專利名稱：雞痘病毒雙基因表達載體(pg7.5n)的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領域，具體涉及一種雞痘病毒雙基因表達 載體、其構(gòu)建方法及應用。背暴技術(shù)痘病毒科是一大群、專性的病毒，直徑300~400nm,脂質(zhì)蛋白 外殼，包繞著一個復雜的核心結(jié)構(gòu)此結(jié)構(gòu)含有一個線性近20kb雙鏈 DNA分子，編碼多個亞單位，DNA依賴的RNA聚合酶，轉(zhuǎn)錄因子， 帽結(jié)構(gòu)和甲基化酶，多聚A聚合酶，都在病毒核心中包裝，并轉(zhuǎn)譯 成mRNAs。雞痘病毒(Fowlpox Virus, FPV )屬痘病毒科禽痘病毒 屬。病毒粒子核心含有雙股線狀DNA， G+C=35%,基因組長約 300kb。其自然條件下只能感染禽類，但能對哺乳動物細胞產(chǎn)生流產(chǎn) 性感染，不產(chǎn)生有感染性的病毒粒子，但能表達、提呈FPV表達的 蛋白，刺激機體產(chǎn)生對FPV表達蛋白的免疫。因此FPV不僅可以作 為禽類基因工程活疫苗載體，而且可以作為哺乳動物非復制型活疫 苗載體。、目前，現(xiàn)有的雞痘病毒載體還不完善，如載體太大，可載的外 源基因長度有限，可用的酶切位點不多，操作繁瑣。而且，雙基因 表達載體多為順式表達，對第二個基因的表達量有一定的降低。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種雞痘病毒雙基因表達載體 (PG7.5N);本發(fā)明的另 一個目的在于提供上述載體的構(gòu)建方法； 本發(fā)明的再一個目的在于提供上述載體在真核表達和構(gòu)建重組 病毒基因疫苗中的應用。本發(fā)明的表達載體具有序列表SEQ ID NO.l所示的序列，其包 括啟動子P7.5、 LacZ基因、位于LacZ基因上的多克隆位點、稀有 酶切位點Not 1、雞痘病毒DNA同源臂F11L1和F11L2、 AmpK抗 性標記基因、復制起點(ori)。其中F11L1和F11L2為載體的同源 臂，F(xiàn)11L1的跨度是2169-2637，長為468bp; F11L2的跨度是 3082-3592，長為510bp; Amp + ori的跨度是1 - 2168; Notl跨度是 2638 - 2646; P7.5LacZ跨度是2650-3068。 F11L基因為痘病毒的非 必需基因，長約1000bp。對于上述的抗性標記，其還可以為Kai^或Te^等抗性標記基因。 本發(fā)明還提供了構(gòu)建上述載體的方法，其包括如下步驟1) 以pGEM4z為模板，Amp + ori F和Amp +ori R為引物，擴 增出pGEM4z的Amp + ori片段；以雞痘病毒DNA為模板，F(xiàn)llLl F 和FllLl+Not 1 R為引物，擴增出雞痘病毒FllLl同源臂；連接Amp + ori片段和FllLl同源臂，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，篩選出陽性菌 落，擴大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，得到pAmp+ori+FllLl Notl;2) 以pGEM4z為模板，P75LacZF和LacZR為引物，擴增出 P7,5LacZ片段；線性化pAmp+ori+ FllLl Not 1并與P7.5LacZ片段 連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，篩選出陽性菌落，擴大培養(yǎng)后抽提 質(zhì)粒得到pAmp+ori+ FllLl Not l+P7.5LacZ;3 )以雞痘病毒DNA為模板，PolyA+ F11L2F和F11L2為引物， 擴增出雞痘病毒F11L2同源臂；線性化pAmp+ori+ FllLl Notl+P7.5LacZ并與F11L2同源臂連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞， 篩選出陽性菌落，擴大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，即得到雞痘病毒雙基因表 達載體。上面所述的引物分別是Amp + ori F: 5，gcgtaatcatggtcatagc3， Amp+oriR: 5'acgtcaggtggcactttt3，P7,5LacZ F:5 ，aaaaattgaaaaactagtctaatttattgcacggatgaccatgattacgccaag3 ，LacZ R: 5 ， ctatgcggcatcagagca3 ，F(xiàn)11L1 F: 5'ctagatgaacatgacacc3，F(xiàn)llLl+Notl R: 5'ttttgcggccgcgcattacgtgttgtttgtt3，PolyA+F11L2 F: 5 ，幼幼a幼幼幼3犯gat33tttctgcto3'F11L2 R: 5,cttctttagaggaaatcg3， 上述表達載體，與雞痘病毒重組后，可以獲得重組病毒 FPV-PG7.5LacZ，其在含有X-gal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)呈藍色。