專利名稱：多拷貝牛肉風味肽表達基因及載體和重組畢赤酵母的構建的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種分子生物學技術構建重組DNA以在畢赤酵母發(fā)酵液中獲得牛肉風味 肽(Beefy Meaty Peptide, BMP)的方法。
技術背景牛肉風味強化肽(BMP)最初是從牛肉的木瓜蛋白酶水解物中分離得到，其一級結 構為Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala。 BMP與食鹽、MSG有較好的協同呈味的作用， 并且具有很好的熱穩(wěn)定性，適合于食品工業(yè)生產中的熱處理要求。因此，BMP有望代替 MSG成為新一代風味強化劑，具有廣闊的市場前景。目前，風味肽大部分是經過蛋白質的酶解而形成的，但會產生大量副產物；此外，在 蛋白質酶水解時會形成苦味肽，這嚴重限制了蛋白質水解物的利用?；瘜W合成法也是合成 小分子肽的有效方法，但其本身具有下述缺點①消旋化和副反應；②需要對肽側鏈中的 基因進行保護，尤其是固相合成時；③需過量的鏈接試劑和?；d體；④鏈接試劑的毒性 殘留影響制品和環(huán)境。隨著分子生物學技術的發(fā)展，利用重組DNA技術改造微生物使其合成分泌所需蛋白 已經成為一種經濟的生產方式。巴斯德畢赤酵母外源基因表達系統是近年來發(fā)展的一種優(yōu)秀的真核表達系統，與傳統 的大腸桿菌和釀酒酵母表達體系相比，其具有的諸多優(yōu)勢使之研究價值及應用價值不斷體 現。其最大特點是維持代謝低，能進行高密度發(fā)酵。自20世紀70年代以來，巴斯德畢赤 酵母作為單細胞蛋白生產菌的高密度發(fā)酵方法已經相當成熟，經發(fā)酵后細胞干重可高達 160g/L，而且有研究表明，發(fā)酵生產的菌體含量和外源蛋白的表達水平具有一定的正比關 系。畢赤酵母對外源蛋白的翻譯后加工(糖基化、二硫鍵的形成、折疊)和高等真核生物 非常相似，使得外源蛋白能夠形成正確的空間構象，不但使表達的蛋白具有很好的生物活 性，而且對蛋白的分泌十分有利。外源基因的整合非常穩(wěn)定是此表達系統的另一個特點。 畢赤酵母的生長和對外源蛋白的表達可以在廉價的合成培養(yǎng)基中進行，另外畢赤酵母自身的分泌蛋白很少，有資料表明，分泌的外源蛋白可以占總分泌蛋白的30%以上。因此， 十分有利于分泌蛋白的純化。 發(fā)明內容本發(fā)明的目的之一在于克服上述現有技術之不足，提供一種含有多拷貝牛肉風味肽表 達基因的重組質粒載體及構建方法。本發(fā)明的目的之二是提供一種由上述表達載體導入畢赤酵母構成的工程菌株。
本發(fā)明的目的之三是提供上述工程菌株在制備多串聯拷貝的牛肉風味肽中的應用。為了實現本發(fā)明的目的，首先按照畢赤酵母翻譯表達的密碼子偏愛性設計出含有4 拷貝BMP的表達基因片段，該片段合成的雙鏈插入到常見的載體上，通過體外連接構建 成含多拷貝BMP表達基因，通過相應限制性酶切位點整合入適當的表達載體(pPIC9)， 再導入畢赤酵母構成重組DNA，使其表達多串聯拷貝的BMP。本發(fā)明目的產物BMP表達基因的獲得是根據畢赤酵母翻譯表達的密碼子偏愛性自行 設計并由大連寶生物公司負責合成的。其中，4拷貝牛肉風味肽(Beefy Meaty Peptide, BMP)的表達基因片段，如序列表序列l(wèi)所示；16拷貝牛肉風味肽的表達基因片段，如 序列表序列2所示。其中，4拷貝BMP的表達基因設計方法如下第一、按照畢赤酵母翻譯表達的密碼子偏愛性設計出含有4拷貝BMP的表達基因片 段，4拷貝的BMP表達基因頭尾相連，每個表達片段之間不含其他序列；第二、在上步4拷貝BMP表達基因的上游位置加入屈o I限制性酶切位點，下游位 置加入&/1限制性酶切位點；第三、在上步的基因片段的J^0 I限制性酶切位點的上游位置加入五coi I限制性酶 切位點，限制性酶切位點的下游位置順序加入6His編碼基因、油M限制性酶切位 點和TAA終止密碼子，最終得到如序列表序列1所示含有4拷貝BMP的表達基因片段。16拷貝BMP的表達基因構建方法為第一、用J^0 I或Sa/1將以上合成構建的4拷貝BMP表達基因的載體酶切后線性化， 產生粘性末端；第二、用Wo I和1將以上合成構建的4拷貝BMP表達基因的載體雙酶切后回收 包含4拷貝BMP、兩端含有^7w I和Sa/ I粘性末端的小片段；第三、將第一步和第二步得到的基因片段通過T4 DNA連接酶進行連接，連接獲得 含有8拷貝、12拷貝、16拷貝或拷貝數為4的任意整數倍的BMP表達基因載體；第四、由于連接反應沒有正反向選擇，需要人為地通過用J^o I和5WI限制性酶切 方法挑出含有正向插入的轉化子，并通過其瓊脂糖凝膠電泳位置確定連接小片段的數量， 本發(fā)明最終選擇含有16拷貝的BMP的轉化子(也可以選擇其他拷貝數)，即得到16拷 貝的BMP基因表達載體。