專利名稱：編碼糖原合成起始因子的基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼糖原合成起始因子的基因及其用途，特別涉及耐干燥性及/ 或耐低溫保存性良好的實(shí)用酵母、使用該酵母制造的酒精飲料、其制造方法等。 更加具體地說，本發(fā)明涉及編碼釀造酵母的具有糖原合成起始活性的蛋白質(zhì)Glglp或Glg2p的GLG1或GLG2基因，特別涉及通過提高啤酒酵母的特征基因 non-ScGLGl或non-ScGLG2的表達(dá)量從而使耐干燥性及/或耐低溫保存性提高的 酵母、使用該酵母的酒精飲料制造方法等。此外，本發(fā)明的酵母也可應(yīng)用于面 包酵母、工業(yè)用酵母。
背景技術(shù)：
啤酒釀造工序中具有的特征是，對發(fā)酵結(jié)束后的酵母進(jìn)行回收并在下次發(fā) 酵中使用(稱為連續(xù)釀造)。在乙醇存在的條件下，將酵母保存在保持為0 3°C 的槽內(nèi)，而在此期間如果酵母死亡，不僅會影響下次發(fā)酵，而且因自溶流出的 細(xì)胞構(gòu)成物可能給產(chǎn)品帶來不良?xì)馕?。因此，使用耐低溫保存性良好的酵母?可自由設(shè)計(jì)工序，對穩(wěn)定生產(chǎn)高質(zhì)量產(chǎn)品非常重要。連續(xù)釀造的次數(shù)根據(jù)發(fā)酵條件、使用酵母的特性而不同，經(jīng)過一定次數(shù)后 終止。生產(chǎn)新使用酵母的工序稱為繁殖，從小規(guī)模經(jīng)過多階段的規(guī)模放大進(jìn)行 放大培養(yǎng)， 一般需要數(shù)日 數(shù)周時間，因此如果能夠縮短工序時間、或使預(yù)先 大量培養(yǎng)的菌體在低溫或干燥狀態(tài)下長期穩(wěn)定保存，在生產(chǎn)效率方面將會有很 大價值。有關(guān)維持髙活菌率的干燥酵母的制造方法，己經(jīng)對干燥裝置、溫度、添加 乳化劑等制造條件進(jìn)行了各種研究。例如L-干燥法能夠維持極高的活菌率，但 另一方面，因?yàn)榛ㄙM(fèi)時間和成本高，在實(shí)際生產(chǎn)規(guī)模中使用不現(xiàn)實(shí)。有關(guān)酵母的耐低溫性，以面包酵母為中心，已報(bào)道了幾種以提高耐冷凍性 為目的的試驗(yàn)。這是因?yàn)榕c低溫下能夠發(fā)酵的啤酒、清酒等的釀造酵母相比較， 面包酵母Saccharomyces cerevisiae的低溫保存性差。例如在日本國特開平1卜155559號公報(bào)、日本國特開2003-304864號公報(bào)中，主要通過篩選法發(fā)現(xiàn)具 有耐冷凍性及耐干燥性的面包酵母。此外，作為使用基因工程技術(shù)的例子，日 本國特開平10-117771號公報(bào)中報(bào)道了破壞NTH1 (海藻糖基因)的海藻糖高積 累菌株，日本國特開2001-238665號公報(bào)中報(bào)道了破壞CAR1 (精氨酸分解酶基 因)的精氨酸等特定氨基酸高積累菌株。 發(fā)明內(nèi)容在上述狀況下，期待利用編碼與釀造酵母的耐干燥性及/或耐低溫保存性相 關(guān)的蛋白質(zhì)的基因以及該蛋白質(zhì)，能夠高效率生產(chǎn)酒精飲料或有用物質(zhì)。本發(fā)明者為了解決上述課題進(jìn)行了精心研究，結(jié)果從啤酒酵母中成功鑒定、 分離出編碼糖原合成起始因子的基因，并且確認(rèn)將得到的基因?qū)虢湍钢兄谱?使其表達(dá)的轉(zhuǎn)化酵母，耐干燥性及/或耐低溫保存性增強(qiáng)，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明涉及編碼啤酒酵母中存在的編碼糖原合成起始因子的基因、該基因編碼的蛋白質(zhì)、該基因的表達(dá)受到調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)化酵母、通過使用該基因表達(dá)受到 調(diào)節(jié)的酵母從而強(qiáng)化酵母的耐干燥性及/或耐低溫保存性的方法等。具體來說，本發(fā)明提供下述所示的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體、導(dǎo)入該載體的轉(zhuǎn)化 酵母、使用該轉(zhuǎn)化酵母的酒精飲料制造方法等。(1)多核苷酸，其為從下述(a) (f)組成的群組中選擇的多核苷酸，(a) 多核苷酸，其含有由序列號1或序列號3的堿基序列所組成的多核苷酸；(b) 多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)由序列號2或 序列號4的氨基酸序列所組成；(c) 多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)由在序列號2 或序列號4的氨基酸序列中缺失、替換、插入及/或添加1個或多個氨基酸后的 氨基酸序列所組成、且具有糖原合成起始活性；(d) 多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有與序列號 2或序列號4的氨基酸序列有60%以上一致性的氨基酸序列、且具有糖原合成起 始活性；(e) 多核苷酸，其含有在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由序列號1或序列號3的堿基序列 的互補(bǔ)堿基序列所組成的多核苷酸進(jìn)行雜交、且編碼具有糖原合成起始活性的 蛋白質(zhì)的多核苷酸；以及(f) 多核苷酸，其含有在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由編碼序列號2或序列號4的氯 基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列所組成的多核苷 酸進(jìn)行雜交、且編碼具有糖原合成起始活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。(2) 如上述(1)所述的多核苷酸，其選自由下述(g) (i)組成的群組，(g) 多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)由序列號2或 序列號4的氨基酸序列所組成、或者由在序列號2或序列號4的氨基酸序列中 缺失、替換、插入及/或添加l 10個氨基酸后的氨基酸序列所組成、且具有糖 原合成起始活性；(h) 多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有與序列號 2或序列號4的氨基酸序列有90%以上一致性的氨基酸序列、且具有糖原合成起 始活性；以及(i) 多核苷酸，其含有在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由序列號1或序列號3的堿基 序列所組成的多核苷酸進(jìn)行雜交、或與由序列號1或序列號3的堿基序列的互 補(bǔ)堿基序列所組成的多核苷酸進(jìn)行雜交、且編碼具有糖原合成起始活性的蛋白 質(zhì)的多核苷酸。(3) 如上述(1)所述的多核苷酸，其含有由序列號1或序列號3的堿基 序列所組成的多核苷酸。(4) 如上述(1)所述的多核苷酸，其含有編碼由序列號2或序列號4的 氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸。(5) 如上述(1) (4)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其為DNA。(6) 蛋白質(zhì)，其為由上述(1) (5)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。(7) 載體，其含有上述(1) (5)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。(7a)上述(7)所述的載體，其包含表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含下述構(gòu)成要素 (x) (z)-(x)在酵母細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的啟動子；(y)連接在該啟動子的有義或反義方向的上述(1) (5)中任一項(xiàng)所述 的多核苷酸；以及(z)涉及RNA分子的轉(zhuǎn)錄終止及多聚腺苷酸化作用并在酵母內(nèi)起作用的信號。(7b)上述(7)所述的載體，其包含表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含下述構(gòu)成要素(X) (Z):(x)在酵母細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的啟動子；(y)連接在該啟動子的有義方向的上述(1) (5)中任一項(xiàng)所述的多核 苷酸；以及(z)涉及RNA分子的轉(zhuǎn)錄終止及多聚腺苷酸化作用并在酵母內(nèi)起作用的信號。(8) 酵母，其為導(dǎo)入上述(7) (7b)中任一項(xiàng)所述的載體的酵母。(9) 耐干燥性增強(qiáng)的上述(8)所述的酵母(實(shí)用酵母)，這里所述的"實(shí) 用酵母"是指釀造用酵母、面包酵母、工業(yè)用酵母等具有實(shí)際使用價值的 酵母。(10) 耐低溫保存性增強(qiáng)的上述(8)所述的酵母。(11) 如上述(9)所述的酵母，其中，通過增大上述(6)所述的蛋白質(zhì) 的表達(dá)量，耐干燥性增強(qiáng)。(12) 如上述(10)所述的酵母，其中，通過增大上述(6)所述的蛋白質(zhì) 的表達(dá)量，耐低溫保存性增強(qiáng)。(12a)如上述(9) (12)中任一項(xiàng)所述的酵母，其為釀造用酵母。(13) 酒精飲料制造方法，其使用上述(8) (12a)中任一項(xiàng)所述的酵母。