專利名稱：：用于產(chǎn)生醬油的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及使用包含糖類結(jié)合模塊(carbohydratebindingmodule)的淀粉分解酶產(chǎn)生醬油的方法。
背景技術(shù)：
：醬油產(chǎn)生自大豆和任選的其它植物成分例如小麥和稻。在該過程中，期望將淀粉和其它糖類降解成能被用于發(fā)酵的微生物所利用的糖，作為形成芳香化合物(aromacompound)的底物和能量源。常規(guī)通過由曲發(fā)酵(kojifermentation)期間使用的發(fā)酵劑(culture)產(chǎn)生的淀粉分解酶來實(shí)現(xiàn)淀粉的分解。淀粉水解的效率對于醬油的生產(chǎn)是重要的。發(fā)明概述發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在相關(guān)的醬油生產(chǎn)條件下，與不含糖類結(jié)合模塊(CBM)的淀粉分解酶相比，使用包含CBM的淀粉分解酶使淀粉水解的速率增加。因此，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生醬油的方法，其包括i)使用淀粉分解酶處理植物材料；和ii)從處理的植物材料產(chǎn)生醬油；其中所述淀粉分解酶包含糖類結(jié)合模塊。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及包含糖類結(jié)合模塊的淀粉分解酶用于產(chǎn)生醬油的用途，和通過本發(fā)明的方法可以獲得的醬油。發(fā)明詳述酶在本發(fā)明的方法中使用的酶是包含糖類結(jié)合模塊(CBM)的淀粉分解酶。淀粉分解酶是能夠降解淀粉和相關(guān)寡糖和多糖的酶。優(yōu)選的淀粉分解酶是a-淀粉酶(EC3.2.1.1)、卩-淀粉酶(EC3.2.1.2)、產(chǎn)麥芽a-淀粉酶(maltogenicalpha-amylase)(EC3.2.1.133)和葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)。EC(EnzymeCommission;酶學(xué)委員會(huì))號(hào)指國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)命名委員會(huì)(NomenclatureCommitteeoftheInternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology)(IUBMB)的酶定義。糖類結(jié)合模塊(CBM),或者通常稱為糖類結(jié)合域(CBD)，是優(yōu)先與多糖或寡糖(糖類)結(jié)合，通常(但并非必然唯一地)與它們不溶于水的(包括結(jié)晶)形式結(jié)合的多肽氨基酸序列。源自淀粉降解酶的CBM通常指淀粉結(jié)合模塊或SBM(可出現(xiàn)在特定淀粉分解酶如特定葡糖淀粉酶中的CBM，或可出現(xiàn)在酶如環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶或內(nèi)淀粉酶中的CBM)。SBM通常稱為SBD(StarchBindingDomains;淀粉結(jié)合域)。對于本發(fā)明優(yōu)選的是其為淀粉結(jié)合模塊的CBM。發(fā)現(xiàn)CBM是在由兩個(gè)或更多個(gè)多肽氨基酸序列區(qū)組成的大多肽或大蛋白的整合部分(integralpart),特別是在通常包含催化模塊和糖類結(jié)合模塊(CBM)的水解酶(hydrolyticenzyme)(水解酶(hydrolase))中，所述催化模塊含有用于底物水解的活性位點(diǎn)，而所述糖類結(jié)合模塊用于結(jié)合至所述的糖類底物。這些酶可包含多于一個(gè)催化模塊和一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)CBM，并且任選地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)將CBM與催化模塊連接的多肽氨基酸序列區(qū)，后一種類型的區(qū)通常被表示為"接頭"。