專利名稱：山羊S6K1基因cDNA編碼區(qū)核苷酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從山羊肌肉細胞分離的編碼S6K1蛋白的cDNA，更具體地說涉及編碼S6K1蛋白質(zhì)的cDNA編碼區(qū)1563bp的核苷酸序列和與它對應(yīng)的氨基酸序列。

背景技術(shù)：
S6K1是一個屬于AGC激酶家族的Ser/Thr激酶，蛋白包含了5個主要的結(jié)構(gòu)域，自N端始分別為NT(N-terminal domain)，catalytic domain，the linker region，autoinhibitory domain和CT(C-terminal domain)。哺乳動物中，目前已經(jīng)清楚牛的S6K1基因cDNA編碼區(qū)有1584個核苷酸組成，編碼了527個氨基酸殘基，兔、人和大鼠的S6K1基因編碼區(qū)由1578個核苷酸組成，編碼525個氨基酸殘基。
S6K1是細胞生長和細胞周期進程的正調(diào)節(jié)器，在mTOR信號通路中它接受來自上游的mTOR(themammalian target of rapamycin)的刺激，至少可以在3個方面發(fā)生作用1)對rpS6、eIF4B發(fā)生作用，促進占細胞內(nèi)總mRNA的15％-20％的5′TOP mRMA的翻譯，翻譯合成核糖體蛋白、延伸因子eEF1A和eEF2及mRNA穩(wěn)定蛋白PABP，進而調(diào)節(jié)細胞的形態(tài)大小、更新和存活；2)抑制IRS-1調(diào)節(jié)細胞對胰島素的敏感性；3)激活CREM促進基因轉(zhuǎn)錄。有實驗證明敲除了S6K1(S6K1-/-)的小鼠，成活率顯著降低，說明S6K1影響新生兒的存活率。
迄今，關(guān)于S6K1在哺乳動物細胞生長與增殖中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的研究已在人、鼠、牛等哺乳動物的細胞中開展并取得了許多成果，但尚未見有關(guān)山羊細胞中S6K1的研究報道，也未見有山羊S6K1基因的cDNA核苷酸序列和與它對應(yīng)的氨基酸序列的報道。
在各種情況下，有重要的原因研究和開發(fā)與山羊S6K1蛋白相關(guān)的基因克隆及其重組表達，因為研究清楚山羊的S6K1基因和蛋白的功能，可以用在提高細胞培養(yǎng)、胚胎移植和發(fā)育及出生后新生兒的存活的質(zhì)量等方面，由重組S6K1蛋白制備的抗體可以檢測S6K1基因在不同種類的細胞、不同的細胞周期及個體的不同發(fā)育階段的表達情況。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人已經(jīng)努力從山羊的不同組織細胞中分離S6K1基因。作為結(jié)果，本發(fā)明人從山羊肌肉組織細胞分離了S6K1基因的cDNA編碼區(qū)1563bp片段，并且確定了它的核苷酸序列和由此推斷的氨基酸序列。本發(fā)明人通過比對已知的人、大鼠、兔、牛的S6K1基因的核苷酸序列，找到保守區(qū)，然后根據(jù)牛的S6K1基因(AY396564)cDNA編碼區(qū)的序列，在不打破氨基酸編碼的前提下設(shè)計上游引物(5’端從起始密碼子開始)，下游引物5’端起始于牛S6K1基因的1563bp并加上終止密碼子TGA，設(shè)計出了一對用于通過RT-PCR方法擴增山羊S6K1基因cDNA編碼區(qū)片段的引物(上游引物稱為P1，下游引物稱為P2)，并應(yīng)用這對引物擴增出了特異性片段，測序后得到了山羊S6K1基因的cDNA編碼區(qū)1563bp片段，序列分析表明與牛的序列(AY396564)同源性為99％(1550/1563)，且保持了正確的編碼，推導(dǎo)出的由此序列編碼的氨基酸序列與牛的相比有2個氨基酸的差別。這一cDNA片段稱為“gS6K1”。
所以，本發(fā)明的目的是通過已知的不同物種的mTOR的核苷酸序列設(shè)計引物，然后通過RT-PCR方法克隆山羊S6K1基因的cDNA編碼區(qū)片段。對該片段測序后提供編碼山羊S6K1蛋白的基因的cDNA的編碼區(qū)1563bp的核苷酸序列和由此推斷的氨基酸序列(序列詳見序列表)。
附圖的簡要說明 從下面給出的說明結(jié)合附圖，本發(fā)明的上面目的的特征將變的明了。其中

圖1顯示了牛S6K1基因的cDNA的核苷酸序列(GenBank登陸號AY396564)。