(14) 如上述(13)所述的酒精飲料制造方法，其中，釀造的酒精飲料是麥芽飲料。(15) 如上述(13)所述的酒精飲料制造方法，其中，釀造的酒精飲料是 葡萄酒。(16) 酒精飲料，其為采用上述(13) (15)任一項(xiàng)所述的方法制造的 酒精飲料。(17) 評價方法，其為使用根據(jù)具有序列號1或序列號3的堿基序列、且編碼糖原合成起始因子的基因的堿基序列設(shè)計(jì)的引物或探針，對被檢酵母的耐干燥性及/或耐低溫保存性進(jìn)行評價的方法。(17a)根據(jù)上述(17)所述的方法，選擇耐干燥性及/或耐低溫保存性增強(qiáng)的酵母的方法。(17b)使用根據(jù)上述(17a)所述的方法選擇的酵母，制造酒精飲料(如 啤酒、工業(yè)用酒精)的方法。(17c)使用根據(jù)上述(17a)所述的方法選擇的酵母，制造有用物質(zhì)(如 蛋白質(zhì))的方法。(18) 評價方法，其為培養(yǎng)被檢酵母，通過測定具有序列號1或序列號3 的堿基序列、且編碼糖原合成起始因子的基因的表達(dá)量，評價被檢酵母的耐干 燥性及/或耐低溫保存性的方法。(18a)根據(jù)上述(18)所述的方法評價被檢酵母，選擇編碼糖原合成起始 因子的基因表達(dá)量高的酵母，選擇耐干燥性及/或耐低溫保存性高的酵母。(18b)使用根據(jù)上述(18a)所述的方法選擇的酵母，制造酒精飲料(如 啤酒)的方法。(18c)使用根據(jù)上述(18a)所述的方法選擇的酵母，制造有用物質(zhì)(如 蛋白質(zhì))的方法。(19) 酵母的選擇方法，其為培養(yǎng)被檢酵母，對上述(6)所述的蛋白質(zhì)進(jìn) 行定量或者測定具有序列號1或序列號3的堿基序列、且編碼糖原合成起始因 子的基因的表達(dá)量，選擇所述蛋白質(zhì)的量或所述基因表達(dá)量與目標(biāo)耐干燥性及/ 或耐低溫保存性相應(yīng)的被檢酵母的方法。(20) 如上述(19)所述的酵母的選擇方法，其為培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母和被檢酵 母，測定具有序列號1或序列號3的堿基序列、且編碼糖原合成起始因子的基 因在各酵母中的表達(dá)量，選擇與標(biāo)準(zhǔn)酵母相比該基因?yàn)楦弑磉_(dá)的被檢酵母的方 法。(21) 如上述(19)所述的酵母的選擇方法，其為培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母和被檢酵 母，對各酵母中的上述(6)所述蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，選擇與標(biāo)準(zhǔn)酵母相比，該蛋 白質(zhì)的量多的被檢酵母的方法。(22) 酒精飲料制造方法，其特征在于，使用上述(8) (12a)所述酵 母和根據(jù)上述(19) (21)所述的方法選擇的酵母中的任一種酵母。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化酵母能夠在千燥保存或低溫保存下維持高的活菌數(shù)，所以應(yīng) 用于釀造等時，能夠消除煩雜的酵母管理，能夠有助于質(zhì)量的穩(wěn)定化。進(jìn)而， 由于干燥酵母適合長期保存，而且其重量減輕，所以對流通運(yùn)輸非常有利，可應(yīng)用于工業(yè)用酒精生產(chǎn)、有用蛋白質(zhì)生產(chǎn)等的工業(yè)用微生物。此外，本發(fā)明的 酵母也可應(yīng)用于面包酵母、工業(yè)用酵母。


圖1表示啤酒釀造試驗(yàn)中酵母增殖量的經(jīng)時變化，橫軸表示發(fā)酵時間，縱軸表示0D660值。圖2表示啤酒釀造試驗(yàn)中浸出物消耗量的經(jīng)時變化，橫軸表示發(fā)酵時間，縱軸表示浸出物表觀濃度(w/wT。)。圖3表示啤酒釀造試驗(yàn)中的酵母中non-ScGLGl基因的表達(dá)行為，橫軸表示發(fā)酵時間，縱軸表示檢出的信號輝度。圖4表示親株及non-ScGLGl高表達(dá)株的耐干燥性試驗(yàn)結(jié)果。圖5表示親株及non-ScGLGl高表達(dá)株的耐低溫保存性試驗(yàn)結(jié)果。圖6表示啤酒釀造試驗(yàn)中酵母增殖量的經(jīng)時變化，橫軸表示發(fā)酵時間，縱軸表示0D660值。圖7表示啤酒釀造試驗(yàn)中浸出物消耗量的經(jīng)時變化，橫軸表示發(fā)酵時間， 縱軸表示浸出物表觀濃度(w/w%)。圖8表示啤酒釀造試驗(yàn)中的酵母中non-ScGLG2基因的表達(dá)行為，橫軸表示 發(fā)酵時間，縱軸表示檢出的信號輝度。圖9表示親株及non-ScGLG2高表達(dá)株的耐干燥性試驗(yàn)結(jié)果。圖10表示親株及non-ScGLG2高表達(dá)株的耐低溫保存性試驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明者根據(jù)日本國特開2004-283169公開的方法解讀的啤酒酵母基因組 的信息，分離、鑒定出編碼啤酒酵母的糖原合成起始因子的non-ScGLGl基因和 non-ScGLG2基因。其堿基序列分別用序列號1和序列號3表示，此外由該基因 編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別用序列號2和序列號4表示。 1.本發(fā)明的多核苷酸首先，本發(fā)明提供(a)多核苷酸，其含有具有序列號1或序列號3的堿 基序列的多核苷酸；以及(b)多核苷酸，其含有編碼具有序列號2或序列號4 的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA也可以是RNA。作為本發(fā)明對象的多核苷酸，并不限定于編碼上述來源于啤酒酵母的具有 糖原合成起始活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸，而且還包括編碼與該蛋白質(zhì)具有同等 功能的蛋白質(zhì)的其他多核苷酸。作為具有同等功能的蛋白質(zhì)，例如可以為(C)蛋白質(zhì)，其具有在序列號2或序列號4的氨基酸序列中缺失、替換、插入及/或 添加1個或多個氨基酸后的氨基酸序列、且具有糖原合成起始活性。此類蛋白質(zhì)可以為具有在序列號2或序列號4的氨基酸序列中如缺失、 替換、插入及/或添加1 100個、1 90個、1 80個、1 70個、1 60個、l 50個、1 40個、1 39個、1 38個、1 37個、1 36個、1 35個、1 34 個、1 33個、1 32個、1 31個、1 30個、1 29個、1 28個、1 27個、 1 26個、1 25個、1 24個、1 23個、卜22個、1 21個、1 20個、l 19個、1 18個、1 17個、1 16個、1 15個、1 14個、1 13個、1 12 個、1 11個、1 10個、l 9個、1 8個、1 7個、1 6個(1 數(shù)個)、l 5個、1 4個、1 3個、1 2個、l個氨基酸殘基后的氨基酸序列、且具有糖 原合成起始活性的蛋白質(zhì)。上述缺失、替換、插入及/或添加的氨基酸殘基的個 數(shù)， 一般優(yōu)選小的數(shù)目。并且此類蛋白質(zhì)還可以為(d)蛋白質(zhì)，其具有與序列 號2或序列號4的氨基酸序列有約60%以上、約70%以上、71%以上、72%以上、 73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以 上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、 88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以 上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99. 1%以上、99. 2%以上、99. 3%以 上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99. 7%以上、99. 8%以上、99. 9%以上 的一致性的氨基酸序列、且具有糖原合成起始活性。上述同源性的數(shù)值一般優(yōu) 選大的數(shù)值。糖原合成起始活性，例如可根據(jù)Cheng etal.， Mol. Cell. Biol. ， 15(12)， 6632—6640 (1995)中記載的方法，通過測定酵母菌體的糖原含量來進(jìn)行評價。本發(fā)明還包括(e)多核苷酸，其含有在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與具有序列號1或序 列號3的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸進(jìn)行雜交、且編碼具有糖原合成 起始活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；以及(f)多核苷酸，其含有在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與具 有編碼具有序列號2或序列號4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸的堿基序列 的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸進(jìn)行雜交、且編碼具有糖原合成起始活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。這里所述的"在嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行雜交的多核苷酸"，是指將具有序列號1或序列號3的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸、或?qū)⒕幋a序列號2或序列號4 的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分作為探針，使用菌落雜交法、噬菌斑 雜交法、Southern雜交法等得到的多核苷酸(如DNA)。