已經(jīng)在藻類中發(fā)現(xiàn)了CBM,例如在紅藻紫紅紫菜CPor//^rapwpwwfl)中發(fā)現(xiàn)了非水解多糖結(jié)合蛋白(non-hydrolyticpolysaccharide-binding)開j式的CBM。在存在CBM的蛋白/多肽(例如，酶，通常為水解酶)中，CBM可以位于N末端或C末端，或位于內(nèi)部位置。構(gòu)成CBM本身的多肽或蛋白的部分通常由多于大約30個(gè)并且少于大約250個(gè)氨基酸殘基組成。將本發(fā)明上下文中的"家族20的糖類結(jié)合模塊，，或CBM-20模塊定義為與Joergensenetal(1997)inBiotechnol.Lett.19:1027-1031的圖1中公開的多肽的糖類結(jié)合模塊具有至少45。/。同一性的大約100個(gè)氨基酸的序列。所述CBM包含該多肽的后102個(gè)氨基酸，即從氨基酸582至氨基酸683的亞序列。在本公開中應(yīng)用的糖苷水解酶家族的編號(hào)遵循Coutinho,P.M.&Henrissat,B.(1999)-Ca/力o/y^ra/e-^c"ve五"zywesservw(lt類-活性酶刀良務(wù)器)在URL:http:〃afmb.cnrs-mrs.fr/cazy/CAZY/index.html或者Coutinho,P.M.&Henrissat,B.1999;Themodularstructureofcellulasesandothercarbohydrate-activeenzymes:anintegrateddatabaseapproach.In〃Ge""/cs,/Woc/zew^^ya"d五co/ogyo/Ce〃w/oseDegraca"o""，K.Ohmiya,K.Hayashi,K.Sakka,Y.Kobayashi，S.KaritaandT.Kimuraeds.,UniPublishersCo.，Tokyo,pp.15-23，andBoume，Y.&Henrissat，B.2001;Glycosidehydrolasesandglycosyltransferases:familiesandfunctionalmodules,CwrewfQp/m'o"5^w"wra/Ao/o"11:593-600的扭無念。包含適合用于本發(fā)明上下文的CBM的酶的實(shí)例是內(nèi)淀粉酶(即EC3.2.1.1中的a-淀粉酶)、產(chǎn)麥芽糖a-淀粉酶(EC3.2.1.133)、葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)和CGT酶(EC2.4.1.19)。包含根據(jù)本發(fā)明的CBM的淀粉分解酶可以是天然包含CBM的野生型酶，或者它可以是重組酶。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，包含CBM的淀粉分解酶是雜合酶，其包含具有淀粉分解活性的催化模塊的氨基酸序列和糖類結(jié)合模塊的氨基酸序列。對于本發(fā)明優(yōu)選的是糖類結(jié)合模塊家族20的CBM。適合于本發(fā)明的糖類結(jié)合模塊家族20的CBM可以源自蠟狀芽孢桿菌(5a"7/wcwew"的(3-淀粉酶(SWISSPROTP36924),或源自環(huán)狀芽孢桿菌(^cz7/wczVcw/ara)的CGT酶(SWISSPROTP43379)。對于本發(fā)明還優(yōu)選的是與前述CBM氨基酸序列中的任一具有至少60%，至少70%,至少80%或甚至至少90。/。同一性的任何CBM。糖類結(jié)合模塊家族20中其它合適的CBM可以見于URL:http:〃afmb.cnrs-mrs.fr/cazy/CAZY/index.html。一旦作為cDNA或染色體DNA的形式鑒定了編碼底物結(jié)合(糖類結(jié)合)區(qū)的核苷酸序列，其后可以多種方式對其進(jìn)行操作以將其融合至編碼感興趣的酶活性的DNA序列。其后用接頭或不用接頭將編碼糖類結(jié)合氨基酸序列的DNA片段與編碼感興趣的酶的DNA連接。