本發(fā)明采用的pPIC9為畢赤酵母分泌性蛋白表達的常用表達載體，帶有AOXl啟動 子。構建的表達載體中，pPIC9的多克隆酶切位點位于cx因子分泌信號基因之后；采用分 子克隆方法將BMP表達基因插在I和iVW I之間，具體構建方法如下第一、將上述構建好的16拷貝BMP表達基因一片段通過￡coi I和iVW I雙酶切， 回收含有BMP表達基因的小片段；第二、將用于畢赤酵母的表達載體pPIC9用￡coi I和iVo/ I雙酶切；第三、將上述第一步和第二步所得的回收小片段和載體大片段通過T4 DNA連接酶連接，使含有拷貝數為16的BMP表達基因片段插入到pPIC9上而得到。本發(fā)明目的二所述的工程菌株的構建方法如下-第一、將上述構建好的拷貝數為16的BMP表達載體pPIC9用Sac I限制性內切酶酶 切線性化；第二、通過電擊轉化的方法將上步線性化的表達載體pPIC9導入畢赤酵母，發(fā)生重組；第三、通過組氨酸營養(yǎng)缺陷平板篩選和PCR法鑒定，選出陽性轉化子，即得到重組 畢赤酵母工程菌株。本發(fā)明提供的工程菌株命名為巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris) GS115-16BMP菌株，已 于2007年7月26日保藏于"中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心"(北京 市朝陽區(qū)大屯路100101，中國科學院微生物研究所)，其保藏號為CGMCC No. 2136。本發(fā)明目的三所述的工程菌株的應用如下該重組畢赤酵母工程菌株通過甲醇誘導，產生含有拷貝數為16的BMP多肽，并帶 有一個6His標記，該標記用于Western Blot進行產物的定性、定量分析，或與Ni柱親和， 進行分離純化。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果本發(fā)明用此多拷貝合成串聯方法構建重組DNA，提高了 BMP在重組畢赤酵母中的 表達量，該方法使用同尾酶為連接橋梁，可以通過廉價的體外連接達到高水平的不同的拷 貝串聯數目，用該方法構建多拷貝基因可以構建出不同拷貝數的表達基因，從而為選擇最 佳表達量提供了梯度選擇，大大優(yōu)化了實驗的選擇性；并且該法采用了融合蛋白的方法， 在16拷貝的BMP后加了 6His尾，可以通過Ni親和柱將BMP純化回收，大大降低了目 標蛋白回收的難度，提高了純化率。選取畢赤酵母為工程菌，該菌誘導簡單，產量大，并 且能夠高密度生長，并且外源基因在畢赤酵母中是融合進宿主DNA中的，可以穩(wěn)定的傳 代而不丟失外源基因，其穩(wěn)定性大大高于釀酒酵母的附加型質粒。從而為大量的工業(yè)生產 奠定了理論基礎，具有重要的應用價值。
具體實施例方式
實施例l: 16拷貝BMP的構建將自行設計好的含有4拷貝BMP表達基因(由大連寶生物公司負責合成)的質粒載 體用Wo I和I雙酶切后,將酶切體系進行瓊脂糖凝膠電泳，回收大小為106bp的小片 段。再將設計好的含有4拷貝BMP表達基因的質粒載體用JWw I單酶切后，用堿性磷酸 酶去磷酸化防止質粒載體自連，再將回收的106bp小片段與該線性化載體進行連接。連J妾 產物通過電擊轉化轉入感受態(tài)大腸桿菌，將菌液涂布于含有氨芐青霉素的LB固體平板 上。37'C培養(yǎng)16小時后挑取在平板上生長的陽性轉化子，提取質粒，使用^Tzo I和Sa/ I 雙酶切驗證，挑選能切出208bp、 310bp、 412bp或者等比例增加的大小片段的轉化子。實施例2:表達載體pPIC9的構建將挑出的正向插入16拷貝BMP表達基因的轉化子質粒再用￡co/ I和iVof I雙酶切， 將切下的小片段回收備用。將表達載體pPIC9用五co/ I和iVw I雙酶切后與上述的小片 段連接，連接產物通過連接產物通過電擊轉化轉入感受態(tài)大腸桿菌，將菌液涂布于含有氨 芐青霉素的LB固體平板上。37t:培養(yǎng)16小時后挑取在平板上生長的陽性轉化子，提取 質粒，通過PCR驗證。實施例3:畢赤酵母工程菌株的構建將驗證好的陽性轉化子質粒(含16拷貝BMP基因的pPIC9)使用Sm I酶切線性化 后電轉入畢赤酵母GS115，將菌液涂布于MD平板。