專利名稱：一種利用環(huán)糊精的疏水化合物生物轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于疏水化合物生物轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及利用環(huán)糊精及其衍生物的疏 水化合物生物轉(zhuǎn)化方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生物轉(zhuǎn)化是指利用酶或有機(jī)體(細(xì)胞、細(xì)胞器)作為催化劑實(shí)現(xiàn)化學(xué)轉(zhuǎn)化的過程， 又稱生物催化，是生物體系(包括細(xì)菌、真菌、植物組織、動物組織培養(yǎng)系或生物體 系的酶制劑)對外源性底物進(jìn)行結(jié)構(gòu)性修飾所發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)。生物催化劑包括酶和 細(xì)胞，具有工業(yè)應(yīng)用價值的生物酶主要來源于微生物菌種，對于多酶系統(tǒng)和具有輔酶 的生物催化，常常采用微生物的全細(xì)胞參與反應(yīng)，又稱微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。應(yīng)用微生物 進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化，絕大多數(shù)的有機(jī)底物都是疏水的，常受到一些因素的嚴(yán)重制約底 物在水中溶解度小，降低了底物的利用率和反應(yīng)速率；高濃度的底物/產(chǎn)物常導(dǎo)致生 物催化劑的抑制或失活，生物轉(zhuǎn)化時間長，轉(zhuǎn)化效率低等缺點(diǎn)。因此，疏水化合物的 微生物轉(zhuǎn)化需要解決的關(guān)鍵問題是提高底物的溶解度，并保持生物催化劑的活性和穩(wěn) 定性。
超分子(Supramolecular)是基于分子間的非共價鍵相互作用而形成的分子聚集
體。超分子主客體分子間的非共價鍵是一種弱相互作用，包括氫鍵、范德華力、配位
鍵、親水/疏水作用等以及它們之間的協(xié)同作用。作為第二代超分子主體化合物的環(huán)
糊精(Cyclodextrin，CD)，是葡萄糖的環(huán)狀聚集體，具有獨(dú)特的"內(nèi)疏水""外親水"
的籠形結(jié)構(gòu)，可以包結(jié)許多無機(jī)、有機(jī)和手性客體分子形成主-客體包結(jié)物，而且產(chǎn)
量較大、價格低廉，是目前最重要的具有包結(jié)作用的環(huán)狀化合物，在模擬酶、分子識
別等領(lǐng)域具有重要的理論價值和應(yīng)用價值。環(huán)糊精在化學(xué)結(jié)構(gòu)、生物相溶性和穩(wěn)定性
上均符合生物催化對主體化合物的要求。
環(huán)糊精是從淀粉得到的六個以上D-吡喃葡萄糖單元以alpha-l, 4-糖苷鍵連結(jié)的
具有環(huán)狀疏水圓錐型結(jié)構(gòu)的低聚糖非還原性化合物系列。由于環(huán)糊精的外部親水而內(nèi)
腔疏水，因而它能夠像酶一樣提供一個疏水的結(jié)合部位，作為主體包結(jié)各種適當(dāng)?shù)目?br> 體，如有機(jī)分子、無機(jī)離子以及氣體分子等。這種選擇性的包結(jié)作用即通常所說的分
子識別，其結(jié)果是形成主客體包結(jié)物。在a-、 、 Y-CD基礎(chǔ)之上，對其進(jìn)行修飾
如酯化、醚化，烷基化、羥基化得到環(huán)糊精衍生物。主要的衍生物有羥丙基、甲基及
磺丁基醚-e-環(huán)糊精等。這些基團(tuán)的引入，并不影響中央空穴對客體分子的容納能力，
但能夠改善環(huán)糊精的某些理化性質(zhì)和包結(jié)能力。環(huán)糊精通過改性，可提高包結(jié)物或超
分子復(fù)合體在水中的溶解度，構(gòu)筑立體幾何關(guān)系，形成特殊的手性位點(diǎn)和弱作用力模 型，這大大擴(kuò)展了環(huán)糊精的應(yīng)用領(lǐng)域。
童林薈所著的《環(huán)糊精化學(xué)-基礎(chǔ)與應(yīng)用》(科學(xué)出版社,2001出版)中介紹了環(huán)
糊精在污水處理中的應(yīng)用，用添加e-cD改進(jìn)活性污泥分解毒物能力，在有毒物質(zhì)工 業(yè)廢水或制藥以及農(nóng)藥廢水處理上有實(shí)際應(yīng)用價值。邵云、高士祥、楊彬等發(fā)表在環(huán)
境科學(xué)學(xué)報的文章《HP-0-CD對不動桿菌降解高濃度硝基苯的影響》(2004, 24 (4): 690 — 695)介紹了在不動桿菌降解高濃度硝基苯的過程中添加羥丙基-e-環(huán)糊精 (HP-e-CD)對細(xì)菌生長、硝基苯的去除及中間產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化的影響。
