zhì)，例如生長因子、 生長調(diào)節(jié)劑、抗體、抗原、用于免疫或疫苗接種等的其衍生物、白介 素、胰島素、G-CSF、 GM-CSF、 hPG-CSF、 M-CSF或其組合，干擾素 例如干擾素-cu干擾素-P、干擾素-，凝血因子例如因子VIII、因子IX 或tPA或其組合。"所需的物質(zhì)"還指工業(yè)酶，例如用于紙漿和紙中、 紡織品改良或酒精生產(chǎn)中的酶。最后，"所需的物質(zhì)"還指用于動物飼 養(yǎng)的蛋白質(zhì)補充物或增值產(chǎn)物。
通過根據(jù)本發(fā)明的方法得到的細胞，本發(fā)明的細胞和由其獲得的 細胞對病毒復(fù)制特別有用。所述的病毒可以是活的、減毒的、重組的 或非重組的。更優(yōu)選地，所述的細胞對痘病毒(痘苗病毒，特別是MVA、 金絲雀痘病毒等)、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、a病毒、泡沫病
毒或腺病毒相關(guān)病毒的復(fù)制特別有用。
逆轉(zhuǎn)錄病毒具有感染的性質(zhì)，并且在大多數(shù)情況下整合到分裂細 胞中，在這方面，其特別適合于癌癥相關(guān)的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的重組 逆轉(zhuǎn)錄病毒通常包含LTR序列、殼體化區(qū)域和根據(jù)本發(fā)明所述的核苷
酸序列，所述的核苷酸序列受逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR或體內(nèi)啟動子比如如下 所述的那些啟動子的調(diào)控。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可包含修飾，特別是LTR (用真核啟動子替換啟動子區(qū)域)或殼體化區(qū)域(用異源殼體化域比 如VL30型替換)(參見法國申請94 08300和97 05203)。
腺病毒載體可能缺少用于復(fù)制所必需的區(qū)域的全部或至少一部 分，所述的區(qū)域選自E1、 E2、 E4禾QL1 L5區(qū)i或。El區(qū)域的缺失是優(yōu) 選的。然而，其可以與特別地影響E2、 E4和/或L1L5區(qū)域的全部或 部分的(一個)其它的修飾/缺失組合。作為例證，El區(qū)域的主要部 分和E4轉(zhuǎn)錄單元的缺失是特別有利的。為了增加克隆量，腺病毒載體 還可以缺少非必需的E3區(qū)域的全部或一部分。根據(jù)另一個替代實例， 有可能使用最小的保留殼體化必需序列的腺病毒載體，即，5'和3'ITRs (Inverted Terminal Repeat,末端反向重復(fù))和殼體化區(qū)域。多種腺病 毒載體和用于制備它們的技術(shù)是已知的(參見，例如，Graham和 Prevect， 1991， in Methods in Molecular Biology, Vol 7， p 109 128; Ed: E. J. Murey， The Human Press Inc)。
痘病毒家族包括脊索動物痘病毒亞科(Chordopoxvirus)和昆蟲痘 病毒亞科的病毒。在這些中，根據(jù)本發(fā)明的痘病毒優(yōu)選自正痘病毒屬、 副痘病毒屬、禽痘病毒屬、羊痘病毒屬、兔痘病毒屬、豬痘病毒、軟 疣痘病毒屬、亞塔痘病毒。根據(jù)一個更優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的痘 病毒為正痘病毒屬。
所述的正痘病毒屬優(yōu)選地為痘苗病毒，更優(yōu)選修飾的痘苗病毒安 卡拉(vaccinia vims Ankara, MVA)，特別是MVA 575 (ECACC V00120707)和MVA-BN (ECACC V00083008)。
術(shù)語"重組體病毒"指包括插入其基因組中的外源序列的病毒。 本文使用的外源序列指不是天然存在于母體病毒中的核酸。
在一個實施方案中，所述的外源序列編碼具有直接的或間接的細 胞毒素功能的分子。"直接的或間接的"細胞毒素指由外源序列編碼的
分子本身可能是有毒性的(例如蓖麻毒、腫瘤壞死因子、白細胞介素-2、 干擾素-Y、核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶、假單胞菌外毒素A)，或者 其可以被代謝形成有毒的產(chǎn)物，或者其可以作用于其他物質(zhì)形成有毒