重組病毒 經(jīng)過裝有目的基因的表達載體穿梭后(裝有目的基因的兩臂之間的 片段相交換)，挑選白色蝕斑，經(jīng)純化的白色蝕斑即為可以表達目的 基因的重組雞痘病毒。該重組病毒除了表達目的基因外不表達其他 外源性蛋白，可以降低接種重組病毒后機體的應激反應。上述重組病毒FPV-PG7,5LacZ亦可作為病毒載體。該重組病毒， 具有GC含量高的Notl稀有酶切位點，由于痘病毒本身基因組長度 為260kb-280kb,該病毒可以裝載比較大的DNA片段，還可以用作 裝載在細菌內(nèi)不穩(wěn)定的DNA序列。在本發(fā)明表達載體的Notl位點裝入連有P7.5啟動子和polyA尾 巴的目的基因片段，將該穿梭載體穿梭雞痘活疫苗(I )純化出藍 色蝕斑病毒，之后再將另 一個目的基因裝入已經(jīng)在Notl裝上一個目 的基因的表達載體的多克隆位點上，將這個質(zhì)粒與之前純化的籃斑 毒再重組，挑取白色蝕斑，純化后的白色蝕斑毒即為可以表達兩個 基因的重組痘病毒。并且，上述連接有？7.5啟動子和？0^八尾巴的 目的基因片斷具有一定的靈活性，可以根據(jù)需要將P7.5替換為不同 的啟動子，并且可以反向插入到載體中，采用反式表達的方法提高 表達效率。本發(fā)明構(gòu)建的雙基因表達載體，最大限度地減少了載體長度，從而可以容納更大的外源基因；增加了可用酶切位點數(shù)量，方便克 隆不同的外源基因；對插入位點Notl處的啟動子不作限定，可以自 由選擇與外源基因搭配的啟動子，可以用于啟動子效率的評估，從 而可以提髙表達效率；采用反式表達的方法，從而提高了外源基因 的表達效率。


附圖l是本發(fā)明實施例l表達載體的結(jié)構(gòu)示意圖，圖中F11L1、 F11L2表示同源臂，AmpK是卡那霉素抗性標記基因，Ori表示復制 起點，P7,5是啟動子，MCS表示多克隆位點；圖2是PG75-S1-N質(zhì)粒的構(gòu)建圖。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明，但不用來限制本發(fā)明 的范圍。 實施例l本實施例將以SEQ ID NO.l所示的表達載體為例來具體描述其 構(gòu)建方法及應用。1. 材料雞痘活疫苗(I )購自乾元浩南京生物制藥廠。pGEM4z購自 華美生物工程有限公司。6孔細胞培養(yǎng)板、DMEM、 Opti-MEM和 Lipofatami股2000購自Invitrogen。 X-gal,低熔點瓊脂糖，T4多聚核 苷酸激酶、PrimeSTAR HS DNA polymerase和DNA Ligation Kit(Mighty Mix)購自Takara。 Gel Extraction Kit和Plasmid mini Kit(200)購自Omega。 JM109感受態(tài)細胞購自Takam。所用引物與說 明書中相同。2. 構(gòu)建方法2.1穿梭質(zhì)粒構(gòu)建方法以pGEM4z為模板，Amp + ori F和Amp +ori R為引物，98°C15s， 50匸15s， 72€ 2min, 30個循環(huán)，擴增出pGEM4z的Amp+ ori片段。以雞痘活疫苗為模板，F(xiàn)llLlF和FllLl+NotlR為引物， 98°C 15s, 50°C 15s， 72°C 40s, 30個循環(huán),擴增出雞痘病毒F11L1 同源臂?；厥誂mp和ori片段和FllLl同源臂，按T4多聚核苷酸 激酶的說明書搡作磷酸化FllLl同源臂的5'端羥基，按照DNA Ligation Kit(Mighty Mix)說明書搡作將磷酸化的FllLl同源臂和 Amp和ori片段連接后轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)細胞，培養(yǎng)14-16小時 后，挑取可疑陽性菌落于含有Ampicilline的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 4小時，以F11L1F和Amp+oriR為檢測引物，對可疑菌落進行菌液 PCR檢測，鑒定陽性菌落后，擴大培養(yǎng)陽性菌落后利用Plasmidmini Kit(200)抽取陽性質(zhì)粒，該質(zhì)粒即為pAmp+ori+FllLl Notl。