之后可以將所得連接的DNA以多種方式操作來實(shí)現(xiàn)表達(dá)。源自細(xì)菌的CBM將通常適合用于本發(fā)明的上下文中，然而，優(yōu)選的是芽孢桿菌屬(Bacillus)來源的CBM，例如來自黃熱芽孢桿菌(Ba"7/w//avoAerww力(同物異名/i"ox;^ac/〃1^co"tom/"ara)的CBM20，4尤選來自；定4分酶AMY1048(WO2005/003311的SEQIDNO:2)、AMY1039或AMY1079(分別作為WO2005/001064中的SEQIDNOl、2和3公開)、來自Diversa的WO2002068589中公開的芽孢桿菌屬淀粉酶、芽孢桿菌屬菌種TS23(Korea)(Lin,L,L.;(1995年3月1日)提交至EMBL/GenBank/DDBJ數(shù)據(jù)庫。Long-LiuLin,FoodIndustryResearchInstitute,CultureCollectionandResearchCenter,331FoodRoad,Hsinchu,Taiwan300,RepublicofChina)。本文所指的雜合酶或遺傳修飾的野生型酶包括以下種類，所述種類包含a-淀粉分解酶(EC3.2丄1)的氨基酸序列，其與包含糖類結(jié)合模塊(CBM)的氨基酸序列連接(即共價(jià)結(jié)合)。含有CBM的雜合酶，以及對其制備和純化的詳細(xì)描述是本領(lǐng)域已知的[參見，例如WO90/00609、WO94/24158和WO95/16782，以及Greenwoodetal.BiotechnologyandBioengineering44(1994)pp.1295-1305]。例如可以通過如下方法來制備它們將DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，所述DNA構(gòu)建體至少包含通過或不通過接頭與編碼感興趣的酶的DNA序列連接的編碼糖類結(jié)合模塊的DNA的片段，并且培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以表達(dá)融合的基因。在本領(lǐng)域中通常將所得重組產(chǎn)物(雜合酶)稱為"融合蛋白"，可以通過如下通式來描述A-CBM-MR-X在后面的通式中，A-CBM是至少包含糖類結(jié)合模塊(CBM)本身的氨基酸序列的N-末端或C-末端區(qū)。MR是中間區(qū)("接頭")，并且X是由編碼與CBM連接的酶(或其它蛋白質(zhì))的DNA序列所編碼的多肽的氨基酸殘基序列?？梢圆淮嬖诓糠諥(由此A-CBM為CBM本身，即不包含構(gòu)成CBM的氨基酸殘基之外的氨基酸殘基)，或者部分A可以是一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列(作為CBM本身的末端延伸發(fā)揮功能)。接頭(MR)可以是鍵，或是包含大約2至大約100個(gè)碳原子，尤其是2至40個(gè)碳原子的短連接基團(tuán)。然而，MR優(yōu)選是大約2至大約100個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選是2至40個(gè)氨基酸殘基，例如2至15個(gè)氨基酸殘基的序列。部分X可以構(gòu)成完整雜合酶的N-末端或C-末端區(qū)。因此從上文中顯而易見的是，在所討論類型的雜合酶中CBM可以位于該雜合酶的C-末端、N-末端或內(nèi)部。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，包含根據(jù)本發(fā)明的CBM的淀粉分解酶是包含淀粉結(jié)合域的a-淀粉酶，例如包含淀粉結(jié)合域并且針對生淀粉具有活性的酸性a-淀粉酶。適合用于本發(fā)明的包含淀粉結(jié)合域的a-淀粉酶可以是雜合酶，或所述多肽可以是已經(jīng)包含具有a-淀粉酶活性的催化模塊和淀粉結(jié)合域的野生型酶。在本發(fā)明的方法中使用的多肽還可以是這種野生型酶的變體。合適的包含淀粉結(jié)合域的a-淀粉酶在WO2005003311A2中公開。