雜交方法利用如Molecular Cloning 3rd Ed. ， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley& Sons 1987-1997等記載的方法。本說明書所述的"嚴(yán)謹(jǐn)條件"，可以為低嚴(yán)謹(jǐn)條件、中嚴(yán)謹(jǐn)條件、高嚴(yán)謹(jǐn)條 件中的任一種。"低嚴(yán)謹(jǐn)條件"，如為5XSSC、 5XDenhardt液、0. 5%SDS、 50% 甲酰胺、32。C的條件；此夕卜，"中嚴(yán)謹(jǐn)條件"，如為5XSSC、 5XDenhardt液、 0. 5%SDS、 50%甲酰胺、42。C的條件；"高嚴(yán)謹(jǐn)條件"，如為5XSSC、 5XDenhardt 液、0.5%SDS、 50%甲酰胺、50'C的條件。在這些條件中，認(rèn)為溫度越高越能有 效得到高同源性的多核苷酸(如DNA)。當(dāng)然， 一般認(rèn)為影響雜交的嚴(yán)謹(jǐn)度的因 素有溫度、探針濃度、探針長度、離子強(qiáng)度、時間、鹽濃度等多個因素，本領(lǐng) 域技術(shù)人員可通過適當(dāng)選擇這些要素實(shí)現(xiàn)相同的嚴(yán)謹(jǐn)度。使用市售的試劑盒進(jìn)行雜交時，如可以使用Alkphos Direct Labelling Reagents(Amersham Pharmacia公司制造)。這種情況下，按照試劑盒中附帶的 說明書，與標(biāo)記探針過夜溫育后，在55'C的條件下用含有0. l%(w/v)SDS的第1 次洗滌緩沖液將膜洗滌后，能夠檢出雜交的多核苷酸(如DNA)。除此之外可能雜交的多核苷酸還可以為，通過FASTA、 BLAST等同源性檢索 軟件用系統(tǒng)設(shè)定的默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行計(jì)算時，與編碼序列號2或序列號4的氨基酸 序列的多核苷酸有約60%以上、約70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74% 以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、 82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以 上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97% 以上、98%以上、99%以上、99.1以上％、 99.2以上％、 99. 3%以上、99. 4%以上、 99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99. 8%以上、99. 9%以上一致性的多核苷酸。氨基酸序列、堿基序列的一致性，可以使用Karlin及Altschul的BLAST Algorithm(Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 87， 2264-2268， 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90， 5873， 1993)來確定。以BLAST Algorithm為基礎(chǔ)的稱為BLASTN 、 BLASTX的程序已在開發(fā)(Altschul SF, et al:J Mol Biol215:403,1990)。使用BLASTN分析堿基序列時，如使參數(shù)為score-lOO、wordlength=12;此外使用BLASTX分析氨基酸序列時，如使參數(shù)為score=50、wordlength二3;使用BLAST和Gapped BLAST程序時，采用各程序的系統(tǒng)設(shè)定默認(rèn)參數(shù)值。2.本發(fā)明的蛋白質(zhì)本發(fā)明還提供由上述(a) (i)中任一種多核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)。本 發(fā)明的優(yōu)選蛋白質(zhì)為具有在序列號2或序列號4的氨基酸序列中缺失、替換、 插入及/或添加1個或多個氨基酸后的氨基酸序列、且具有糖原合成起始活性的 蛋白質(zhì)。此類蛋白質(zhì)可以為具有在序列號2或序列號4的氨基酸序列中缺失、替換、 插入及/或添加上述數(shù)量的氨基酸殘基后的氨基酸序列、且具有糖原合成起始活 性的蛋白質(zhì)。此外，此類蛋白質(zhì)還可以為具有與序列號2或序列號4的氨基酸 序列有上述同源性的氨基酸序列、且具有糖原合成起始活性的蛋白質(zhì)。此類蛋白質(zhì)可通過使用《Molecular Cloning 3》、《Current Protocols in Molecular Biology》、"Nuc. Acids. Res. ， 10， 6487 (1982) ，，、 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79， 6409 (1982)"、 "Gene, 34， 315 (1985)"、 "Nuc. Acids. Res. ， 13， 4431 (1985) "、 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 82， 488 (1985)" 等記載的定點(diǎn)誘變法獲得。本發(fā)明所述的在蛋白質(zhì)的氨基酸序列中缺失、替換、插入及/或添加1個以 上的氨基酸殘基，是指在同一序列中的任意且1個或多個氨基酸序列中的位置 上缺失、替換、插入及/或添加1個或多個氨基酸殘基，并且缺失、替換、插入 及添加中的2種以上可同時發(fā)生。下面列舉可互相替換的氨基酸殘基，同一組中包含的氨基酸殘基可互相替 換。A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基 丁酸、蛋氨酸、0-甲基絲氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸； B組天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二 酸.，C組天冬酰胺、谷氨酰胺；D組賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、2， 4-二氨 基丁酸、2， 3-二氨基丙酸；E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸；F 組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸；G組苯基丙氨酸、酪氨酸。本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可以通過Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基 法)等化學(xué)合成法制造，并且也可以利用Advanced Chem Tech公司、Perkin Elmer 公司、Pharmacia公司、Protein Technology Installment公司、Synthecell-Vega 公司、PerS印tive公司、島津制作所公司等制造的肽合成儀進(jìn)行化學(xué)合成。 3.本發(fā)明的載體及導(dǎo)入該載體的轉(zhuǎn)化酵母本發(fā)明提供含有上述多核苷酸的載體，本發(fā)明的載體含有上述(a) (i) 中任一項(xiàng)所述的多核苷酸(DNA)。并且，構(gòu)成的本發(fā)明的載體通常包含表達(dá)盒， 該表達(dá)盒包括的結(jié)構(gòu)要素為(x)在酵母細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的啟動子，(y)連接在 該啟動子的有義或反義方向的上述(a) (i)任一項(xiàng)所述的多核苷酸(DNA)， 以及(z)涉及RNA分子的轉(zhuǎn)錄終止及多聚腺苷酸化作用并在酵母內(nèi)起作用的信 號。此外，要使上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)進(jìn)行高表達(dá)時，優(yōu)選將上述(a) (i) 中任一項(xiàng)所述的多核苷酸(DNA)以該啟動子的有義方向?qū)耄源龠M(jìn)這些多核 苷酸的表達(dá)。導(dǎo)入酵母時使用的載體可以是多拷貝型(YEp型)、單拷貝型(YCp型)、染 色體整合型(YIp型)中的任一種。例如作為YEp型載體，已知有YEp24 (J. R. Broach et al. ， Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83， 1983)，作為YCp型載體，已知有YCp50 (M. D. Rose et al. ， gene， 60， 237， 1987)，作為Yip型載體，已知有YIp5(K. Struhl et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USP， 76， 1035， 1979)，且容易獲得。用于調(diào)節(jié)酵母中的基因表達(dá)的啟動子/終止子，只要在實(shí)用酵母中起作用的 同時不受醪液中的成分影響，可以任意組合。例如可使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶 基因(TDH3)的啟動子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的啟動子等。這些基 因均已克隆，如在M. F. Tuite et al. ， EMB0 J. ， 1， 603 (1982)中有詳細(xì)記 載，通過已知的方法能夠容易地獲得。