以pAmp+ori+FllLl Notl為模板，Amp + ori F和FllLl+Notl R 為引物，98°C 15s， 50°C 15s, 72°C 2min20s, 30個循環(huán)，把 pAmp+ori+FllLl Notl線性化。以pGEM4z為模板，P7.5LacZ F和 LacZR為引物，98°C 15s, 45°C 15s, 72°C 40s， 30個循環(huán)，擴增 出P7.5LacZ，回收線性化的pAmp+ori+FllLl Notl和P7.5LacZ,按 T4多聚核苷酸激酶的說明書搡作磷酸化P7.5LacZ同源臂的5'端羥 基，連接磷酸化的P7.5LacZ和線性化的pAmp+ori+FllLl Notl后轉(zhuǎn) 化入JM109感受態(tài)細胞，培養(yǎng)14-16小時后，挑取可疑陽性菌落于 含有Ampidlline的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4小時，以FllLl F和LacZ R為檢測引物，對可疑菌落進行菌液PCR檢測，鑒定陽性菌落后， 擴大培養(yǎng)陽性菌落后利用PlasmidminiKit(200)抽取陽性質(zhì)粒，該質(zhì) 粒即為pAmp+ori+FllLl Notl+P7.5LacZ。以pAmp+ori+FllLl Notl+P7.5LacZ為模板，Amp + ori F和LacZ R為引物，98'C 15s， 50°C 15s, 72°C 3min， 30個循環(huán)，把 pAmp+ori+FllLl Notl+P7.5LacZ線性化。以雞痘活疫苗為模板， PolyA+FllL2F和FllL2R為引物，98°C 15s， 50。C 15s, 72°C 40s，30個循環(huán)，擴增出雞痘病毒F11L2同源臂?；厥站€性化的 pAmp+ori+FULl Notl+P7.5LacZ和F11L2同源臂，按T4多聚核苷 酸激酶的說明書搡作磷酸化F11L2同源臂的5'端羥基，按照DNA Ligation Kit(Mighty Mix)說明書操作將轔酸化的F11L2同源臂和線 性化的pAmp+ori+FllLl Notl+P7.5LacZ連接后轉(zhuǎn)化入JM109感受 態(tài)細胞，培養(yǎng)14-16小時后，挑取可疑陽性菌落于含有Ampicilline 的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4小時，以F11L1 F和F11L2 R為檢測引 物，對可疑菌落進行菌液PCR檢測，鑒定陽性菌落后，擴大培養(yǎng)陽 性菌落后利用Plasmid mini Kit(200)抽取陽性質(zhì)粒，該質(zhì)粒即為 pG7,5N。2.1 FPV重組籃斑毒的構(gòu)建按Iipofatamine2000的搡作說明書操作，將pG7.5N轉(zhuǎn)染入已經(jīng) 感染雞痘活疫苗(I )的雞胚成纖維細胞的6孔細胞培養(yǎng)板上，培 養(yǎng)60小時后，收取病毒液。將病毒液感染雞胚成纖維細胞，感染l 小時后棄去病毒液，鋪上一層1%的低熔點瓊脂糖，培養(yǎng)24小時后 再鋪上另一層含X-gal的低熔點瓊脂糖，繼續(xù)培養(yǎng)3-5天后，挑取可 疑的藍綠色蝕斑。以藍綠色蝕斑為模板，P7.5LacZ F和LacZ R為引 物，對可疑藍綠色蝕斑進行PCR檢測，選擇陽性蝕斑后，再經(jīng)過3 代的蝕斑純化，直到所產(chǎn)生的蝕斑全為藍綠色為止，將該純化后的 重組雞痘病毒命名為FPV-PG7.5LacZ。 3.應用以傳染性支氣管炎病毒(IBV) Sl基因和NP基因在痘病毒載 體中的表達與生物活性的檢測為例。 1、構(gòu)建PG7.5N-S1-NP質(zhì)粒根據(jù)Sl基因設計擴增Sl基因ORF的引物，該引物對分別帶iVW /酶切位點和P7.5啟動子，將擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)入pMD18-T載體(購自 Takara),測序正確后，用iVw /酶切并和經(jīng)JVof /酶切后的PG7.5N連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO (購自天根生化科技有限公司)，挑選陽 性菌落，提取質(zhì)粒，得到PG7.5N-S1質(zhì)粒。根據(jù)N基因設計擴增N 基因ORF的引物，該引物對分別帶有5 附///和州^/肌酶切位點， 將擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)入pMD18-T載體，測序正確后，用Bflm///////;^/// 雙酶切，并和經(jīng)丑0 1////////^///雙酶切后的PG7,5N連接，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌ToplO,挑選陽性菌落，提取質(zhì)粒，得到PG7.5N-NP質(zhì)粒。 