優(yōu)選的是具有WO2006/066579中公開為SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的氨基酸序列的淀粉酶，或具有WO2006/066596中公開為SEQIDNO:2或SEQIDNO:12的氨基酸序列的淀粉酶，或任何具有a-淀粉酶活性并且包含淀粉結(jié)合域的多肽，所述多肽具有的氨基酸序列與前述氨基酸序列中任一具有至少50%，至少60%，至少70%，至少80%,至少90°/?；蛏踔林辽?5%同一性。在具體的實(shí)施方式中，a-淀粉酶是細(xì)菌a-淀粉酶，優(yōu)選源自地衣芽孢桿菌(5./z'c/2em/ow^)、解淀粉芽孢桿菌(及^^/0//^^/ac/e"力和嗜熱脂肪芽孢桿菌(5.Weara^zermo//w7w力菌才朱的a-淀4分酶。在本發(fā)明的方法中，包含CBM的淀粉分解酶可以是經(jīng)純化的(purified)。術(shù)語"經(jīng)純化的"用于本文包括不含(freefrom)來自生物的成分的淀粉分解酶蛋白，所述淀粉分解酶蛋白源自所述生物。術(shù)語"經(jīng)純化的"還包括不含來自天然生物的成分的淀粉分解酶蛋白，所述淀粉分解酶蛋白從該天然生物獲得，這也被稱為"基本上純的(essentiallypure)"淀粉分解酶，并且可與天然存在且未經(jīng)遺傳修飾的淀粉分解酶特別相關(guān)，所述遺傳修飾如通過缺失、取代或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基來進(jìn)行。因此，可將包含CBM的淀粉分解酶純化，即只存在較少量其它蛋白。表述"其它蛋白"具體涉及其它酶。本文所用術(shù)語"純化"還指去除其它成分，特別是其它蛋白質(zhì)，并且最特別是存在于所述淀粉分解酶所來源的細(xì)胞中的其它酶。淀粉分解酶可以是"基本上純的"，即不含來自產(chǎn)生該淀粉分解酶的生物的其它成分，所述產(chǎn)生該淀粉分解酶的生物即，例如，用于重組產(chǎn)生淀粉分解酶的宿主生物。優(yōu)選地，所述酶是至少75%(重量/重量)純的，更優(yōu)選至少80%、85%、90%或甚至至少95%純的。在還更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述淀粉分解酶是至少98%純的酶蛋白制劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過本領(lǐng)域熟知的方法來選擇將在本發(fā)明的方法中使用的特定的酶?？梢赃x擇在期望該酶有活性的醬油方法的部分的條件下具有期望活性的酶。例如可以選擇在醬油生產(chǎn)方法使用的高NaCl濃度和低pH下有活性的酶。醬油醬油是基于大豆和源自大豆的材料的淺褐色至黑色液體型調(diào)味品(condiment),具有肉樣的咸味，用作調(diào)味料(seasoning),特別是在東方食品中。在醬油的產(chǎn)生中，使用植物成分例如大豆或源自大豆的材料，例如大豆粉、脫脂大豆和脫脂大豆粉；小麥；源自小麥的材料；稻；源自稻的材料；和大麥。醬油的主要成分通常是大豆或脫脂大豆粉、小麥、鹽和水。通常而言，使用發(fā)酵方法來制造醬油，但是也可以生產(chǎn)未發(fā)酵的醬油。發(fā)酵醬油通常按照以下步驟生產(chǎn)制備曲，鹽水發(fā)酵(brinefermentation)(醪發(fā)酵(moromifermentation)),過濾/巴氏滅菌，和成熟作用(maturation)。通常通過將經(jīng)烹制的大豆(cookedsoybean)或經(jīng)烹制的脫脂大豆粉與經(jīng)炙烤的小麥(roastedwheat)混合來制備曲。其后用通常為米曲霉(Ay/erg/〃ws0/^zae)和/或醬油曲霉0^pe/^/〃wssq/ae)的起子i咅養(yǎng)物(starterculture)來4姿種該混合物，并且使其在用于需氧發(fā)酵的淺床中發(fā)酵數(shù)日。在發(fā)酵之后，將曲轉(zhuǎn)移至用于鹽水發(fā)酵(醪發(fā)酵)的罐中。添加鹽水(saltbrine)至總NaCl量通常為16-18%，并且通常用酵母和乳酸細(xì)菌培養(yǎng)物來接種以進(jìn)一步厭氧發(fā)酵。