進(jìn)行轉(zhuǎn)化時使用的選擇性標(biāo)記，因?qū)嵱媒湍覆荒芾脿I養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，可 利用氨基糖苷類抗生素(Geneticin)抗性基因(G418r)、耐銅基因(CUP1) (Marin et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 81， 337 1984)、抗淺藍(lán)菌素基因 (fas2m，PDR4)(豬腰淳嗣等，生物化學(xué)，64， 660， 1992; Hussain et al.， gene，101，149，1991)(日語原名豬腰淳嗣、生化學(xué)，64， 660, 1992; Hussain et al.， gene, 101, 149， 1991)等。將上述構(gòu)建的載體導(dǎo)入宿主酵母內(nèi)，作為宿主酵母可以為任意酵母(實(shí)用 酵母)，如啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母，面包酵母，工業(yè)用酒精生產(chǎn)酵母，有用蛋白質(zhì)生產(chǎn)酵母等。具體可以為如酵母屬(Saccharomyces)等酵母， 在本發(fā)明中，可使用啤酒酵母，如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus) W34/70等、Saccharomyces carlsbergensis NCYC453、NCYC456等、Saccharomyces cerevisiaeNBRC1951、 NBRC1952、 NBRC1953、 NBRC1954等。并且還可使用威士 忌酵母如Saccharomyces cerevisiae NCYC90等，葡萄酒酵母如協(xié)會葡萄酒用1 號、葡萄酒用3號、葡萄酒用4號等，清酒酵母如協(xié)會酵母清酒用7號、清酒 用9號等，面包酵母如NBRC 0555、 NBRC 1346、 NBRC 2043等，但并不限于這 些酵母。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用啤酒酵母例如巴斯德酵母(Saccharomyces pastoriamis)o酵母的轉(zhuǎn)化方法可利用一般使用的公知方法。如電穿孔法"Meth. Enzym.， 194， p182 (1990)"、原生質(zhì)球法(Spheroplast) "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75pl929(畫)"、乙酸鋰法"J. Bacteriology, 153, pl63(1983)"、 Proc. Natl. Acad. Sci. ■， 75 pl929 (1978)、 Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Ma腿l等記載的方法，但并不限于 這些方法。更加具體地說，將宿主酵母在標(biāo)準(zhǔn)酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基(如YEPD培養(yǎng)基"Genetic Engineering. Vol. 1， Plenum Press, New York, 117(1979)"等)中培養(yǎng)至OD600nm 值為1 6。將該培養(yǎng)酵母離心分離并收集，洗凈，用濃度約為1M 2M的堿金 屬離子進(jìn)行前處理，優(yōu)選用鋰離子進(jìn)行前處理。上述細(xì)胞在約3(TC下，靜置約 60分鐘后，與導(dǎo)入的DNA(約lug 20"g)同時在約3(TC下，靜置約60分鐘。 添加聚乙二醇，優(yōu)選添加約4， 000道爾頓的聚乙二醇，使最終濃度約為20% 50%。約30。C下靜置約30分鐘后，將上述細(xì)胞在約42-C下加熱處理約5分鐘。 優(yōu)選用標(biāo)準(zhǔn)酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基將上述細(xì)胞懸浮液洗凈，加入到規(guī)定量的新鮮標(biāo)準(zhǔn) 酵母營養(yǎng)培養(yǎng)基中，約30'C下靜置約60分鐘。然后，將其移植于含有作為選擇性標(biāo)記使用的抗生素等的標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基上，獲得轉(zhuǎn)化體。一般克隆技術(shù)可參照《Molecular Cloning 3》、"Methods in Yeast Genetics、 A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、 Cold Spring Harbor, NY)，，等。4. 本發(fā)明的酒精飲料制造方法以及根據(jù)該方法得到的酒精飲料將上述本發(fā)明的載體導(dǎo)入酵母中，能夠得到耐干燥性及/或耐低溫保存性良 好的酵母。此外，通過使用下述本發(fā)明的酵母的評價方法進(jìn)行選擇，也可以得 到耐干燥性及/或耐低溫保存性良好的酵母。本發(fā)明得到的酵母的應(yīng)用對象，例 如可以為啤酒、葡萄酒、威士忌、清酒等的釀造，面包制造，工業(yè)用酒精生產(chǎn)， 有用蛋白質(zhì)生產(chǎn)等有用物質(zhì)的制造等，但并不限于這些。生產(chǎn)這些物質(zhì)時，除使用本發(fā)明得到的釀造酵母代替親株之外，還可利用 公知的技術(shù)手段。因此，使用的原料、制造設(shè)備、制造管理等可與以往的方法 完全相同，不用增加成本就可實(shí)施。5. 本發(fā)明的酵母的評價方法本發(fā)明涉及的評價方法是，使用根據(jù)具有序列號1或序列號3的堿基序列、 且編碼糖原合成起始因子的基因的堿基序列設(shè)計(jì)的引物或探針，評價被檢酵母 的耐干燥性及/或耐低溫保存性。上述評價方法的一般方法是公知的，例如在 W001/040514號公報(bào)、日本國特開平8-205900號公報(bào)等中有記載。下面，對該 評價方法進(jìn)行簡單說明。首先，制備被檢酵母的基因組。制備方法可采用Hereford法或乙酸鉀法等 l壬何一種公知方法(如Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130(1990))。以得到的基因組為對象，使用根據(jù)編碼糖原 合成起始因子的基因的堿基序列(優(yōu)選ORF序列)設(shè)計(jì)的引物或探針，檢測被 檢酵母的基因組中是否存在其基因或其基因的特異序列?？刹捎霉姆椒ㄔO(shè) 計(jì)引物或探針。基因或特異序列的檢出可采用公知的方法實(shí)施。例如，用含有特異序列的 一部分或全部的多核苷酸或者含有其堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸作為 一個引物，用含有該序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或者含 有其堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸作為另一個引物，通過PCR法擴(kuò)增酵 母的核酸，測定擴(kuò)增產(chǎn)物的有無、擴(kuò)增產(chǎn)物分子量大小等。引物使用的多核苷 酸的堿基數(shù)通常為10bp以上，優(yōu)選15bp 25bp。此外，夾在兩引物間的堿基數(shù) 通常以300bp 2000bp為宜。PCR法的反應(yīng)條件無特別限定，如可采用變性溫度90iC 95t:，退火溫度: 40。C 60。C，延伸溫度60。C 75。C，循環(huán)數(shù)10次以上等條件。得到的反應(yīng)生成物通過使用瓊脂糖凝膠等的電泳法等被分離，能夠測定擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量。通過該方法，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量包含特定DNA分子的大小，預(yù)測、評價該 酵母的耐干燥性及/或耐低溫保存性。并且，通過分析擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基序列，可 以更準(zhǔn)確地預(yù)測、評價上述性質(zhì)。在本發(fā)明中，培養(yǎng)被檢酵母，通過測定具有序列號1或序列號3的堿基序 列、且編碼糖原合成起始因子的基因的表達(dá)量，也能夠評價被檢酵母的耐干燥 性及/或耐低溫保存性。此外，編碼糖原合成起始因子的基因的表達(dá)量的測定， 能夠通過培養(yǎng)被檢酵母，對該基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA或蛋白質(zhì)進(jìn)行定量來進(jìn)行。 mRNA或蛋白質(zhì)的定量可采用公知的方法進(jìn)行。mRNA的定量例如可通過Northern 雜交法、定量RT-PCR進(jìn)行，蛋白質(zhì)的定量例如可通過Western印跡法進(jìn)行 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。培養(yǎng)被檢酵母，測定具有序列號1或序列號3的堿基序列、且編碼糖原合 成起始因子的基因的表達(dá)量，通過選擇與目標(biāo)糖原合成能力相應(yīng)的上述基因表 達(dá)量的酵母，能夠選擇出適于釀造所期望酒精飲料的酵母。此外，也可以培養(yǎng) 標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母，測定各酵母中上述基因的表達(dá)量，通過比較標(biāo)準(zhǔn)酵母和 被檢酵母中上述基因的表達(dá)量，從而選擇所期望的酵母。