圖2顯示了1563bp的山羊S6K1基因的cDNA的編碼區(qū)核苷酸序列(SEQ ID NO1)和由此推斷的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖3是顯示從山羊肌肉組織分離的總RNA的RT-PCR的結(jié)果(1563bp的cDNA gS6K1)的電泳圖。
圖4是顯示以質(zhì)粒pMD19-T-gS6K1為模板，以P1、P2為引物進行PCR鑒定的電泳圖。
圖5是顯示將質(zhì)粒pMD19-T-gS6K1進行EcoRI酶切鑒定的電泳圖。
圖6顯示了山羊S6K1基因cDNA的編碼區(qū)核苷酸序列與牛(AY396564)的S6K1基因cDNA的序列的比較。

具體實施例方式 為了從山羊組織細胞中分離S6K1基因，本發(fā)明人首先按照提取RNA的標準要求采集內(nèi)蒙古白絨山羊(Inner Mongolia Cashmere Goat，Capra hircus)的各類組織樣本。即，現(xiàn)場宰殺內(nèi)蒙古白絨山羊后立即采取肌肉、肝、腎、淋巴結(jié)、脾及睪丸等組織塊(將組織塊大小控制在30～50μg)，放入冷凍管后立即入液氮保存，帶回實驗室后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。然后利用TaKaRa的總RNA提取試劑盒(TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用說明書的操作程序提取山羊肌肉組織、睪丸組織、腎組織、肝組織、淋巴結(jié)組織及脾臟組織的總RNA，最后根據(jù)文獻報道的哺乳動物S6K1基因在各類組織中的表達情況和總RNA提取結(jié)果，選定以肌肉組織總RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄操作，得到cDNA第一鏈。再以此cDNA第一鏈為模板，利用特異性引物P1、P2進行PCR擴增，得到目的片段。之后將電泳后分離的目的片段切膠回收，測定雙鏈cDNA的濃度，與pMD19-T克隆載體連接構(gòu)建成質(zhì)粒pMD19-T-gS6K1。
為了檢測連接反應(yīng)是否成功和擴增質(zhì)粒pMD19-T-gS6K1，將其轉(zhuǎn)化Ecoli DH5α感受態(tài)細胞，然后將此被質(zhì)粒pMD19-T-gS6K1轉(zhuǎn)化了的Ecoli DH5α細胞涂在含有氨芐青霉素的選擇性平板上，并同時進行藍、白菌落篩選。37℃培養(yǎng)16小時后選取白色的重組菌落再進行平板劃線培養(yǎng)12小時。作為結(jié)果，初步認定白色菌落為獲得的重組菌落。
重組菌落和重組質(zhì)粒pMD19-T-gS6K1的進一步鑒定則分為三個步驟進行。首先挑取劃線培養(yǎng)的菌落用Kieser法提質(zhì)粒，再以此質(zhì)粒為模板，用特異性引物P1、P2進行PCR鑒定，陽性的初步認定為重組質(zhì)粒，其相應(yīng)的菌落則為重組菌落。然后，再挑取初步認定為重組的菌落進行液體培養(yǎng)，精提質(zhì)粒，再以此精提的質(zhì)粒為模板進行PCR鑒定，陽性的質(zhì)粒進一步進行EcoR I酶切鑒定。經(jīng)過了PCR和酶切雙重鑒定的質(zhì)粒確定為重組質(zhì)粒pMD19-T-gS6K1。作為結(jié)果，得到了顯示陽性反應(yīng)的重組質(zhì)粒和重組菌落。將含有重組質(zhì)粒pMD19-T-gS6K1的Ecoli DH5α液體培養(yǎng)的樣品送上海生工生物工程有限公司測序。作為結(jié)果，獲得了1563bp的山羊S6K1基因cDNA編碼區(qū)的核苷酸序列。
顯示上面提到的特征的本發(fā)明的特異性PCR引物P1和P2，可以利用RT-PCR方法擴增出山羊的S6K1基因的cDNA編碼區(qū)片段。根據(jù)本發(fā)明獲得的羊S6K1基因cDNA的核苷酸序列可進一步通過RT-PCR或雜交的方法檢測S6K1基因的組織表達特異性，也可進一步實現(xiàn)羊S6K1基因全長cDNA的克隆。將本發(fā)明的cDNA重組到表達載體上可能會表達出完整的S6K1蛋白，進而可用于抗體生產(chǎn)，檢測山羊各類細胞和組織、早期胚胎、個體在不同狀態(tài)下的S6K1基因的表達情況等等。