所得混合物稱作醪。數(shù)日的發(fā)酵之后，可以從醪壓出粗制醬油(rawsoysauce),過濾，巴氏滅菌并且進(jìn)行發(fā)酵，通常發(fā)酵數(shù)個(gè)月，或可將醪進(jìn)行發(fā)酵直至發(fā)酵結(jié)束，此時(shí)將其過濾并且裝瓶用于消費(fèi)。在曲和醪發(fā)酵過程中糖類例如淀粉被水解，并且在醪發(fā)酵期間將所得的糖發(fā)酵以產(chǎn)生風(fēng)味(flavour)和小量的醇和乳酸，并且將蛋白質(zhì)分解成肽和氨基酸。這些過程對于產(chǎn)生發(fā)酵醬油典型的復(fù)合風(fēng)味是重要的。未發(fā)酵醬油通常從水解的植物蛋白制備，通常從例如大豆、脫脂大豆、小麥、源自小麥的材料、稻、源自稻的材料和/或大麥的酸水解物制備，向其中添加額外的成分例如焦糖色(caramelcolour)、玉米^f唐漿和鹽?？梢詫⑨u油生產(chǎn)成低鹽醬油(reducesaltsoysauce)。在發(fā)酵醬油的情況下這通常通過如下方法完成，通過過濾和/或離子交換從醬油中去除鹽。制成的醬油通常具有4-6.5的pH和13-22。/。NaCl(重量/重量)的鹽含量，只是低鹽醬油通常具有低至6。/。NaCl的鹽含量。酶處理使用包含CBM的淀粉分解酶處理植物材料可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法來進(jìn)行。所述處理可以通過如下方法實(shí)施例如將酶添加至植物材料的漿料，或?qū)⒚竾婌F至原料上。例如可以在曲發(fā)酵之前或期間添加所述酶，或者例如可以在醪發(fā)酵之前或期間添加所述酶?？梢酝瑫r(shí)用淀粉分解酶處理醬油中的全部成分，或可以在將醬油的一種或多種植物成分與其它成分混合之前進(jìn)行處理。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，待用淀粉分解酶處理的植物材料包含大豆和/或源自大豆的材料。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，待用淀粉分解酶處理的植物材料包含小麥；源自小麥的材料，例如小麥面粉或小麥淀粉；稻；和/或源自稻的材料，例如米淀粉?？梢詫⒑矸鄢煞衷谄渑c醬油的其它成分混合之前，單獨(dú)(separately)用淀粉分解酶處理；例如可以用淀粉分解酶單獨(dú)處理小麥、小麥面粉、小麥淀粉、稻和/或米淀粉；并且可以在用淀粉分解酶處理之后添加其它成分。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，在步驟i)之后將大豆和/或源自大豆的材料添加至經(jīng)處理的植物材料。使用的酶量應(yīng)該足以使淀粉水解與曲發(fā)酵劑本身的淀粉水解相比增加。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，包含CBM的淀粉分解酶的量足以使淀粉水解的程度與未添加淀粉分解酶的相似方法相比增加。在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，包含CBM的淀粉分解酶的量足以使淀粉水解的程度與添加不含CBM的淀粉分解酶的相似方法相比增加。包含CBM的淀4分分解酶應(yīng)該以如下量添加，所述量使其在酶必須起作用的醬油方法條件下，例如在25-45。C的溫度，和醪發(fā)酵步驟中的鹽(NaCl)濃度為例如17-18。/。的條件下具有足夠的活性。發(fā)明的方法獲得的醬油。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及包含糖類結(jié)合模塊的淀粉分解酶用于產(chǎn)生醬油的用途。實(shí)施例l鱉兩種具有CBM的細(xì)菌a-淀粉酶AMY1048:氨基酸序列在WO2006/066596中作為SEQIDNO:2給出。包含CBM的來自黃熱芽孢桿菌(同物異名JwoxykzcW/wco"tom/"ara)的野生型a-淀粉酶。催化域是WO2006/066596的SEQIDNO:2的氨基酸l-484，而CBM是氨基酸485-586。AX379+CBM:氨基酸序列在WO2006/066596中作為SEQIDNO:12給出。