醋酸可的松經(jīng)微生物Cw位脫氫生成甾體藥物的重要中間體醋酸潑尼松是生物轉(zhuǎn) 化疏水性化合物的典型例子。姚傳義等人進(jìn)行了相關(guān)研究，發(fā)表于《中國醫(yī)藥工業(yè)雜 志》的文章"PVA復(fù)合載體固定化簡單節(jié)桿菌用于醋酸可的松脫氫"(1998年第6 期245-247頁)，文章敘述了以聚乙烯醇復(fù)合載體包埋簡單節(jié)桿菌BY-2-3-51,制得 具有較高機(jī)械強(qiáng)度和較好活性的球形固定化細(xì)胞，并用以進(jìn)行初始濃度為20g/L的 醋酸可的松脫氫的搖瓶實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)化率平均達(dá)90%。上述研究結(jié)果雖然有效的提高了醋 酸可的松的生物轉(zhuǎn)化效率，但由于該方法涉及微生物包埋載體的制備以及微生物細(xì)胞 的包埋等工藝環(huán)節(jié)，從而使得其轉(zhuǎn)化工藝較為復(fù)雜，對上述工藝的應(yīng)用產(chǎn)生了一定的 制約和影響作用。
微生物轉(zhuǎn)化疏水性化合物常受到一些因素的嚴(yán)重制約底物在水中的溶解度很 小，限制了其生物利用度，產(chǎn)物/底物對微生物具有抑制作用，生物轉(zhuǎn)化時間長，轉(zhuǎn) 化效率低等缺點(diǎn)。
如何有效利用環(huán)糊精及其衍生物的特性提高疏水化合物的生物轉(zhuǎn)化效率是一個 值得探索和研究的課題。這方面的研究對于高效率獲得疏水化合物生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)品具有 重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題是利用環(huán)糊精及其衍生物提供一種疏水化合物微生物轉(zhuǎn) 化的新方法；同時提供了環(huán)糊精及其衍生物在上述化合物微生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。 本發(fā)明的技術(shù)方案如下
本發(fā)明提供的疏水化合物微生物轉(zhuǎn)化方法，特征在于疏水化合物微生物轉(zhuǎn)化過程 中添加環(huán)糊精及其衍生物，環(huán)糊精及其衍生物作為轉(zhuǎn)化介質(zhì)。
本發(fā)明中所用環(huán)糊精及其衍生物包括本發(fā)明所述的環(huán)糊精或其衍生物分別選用
e-環(huán)糊精(e-cd), y-環(huán)糊精(y-cd)，羥丙基-e-環(huán)糊精、磺丁基醚-e-環(huán)糊精， 雙糖基-e-環(huán)糊精，甲基-e-環(huán)糊精，羥乙基-e-環(huán)糊精。
本發(fā)明中環(huán)糊精或其衍生物與疏水化合物的的摩爾比為0. 1 4: i。
醋酸可的松的c,2位脫氫反應(yīng)
即在添加有醋酸可的松的微生物轉(zhuǎn)化體系中按一定比例添加環(huán)糊精或環(huán)糊精衍
生物與醋酸可的松的混合物，生物轉(zhuǎn)化的基本過程包括如下步驟
1. 微生物菌種活化培養(yǎng)微生物菌種斜面培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
2. 醋酸可的松生物轉(zhuǎn)化將活化的液體種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后， 加入醋酸可的松，同時添加環(huán)糊精或其衍生物，培養(yǎng)到64h 78h時將培養(yǎng)液加熱至 微沸，中止轉(zhuǎn)化，自然降至室溫，待分析。
詳細(xì)步驟如下
1. 種子培養(yǎng)液制備取5mL無菌水從培養(yǎng)斜面洗下菌體，制備成菌懸浮液。按1% 接種量菌懸液轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基中，31-33°C， 160r/min振蕩培養(yǎng)24h。
2. 發(fā)酵培養(yǎng)液培養(yǎng)以1%接種量種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，3卜33'C， 160r/min振蕩培養(yǎng)20h-30h。
3. 轉(zhuǎn)化將轉(zhuǎn)化底物醋酸可的松研磨成細(xì)粉狀，按發(fā)酵液重量的0. 5-4%的濃度直 接投于發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后添加發(fā)酵培養(yǎng)基體積2-7%的工業(yè)酒精，同時加入與底物 醋酸可的松摩爾比為0. 1 0.8的環(huán)糊精或其衍生物，于32-35°C， 150-200 r/min 繼續(xù)轉(zhuǎn)化到64h-78h。