在下面的實施例中進一步說明了本發(fā)明，但這并不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1山羊S6K1基因的cDNA編碼區(qū)1563bp片段的克隆 為了克隆來自山羊肌肉組織細胞的S6K1基因包含1563bp編碼區(qū)的cDNA，根據(jù)圖1公開的核苷酸序列(AY396564)，首先制備允許擴增1563bp的cDNA的PCR引物，即上游引物5′ATGAGGCGACGAAGGAGGC 3′和下游引物5′CAGGTGCTCTGGTCGTTTG 3′。然后在上游引物5′端加上BamHI酶切位點和保護性堿基GC，在下游引物5′端加上終止密碼子TGA和EcoRI酶切位點和保護性堿基GC，即有上游引物P15′GC GGATCC ATGAGGCGACGAAGGAGGC 3′，下游引物P25′GC GAATTC TCA CAGGTGCTCTGGTCGTTTG 3′。
為了利用RT-PCR方法克隆S6K1基因的cDNA，從山羊肌肉組織分離總RNA，利用TaKaRa總RNA提取試劑盒(TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用說明書的操作程序提取山羊肌肉組織總RNA，進行電泳檢測和紫外測定RNA濃度后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。然后，利用TaKaRa的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶并按照使用說明書的操作程序進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA第一鏈。
以上面得到的cDNA第一鏈為模板，P1、P2為引物，利用TaKaRa LATaqDNA聚合酶進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為10μl模板cDNA 1μl，2×GC bufferII(5mM Mg2+)5μl，dNTP(各2.5mM)1.6μl，P1(10pmol/μl)0.5μl，P2(10pmol/μl)0.5μl，LA Taq酶(5U/μl)0.2μl，ddH2O 1.2μl。反應(yīng)循環(huán)為94℃4分鐘；94℃1分鐘，58℃1分鐘，72℃，2分鐘，35個循環(huán)；72℃10分鐘。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物10μl進行0.7％瓊脂糖凝膠電泳(0.5％TAE，電壓8v/cm，1.5h)。電泳結(jié)束，0.5μg/ml的EB染色液中染色20分鐘，再清水浸泡10分鐘后置于凝膠成像儀觀察照相。作為結(jié)果，得到了1563bp的特異性目的片段(參見圖3)。
為了將獲得的1563bp的cDNA特異性目的片段連接到pMD19-T克隆載體上，首先將電泳分離的1563bp的cDNA特異性目的片段進行切膠，然后利用膠回收試劑盒回收目的片段，紫外測定濃度后按照pMD19-T克隆載體說明書操作程序完成連接。為了檢測連接反應(yīng)是否成功和進一步擴增質(zhì)粒pMD19-T-gS6K1，將其轉(zhuǎn)化Ecoli DH5α感受態(tài)細胞，然后將此被質(zhì)粒pMD19-T-gS6K1轉(zhuǎn)化了的Ecoli DH5α細胞涂在含有氨芐青霉素和X-gal的選擇性平板上，并同時涂上IPTG進行誘導(dǎo)，實現(xiàn)藍、白菌落篩選。涂布的平板37℃培養(yǎng)16小時后選取白色的重組菌落再進行平板劃線培養(yǎng)12小時。作為結(jié)果，得到了白色的重組菌落。
進一步的工作是對重組菌落和重組質(zhì)粒進行鑒定(理論上將只有含有重組質(zhì)粒的菌落才是真正的重組菌落)。首先將白色的重組菌落進行劃線培養(yǎng)12小時，然后挑取菌落，用Kieser法提質(zhì)粒。再以此質(zhì)粒為模板，用特異性引物P1、P2進行PCR鑒定。對陽性的菌落進行搖床振蕩液體培養(yǎng)12小時，精提質(zhì)粒，紫外檢測濃度并進行1％瓊脂糖凝膠電泳(0.5％TAE，電壓8v/cm，1.5h)檢測，作為結(jié)果，得到了與預(yù)期結(jié)果大小相符的質(zhì)粒。最后一步是對精提的質(zhì)粒利用PCR反應(yīng)和酶切反應(yīng)進行二次鑒定。PCR反應(yīng)以質(zhì)粒為模板，以P1、P2為引物，反應(yīng)體系為10μl質(zhì)粒DNA 0.1μl，2×GC bufferII(5mM Mg2+)5μl，dNTP(各2.5mM)1.6μl，P1(10pmol/μl)0.5μl，P2(10pmol/μl)0.5μl，LATaq酶(5U/μl)0.2μl，ddH2O 2.1μl。反應(yīng)循環(huán)為94℃4分鐘；94℃1分鐘，58℃1分鐘，72℃，2分鐘，35個循環(huán)；72℃10分鐘。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物10μl進行0.7％瓊脂糖凝膠電泳(0.5％TAE，電壓8v/cm，1.5h)。電泳結(jié)束，0.5μg/ml的EB染色液中染色20分鐘，再清水浸泡10分鐘后置于凝膠成像儀觀察照像。作為結(jié)果，得到了1563bp的特異性目的片段(參見圖4)。酶切鑒定采用TaKaRa EcoR I單酶切，由于設(shè)計引物時加了一個EcoRI酶切位點，同時pMD19-T載體上也有一個EcoRI酶切位點，故根據(jù)克隆片段插入T載體的方向，切出的片段有可能是一段或兩段。作為結(jié)果，兩個克隆的單酶切分別得到了與預(yù)期結(jié)果大小相符的一個片段和兩個片段(參見圖5)。