具體來說，例如培養(yǎng) 標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母，測定具有序列號1或序列號3的堿基序列、且編碼糖原 合成起始因子的基因在各酵母中的表達(dá)量，通過選擇與標(biāo)準(zhǔn)酵母相比該基因?yàn)?高表達(dá)的菌株，能夠選擇出適于釀造所期望酒精飲料、適于生產(chǎn)有用物質(zhì)的酵 母。培養(yǎng)被檢酵母，通過選擇有高糖原合成起始活性的蛋白質(zhì)的酵母，能夠選 擇出適于釀造所期望酒精飲料、或適于生產(chǎn)有用物質(zhì)的被檢酵母。所述情況下，作為被檢酵母或標(biāo)準(zhǔn)酵母，例如可以使用導(dǎo)入上述本發(fā)明載 體的酵母、實(shí)施突變處理的酵母、發(fā)生自然突變的酵母等。糖原合成起始活性， 例如能夠根據(jù)Cheng et al. ， Mol. Cell. Biol. ， 15(12)， 6632-6640 (1995) 中記載的方法，通過測定酵母菌體的糖原含量來進(jìn)行評價。對于突變處理，例 如可以使用紫外線照射、放射線照射等物理方法，EMS (甲基磺酸乙酯)、N-甲 基-N-亞硝基胍等試劑處理的化學(xué)方法等任何方法(如參照大嶋泰治編著、生 物化學(xué)實(shí)驗(yàn)法39酵母分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)法、p67-75、學(xué)會出版中心等)(日語原 名大嶋泰治編著、生物化學(xué)実験法39酵母分子遺伝學(xué)実験法、P67-75、學(xué)會出版七 >夕一)。能夠作為標(biāo)準(zhǔn)酵母、被檢酵母使用的酵母，可以為任意酵母(實(shí)用酵母)， 如啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母，面包酵母，工業(yè)用酒精生產(chǎn)酵母，有用蛋白質(zhì)生產(chǎn)酵母等。具體可以為酵母屬(Saccharomyces)等酵母(例如 Saccharomyces pastorianus、 Saccharomyces cerevisiae及Saccharomyces carlsbergensis )等，在本發(fā)明中可以使用啤酒酵母如Saccharomyces pastoriamis W34/70等、Saccharomyces carlsbergensis NCYC453、 NCYC456 等、Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、 NBRC1952、 NBRC1953、 NBRC1954等。 并且也可以使用威士忌酵母如Saccharomyces cerevisiae NCYC90等，葡萄酒 酵母如協(xié)會葡萄酒用1號、葡萄酒用3號、葡萄酒用4號等，清酒酵母如協(xié)會 酵母清酒用7號、清酒用9號等，面包酵母如NBRC 0555、 NBRC 1346、 NBRC 2043 等，但并不限于這些酵母。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用啤酒酵母如巴斯德酵母 (Saccharomyces pastorianus)。標(biāo)準(zhǔn)酵母、被檢酵母也可以從上述酵母組中 任意組合選擇。實(shí)施例下面根據(jù)實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不限于下述實(shí)施例。 實(shí)施例l編碼糖原合成起始因子的基因(non-ScGLGl)的克隆使用日本國特開2004-283169所述的比較數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了編 碼啤酒酵母的特有糖原合成起始因子的non-ScGLGl基因(序列號1)。根據(jù)獲得 的堿基序列信息，分別設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增全長基因的引物non-ScGLGl_for (序列號 5) /non-ScGLGl—rv (序列號6),通過以基因組解讀株Saccharomyces pastorianus Weihenst印an34/70株(簡稱"W34/70株")的染色體DNA為模板 的PCR,取得包括non-ScGLGl全長基因的DNA片段。將上述得到的non-ScGLGl基因片段，通過TA克隆插入pCR2. 1-T0P0載體 (Invitrogen公司制造)。用Sanger法(F. Sanger, Science, 214， 1215， 1981) 分析并確定non-ScGLGl基因的堿基序列。實(shí)施例2啤酒釀造試驗(yàn)中non-ScGLGl基因表達(dá)分析使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株進(jìn)行啤酒釀造試驗(yàn)造,從發(fā)酵中的啤酒酵母菌體中提取的mRNA通過啤酒酵母DNA微陣列進(jìn)行檢測。 麥芽汁浸出物濃度 12.69%對發(fā)酵液進(jìn)行經(jīng)時采樣，觀察酵母增殖量(圖l)、浸出物表觀濃度(圖2) 的經(jīng)時變化。與此同時對酵母菌體進(jìn)行采樣，將制備的mRNA用生物素進(jìn)行標(biāo)記， 使其與啤酒酵母DNA微陣列進(jìn)行雜交。使用GeneChip Operating System (GCOS; GeneChip Operating Software 1.0， Affymetrix公司制造)進(jìn)行信號檢測， non-ScGLGl基因的表達(dá)模式如圖3所示。根據(jù)該結(jié)果確認(rèn)在通常的啤酒發(fā)酵中 non-ScGLGl基因進(jìn)行表達(dá)。實(shí)施例3 non-ScGLGl高表達(dá)株的制作將實(shí)施例l所述方法得到的non-ScGLGl/pCR2. 1-TOPO用限制酶SacI及NotI 酶解，制備包括non-ScGLGl基因的DNA片段。將該片段連接于經(jīng)限制酶Sacl 及Notl處理的pYCGPYNot上，構(gòu)建non-ScGLGl 高表達(dá)載體 non-ScGLGl/pYCGPYNot。 pYCGPYNot為YCp型酵母表達(dá)載體，導(dǎo)入的基因通過丙 酮酸激酶基因PYK1的啟動子進(jìn)行高表達(dá)。酵母的選擇性標(biāo)記包括氨基糖苷類抗 生素(Geneticin)抗性基因G418、大腸桿菌的選擇性標(biāo)記包括氨節(jié)青霉素抗 性基因Amp:使用上述方法制作的高表達(dá)載體，采用日本國特開平07-303475記載的方 法轉(zhuǎn)化A幾4004株，采用含有氨基糖苷類抗生素(Geneticin) 300mg/L的YPD 平板培養(yǎng)基(1%酵母浸出物，2%多聚蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂)選擇轉(zhuǎn)化體。實(shí)施例4 non-ScGLGl高表達(dá)株的耐干燥性評價親株(A幾4004株)及根據(jù)實(shí)施例3中記載的方法得到的non-ScGLGl高表 達(dá)株的耐干燥性采用以下方法評價。取1白金耳酵母接種于10mL麥芽汁(含100mg/L氨基糖苷類抗生素 (Geneticin))中，3CTC振蕩培養(yǎng)過夜。將該前培養(yǎng)液接種于10mL麥芽汁(同麥芽汁體積 麥芽汁中溶解 發(fā)酵溫度 酵母添加量12.8XlQ6細(xì)胞/mL上)中，且0D660:0.5，開始增菌培養(yǎng)，培養(yǎng)2天使酵母增殖至穩(wěn)定期。測定 結(jié)束時的菌體濁度，將其懸浮于滅菌水中且使0D660=2。將如此調(diào)整的懸浮液 100 iiL裝入1.5mL微量管內(nèi)，用減壓干燥機(jī)(DNA110 SpeedVac (注冊商標(biāo))、 ThermoSavant公司制造)處理1小時，使菌體干燥固化?；罹实臏y定采用下述方法，將上述得到的干燥菌體再懸浮于50pL滅菌 水中，加入50uL的0.02W亞甲藍(lán)溶液(pH4.5)，將失去還原能力的被染成藍(lán)色 的菌體作為死菌體。接著，在顯微鏡下觀察該懸浮液，使用鑒定細(xì)胞死活體系 (DA細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、Yamato科學(xué)株式會社制造)計(jì)算活菌率。為了減小實(shí)驗(yàn)誤差， 計(jì)算時使基數(shù)為2000個細(xì)胞以上。如圖4所示，親株的活菌率為19. 9%，而高表達(dá)株的活菌率為38. 9%,由此 表明non-ScGLGl高表達(dá)使酵母的耐干燥性提高。實(shí)施例5 non-ScGLGl高表達(dá)株的耐低溫性評價親株(A幾4004株)及根據(jù)實(shí)施例3中記載的方法得到的non-ScGLGl高表 達(dá)株的耐低溫性采用以下方法評價。采用實(shí)施例4中記載的方法培養(yǎng)，將制成 的0D660-2的酵母懸浮液分別在2個微量管內(nèi)各注入900u L，向其中一個微量 管內(nèi)加入100 n L滅菌水，另一個微量管內(nèi)加入100 u L的99. 5%的乙醇(最終濃 度10%)。將其5t:保存4周時間，然后采用與實(shí)施例4同樣的方法計(jì)算活菌率。如圖5所示，保存后的non-ScGLGl高表達(dá)株的活菌率比親株高，其效果在 10%乙醇存在下更明顯。由此表明non-ScGLGl高表達(dá)使酵母的耐低溫保存性得 到了提高。實(shí)施例6編碼糖原合成起始因子的基因(non-ScGLG2)的克隆使用日本國特開2004-283169所述的比較數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了編 碼啤酒酵母的糖原合成起始因子的non-ScGLG2基因(序列號3)。