4. 將培養(yǎng)液加熱至微沸，中止轉(zhuǎn)化，自然降至室溫，待分析。 微生物菌種采用節(jié)桿菌^ Mro&c&r砂.CICC 10193,它能實(shí)現(xiàn)甾體化合物的
d, 2位脫氫轉(zhuǎn)化，將醋酸可的松轉(zhuǎn)化為醋酸潑尼松。
培養(yǎng)基
斜面培養(yǎng)基(g/U:葡萄糖IO，酵母膏IO，瓊脂20， pH7.0 種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10，玉米漿10，蛋白胨5，磷酸氫二鉀2.5， pH7.0 發(fā)酵培養(yǎng)基(g/U:葡萄糖10，玉米漿15，蛋白胨5，磷酸氫二鉀2.5， pH7.0 分析檢測方法
取樣品發(fā)酵液lmL于微型離心管中，樣品離心，棄上清，清水洗滌沉淀一次，加 入1.5mL三氯甲垸，充分震蕩使溶解，離心，取上清。自然風(fēng)干，加入lmL流動相溶 解，12000r/min離心10min，進(jìn)行HPLC分析，用Phenomenex硅膠柱，流動相為二 氯甲烷-乙醚-甲醇-水(體積比86. 0:12. 0:1. 6:0. 4);流速0. 8mLAiin;檢測波長為 240nm;外標(biāo)法檢測。
化合物RS (17a, 21-二羥基-孕甾-4-烯-3,20-二酮)的11P-羥基化反應(yīng)。
斜面種子的培養(yǎng)取藍(lán)色犁頭霉接種于新鮮斜面培養(yǎng)基上，28'C恒溫箱培養(yǎng)5d。
菌體培養(yǎng)取犁頭霉保藏斜面2支，勾取菌絲于lOraL無菌水中，將孢子洗下， 制得孢子懸浮液。調(diào)整孢子濃度為3Xl()7個/mL。
取2mL孢子懸浮液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28'C搖床振蕩培養(yǎng)19 21 h，至培養(yǎng) 液的pH降至3. 5-4左右。用10%的NaOH溶液將培養(yǎng)液的pH值調(diào)至5. 4 5. 6。
將化合物RS磨成粉末狀，與80%乙醇以1:15-18 (W/V)比例混合，在燒瓶內(nèi)加 熱回流溶解lh 1.5h至澄清，用無菌注射器吸取一定量的澄清液迅速投入到發(fā)酵液 內(nèi)，搖勻。在投料后的6-15h，加入與化合物RS摩爾比為0.25 0.8的環(huán)糊精或其 衍生物，繼續(xù)轉(zhuǎn)化19-38h。對照不加環(huán)糊精，在投料后于28-32°C， 150-170r/min 繼續(xù)轉(zhuǎn)化。
所用微生物菌種藍(lán)色犁頭霉coer^朋CICC 40302，它能實(shí)現(xiàn)甾體化合 物RS的11 P -羥基化反應(yīng)，生成氫化可的松(HC)。
培養(yǎng)基
斜面培養(yǎng)基(g/U: 土豆200，葡萄糖20，瓊脂20
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/U:葡萄糖10.5，酵母膏2.5，玉米漿12.0，硫酸銨5.0, pH 6. 4 6. 7
分析檢測方法
取2mL發(fā)酵液，加熱微沸，靜置到5(TC，加入5mL氯仿萃取，用振蕩器劇烈振蕩 2min，分層后，取下層有機(jī)相l(xiāng)mL于微型離心管中，干燥后，加入lmL的流動相，離 心(10000r/min， 10min)，進(jìn)行HPLC分析，用Phenomenex硅膠柱，流動相為二氯 甲烷乙醚甲醇水(體積比385:60:30:2);流速lmL/rain;檢測波長為242nra;外 標(biāo)法檢測。
化合物RSA (17(1-羥基孕甾-4-烯-3， 20-二酮-21-醋酸酯)的lie-羥基化反應(yīng)。
斜面種子的培養(yǎng)取藍(lán)色犁頭霉接種于新鮮斜面培養(yǎng)基上，28""C恒溫箱培養(yǎng)5d。 菌體培養(yǎng)取犁頭霉保藏斜面2支，勾取菌絲于10mL無菌水中，將孢子洗下， 制得孢子懸浮液。調(diào)整孢子濃度為3X107個/mL。
取2mL孢子懸浮液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28'C搖床振蕩培養(yǎng)19 21 h，至培養(yǎng) 液的pH降至3.5-4左右。用10X的NaOH溶液將培養(yǎng)液的pH值調(diào)至5.4 5.6。
將化合物RSA磨成粉末狀，與80%乙醇以1:15-18 (W/V)比例混合，在燒瓶內(nèi)加
熱回流溶解lh 1.5h至澄清，用無菌注射器吸取一定量的澄清液迅速投入到發(fā)酵液 內(nèi)，搖勻。在投料后的3-9h，加入與化合物RSA摩爾比為0.25 0.8的環(huán)糊精或其 衍生物，繼續(xù)轉(zhuǎn)化19-38h。對照不加環(huán)糊精，在投料后于28-32°C， 150-170r/min 繼續(xù)轉(zhuǎn)化。