經(jīng)過兩次鑒定的重組質(zhì)粒，與其相應(yīng)的菌落即是重組菌落。將液體培養(yǎng)的重組菌落樣品1ml送往上海生工生物工程有限公司用測序。作為結(jié)果，獲得了1563bp的山羊S6K1基因的cDNA編碼區(qū)1563bp片段的核苷酸序列(參見圖2)。
實施例2山羊S6K1基因的cDNA的核苷酸序列 圖2顯示了實施例1中獲得的cDNA克隆的核苷酸序列(SEQ ID NO1)，和由此推斷的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。在圖2中，顯示的序列是S6K1基因的核苷酸序列，它包括了cDNA編碼區(qū)的1563bp的核苷酸序列，編碼形成分子量推斷的58.6KDa的成熟蛋白質(zhì)的521個氨基酸。
圖6顯示了山羊S6K1基因cDNA的核苷酸序列與牛(AY396564)的S6K1基因cDNA的核苷酸序列的比較。表明1)山羊S6K1基因cDNA的核苷酸序列與牛的S6K1基因cDNA的核苷酸序列有99％的同源性。由山羊的這段核苷酸序列推導(dǎo)出的氨基酸序列與牛的S6K1蛋白相同位置片段的氨基酸序列相比(AAR01025)有2個氨基酸的差別，同源性99.6％(519/521)。
正如清楚說明的和如上說明，本發(fā)明提供利用RT-PCR法克隆山羊S6K1基因cDNA編碼區(qū)的引物和編碼山羊的S6K1蛋白質(zhì)的包括1563bp的cDNA的核苷酸序列和由此推斷的氨基酸序列。此cDNA包括了1563bp的核苷酸序列，它編碼含有521個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，經(jīng)過進一步的改造后它可以亞克隆到如pET或pcDNA3.1等原核或真核表達載體上進行表達。重組的cDNA片段可能會表達出完整的S6K1蛋白，進而可用于抗體生產(chǎn)，檢測山羊各類細胞和組織、早期胚胎、個體在不同狀態(tài)下的S6K1基因的表達情況等等。
1.山羊S6K1 cDNA的編碼區(qū)片段，它的核苷酸序列如SEQ ID NO1所述。
2.由cDNA編碼區(qū)的核苷酸序列推斷出的山羊S6K1蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO2所述。
山羊S6K1基因cDNA編碼區(qū)核苷酸序列.ST25
SEQUENCE LISTING
<110>旭，日干
吳，應(yīng)積
王，志鋼
<120>山羊S6K1基因cDNA編碼區(qū)核苷酸序列
<130>NO
<140>NO
<141>2007-02-02
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1563
<212>DNA
<213>Capra hircus
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1563)
<400>1
atg agg cga cga agg agg cgg gac ggt ttc tac ccg gcg ccg gac ttc 48
Met Arg Arg Arg Arg Arg Arg Asp Gly Phe Tyr Pro Ala Pro Asp Phe
1 5 10 15
cga gac agg gaa gct gag gac atg gca ggg gtg ttt gac ata gac ctg 96
Arg Asp Arg Glu Ala Glu Asp Met Ala Gly Val Phe Asp Ile Asp Leu
20 25 30
gac cag ccg gag gac gcg ggc tct gag gat gag ctg gag gag ggg ggt144
Asp Gln Pro Glu Asp Ala Gly Ser Glu Asp Glu Leu Glu Glu Gly Gly
35 40 45