根據(jù)獲得的堿 基序列信息，分別設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增全長基因的引物non-ScGLG2—for (序列號7) / non-ScGLG2—rv (序歹lj號8)，通過以基因組解讀株Saccharomyces pastorianus Weihenst印an34/70株(簡稱"W34/70株")的染色體DM為模板的PCR，取得 包括non-ScGLG2全長基因的DNA片段。將上述得到的non-ScGLG2基因片段，通過TA克隆插入pCR2.1-T0P0載體(Invitrogen公司制造)。用Sanger法(F. Sanger, Science, 214， 1215， 1981) 分析并確定non-ScGLG2基因的堿基序列。實(shí)施例7啤酒釀造試驗(yàn)中non-ScGLG2基因表達(dá)分析使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株進(jìn)行啤酒釀造試驗(yàn) 造，從發(fā)酵中的啤酒酵母菌體中提取的mRNA通過啤酒酵母DNA微陣列進(jìn)行檢測。麥芽汁浸出物濃度 12.69%麥芽汁體積 70L麥芽汁中溶解氧濃度 8.6卯m發(fā)酵溫度 15°C酵母添加量 12.8X106細(xì)胞/mL對發(fā)酵液進(jìn)行經(jīng)時采樣，觀察酵母增殖量(圖6)、浸出物表觀濃度(圖7) 的經(jīng)時變化。與此同時對酵母菌體進(jìn)行采樣，將制備的mRNA用生物素進(jìn)行標(biāo)記， 使其與啤酒酵母DNA微陣列進(jìn)行雜交。使用GeneChip Operating System (GC0S; GeneChip Operating Software 1.0， Affymetrix公司制造)進(jìn)行信號檢測， non-ScGLG2基因的表達(dá)模式如圖8所示。根據(jù)該結(jié)果確認(rèn)在通常的啤酒發(fā)酵中 non-ScGLG2基因進(jìn)行表達(dá)。實(shí)施例8 non-ScGLG2高表達(dá)株的制作將實(shí)施例6所述方法得到的non-ScGLG2/PCR2. 1-T0P0用限制酶Sac I及Not I 酶解，制備包含non-ScGLG2基因的DNA片段。將該片段連接于經(jīng)限制酶Sacl 及Notl處理的實(shí)施例3所述的酵母表達(dá)載體pYCGPYNot上，構(gòu)建non-ScGLG2 高表達(dá)載體non-ScGLG2/pYCGPYNot。使用上述方法制作的高表達(dá)載體，采用日本國特開平07-303475記載的方 法轉(zhuǎn)化A幾4004株，采用含有氨基糖苷類抗生素(Geneticin) 300mg/L的YPD 平板培養(yǎng)基(1%酵母浸出物，2%多聚蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂)選擇轉(zhuǎn)化體。實(shí)施例9 non-ScGLG2高表達(dá)株的耐干燥性評價親株(A幾4004株)及根據(jù)實(shí)施例8中記載的方法得到的non-ScGLG2高表 達(dá)株的耐干燥性，采用與實(shí)施例4同樣的方法進(jìn)行評價。如圖9所示，親株的活菌率為19. 9%，而高表達(dá)株的活菌率為30. 3%，由此 表明non-ScGLG2高表達(dá)使酵母的耐干燥性提高。實(shí)施例10 non-ScGLG2高表達(dá)株的耐低溫性評價親株(A幾4004株)及根據(jù)實(shí)施例8中記載的方法得到的non-ScGLG2高表 達(dá)株的耐低溫性，采用與實(shí)施例5同樣的方法進(jìn)行評價。如圖10所示，保存后的non-ScGLG2高表達(dá)株的活菌率比親株高，其效果 在10%乙醇存在下更明顯。由此表明non-ScGLG2高表達(dá)使酵母的耐低溫保存性 提高。根據(jù)本發(fā)明，能夠提高酵母的耐干燥性及/或耐低溫保存性，因此能夠使酵 母長期穩(wěn)定保存，能夠提高酒精飲料(如啤酒)釀造、面包制造、工業(yè)用酒精 生產(chǎn)、有用蛋白質(zhì)生產(chǎn)等有用物質(zhì)的制造等的效率。序列表〈110〉三得利株式會社(Suntory Limited)〈120〉編碼糖原合成起始因子的基因及其用途 (Gene encoding self-glucosylating initiator of glycogen synthesis and use thereof)〈130〉 G06-0107CN<150> JP2006-55570 <151> 2006-03-01<160> 8<170> Patentln version 3. 3〈210〉 1 〈211> 1680 <212> DNA<213>酵母屬(Saccharomyces sp.) 〈400> 1atgtgtagaa aactagccat tgtcacacta ctgtactccg cggattattt accgggcgtg 60 tttgctcttg gtcatcaagt taacaaactg ttaaaggaag cgggtaggaa agatagaatt 120 gatgcatgcc ttgttgtgac aactccctta ttcaatgaca ttttgagcga tttggccaaa 180 gatcttttga aaacaatata cgacgatatc gtacttgtaa accctttgga atgccaagat 240 gaaagtattc agagaaacag tgaaaatcta gctcttttgg aaaggcccga attgtcgttt 300 gctctaataa aggcaagact atgggaacta acccagtacg aacaagttct atatttggat 360 tcagacactt tacccctgaa aaaagacttt ctaagattgt tcgacattat gtctaaacaa 420act幼gttac卿ttggtgctgttgctgacattggctggccagata/ttttcaatagcggc480gttatgatgctgataccaget tgctgatactgcatctgttttacagaactatgttatcgaa540aatacttcaattgatggtgctgatcagggcattttgaatcagttttttaaccaaaactgc600tgcacggatgsgctgctcaa 8gaaetgctttccccgaga>gtgggtacagttatcatttaca660ccacccctaa tcttggttatgaatcttcacctgctatgaatta/ttttgtaa720ccaactatcaaactgattca tttcattggccatggtctctgtggtctcag780acaaactttgttagaaacga atacaatacccaatggeL6ttggagtgtacgagg2LCttt肪g840cELgg幼aacaaattggtagatgacgtctcgaagsttgatatcagtgattttaatgaggac900aataatgttctcaagaaactattccgcaaacagcatcttc鄉(xiāng)ggctatt960cctcaagataatgatttttctactgaaaaggaagtcgaaacaategeic3caaagcaag犯1020gaicaccagagtccagctcaataagccagctcccgttcctgttccactgaatttcactgaa1080tggttgacaactttcataaacaaggat幼tgtgaattcccaggcaatgaacaaaatgcac1140g犯ceicgeigLggaaatgat8gtggttttgata幼gax;gfLcgctaaatcagatgaagacatc1200tacgtgaataacgtgcgacgcta>aacc￡igaccaagaaagtattgcggalaaaaacgacgct1260aagacggcca^tgtgaataacaatgactctaatcc觀3cc3￡Lgag8LgtC8LC1320gcggatgtcacacaagaccctattacttattatcagsgg8tatagaaccg1380cctgtgcctaccgaagacgacgtgaaacttctggaac鄉(xiāng)attg鄉(xiāng)郷gttacgatgaa1440ttccttctagacgt3tgcgatgcagatgcgatcaacaacgei卿agg卿agatttcgat1500gt卿aaaagtgggaaggagtgttgaagatgcactcgaaa肌gag肪tccgac卿ggac1560gaaccc犯aaattcacctcaagaaatgccgaacttcaggttcgactgggaaggittctgat1620tacctatcaa肌gttgaaaggtatttccctgatgacgtctttgaatatgcagtagaatga廳〈210〉 2 〈211> 559 〈212〉 PRT<213〉酵母屬(Saccharomyces sp.) <400> 2Met Cys Arg Lys Leu Ala lie Val Thr Leu l-eu Tyr Ser Ala Asp Tyr1 5 Leu Pro Gly Val Phe Ala Leu 20Glu Ala Gly Arg Lys Asp Arg 35Pro Leu Phe Asn Asp 50lie Tyr Asp Asp10 15 Gly His Gin Val Asn Lys Leu Leu Lys 25 30 Asp Ala Cys Leu Val Val Thr Thrlie 40Ser Asp LeuThr 65Glu Ser lie Gin Arg Asn Ser Glu AsnAla Lys 60 Pro Leu 75Ala LeuVal 45Asp Leu Leu Lyslie Leu 55lie Val Leu Val Asn Pro Leu Glu Cys Gin 70Arg Asn Ser Glu Asn Leu Ala Leu Leu