所用微生物菌種藍(lán)色犁頭霉^^z'力'a coer"7朋CICC 40302，它能實(shí)現(xiàn)甾體化合 物RSA的11 e -羥基化反應(yīng)，生成氫化可的松(HC)。
培養(yǎng)基
斜面培養(yǎng)基(g/L): 土豆200，葡萄糖20，瓊脂20
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10.5，酵母膏2.5，玉米漿12.0，硫酸銨5.0, pH 6. 4 6. 7
分析檢測方法
取2mL發(fā)酵液，加熱微沸，靜置到5(TC，加入5mL氯仿萃取，用振蕩器劇烈振蕩 2min，分層后，取下層有機(jī)相l(xiāng)mL于微型離心管中，干燥后，加入lmL的流動相，離 心(10000r/min， 10min)，進(jìn)行HPLC分析，用Phenomenex硅膠柱，流動相為二氯 甲烷乙醚甲醇水(體積比385:60:30:2);流速lmL/min;檢測波長為242nm;外 標(biāo)法檢測。
留醇側(cè)鏈降解反應(yīng)
即在添加有甾醇的微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中按一定比例添加環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生
物，生物轉(zhuǎn)化的微生物為分枝桿菌，生物轉(zhuǎn)化的基本過程包括如下步驟
1. 微生物菌種活化培養(yǎng)微生物菌種斜面培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
2. 甾醇生物轉(zhuǎn)化將活化的液體種子接入加有甾醇的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，在0h 60h
時加入環(huán)糊精或其衍生物，培養(yǎng)到72h 144h時將培養(yǎng)液加熱至微沸，中止轉(zhuǎn)化，自
然降至室溫，待分析。
微生物菌種活化培養(yǎng)菌種轉(zhuǎn)接于新鮮斜面上，27 32。C培養(yǎng)2 4d，制備菌懸 液，按1% 10%的接種量接入液體培養(yǎng)基中，在27 32。C、 160 220r/min條件下培 養(yǎng)20 50h;
甾醇生物轉(zhuǎn)化工藝條件將液體種子按照2% 20%的接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中， 在27 32°C 、 160 200r/min條件下培養(yǎng)。
本發(fā)明中轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的合適微生物接種量為4% 15%;本發(fā)明中轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基用微 生物合適種齡在30-40h;
本發(fā)明中微生物菌種活化培養(yǎng)合適溫度為27 30°C，優(yōu)選溫度29°C。
本發(fā)明中環(huán)糊精或其衍生物與甾醇的摩爾比為0. 3 4: 1，甾醇與環(huán)糊精或其衍生 物的合適摩爾比為1 3: 1。
本發(fā)明所用甾醇包括谷甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇和菜油甾醇及由各種甾醇按照任 意比組成的甾醇混合物。
本發(fā)明中所用環(huán)糊精及其衍生物包括本發(fā)明所述的環(huán)糊精或其衍生物分別選用 e-環(huán)糊精(beta-CD) ， Y-環(huán)糊精(gamma-CD)，羥丙基-0-環(huán)糊精、磺丁基醚-P-
環(huán)糊精，雙糖基-環(huán)糊精，甲基-e-環(huán)糊精，羥乙基-e-環(huán)糊精。
本發(fā)明中采用的微生物主要有分枝桿菌和節(jié)桿菌。分枝桿菌有.妙co力ac"ri柳 邵.NRRL B-3683， y^coda"eri湖卬.NRRL B-3805。
本發(fā)明所用的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基成分主要包括葡萄糖，檸檬酸，檸檬酸亞鐵按，硫酸鎂， 磷酸氫二鉀，磷酸氫二銨，pH7.0 pH7.4。本發(fā)明所用的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基組成為(g/L): 葡萄糖IO，檸檬酸2，檸檬酸亞鐵按0.05，硫酸鎂0.5，磷酸氫二鉀0.5，磷酸氫二 銨3. 5， pH 7.2。