cag tta aat gaa agc atg gac cat ggg gga gtt gga cca tat gaa ctt192
Gln Leu Asn Glu Ser Met Asp His Gly Gly Val Gly Pro Tyr Glu Leu
50 55 60
ggc atg gag cat tgt gag aaa ttt gaa atc tca gaa act agt gtg aac240
Gly Met Glu His Cys Glu Lys Phe Glu Ile Ser Glu Thr Ser Val Asn
65 70 75 80
aga ggg cca gaa aaa atc aga cca gaa cgt ttt gag cta ctt cga gta288
Arg Gly Pro Glu Lys Ile Arg Pro Glu Arg Phe Glu Leu Leu Arg Val
85 90 95
ctt ggt aaa ggg ggc tat gga aag gtt ttt caa gta cga aaa gta aca336
Leu Gly Lys Gly Gly Tyr Gly Lys Val Phe Gln Val Arg Lys Val Thr
100 105 110
gga gca aat acc ggg aaa ata ttt gcc atg aag gtg ctt aaa aag gca384
Gly Ala Asn Thr Gly Lys Ile Phe Ala Met Lys Val Leu Lys Lys Ala
115 120 125
atg ata gta aga aat gct aaa gat aca gct cat aca aaa gca gaa cgg432
Met Ile Val Arg Asn Ala Lys Asp Thr Ala His Thr Lys Ala Glu Arg
130 135 140
aat att ctg gag gaa gta aag cat cct ttc att gtg gat tta att tat480
Asn Ile Leu Glu Glu Val Lys His Pro Phe Ile Val Asp Leu Ile Tyr
145 150 155 160
gcc ttt cag acc ggt gga aaa ctc tac ctc atc ctt gag tat ctc ggc528
Ala Phe Gln Thr Gly Gly Lys Leu Tyr Leu Ile Leu Glu Tyr Leu Gly
165 170 175
gga gga gaa tta ttt atg cag tta gaa aga gaa gga ata ttt atg gaa576
Gly Gly Glu Leu Phe Met Gln Leu Glu Arg Glu Gly Ile Phe Met Glu
180 185 190
gac aca gcc tgc ttt tac ttg gca gaa atc tcc atg gct ttg ggg cat 624
Asp Thr Ala Cys Phe Tyr Leu Ala Glu Ile Ser Met Ala Leu Gly His
195 200 205
tta cat caa aag ggg atc atc tac aga gac ctg aag ccg gag aat atc 672
Leu His Gln Lys Gly Ile Ile Tyr Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Ile
210 215 220
atg ctt aat cac caa ggt cac gtc aaa cta aca gat ttt gga cta tgc 720
Met Leu Asn His Gln Gly His Val Lys Leu Thr Asp Phe Gly Leu Cys
225 230 235 240
aaa gaa tct att cat gac gga aca gtc aca cac acc ttt tgt gga aca 768
Lys Glu Ser Ile His Asp Gly Thr Val Thr His Thr Phe Cys Gly Thr
245 250 255
ata gaa tac atg gcc cct gag atc ttg atg aga agt ggc cac aat cgt 816
Ile Glu Tyr Met Ala Pro Glu Ile Leu Met Arg Ser Gly His Asn Arg
260 265 270