Glu Arg 85 90 95Glu Leu Ser Phe Ala Leu lie Lys Ala Arg Leu Trp Glu Leu ThrAsp80ProGinPhe Ala Leu lie Lys Ala Arg Leu Trp Glu Leu 100 105 110Tyr Glu Gin Val Leu Tyr Leu Asp Ser Asp Thr Leu Pro Leu Lys LysGin 115Asp Phe Leu Arg Leu PhePhe 130 GlyAsp 150 ProAsp 135 lieAsp 120lie Met SerPro 125Thr Lys Leu GinLys Gin 140Ala Val Ala A印lie Gly Trp Pro Asp lie Phe Asn Ser Gly155 160 Ala Ser Val Leu Gin Asnlie 145Val Met Met Leu lie Pro Asp Ala Asplie 165Tyr Val lie Glu Asn Thr SerPhe 195Ser Phe Pro Arg Glu TrpPhe 210lie Asp 185 Cys Cys 200Gin LeuThr Ala Ser Val Leu Gin 170 175 Gly Ala Asp Gin Gly lie LeuGlu Asn Thr Ser lie Asp Gly Ala Asp Gin Gly 180 185 190Asn Gin Phe Phe Asn Gin Asn Cys Cys Thr Asp Glu Leu Leu Lys GluLeu 205Tyr Asn Val ThrVal Gin Leu Ser Phe Thr 215 220 Thr Pro Asn Leu Gly Tyr Glu Ser Ser Pro Ala Met Asn Tyr Phe Lys 225 230 235 240Pro Thr lie Lys Leu lie His Phe lie Gly Gin His Lys Pro Trp Ser 245Thr Asn Phe ValLeu Trp Ser Gin 260Asn Gly Val Tyr Glu Asp 275Lys lie Asp lielie Gly 250 Arg Asn 265Gin GluTrp 255 GinTrpVal Ser 290Thr Ala Ser Gin Glu Thr 305 310 Pro Gin Asp Asn Asp Phe Ser Thr 325Thr Lys Gin Glu Asp Thr Arg Val 340Leu Asn Phe ThrGlu Tyr Asn Thr 270Asn Lys Leu Val Asp Asp 285Asn Asn Val GinPhe Lys 280Ser Asp Phe Asn Glu Asp 295 300 lie Pro Gin Thr Ala Ser Ser Gly AlaAla Ser Ser Gly Ala lie 315 320 Glu Val Glu Thr lie AspPro Val Pro 355Val Asn Ser GinGlu Lys 330Gin Leu Asn Lys 345Trp Leu Thr Thr Phe lie Asn Lyslie 335 ProValAla 375 LysGlu 360Met Asn Lys MetAsp Asn 370Asn Asp Ser Gly Phe Asp Lys Asp Asp Ala Lys Ser Asp Glu Asp 385 390 Tyr Val Asn Asn Ser Asp Ala !>ysHis 380 SerPro Ala 350 Phe lie 365Glu His Glu GlyLys Asn Asp Ala 420Ser Asn Pro Asp Gin Glu Ser 435Thr Tyr Lys Asp Asp lie450Glu Asp Asp ValSer 405Lys Ser Asp Gin Asp Gly His ValPro Asp 410 Asp Gly 425Alei AspLys 395Gin Glu Ser lieAla 415 Asnlie 400 AspAspAsn Asn 430His Ala Asp Val Thr Gin Asp Pro lie 440 445 Ser Glu A印lie Glu Pro Pro Val Pro Thr 455 460 Lys Leu Leu Glu Gin Asp Glu Glu Gly Tyr Asp Glu<formula>formula see original document page 27</formula>ttcatctata acgtaacaat gcccaattac ttccagcagc atatcaacct agttcatttc gcattcaacc acgataatta ttattatcaa aacgaacacc acttgagtaa ttatttcaca acagatttcc atcacgaggc tccctgcatc aatcaaaagc aggttagccc tgatgaaacc cctatacaag aacacgatca aaaagtgaca gagtgggaga atacggacta tttgcaccac t朋ggataccagt cctcgcctgc gatgagcttt 720atcggaacgt tcaaaccgtg gtcacatagt 780ttatggaggg atacagagag ggatctacac 840cgcttgcaac tcggcaatct cgaaagggaa 900aacacgctgc taaggcaaaa ctcaagggag 960caggtaggtc ctaatgctgc acaaaatata 1020actgctgata ctcaaagtgc cttcaagttt 1080gtccagagag cgttcccaga ctccgatatc 11401143〈210〉 4 〈211> 380 〈212〉 PRT<213>酵母屬(Saccharo邁yces sp.)<400> 4Met lie Lys Lys Val Ala Leu Cys Thr Leu Leu Tyr Ser Arg Gly Tyr15 10 15Leu Pro Gly Ala Leu Thr Leu Ala Tyr Gin Leu Gin Gly Leu Leu Ser20 25 30Gin Thr Val Val Glu A印Glu lie Thr lie Cys Leu Leu Val Ala Arg35 40 45Thr Leu Phe Glu Asp Glu Phe Thr Pro Gin Glu lie Val Leu lie Arg50 55 60Ser Leu Phe Lys Glu lie lie lie lie Glu Ser Leu Glu Gly Gin Ala 65 70 75 80Lys Ser Val Glu Asn Asn Lys Ala Asn Uu Asp Leu Leu ILys Arg Pro85 90 95Glu Leu Ser Phe Thr Leu Uu Lys Ala Arg Leu Trp Glu Leu Val Gin100
Phe Asp Gin Val
105 110 Leu Phe Leu Asp Ala Asp Thr Leu Pro Leu Asn Lys
115
Phs Lys
Asp 120
lie Leu Gin Leu Tyr Pro
Glu Phe Phe Lys lie Leu Gin 130 135 lie Ala Ala Val Pro Asp lie Gly Trp Pro 145 150 Val Leu Leu Leu lie Pro Asp Leu Glu
Glu Gin 140
Asp Met Phe Asn 155
Ala Lys Ser Leu
Pro 125
Thr Arg Phe Gin
lie Pro Asp Leu Glu Met 165 170 Phe Leu Val Lys Thr Val Ser lie Asp Gly Ala Asp Gin
Lys 180
Phe Asn Pro Ala
Thr Gly 鄉(xiāng) Gin Asp 175
lie Phe
Cys 200 Trp
Asp Gly Ala Asp Gin Gly 185 190 Asn Tyr Ser Lys Glu lie Leu His
Asn Gin Phs 195
Ser Pro Leu Met Glu Trp lie Arg Leu Pro Phe lie Tyr Asn
Glu 205 Phe
Lys lie Ser Pro Leu Met Glu Trp lie Arg Leu Pro 210 215 220
Val Thr Met Pro Asn Tyr Gly Tyr Gin Ser Ser Pro Ala Met 225
Phe Gin Gin His
Tyr 230
Asn Leu Val His Phe lie Gly Thr Phe
Ser 235 lie
Trp Ser His Ser 260 Glu
lie Asn Leu Val His Phe 245 250 Ala Phe Asn His Asp Asn Tyr Tyr Tyr
Ser Phe 240 Lys Pro 255
Leu Trp
Asp Asn Tyr Tyr Tyr Gin 265 270 Arg Asp Thr Glu Arg Asp Leu His Asn Glu His His Leu Ser Asn Tyr
Phe Thr 290
His Glu Ala Pro 305
Asn Gin Lys
Thr Glu Arg Asp Leu His Asn Glu His His Leu 275 280 285
Arg Leu Gin Leu Gly Asn Leu Glu Arg Glu Thr Asp Phe His
Cys lie 310
Gly 295
Asn Thr Leu Leu
Arg 315
Glu 300