本發(fā)明中甾醇可以在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配制時加入或轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的30小時內(nèi)加入，甾醇 添加量為轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的0. 3%-2%。 分析檢測方法
用乙酸乙酯萃取發(fā)酵液，離心，取乙酸乙酯相l(xiāng)mL于1.5mL的小離心管中，自然 風(fēng)千后加lmL的流動相，離心后進(jìn)行HPLC分析。用Phenoraenex C18柱，流動相為甲 醇水(4:1)，流速為lmL/min，檢測波長為254nm。
有益效果
含有環(huán)糊精及其衍生物的體系中，醋酸可的松4小時的轉(zhuǎn)化率達(dá)到67. 3%，同條 件下對照僅為25.1%，顯著提高了轉(zhuǎn)化反應(yīng)的速率。本發(fā)明的工藝方法應(yīng)用醋酸可的 松轉(zhuǎn)化方面明顯提高了轉(zhuǎn)化率，同時縮短了反應(yīng)時間。為醋酸可的松轉(zhuǎn)化提供了新途 徑。
RS經(jīng)轉(zhuǎn)化后目標(biāo)產(chǎn)物HC生成率60. 57%，對照實(shí)驗(yàn)HC生成率為47. 56%，提高了 13.01%;比對照的轉(zhuǎn)化時間也縮短了 16h，此項(xiàng)新的轉(zhuǎn)化技術(shù)為RS的轉(zhuǎn)化也提供了 一個新的捷徑。
添加環(huán)糊精或其衍生物后甾醇生物轉(zhuǎn)化的周期縮短，由對照的7d縮短至3-6d;
底物濃度和轉(zhuǎn)化率均大幅度提高，在底物濃度為0.3% 2%的濃度范圍內(nèi)；轉(zhuǎn)化率
由對照的5% 35%提高為50% 95%。
本發(fā)明將環(huán)糊精或其衍生物加入轉(zhuǎn)化底物體系中形成一種超分子反應(yīng)介質(zhì)系統(tǒng)，
有效的增加了疏水性化合物的溶解并促進(jìn)了生物轉(zhuǎn)化的進(jìn)行。
疏水性化合物在水中的溶解度很低，采用添加環(huán)糊精或其衍生物后溶解度增加，
環(huán)糊精或其衍生物與疏水性化合物的混合物也同樣達(dá)到上述目的；采用環(huán)糊精的特殊 作用使反應(yīng)底物由固相轉(zhuǎn)移至反應(yīng)相，使得底物與生物酶的接觸更為方便，轉(zhuǎn)化反應(yīng) 速率加快，并在一定程度上解除了底物/產(chǎn)物對生物酶活性的抑制作用，使反應(yīng)的轉(zhuǎn) 化率提高，提高產(chǎn)物的收率，發(fā)酵轉(zhuǎn)化周期明顯縮短。環(huán)糊精作為超分子在生物轉(zhuǎn)化 中形成了一種特殊的超分子介質(zhì)系統(tǒng)，其本身不參與生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，也不影響細(xì)胞的 生長比速率和細(xì)胞密度，僅僅作為疏水性化合物增溶劑和反應(yīng)載體。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制 本發(fā)明。 實(shí)施例1
化合物醋酸可的松的d,2位脫氫反應(yīng) 微生物菌種
微生物菌種采用節(jié)桿菌力rt/ ro&cter CICC 10193，它能實(shí)現(xiàn)甾體化合物的 d. 2位脫氫轉(zhuǎn)化，將醋酸可的松轉(zhuǎn)化為醋酸潑尼松。
斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖IO，酵母膏IO，瓊脂20， pH7.0 種子培養(yǎng)基(g/U:葡萄糖IO，玉米漿IO，蛋白胨5，磷酸氫二鉀2.5， pH7.0 發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖IO，玉米漿15，蛋白胨5，磷酸氫二鉀2.5， pH7.0 斜面種子的培養(yǎng)取一環(huán)斜面菌種轉(zhuǎn)接于新鮮斜面培養(yǎng)基上，32'C下培養(yǎng)24h。 菌體培養(yǎng)
取5mL無菌水洗下斜面種子，制備成菌懸浮液。按1%接種量轉(zhuǎn)接于30mL種子培 養(yǎng)基中，32°C， 160r/min振蕩培養(yǎng)24h。
以W接種量取種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于30mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，32°C， 160r/min振蕩培養(yǎng)
25h。
將轉(zhuǎn)化底物醋酸可的松研磨成細(xì)粉狀，按發(fā)酵液重量的1%的濃度直接投于發(fā)酵培 養(yǎng)基中，然后添加發(fā)酵培養(yǎng)基體積7%的工業(yè)酒精，同時加入與底物醋酸可的松摩爾 比為0.25: l的羥丙基-e-環(huán)糊精，于34。C, 160r/min繼續(xù)發(fā)酵48h。