的產(chǎn)物。蓖麻毒cDNA的序列公開在Lamb等人的(Eur. J. Biochem.， 1985， 148， 265-270)中，將其引入作為參考。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述的外源序列為自殺基因。 自殺基因編碼能將相對無毒的藥物前體轉(zhuǎn)化成有毒的藥品的蛋白質(zhì)。 例如，酶胞嘧啶脫氨酶將5-氟胞嘧啶(5FC)轉(zhuǎn)化成5-氟尿嘧啶(5FU) (Mullen等人，(1922) PNAS 89， 33);單純性皰疹酶胸苷激酶致敏 要用抗病毒藥更昔洛韋(GC V )或阿昔洛韋處理的細胞(Moolten (1986) Cancer Res. 46， 5276; Ezzedine等人(1991 ) New Biol 3， 608)?？梢?使用任一種生物的胞嘧啶脫氨酶，例如大腸桿菌或釀酒酵母。
因此，在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案中，所述的基因編碼具 有胞嘧啶脫氨酶活性的蛋白質(zhì)，甚至更優(yōu)選如在專利申請 WO2005007857和W09954481中描述的蛋白質(zhì)。
在一個進一步的實施方案中，所述的外源基因編碼能切割目標(biāo) RNA或DNA的核酶。要切割的目標(biāo)RNA或DNA可以是細胞功能所 必需的且其切割引起細胞死亡的RNA或DNA，或者要切割的RNA或 DNA可以是編碼不想要的蛋白質(zhì)例如致癌基因產(chǎn)物且該RNA或DNA 的切割可預(yù)防細胞癌變的RNA或DNA。
在一個更進一步的實施方案中，所述的外源基因編碼反義RNA。 "反義RNA"指如下的RNA分子其雜交至編碼蛋白質(zhì)的mRNA 分子和干擾其表達，或者雜交至細胞內(nèi)的另一個RNA分子，比如 pre-mRNA或tRNA或rRNA，或者雜交至基因和干擾其表達。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的外源序列代替目標(biāo)細胞中 有缺陷的基因的功能。存在數(shù)千個包括人類的哺乳動物由缺陷基因引 起的遺傳疾病。這樣的遺傳性疾病的實例包括囊性纖維化，其中已知 存在CFTR基因突變；迪謝內(nèi)肌營養(yǎng)不良，其中已知存在肌營養(yǎng)不良 蛋白基因突變；鐮狀紅細胞病，其中已知存在HbA基因突變。許多類 型的癌癥由有缺陷的基因引起，尤其是原癌基因和已經(jīng)進行突變的腫 瘤抑制基因。
原癌基因的實例為ms、 src、 bcl等；腫瘤抑制基因的實例為p53 和Rb。
在本發(fā)明的一個進一步的實施方案中，所述的外源序列編碼腫瘤 相關(guān)抗原(TAA)。 TAA指在腫瘤細胞中比在相同組織類型的非腫瘤細 胞中以較高頻率或密度檢測到的分子。TAA的實例包括，但不限于 CEA、 MART-1、 MAGE-1、 MAGE-3、 GP-IOO、 MUC-1、 MUC-2、點 突變的ras致癌基因、正?；螯c突變的p53、過表達的p53、 CA-125、 PSA、 C-erb / B2、 BRCAI、 BRCAII、 PSMA、酪氨酸酶、TRP-1、 TRP-2、 NY-ESO-l、 TAG72、 KSA、 HER-2 / neu、 bcr陽abl、 pax3-fkhr、 ews-fli-l、 存活的(surviving)和LRP。根據(jù)更優(yōu)選的實施方案，所述的TAA為 MUC1。
所述的重組體病毒可以包括多于一種外源序列，并且各個外源序 列可以編碼多于一個分子。例如，在同一個重組體痘病毒中，將編碼 TAA的外源序列和編碼細胞因子的外源序列聯(lián)合起來是有用的。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的外源基因編碼抗原。本文 使用的"抗原"指可以通過抗體結(jié)合的配體；抗原本身不必是免疫原 性的。
優(yōu)選地，所述的抗原來源于病毒，例如HIV-1、(比如gp 120或gp 160)、貓科免疫缺陷病毒的任何一種、人類或動物皰疹病毒比如gD或 其衍生物或即刻早期蛋白(Immediate Early protein)比如來自HSV1或 HSV2的ICP27、細胞巨化病毒(比如gB或其衍生物)、水痘帶狀皰疹
病毒(比如gpi、 n或m)、或者來自肝炎病毒比如乙型肝炎病毒例如
乙型肝炎表面抗原或其衍生物、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒(優(yōu)選
地來自基因型lb菌株ja的非結(jié)構(gòu)蛋白)和戊型肝炎病毒、或者來自其 它病毒病原體比如呼吸道合胞病毒、人乳頭狀瘤病毒(優(yōu)選來自HPV16 菌株的E6和E7蛋白質(zhì))或流感病毒，或來源于細菌性病原體比如沙 門氏菌、奈瑟氏菌、包柔氏螺旋體(例如OspA或OspB或其衍生物)、 或衣原體、或博德特氏菌例如R69、 PT禾卩FHA、或來源于寄生物比如 變形體或弓形體。
圖l:包括編碼端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的基因的載體。
圖2:編碼端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的基因位點特異性插入HPRT基因的圖
不。