用5flm/// /歷/w/ ///雙酶切PG7.5N-S1和PG7.5N-NP，連接后轉(zhuǎn)化 大腸桿菌ToplO，挑選陽性菌落，提取質(zhì)粒，得到PG7,5N-S1-NP質(zhì) 粒。上面所用的引物是 NP引物M41NP1: 5 'CTAAGCTTCATGGCAAGCGGTAAGGCAACTG3' M41NP2:5'GCGAATTCTCAAAGTTCATTCTCTCCTAGG3' Sl引物M41S1 F:5 ， aattGCGGCCGCatgttggtaacacctctt3 ， M41S1R:5， ttaaGCGGCCGCtaacgtctaaaacgacgtgtt3， 2、同源重組病毒FPV 282E4購自乾元浩南京生物藥廠(雞痘活疫苗1)， 轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 (Invitrogen)FPV 282E4接種CEF (雞胚成纖維細胞)適當時間后轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 PG7.5N-S1,經(jīng)IPTG+X-Gal誘導后篩選陽性重組病毒FPV-IBVS1, 純化后得到馴化的能產(chǎn)生藍斑的重組病毒FPV- IBVS1 。用質(zhì)粒PG75N-NP轉(zhuǎn)染上述重組病毒FPV- IBVS1的宿主CEF， 經(jīng)二次同源重組并挑選白斑獲得重組病毒FPV-IBVNP;用質(zhì)粒PG7.5N-S1-N轉(zhuǎn)染上述重組病毒FPV- IBVS1的宿主 CEF，經(jīng)二次同源重組并挑選白斑獲得重組病毒FPV-IBVS1-NP。三個重組病毒FPV-IBVS1、 FPV-IBVNP、 FPV-IBVS1-NP經(jīng)過若干代次傳代后測定其穩(wěn)定性。用于對照的載體為ADe加vator購自Qbiogen，裝入Sl基因及 NP基因得到rAD-Sl-NP表達載體。FPV- IBVS1-NP及rAD-Sl-NP在相同條件下分別在大腸桿菌 ToplO中表達。結(jié)果釆用SynGeneGeneGenius凝膠成像系統(tǒng)對采用表達蛋白 的Westenblot纖維膜進行蛋白量估算。rAd-Sl-NP載體的第一蛋白 (Sl)的表達量約為95-110mg/L ,而第二蛋白(NP)的表達量約為 15-30mg/L，遠低于S1蛋白的表達量。而釆用PG7.5N載體，第一 蛋白(Sl)的表達量為95-120 mg/L，與rAd-Sl-NP載體表達量相近。 但第二蛋白(NP)的表達量為85-110 mg/L，遠高于rAd-Sl-NP載 體NP蛋白的表達量。(由于進行了三次以上的重復實驗，上述數(shù)據(jù)為 估算值的變動范圍)序列 表<110>華南農(nóng)業(yè)大學<120> 雞痘病毒雙基因表達載體(PG7.5N)<130><勝 1<170〉 Patentln version 3. 3<210> 1<211> 3592<212> DNA 〈213〉人工序列〈400〉 1gcgtaatcELtggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcaceLattccacac60aacatacgagCCgg卿C3tgcctggggtgcctaatgagt120acattasttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctg180tcggccaacgcgcgggg卿ggcggtttgcgtattgggcgctcttccgct240tcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcac300tcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcagggg8t￡iacgcsgg幼ag犯catgtga360gcaaaaggcc3gca幼aggccagg幼ccgtcgttgctggcgtttttccat420aggctccgcccccctgacgagcatcacaaa犯tcgacgctgtggcga犯c480CCg8C￡lgg￡lCtataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcct540gttccgaccctgccgcttacCgg8t3CCtgtccgcctttctcccttcggg卿cgtggcg600ctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgt郷tcgttcgctcc犯gctg660ggctgtgtgceicgaaccccccgttceigcccgaccgctgcgccttatccggt犯ctatcgt720cttgagtccaacccggteagacacgacttatcgccactggcagcagccactggt肌cagg780attagcagagcgaggtatgt鄉(xiāng)cggtgct8C3gagttcttgaagtggtggcct幼ctac840ggctacactagaag幼cagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcgga900aa肌gagttggtagctcttgatccggcaaactggtagcggtggttttttt960gtttgc肌gcagcagattacgcgcagaaaaSLELELggatCtCaagaagatcctttgatcttt1020tctacggggtctgacgctcagtgg幼cg犯aactcacgttaagggattttggtc 1080ggatcttcacctagatccttt taaat taaa1140taaagtat8tatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgCtt￡LatC￡Lgtggtggcacct1200atctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagata1260actacgatacggg鄉(xiāng)gcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgCgag6LCCC31320cgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccgg卿ggccgagcgc柳1380agtggtcctgc犯ctttatccgcctccatccagtctattaattgttgccggg鄉(xiāng)ct鄉(xiāng)1440gtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctac鄉(xiāng)C3tCgtg1500gtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacg￡LtC￡L￡LggCg31560gttgtcatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgtt1620gtcagaagtaagttggccgc3gtgttatc8ctcatggttatggcagcact1680cttactgtcettgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaacc幼gtc81740ttctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtc犯tacgggat犯t1800accgcgccEicatagcag肪ctttaaaagtgctc教tcattggaaaacgttcttcggggcga1860冊actctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcaccc1920aactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagc肌a犯C3gg犯gg1980c犯朋tgccgcaaaaaagggaat卿ggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttc2040ctttttcaatcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatattt2100gaatgtatttagaaa肌ta8acaaataggggttccgcgcacatttccccg犯aagtgcca2160cctgacgtctagatg肌catgacaccggtgaagaatcacccggtaeLeittacaaatagttg2220犯attaacgacagataaccceitattataaactagtga幼t2280ctcgcgat幼tagtattaatctcgtacctttagtcggatgtgttatgatt犯gataaatg23403tatt幼gggtgtaacagataaagt肪ataaactattacctaaaacatc