Gin Asn Ser
Gin Val Ser Pro Asp Glu Thr Gin Val 325 330
Arg Glu 320
Gly Pro Asn Ala 335Ala Gin Asn lie Pro lie Gin Glu His Asp Gin Lys Val Thr Thr Ala
340 345 350
Asp Thr Gin Ser Ala Phe Lys Phe Glu Trp Glu Asn Thr Asp Tyr Leu
355 360 365
His His Val Gin Arg Ala Phe Pro Asp Ser Asp lie 370 375 380
<210〉 5 <211> 40 <212> 醒
〈213>人工序列(Artificial) <220>
〈223>引物(Primer) <400> 5
gagctcatag cggccatgtg tagaaaacta gccattgtca 40
〈210〉 6 〈211〉 42 〈212> DNA
<213>人工序列(Artificial) 〈220>
〈223>引物(Primer) 〈400〉 6
ggatcctatg cggccgcgta cgtgaaagaa ctacactttc tt 42〈210〉 7 〈211〉 40 <212> 腿
〈213〉人工序列(Artificial) 〈220〉
〈223>引物(Primer) 〈400〉 7
gagctcatag cggccatgat taagaaagtt gctctttgca 40
<210> 8 〈211〉 42 〈212〉 DNA
<213>人工序列(Artificial) <220〉
〈223〉引物(Primer) 〈400> 8
ggatcctatg cggccgccag cgaattgacc cggccttact at 4權(quán)利要求
1. 多核苷酸，其為從下述(a)～(f)組成的群組中選擇的多核苷酸，(a)多核苷酸，其含有由序列號1或序列號3的堿基序列所組成的多核苷酸；(b)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)由序列號2或序列號4的氨基酸序列所組成；(c)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)由在序列號2或序列號4的氨基酸序列中缺失、替換、插入及/或添加1個或多個氨基酸后的氨基酸序列所組成、且具有糖原合成起始活性；(d)多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有與序列號2或序列號4的氨基酸序列有60％以上一致性的氨基酸序列、且具有糖原合成起始活性；(e)多核苷酸，其含有在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由序列號1或序列號3的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列所組成的多核苷酸進(jìn)行雜交、且編碼具有糖原合成起始活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸；以及(f)多核苷酸，其含有在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼由序列號2或序列號4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列所組成的多核苷酸進(jìn)行雜交、且編碼具有糖原合成起始活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
2. 如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其選自由下述(g) (i)組成的群組，(g) 多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)由序列號2或 序列號4的氨基酸序列所組成、或者由在序列號2或序列號4的氨基酸序列中 缺失、替換、插入及/或添加l 10個氨基酸后的氨基酸序列所組成、且具有糖 原合成起始活性；(h) 多核苷酸，其含有編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，所述蛋白質(zhì)具有與序列號 2或序列號4的氨基酸序列有90%以上一致性的氨基酸序列、且具有糖原合成起 始活性；以及(i) 多核苷酸，其含有在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由序列號1或序列號3的堿基 序列所組成的多核苷酸進(jìn)行雜交、或與由序列號1或序列號3的堿基序列的互 補(bǔ)堿基序列所組成的多核苷酸進(jìn)行雜交、且編碼具有糖原合成起始活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
3. 如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其含有由序列號1或序列號3的堿基序 列所組成的多核苷酸。
4. 如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其含有編碼由序列號2或序列號4的氨 基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
5. 如權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其為DNA。
6. 蛋白質(zhì)，其為由權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。
7. 載體，其含有權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
8. 酵母，其為導(dǎo)入權(quán)利要求7所述的載體的酵母。
9. 如權(quán)利要求8所述的酵母，其耐干燥性增強(qiáng)。
10. 如權(quán)利要求8所述的酵母，其耐低溫保存性增強(qiáng)。
11. 如權(quán)利要求9所述的酵母，其中，通過增大權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì) 的表達(dá)量，增強(qiáng)耐干燥性。
12. 如權(quán)利要求10所述的酵母，其中，通過增大權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì) 的表達(dá)量，增強(qiáng)耐低溫保存性。
13. 酒精飲料的制造方法，其使用權(quán)利要求8 12中任一項(xiàng)所述的酵母。
14. 如權(quán)利要求13所述的酒精飲料的制造方法，其中，釀造的酒精飲料是 麥芽飲料。
15. 如權(quán)利要求13所述的酒精飲料的制造方法，其中，釀造的酒精飲料是 葡萄酒。
16. 酒精飲料，其為采用權(quán)利要求13 15中任一項(xiàng)所述的方法制造的酒精 飲料。
17. 評價方法，其為使用根據(jù)具有序列號1或序列號3的堿基序列、且編 碼糖原合成起始因子的基因的堿基序列設(shè)計(jì)的引物或探針，對被檢酵母的耐干 燥性及/或耐低溫保存性進(jìn)行評價的方法。
18. 評價方法，其為通過培養(yǎng)被檢酵母，對具有序列號1或序列號3的堿 基序列、且編碼糖原合成起始因子的基因的表達(dá)量進(jìn)行測定，來評價被檢酵母 的耐干燥性及/或耐低溫保存性的方法。
19. 酵母的選擇方法，其為通過培養(yǎng)被檢酵母，對權(quán)利要求6所述的蛋白 質(zhì)進(jìn)行定量，或者對具有序列號1或序列號3的堿基序列、且編碼糖原合成起始因子的基因的表達(dá)量進(jìn)行測定，來選擇與目標(biāo)耐干燥性及/或耐低溫保存性相 應(yīng)的所述蛋白質(zhì)的量或所述基因表達(dá)量的被檢酵母的方法。
20. 如權(quán)利要求19所述的酵母的選擇方法，其為通過培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母和被檢 酵母，對具有序列號1或序列號3的堿基序列、且編碼糖原合成起始因子的基 因在各酵母中的表達(dá)量進(jìn)行測定，來選擇與標(biāo)準(zhǔn)酵母相比該基因?yàn)楦弑磉_(dá)的被 檢酵母的方法。
21. 如權(quán)利要求19所述的酵母的選擇方法，其為通過培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母和被檢 酵母，對各酵母中的權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，來選擇該蛋白質(zhì)的量 比標(biāo)準(zhǔn)酵母多的被檢酵母的方法。
22. 酒精飲料制造方法，其特征在于，使用權(quán)利要求8 12中任一項(xiàng)所述 的酵母或根據(jù)權(quán)利要求19 21中任一項(xiàng)所述的方法選擇出的酵母。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼糖原合成起始因子的基因及其用途，特別涉及耐干燥性及/或耐低溫保存性良好的實(shí)用酵母、使用該酵母制造的酒精飲料、其制造方法等。更加具體地說，本發(fā)明涉及編碼釀造酵母的糖原合成起始因子Glg1p或Glg2p的GLG1或GLG2基因，特別涉及通過提高啤酒酵母的特征基因non-ScGLG1或non-ScGLG2的表達(dá)量從而使耐干燥性及/或耐低溫保存性提高的酵母、使用該酵母的酒精飲料制造方法等。
文檔編號C12N1/19GK101255430SQ200710084680
公開日2008年9月3日 申請日期2007年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月1日
發(fā)明者下永朋子, 中尾嘉宏, 兒玉由紀(jì)子 申請人:三得利株式會社