圖3:從通過本發(fā)明的方法獲得的無限增殖細胞的基因組中除去第 一和第三選擇標(biāo)記的圖示。
實施例
實施例1:端粒酶表達系統(tǒng) 隨機插入
為達到此目的，使用與鴨基因組無特異性序列同源性的質(zhì)粒(

圖1)。
目標(biāo)插入
構(gòu)建包括與包圍疣鼻棲鴨端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因的疣鼻棲鴨HPRT 基因同源的兩個5kb片段和兩種選擇標(biāo)記的質(zhì)粒。選擇編碼次黃嘌呤 鳥嘌呤磷?；D(zhuǎn)移酶的HPRT基因作為用于組成型表達疣鼻棲鴨端粒 酉每的合適4立點(adequate site )。
這兩個選擇標(biāo)記為在CMV啟動子(Thomsen等人，P.N.A.S. 1984， 81， 3:659-63)調(diào)控下的FCU1基因(Erbs等人，Cancer Res. 2000， 15， 60， 3813-22)和在SV40啟動子調(diào)控下的新霉素抗性基因。新霉素耐 藥性和FCU-1表達盒(expression cassette)被See 1切割位點包圍，以 允許從最終細胞系中除去的選擇盒(cassettes)。將由RSV啟動子驅(qū)動 的編碼HSVTK的選擇標(biāo)記插入HPRT基因臂之外(圖2)。
實施例2:從12只老的疣鼻棲鴨卵中制備批量CEC以及對亞群的 描述。
將25只受精的SPF卵在37.5"C培養(yǎng)。在按照可獲得的實驗方案培 養(yǎng)12天后，卵張開。
剁碎23只胚胎，在磷酸鹽緩沖鹽水-Dulbecco (PBS)中洗滌一次， 并在室溫下，在TrypLE Select (Invitrogen)中分離5小時。
在低速離心后，將細胞再懸浮在補充有10%的胎牛血清(FCS)、 慶大霉素0.04 g/L的Eagle基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MBE)中，接種在500cm2的 培養(yǎng)瓶(triple flask)中，并在37。C， 5%(302下培養(yǎng)。
在24小時后，使用TrypLE Select (5mL/培養(yǎng)瓶)從燒瓶中除去 融合細胞，將部分該細胞再接種在175ci^的燒瓶中用于第二次傳代。
將剩余細胞以107細胞/ mL濃縮在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基(60% BME、 30% FCS和10。/。DMSO)中，并在用液氮中轉(zhuǎn)移之前在-8(TC冷凍于異丙醇 (isopropyl alcool)調(diào)節(jié)的容器(NALGENE. . "Mr. Frosty" 1°C frezing. Container)中，用于長期儲存，構(gòu)成原始細胞儲存庫(50x1， 5.107細胞/小瓶，44xl.l()7細胞/小瓶)。
保留在培養(yǎng)基中細胞按傳統(tǒng)傳代至多達18代，在3個第一次傳代 期間，通過低離心條件培養(yǎng)基收集非附著細胞，再接種和按照與初始 培養(yǎng)相同的方法進一步傳代。
在培養(yǎng)物的生存期中，可重復(fù)地分離表現(xiàn)出不同的形態(tài)特征的亞群。
實施例3:轉(zhuǎn)染的方法
本領(lǐng)域己知大量將表達所需的核苷酸序列的載體引入的轉(zhuǎn)染的方 法。下面非限制性的列出這些方法CaP04沉淀法、電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn) 染法(lipofectin)。給出的實施例是基于CaP04沉淀過程。
細胞應(yīng)當(dāng)約80-50%融合。在CaP04 / DNA加入前兩小時更換培養(yǎng) 基。將30 u g的DNA再懸浮在31 u 1的2M CaCl2 161.3 mM Tris pH 7.6 中。加水至最終體積為0.5ml。
每次轉(zhuǎn)染，將0.5 ml的2x HEBS分配在15 ml無菌Falcon管中， 滴加DNA溶液，同時輕輕地震蕩所述的DNA溶液或向其中通氣。該 溶液將變成乳狀。在室溫下靜置該混合物10-30分鐘。然后，在組織培 養(yǎng)箱中用無菌吸量管使吸量管進出一次以打碎薄片(flakes),并滴加 于細胞。然后，在37。C，培養(yǎng)細胞6小時至過夜。良好的沉淀物將覆 蓋細胞表面。為了完成轉(zhuǎn)染過程，將甘油休克溶液加熱至37°C。抽吸 出培養(yǎng)基，加入5mlBME以洗滌細胞層，然后，抽吸出培養(yǎng)基，用2 分鐘或更短時間加入1 ml甘油休克溶液。接著，緩慢地加入10 ml BME 以稀釋甘油，并完全除去BME-甘油。然后，加入10ml所需的培養(yǎng)基 (desiredmedium),在適當(dāng)?shù)逆@度下?！凤@平皿。
實施例4:選擇方法
隨機插入