gct gtg gat tgg tgg agt ttg gga gca tta atg tat gac atg ctg act 864
Ala Val Asp Trp Trp Ser Leu Gly Ala Leu Met Tyr Asp Met Leu Thr
275 280 285
gga gca ccc ccg ttc act ggg gag aat aga aag aaa aca att gac aaa 912
Gly Ala Pro Pro Phe Thr Gly Glu Asn Arg Lys Lys Thr Ile Asp Lys
290 295 300
atc ctc aaa tgt aaa ctc aat ttg cct ccc tac ctc acg caa gaa gcc 960
Ile Leu Lys Cys Lys Leu Asn Leu Pro Pro Tyr Leu Thr Gln Glu Ala
305 310 315 320
aga gat ctg ctt aaa aag ctg ctg aaa cga aat gct gct tct cgt ctt1008
Arg Asp Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Arg Asn Ala Ala Ser Arg Leu
325 330 335
gga gct ggt cct ggg gat gct gga gaa gtt caa gct cat cca ttc ttc1056
Gly Ala Gly Pro Gly Asp Ala Gly Glu Val Gln Ala His Pro Phe Phe
340 345 350
aga cat att aac tgg gaa gaa ctg ctg gct cgg aag gtg gag ccc ccc1104
Arg His Ile Asn Trp Glu Glu Leu Leu Ala Arg Lys Val Glu Pro Pro
355 360 365
ttc aaa cct ctt ttg caa tca gaa gag gat gtg agt cag ttt gat tcc1152
Phe Lys Pro Leu Leu Gln Ser Glu Glu Asp Val Ser Gln Phe Asp Ser
370 375 380
aag ttt aca cgt cag aca cct gtt gac agc cca gat gac tca gct ctc1200
Lys Phe Thr Arg Gln Thr Pro Val Asp Ser Pro Asp Asp Ser Ala Leu
385 390 395 400
agt gaa agt gcc aac cag gtc ttt ctg ggt ttt acg tat gtg gct cca1248
Ser Glu Ser Ala Asn Gln Val Phe Leu Gly Phe Thr Tyr Val Ala Pro
405 410 415
tct gta ctt gaa agc gtg aaa gaa aag ttt tcc ttt gaa cca aaa atc1296
Ser Val Leu Glu Ser Val Lys Glu Lys Phe Ser Phe Glu Pro Lys Ile
420 425 430
cga tcc cct cga aga ttt att ggc agc cca cga aca cct gtc agc cca1344
Arg Ser Pro Arg Arg Phe Ile Gly Ser Pro Arg Thr Pro Val Ser Pro
435 440 445
gtc aaa ttt tct cct ggg gat ttc tgg gga aga ggt gct tca gcc agc1392
Val Lys Phe Ser Pro Gly Asp Phe Trp Gly Arg Gly Ala Ser Ala Ser
450 455 460
acg gca aat ccg cag acg cct gtg gaa tac ccc atg gag aca agt ggg1440
Thr Ala Asn Pro Gln Thr Pro Val Glu Tyr Pro Met Glu Thr Ser Gly
465 470 475 480
ata gag cag atg gac gtg aca atg agc ggg gag gct tca gca ccg ctt1488
Ile Glu Gln Met Asp Val Thr Met Ser Gly Glu Ala Ser Ala Pro Leu
485 490 495