將培養(yǎng)液加熱至微沸，中止轉(zhuǎn)化，自然降至室溫，待分析。
產(chǎn)物提取及測定
外標(biāo)法檢測。測得醋酸可的松4小時的轉(zhuǎn)化率達(dá)到67.3%，同條件下對照僅為
25.1%，顯著提高了轉(zhuǎn)化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化速率；轉(zhuǎn)化結(jié)束時轉(zhuǎn)化率達(dá)到98.5%，同條件下 空白對照樣轉(zhuǎn)化率為95.4%。
實(shí)施例2基本同例1
化合物醋酸可的松的d,2位脫氫反應(yīng)
將轉(zhuǎn)化底物醋酸可的松研磨成細(xì)粉狀，按發(fā)酵液重量的4%的濃度直接投于發(fā)酵培 養(yǎng)基中，然后添加發(fā)酵培養(yǎng)基體積5%的工業(yè)酒精，同時加入與底物醋酸可的松摩爾 比為0.3: 1的磺丁基醚-e-環(huán)糊精，于34'C， 160r/min繼續(xù)發(fā)酵50h。
將培養(yǎng)液加熱至微沸，中止轉(zhuǎn)化，自然降至室溫，待分析。
外標(biāo)法檢測。測得轉(zhuǎn)化率為98.7%。同條件下同時實(shí)驗(yàn)的無添加空白對照樣轉(zhuǎn)化 率為92. 6%。
實(shí)施例3基本同例1
化合物醋酸可的松的d,2位脫氫反應(yīng)
將轉(zhuǎn)化底物醋酸可的松研磨成細(xì)粉狀，按發(fā)酵液重量的2. 5%的濃度直接投于發(fā)酵 培養(yǎng)基中，然后添加發(fā)酵培養(yǎng)基體積4%的工業(yè)酒精，同時加入與底物醋酸可的松摩 爾比為0.25: l的羥丙基-e-環(huán)糊精，于34'C， 160r/min繼續(xù)發(fā)酵50h。
將培養(yǎng)液加熱至微沸，中止轉(zhuǎn)化，自然降至室溫，待分析。
外標(biāo)法檢測。測得轉(zhuǎn)化率為98.9%。同條件下同時實(shí)驗(yàn)的無添加空白對照樣轉(zhuǎn)化 率為93. 7%。
實(shí)施例4基本同例1
化合物醋酸可的松的Ct,2位脫氫反應(yīng)
將轉(zhuǎn)化底物醋酸可的松研磨成細(xì)粉狀，按發(fā)酵液重量的0. 5%的濃度直接投于發(fā)酵 培養(yǎng)基中，然后添加發(fā)酵培養(yǎng)基體積3%的工業(yè)酒精，同時加入與底物醋酸可的松摩 爾比為0.2: l的羥丙基-e-環(huán)糊精，于32。C， 160r/min繼續(xù)發(fā)酵40h。將培養(yǎng)液加 熱至微沸，中止轉(zhuǎn)化，自然降至室溫，待分析。
外標(biāo)法檢測。測得醋酸可的松5小時的轉(zhuǎn)化率達(dá)到70.5%，同條件下對照僅為 30.1%，顯著提高了轉(zhuǎn)化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化速率；轉(zhuǎn)化結(jié)束時測得轉(zhuǎn)化率為99%。同條件下 空白對照轉(zhuǎn)化率為95. 7%。
實(shí)施例5
化合物rs的ii e -羥基化反應(yīng) 微生物菌種
藍(lán)色犁頭霉coer"2es CICC 40302。它能實(shí)現(xiàn)甾體化合物RS的110-
羥基化反應(yīng)，生成氫化可的松(HC)。
(1) 斜面培養(yǎng)基(g/L): 土豆200，葡萄糖20，瓊脂20
(2) 發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10. 5，酵母膏2. 5，玉米漿12. 0，硫酸銨5. 0， pH 6. 4 6. 7
斜面種子的培養(yǎng)取藍(lán)色犁頭霉接種于新鮮斜面培養(yǎng)基上，在28'C恒溫箱培養(yǎng)5d。 菌體培養(yǎng)取犁頭霉保藏斜面2支，勾取菌絲于10mL無菌水中，將孢子洗下，制得 孢子懸浮液。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子濃度為3.0Xl(T個/mL。
取2mL孢子懸浮液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28。C搖床振蕩培養(yǎng)19h，至培養(yǎng)液的pH 降至3. 8左右。用10%的NaOH溶液將培養(yǎng)液的pH值調(diào)至5. 4。
將化合物RS磨成粉末狀，與80%乙醇以1:18 (W/V)比例混合，在燒瓶內(nèi)加熱回 流溶解lh至澄清，用無菌注射器吸取RS澄清液迅速投入到發(fā)酵液內(nèi)，搖勻。在投料 后的9h，加入與化合物RS摩爾比為0.6: l的0-CD，繼續(xù)轉(zhuǎn)化。對照不加環(huán)糊精， 在投料后于28°C ， 150r/min培養(yǎng)44 h。
產(chǎn)物提取及測定