ta_gtaag3caa2400attctactagttgtataaatattcctEitagatagtattcctttgaattttctggatgatg2460tttcaatgtttccgaagtgagtatacttcaggtaagtcat2520tgatgaacatagata肪tatgtcgatggtagctttgattacatagccgtattatgtttaa2580aaaattctggtagatctgtgattatgtt犯caa^ceiacscgt犯tgcgcg2640gccgcttttaaeiaattgaaaaactagtctaatttattgcaCgg3tg￡LCC￡ltgattacgcc2700aeLgctctaatacgetctcactaagcttgcatgcctgc鄉(xiāng)tcgactctagai2760ggatccccgggtaccgagctcgaattcgtattctatagtgccaattcact2820ggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttaccc犯cttaatcgcct2880tgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgccc2940ttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctg8tgCggt8ttttctccttac3000gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagt3caatctgctctgatgc3060cgcatagaaaagataatttctgcttaatattcagatctttctatggtata3120aacatattgac 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1. 雞痘病毒雙基因表達載體，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2、 一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述表達載體的方法，其包括如下步驟1) 以PET28a為模板，Kan + ori F和Kan +ori R為引物，擴增 出PET28a的Kan + ori片段；以雞痘病毒DNA為模板，TKl F和 TKl+NotlR為引物，擴增出雞痘病毒TK1同源臂；連接Kan + ori 片段和TK1同源臂，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，篩選出陽性菌落，擴 大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，得到pKan+ori+TKlNotl;2) 以PET28a為模板，P7.5LacZ F和LacZ R為引物，擴增出 P7.5LacZ片段；線性化pKan+ori+TKl Not 1并與P7.5LacZ片段連 接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，篩選出陽性菌落，擴大培養(yǎng)后抽提質(zhì) 粒得到pKan+ori+TKl Not l+P7.5LacZ;3) 以雞痘病毒DNA為模板，PolyA+TK2F和TK2R為引物， 擴增出雞痘病毒TK2同源臂；線性化pKan+ori+TKl Notl+P7.5LacZ 并與TK2同源臂連接，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，篩選出陽性菌落， 擴大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，即得到雞痘病毒雙基因表達載體。
3、 權(quán)利要求l所述的表達載體在真核表達中的應用。
4、 權(quán)利要求l所述的表達載體在構(gòu)建重組病毒基因疫苗中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種雞痘病毒雙基因表達載體，其具有SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，包括啟動子P7.5、LacZ基因、位于LacZ基因上的多克隆位點、稀有酶切位點Not1、雞痘病毒DNA同源臂F11L1和F11L2、Amp^R抗性標記基因、復制起點(ori)。本發(fā)明構(gòu)建的雙基因表達載體，最大限度地減少了載體長度，從而可以容納更大的外源基因；增加了可用酶切位點數(shù)量，方便克隆不同的外源基因；對插入位點Not1處的啟動子不作限定，可以自由選擇與外源基因搭配的啟動子，從而提高了表達效率，并且，采用反式表達的方法，從而提高了外源基因的表達效率。
文檔編號C12N15/863GK101220374SQ20071006263
公開日2008年7月16日 申請日期2007年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月11日
發(fā)明者濤 任, 孔令辰, 明 廖, 江經(jīng)偉, 郁宏偉 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學