cca ata cga cag cca aac tcc gga ccg tac aaa aag caa gct ttt ccc1536
Pro Ile Arg Gln Pro Asn Ser Gly Pro Tyr Lys Lys Gln Ala Phe Pro
500 505 510
atg atc tcc aaa cga cca gag cac ctg1563
Met Ile Ser Lys Arg Pro Glu His Leu
515 520
<210>2
<211>521
<212>PRT
<213>Capra hircus
<400>2
Met Arg Arg Arg Arg Arg Arg Asp Gly Phe Tyr Pro Ala Pro Asp Phe
1 5 10 15
Arg Asp Arg Glu Ala Glu Asp Met Ala Gly Val Phe Asp Ile Asp Leu
20 25 30
Asp Gln Pro Glu Asp Ala Gly Ser Glu Asp Glu Leu Glu Glu Gly Gly
35 40 45
Gln Leu Asn Glu Ser Met Asp His Gly Gly Val Gly Pro Tyr Glu Leu
50 55 60
Gly Met Glu His Cys Glu Lys Phe Glu Ile Ser Glu Thr Ser Val Asn
65 70 75 80
Arg Gly Pro Glu Lys Ile Arg Pro Glu Arg Phe Glu Leu Leu Arg Val
85 90 95
Leu Gly Lys Gly Gly Tyr Gly Lys Val Phe Gln Val Arg Lys Val Thr
100 105 110
Gly Ala Asn Thr Gly Lys Ile Phe Ala Met Lys Val Leu Lys Lys Ala
115 120 125
Met Ile Val Arg Asn Ala Lys Asp Thr Ala His Thr Lys Ala Glu Arg
130 135 140
Asn Ile Leu Glu Glu Val Lys His Pro Phe Ile Val Asp Leu Ile Tyr
145 150 155 160
Ala Phe Gln Thr Gly Gly Lys Leu Tyr Leu Ile Leu Glu Tyr Leu Gly
165 170 175
Gly Gly Glu Leu Phe Met Gln Leu Glu Arg Glu Gly Ile Phe Met Glu
180 185 190
Asp Thr Ala Cys Phe Tyr Leu Ala Glu Ile Ser Met Ala Leu Gly His
195 200 205
Leu His Gln Lys Gly Ile Ile Tyr Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Ile
210 215 220
Met Leu Asn His Gln Gly His Val Lys Leu Thr Asp Phe Gly Leu Cys
225 230 235 240
Lys Glu Ser Ile His Asp Gly Thr Val Thr His Thr Phe Cys Gly Thr
245 250 255
Ile Glu Tyr Met Ala Pro Glu Ile Leu Met Arg Ser Gly His Asn Arg
260 265 270
Ala Val Asp Trp Trp Ser Leu Gly Ala Leu Met Tyr Asp Met Leu Thr
275 280 285
Gly Ala Pro Pro Phe Thr Gly Glu Asn Arg Lys Lys Thr Ile Asp Lys
290 295 300
Ile Leu Lys Cys Lys Leu Asn Leu Pro Pro Tyr Leu Thr Gln Glu Ala
305 310 315 320
Arg Asp Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Arg Asn Ala Ala Ser Arg Leu
325 330 335
Gly Ala Gly Pro Gly Asp Ala Gly Glu Val Gln Ala His Pro Phe Phe
340 345 350
Arg His Ile Asn Trp Glu Glu Leu Leu Ala Arg Lys Val Glu Pro Pro