外標(biāo)法檢測。測得28h目標(biāo)產(chǎn)物HC生成率60. 57%，此時對照實(shí)驗(yàn)HC生成率為 47.56%，提高了 13.01%;轉(zhuǎn)化結(jié)束時，目標(biāo)產(chǎn)物HC生成率60.60%，對照轉(zhuǎn)化率為 54. 36%。
實(shí)施例6基本同例5
將化合物RS磨成粉末狀，與80%乙醇以1:15 (W/V)比例混合，在燒瓶內(nèi)加熱回 流溶解1.5h至澄清，用無菌注射器吸取RS澄清液迅速投入到發(fā)酵液內(nèi)，搖勻。在投 料后的llh，加入與化合物RS摩爾比為0.7: l的CD，繼續(xù)轉(zhuǎn)化。對照不加環(huán)糊 精，在投料后于32'C， 170r/min繼續(xù)培養(yǎng)40h。
測得HC生成率達(dá)到62. 83%。對照實(shí)驗(yàn)HC生成率為45. 44%。
實(shí)施例7基本同例5
將化合物RSA磨成粉末狀，與80%乙醇以1:15 (W/V)比例混合，在燒瓶內(nèi)加熱 回流溶解1.5h至澄清，用無菌注射器吸取RSA澄清液迅速投入到發(fā)酵液內(nèi)，搖勻。 在投料后的3h，加入與化合物RSA摩爾比為0.25: l的e-CD，繼續(xù)轉(zhuǎn)化。對照不加 環(huán)糊精，在投料后于28。C， 150r/min繼續(xù)培養(yǎng)30h。
外標(biāo)法檢測。測得14h目標(biāo)產(chǎn)物HC生成率50. 15%，此時對照實(shí)驗(yàn)HC生成率為 29.08%，提高了21.07%;轉(zhuǎn)化結(jié)束時測得目標(biāo)產(chǎn)物HC生成率57.H，對照生成率為 55.1%。
實(shí)施例8基本同例5
將化合物RSA磨成粉末狀，與80%乙醇以1:15 (W/V)比例混合，在燒瓶內(nèi)加熱 回流溶解lh至澄清，用無菌注射器吸取RSA澄清液迅速投入到發(fā)酵液內(nèi)，搖勻。在 投料后的6h，加入與化合物RSA摩爾比為0.4: l的3-CD，繼續(xù)轉(zhuǎn)化。對照不加環(huán) 糊精，在投料后于28'C， 150r/min繼續(xù)培養(yǎng)28h。
外標(biāo)法檢測。測得目標(biāo)產(chǎn)物HC生成率60. 60%，對照轉(zhuǎn)化率為54. 36%。
實(shí)施例9
植物甾醇的側(cè)鏈降解反應(yīng)
微生物菌體斜面活化培養(yǎng)取一環(huán)斜面菌種轉(zhuǎn)接于新鮮斜面上，29'C培養(yǎng)3d。
微生物菌體液體種子活化培養(yǎng)用0. 5%的Tween80無菌水溶液洗下斜面培養(yǎng)的 種子，使菌懸液丄。值控制在1.0士0.2,按2%的接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，在27'C、 200r/min條件下活化培養(yǎng)36h。
植物甾醇轉(zhuǎn)化液體種子按5%的接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(預(yù)先加入1%的植物甾 醇)中，在30h時加入羥丙基-e-環(huán)糊精，培養(yǎng)到72h時將培養(yǎng)液加熱至微沸，中止 轉(zhuǎn)化，自然降至室溫，待分析。
微生物菌種采用#/c^acter^// 砂.NRRL B-3683，它能實(shí)現(xiàn)植物甾醇的Cn位側(cè) 鏈降解反應(yīng)，生成產(chǎn)物4AD和ADD。
斜面培養(yǎng)基(g/U:磷酸氫二鉀0.5，硫酸鎂0.5，檸檬酸鐵銨0.05，檸檬酸2， 硝酸銨2，碳酸鈣IO，甘油20，葡萄糖5，瓊脂15。
種子培養(yǎng)基(g/U:磷酸氫二鉀0.5，硫酸鎂0.5，檸檬酸2，硝酸銨2，擰檬酸 鐵銨0.05，碳酸鈣IO，甘油20，葡萄糖5。
轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(g/U:葡萄糖IO，檸檬酸2，檸檬酸亞鐵按0.05，硫酸鎂0.5，磷 酸氫二鉀0.5，磷酸氫二銨3.5，植物甾醇IO， pH 7.2。
植物甾醇由谷甾醇(48.12%)、豆甾醇(5.37W、菜籽甾醇(17.1%)和菜油甾 醇(27.85%)組成。植物留醇與羥丙基-e-環(huán)糊精摩爾比為1: 2，經(jīng)分析檢測轉(zhuǎn) 化率為80. 8%。同等條件下對照的轉(zhuǎn)化率為12. 7%。
權(quán)利要求