酶是芽孢桿菌屬a-淀粉酶和來自AMY1048的CBM的雜合體。兩種不具有CBM的細(xì)菌a-淀粉酶不具有CBM的AMY1048:氨基酸序列在WO2006/066596中作為SEQIDNO:2的氨基酸l-484給出。AX379:氨基酸序列在WO2006/066596中作為SEQIDNO:12的氨基酸1一484給出。實(shí)施例舉例說明了如使用細(xì)菌a-淀粉酶通過還原端的增加來測量小麥面粉水解成可溶性寡糖。在50mM乙酸鈉pH5.0、20%NaCl中制備具有1。/。(重量/重量)干固體(DS)小麥面粉的漿料。將lmL的小麥面粉漿分配至試管。將試管在25。C的熱混合器上溫育。在第0分鐘將酶按照劑量(160微克/克干固體)添加至試管。在36、64和90分鐘之后取出樣品。通過使用DNS試劑方法測量還原端的增加來測定寡糖的釋放。DNS試劑將lg3，5-二硝基水楊酸溶解在20ml2NNaOH和50ml水中，繼而添加30gRochelle鹽(酒石酸鉀鈉四水合物)，并且將溶液加熱至大約70°C，隨后用水調(diào)節(jié)至100ml。通過將50微升反應(yīng)混合物與50微升DNS試劑一起在100。C溫育IO分鐘來測定釋放的還原糖。煮沸之后，添加250微升水，并且在550nm測量吸光度。使用D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線來對釋放的還原糖量進(jìn)行定量。結(jié)果示于表1。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權(quán)利要求1.用于產(chǎn)生醬油的方法，其包括i)使用淀粉分解酶處理植物材料；和ii)從處理的植物材料產(chǎn)生醬油；其中所述淀粉分解酶包含糖類結(jié)合模塊。2.權(quán)利要求1的方法，其中在醪(moromi)發(fā)酵過程之前或期間添加所述淀粉分解酶。3.權(quán)利要求1和2中任一項(xiàng)的方法，其中在曲(koji)發(fā)酵過程之前或期間添加所述淀粉分解酶。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述淀粉分解酶是包含糖類結(jié)合模塊的a-淀粉酶。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述淀粉分解酶是包含糖類結(jié)合模塊的細(xì)菌a-淀粉酶。6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物材料包含大豆和/或源自大豆的材料。7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟i)之后將大豆和/或源自大豆的材料添加至處理的植物材料。8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物材料包含小麥、源自小麥的材料、稻和/或源自稻的材料。9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述過程包括在步驟ii)中使用曲發(fā)酵劑的發(fā)酵。10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述過程包括在步驟ii)中使用醪發(fā)酵劑的發(fā)酵。11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中在步驟ii)期間進(jìn)行步驟i)。12.包含糖類結(jié)合模塊的淀粉分解酶用于產(chǎn)生醬油的用途。13.通過前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法可以獲得的醬油。全文摘要本發(fā)明涉及使用包含糖類結(jié)合模塊的淀粉分解酶的用于產(chǎn)生醬油的方法。文檔編號(hào)A23L1/238GK101365349SQ200780001939公開日2009年2月11日申請日期2007年1月3日優(yōu)先權(quán)日2006年1月4日發(fā)明者安德斯·維克蘇-尼爾森,珀·M·尼爾森申請人:諾維信公司