355 360 365
Phe Lys Pro Leu Leu Gln Ser Glu Glu Asp Val Ser Gln Phe Asp Ser
370 375 380
Lys Phe Thr Arg Gln Thr Pro Val Asp Ser Pro Asp Asp Ser Ala Leu
385 390 395 400
Ser Glu Ser Ala Asn Gln Val Phe Leu Gly Phe Thr Tyr Val Ala Pro
405 410 415
Ser Val Leu Glu Ser Val Lys Glu Lys Phe Ser Phe Glu Pro Lys Ile
420 425 430
Arg Ser Pro Arg Arg Phe Ile Gly Ser Pro Arg Thr Pro Val Ser Pro
435 440 445
Val Lys Phe Ser Pro Gly Asp Phe Trp Gly Arg Gly Ala Ser Ala Ser
450 455 460
Thr Ala Asn Pro Gln Thr Pro Val Glu Tyr Pro Met Glu Thr Ser Gly
465 470 475 480
Ile Glu Gln Met Asp Val Thr Met Ser Gly Glu Ala Ser Ala Pro Leu
485 490 495
Pro Ile Arg Gln Pro Asn Ser Gly Pro Tyr Lys Lys Gln Ala Phe Pro
500 505 510
Met Ile Ser Lys Arg Pro Glu His Leu
515 520
權(quán)利要求
獨立權(quán)利要求
本發(fā)明涉及一段從山羊肌肉細胞分離的編碼S6K1蛋白的cDNA，更具體地說涉及編碼S6K1蛋白質(zhì)的cDNA編碼區(qū)核苷酸序列和與它對應(yīng)的氨基酸序列。目前應(yīng)用RT-PCR方法克隆基因并獲得相應(yīng)的核苷酸序列是獲得基因(cDNA)核苷酸序列的常用方法。本項發(fā)明設(shè)計了一對引物并應(yīng)用這對引物通過RT-PCR方法擴增出了山羊S6K1基因cDNA的編碼區(qū)特異性片段，經(jīng)過測序后得到這一片段的1563bp的核苷酸序列，其特征是在還沒有羊S6K1基因核苷酸序列的情況下，通過比較已知的人、大鼠、兔、牛的S6K1基因的核苷酸序列，找到保守區(qū)，然后根據(jù)牛S6K1基因cDNA序列在不打破氨基酸編碼的前提下設(shè)計PCR引物，進而通過RT-PCR方法擴增出了山羊S6K1基因cDNA的編碼區(qū)片段，測序后得到了1563bp的核苷酸序列和與它對應(yīng)的氨基酸序列，這一山羊S6K1基因cDNA編碼區(qū)片段的核苷酸序列和與它對應(yīng)的氨基酸序列在國內(nèi)外是首次獲得。
基于上述說明的本發(fā)明的技術(shù)特征，本發(fā)明的獨立權(quán)利要求表述為一種自山羊分離的多核苷酸序列和與它對應(yīng)的氨基酸序列，是下列序列之一1)序列表中SEQ ID NO1的cDNA序列；2)與序列表中SEQID NO1的cDNA序列對應(yīng)的標注為SEQ ID NO2的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及從山羊肌肉細胞分離的編碼S6K1蛋白的cDNA的核苷酸序列和與它對應(yīng)的氨基酸序列。本發(fā)明通過比對已知的人、大鼠、兔、牛S6K1基因cDNA的核苷酸序列，找到保守區(qū)，然后根據(jù)牛S6K1基因cDNA序列(GenBank登陸號AY396564)設(shè)計出了一對用于RT-PCR擴增羊S6K1基因cDNA編碼區(qū)片段的引物并用這對引物通過RT-PCR方法擴增出了特異性片段，測序后得到了羊S6K1基因cDNA的編碼區(qū)的1563bp的核苷酸序列和與它對應(yīng)的氨基酸序列。獲得的這1563bp的核苷酸序列可進一步用于羊S6K1基因全長cDNA的克隆及用于通過RT-PCR或雜交的方法檢測S6K1基因的組織表達特異性，也可用于重組表達得到蛋白后制備檢測S6K1的抗體。
文檔編號C12N15/12GK101245345SQ20071008451
公開日2008年8月20日 申請日期2007年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月12日
發(fā)明者旭日干, 吳應(yīng)積, 王志鋼 申請人:旭日干, 吳應(yīng)積, 王志鋼