在轉(zhuǎn)染后48小時施加選擇壓用TrypLE Select分離細胞，低速 離心并再接種在具有FCS 10%和G418 800 u g / mL的BME中。
連續(xù)傳代細胞直至可以分離單個生長克隆。分離和擴增繁殖源
(multiplying foci)，然后用TRAPeze XL端粒酶檢測試劑盒(S7707, Chemicon)定量端粒酶活性以及用Southern印跡分析確定在目標(biāo)特異 性基因座中的整合。 目標(biāo)插入
在轉(zhuǎn)染后48小時施加選擇壓用TrypLE Select分離細胞，低速離 心并再接種在具有FCS 10%、更昔洛韋25 u g / mL和G418 800 y g / mL的BME中。
連續(xù)傳代細胞直至可以分離單個生長克隆。分離和擴增繁殖源， 然后用TRAPeze⑧XL端粒酶檢測試劑盒(S7707, Chemicon)定量端 粒酶活性以及用Southern印跡寡核苷酸分析確定在目標(biāo)特異性基因座 中的整合。
接著，按如下所述的方法，用大范圍核酸酶(meganuclease) I-Scel 表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染具有檢測到恢復(fù)的端粒酶活性并且目標(biāo)HPRT基因座有 整合的細胞克隆。
為選擇去除選擇標(biāo)記的細胞，在轉(zhuǎn)染后48小時應(yīng)用5-氟胞嘧啶 (5-FC):用TrypLE Select分離細胞，低速離心并再接種在培養(yǎng)基中， 所述的培養(yǎng)基含有濃度范圍為10—3至10—7 M的5-FC，并維持G418選 擇(具有FCS 10%、 5隱FC和G418 800 P g / mL的BME)。
權(quán)利要求
1.一種分離的或重組多肽，其包括具有與SEQ ID NO1至少60％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
2. —種分離的或重組多肽，其包括具有與SEQIDNO: 1至少70%的氨基酸序列同一性的氮基酸序列。
3. —種分離的或重組多肽，其包括具有與SEQIDNO: 1至少80%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
4. 一種分離的或重組多肽，其包括具有與SEQIDNO: 1至少90%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
5. —種分離的多肽，其包括如在SEQ ID NO: l中列出的氨基酸 序列。
6. —種分離的或重組核酸分子，其編碼如權(quán)利要求1至5中任一 項所述的多肽。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的核酸分子，其中所述的核酸序列 包括基本上如在SEQIDNO: 2中列出的核酸序列。
8. 載有如權(quán)利要求6或7中任一項所述的核酸分子的載體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的載體，其中所述的載體包括兩個與目標(biāo) DNA序列同源的序列。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的載體，其中所述的核酸分子被所述的同 源序列包圍。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9至10中任一項所述的載體，其中所述的載體 進一步包括第一選擇標(biāo)記，其中所述的第一選擇標(biāo)記為陽性選擇標(biāo)記， 并且所述的第一選擇標(biāo)記被所述的同源序列包圍。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的載體，其中所述的第一選擇標(biāo)記被抑 制該標(biāo)記的序列包圍。
13. 根據(jù)權(quán)利要求9至12中任一項所述的載體，其中所述的載體包括不被所述的同源序列包圍的第二選擇標(biāo)記，并且其中所述的選擇 標(biāo)記為陰性選擇標(biāo)記。
14. 根據(jù)權(quán)利要求11至13中任一項所述的載體，其中所述的載體 包括第三選擇標(biāo)記，其中所述的第三選擇標(biāo)記為陰性選擇標(biāo)記，并且 其中所述的第三選擇標(biāo)記位于抑制第一選擇標(biāo)記的序列之間。
15. 用如權(quán)利要求6或7中任一項所述的核酸分子轉(zhuǎn)染的細胞。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的細胞，其中所述的核酸分子插入到原 代細胞的HPRT基因之中。
17. 包括可操作地連接到細胞的內(nèi)源性HPRT啟動子的如權(quán)利要求 6或7中任一項所述的核酸分子的細胞。