1.一種利用環(huán)糊精的疏水化合物生物轉(zhuǎn)化方法，特征在于疏水化合物生物轉(zhuǎn)化過程中添加環(huán)糊精及其衍生物作為轉(zhuǎn)化介質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用環(huán)糊精的疏水化合物生物轉(zhuǎn)化方法，特征在于所述環(huán)糊精或其衍生物與疏水化合物的的摩爾比為O. 1 4: 1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種利用環(huán)糊精的疏水化合物生物轉(zhuǎn)化方法，特征在于所述環(huán)糊精及其衍生物為e-環(huán)糊精、Y-環(huán)糊精、羥丙基-e-環(huán)糊精、磺丁基醚-e-環(huán)糊精、 雙糖基-e-環(huán)糊精、甲基-P-環(huán)糊精或羥乙基-P-環(huán)糊精。
4. 根據(jù)權(quán)利要求i所述的一種利用環(huán)糊精的疏水化合物生物轉(zhuǎn)化方法，特征在于所述疏水化合物為醋酸可的松、17a，21-二羥基-孕甾-4-烯-3，20-二酮(RS)、 17a-羥基孕甾-4-烯-3， 20-二酮-21-醋酸酯(RSA)或甾醇。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種利用環(huán)糊精的疏水化合物生物轉(zhuǎn)化方法，特征在于所述醋 酸可的松生物轉(zhuǎn)化方法包括如下步驟微生物菌種活化培養(yǎng)；醋酸可的松生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵 培養(yǎng)液添加醋酸可的松，添加工業(yè)酒精，加入環(huán)糊精或其衍生物，環(huán)糊精或其衍生物與醋 酸可的松摩爾比為0.1-0.8: 1，發(fā)酵培養(yǎng)，加熱至微沸，降溫。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種利用環(huán)糊精的疏水化合物生物轉(zhuǎn)化方法，特征在于所述RS 生物轉(zhuǎn)化方法是在在添加有RS的微生物轉(zhuǎn)化體系中按一定比例添加環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生 物與RS的混合物，包括如下步驟化合物RS磨成粉末，添加80%乙醇，RS與乙醇比例為 1:15-18 (W/V)，燒瓶內(nèi)加熱回流溶解lh 1.5h至澄清，取一定量的澄清液投入發(fā)酵液， 搖勻；6-15h內(nèi)加入環(huán)糊精或其及其衍生物，環(huán)糊精或其衍生物與RS摩爾比為0. 25 0. 8: 1，繼續(xù)轉(zhuǎn)化19-38小時。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種利用環(huán)糊精的疏水化合物生物轉(zhuǎn)化方法，特征在于所述甾醇 生物轉(zhuǎn)化方法如下l.微生物菌種活化培養(yǎng)；2.甾醇生物轉(zhuǎn)化將活化菌種加入有甾醇的轉(zhuǎn) 化培養(yǎng)基中，在Oh-60h加入環(huán)糊精或其衍生物，培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)液加熱至微沸，中止轉(zhuǎn) 化。
8. —種如權(quán)利要求1所述的利用環(huán)糊精的疏水化合物生物轉(zhuǎn)化方法在疏水化合物生物轉(zhuǎn) 化中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用環(huán)糊精及其衍生物的疏水化合物生物轉(zhuǎn)化的方法。本發(fā)明屬于生物轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及利用環(huán)糊精及其衍生物的疏水化合物生物轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明提供一種利用環(huán)糊精及其衍生物的疏水化合物生物轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明方法特別適用于疏水性化合物的微生物轉(zhuǎn)化，能夠有效提高反應(yīng)底物在水溶液中的溶解度，提高底物的利用率和反應(yīng)速率，并在一定程度上解除底物和產(chǎn)物抑制，提高產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明采用含有環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化體系，環(huán)糊精的特殊結(jié)構(gòu)使其具有一定的增溶能力，強(qiáng)化了底物的生物利用度。
文檔編號C12P33/00GK101168765SQ200710059819
公開日2008年4月30日 申請日期2007年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月11日
發(fā)明者杜連祥, 敏 王, 王建新, 申雁冰, 肖克勝, 駱健美 申請人:天津科技大學(xué)