18. 根據(jù)權(quán)利要求15至17中任一項所述的細胞，其中所述的細胞 取自屬于鴨科的動物。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的細胞，其中所述的動物屬于疣鼻棲鴨 禾中ca/r/wa mosc/zato。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的細胞，其中所述的動物屬于綠頭鴨種
21. 根據(jù)權(quán)利要求15至20中任一項的細胞系，其中其進一步包括 編碼所需物質(zhì)的核酸序列。
22. 根據(jù)權(quán)利要求15至21中任一項所述的細胞，其中其進一步包 括允許缺損病毒繁殖的互補盒。
23. 如權(quán)利要求1至5中任一項所述的多肽、如權(quán)利要求6或7中 任一項所述的核苷酸分子或如權(quán)利要求8至14中任一項所述的載體用 于使細胞無限增殖的用途。
24. 如權(quán)利要求15至21中任一項所述的細胞用于病毒復(fù)制的用途。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的用途，其中所述的病毒選自牛痘病毒、 小鼠痘病毒、猴痘病毒、痘苗病毒、天花病毒或MVA。
26. 如權(quán)利要求21所述的細胞用于產(chǎn)生所需物質(zhì)的用途。
27. 如權(quán)利要求15至22中任一項所述的細胞用于產(chǎn)生病毒的用途。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的用途，其中所述的病毒為痘病毒。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的用途，其中所述的病毒為痘苗病毒。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的用途，其中所述的痘苗病毒為MVA。
31. 如權(quán)利要求15至21中任一項所述的細胞用于產(chǎn)生重組病毒的 用途。
32. 使細胞無限增殖的方法，其包括將如權(quán)利要求8至14中任一 項所述的載體轉(zhuǎn)染到所述的細胞中的步驟。
33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于其進一步包括下述步驟將所述的細胞在僅允許包含第一選擇標(biāo)記的細胞生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
34. 根據(jù)權(quán)利要求32至33中任一項所述的方法，其特征在于其進 一步包括下述步驟將所述的細胞在不允許包含第二選擇標(biāo)記的細胞 生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
35. 根據(jù)權(quán)利要求32至34中任一項所述的方法，其中所述的方法 進一步包括下述步驟從所述細胞的基因組中除去第一選擇標(biāo)記。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中將從所述細胞的基因組中 除去第一選擇標(biāo)記的所述歩驟后獲得的細胞在不允許包括第三選擇標(biāo) 記的細胞生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
37. 根據(jù)權(quán)利要求32至36中任一項所述的方法，其中所述的細胞 取自屬于鴨科的生物。
38. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述的生物屬于疣鼻棲鴨 禾中ca/r/"a mosc/2<2to。
39. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述的生物屬于綠頭鴨種
40. 根據(jù)權(quán)利要求32至39中任一項所述的方法，其中將所述的核 酸分子插入到所述細胞的目標(biāo)DNA序列中。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述的目標(biāo)DNA序列為 HPRT基因。
全文摘要
本發(fā)明特別地涉及新的重組端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶、其編碼核酸分子、包含所述的核酸分子的細胞以及用這些細胞生產(chǎn)所需的物質(zhì)的用途。
文檔編號C12N9/12GK101365789SQ200780001961
公開日2009年2月11日 申請日期2007年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月5日
發(fā)明者J-M·巴盧爾, M·卡普弗, N·西爾韋斯特雷, P·埃爾布 申請人:特蘭斯吉恩股份有限公司