28'C培養(yǎng)50小時后挑取陽性轉化子， 提取其宿主DNA，進行PCR驗證。實施例5:畢赤酵母工程菌株在制備多串聯拷貝的牛肉風味肽中的應用在BMGY (1.340/oYNB,0.00004o/。生物素，1%甘油，1%酵母浸出粉，2%多聚蛋白胨， 0.1mol/L磷酸緩沖液pH6.1)培養(yǎng)基中30。C, 200rpm搖床培養(yǎng)40小時后，加入1%甲醇 /天，誘導70小時后，可產生大量的目標肽一16copyBMP。使用本發(fā)明方法所述的運用分子操作技術構建表達BMP的畢赤酵母新型菌株，克服 了以往生產BMP所存在的設備條件要求高、技術難度大、成本高、產量低等缺點，使 BMP能夠大量的合成分泌，成本較低，并且在BMP表達產物后連有6His尾，可以通過 Ni柱進行分離純化，因此具有一定的經濟開發(fā)價值。
序列表<110>天津春發(fā)食品配料有限公司天津科技大學<120>多拷貝牛肉風味肽表達基因及載體和重組畢赤酵母的構建<160>2<210> 1<211> 143<212>DNA<213>人工序列<220><223>含4個BMP表達基因 <400> 1gaattcctcg agaagggtgacgaggaatctttggctaagggtgacgaggaatctttggct 60aagggtgacg aggaatctttggctaagggtgacgaggaatctttggctgtcgaccaccac 120caccaccacc actaagcggccgc 143<210>2<211〉449<212>DNA<213>人工序列<220><223>含16個BMP表達基因<400> 2gaattcctcg agaagggtgacgaggaatctttggctaagggtgacgaggaatctttggct 60aagggtgacg aggaatctttggctaagggtgacgaggaatctttggctgtcgagaagggt 120gacgaggaat ctttggctaagggtgacgaggaatctttggctaagggtgacgaggaatct 180ttggctaagg gtgaegaggaatctttggctgtcgagaagggtgacgaggaatctttggct 240a鄉(xiāng)gtgacg aggaatctttggctaagggtgacgaggaatctttggctaagggtgacgag 300gaatctttgg ctgtcgagaagggtgacgaggaatctttggctaagggtgacgaggaatct 360ttggctaagg gtgacgaggaatctttggctaagggtgacgaggaatctttggctgtcgac 420caccaccacc accaccactaagcggccgc 449
權利要求
1、一種含有4拷貝牛肉風味肽BMP的表達基因片段，其基因序列如序列表序列1所示。
2、 根據權利要求1所述的表達基因片段，其特征是所述的表達基因片段是以4拷貝牛肉 風味肽為基本單元，進行體外連接后得到的具有牛肉風味肽的多拷貝數N的表達基因 片段，拷貝數N為4的整數倍。
3、 根據權利要求2所述的表達基因片段，其特征是所述的表達基因片段的牛肉風味肽的 拷貝數為N-16,其基因序列如序列表序列2所示。
4、 一種表達載體，其特征是含有權利要求3所述的拷貝數為N=16的表達基因片段的表 達載體pPIC9。
5、 一種工程菌株，其特征在于是用權利要求4所述的表達載體pPIC9導入畢赤酵母構成 的工程菌株，菌種命名為巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris) GS115-16BMP，保藏編號 為No.2136。
6、 一種權利要求1所述的表達基因片段的設計方法，其特征是該設計方法的步驟如下 第一、按照畢赤酵母翻譯表達的密碼子偏愛性設計出含有4拷貝BMP的表達基因片段，4拷貝的BMP表達基因頭尾相連，每個表達片段之間不含其他序列； 第二、在上步4拷貝BMP表達基因的上游位置加入^0 I限制性酶切位點，下游位置加入&n限制性酶切位點； 第三、在上步的基因片段的Jao I限制性酶切位點的上游位置加入五coi I限制性酶切位點，限制性酶切位點的下游位置順序加入6His編碼基因、WWI限制性酶切位點和TAA終止密碼子，最終得到如序列表序列1所示的含有4拷貝BMP的表達基因片段。
7、 一種權利要求3所述的表達基因片段的構建方法，其特征是該構建方法的步驟如下 第一、用屈o I或I將權利要求6所述的表達基因片段的載體酶切后線性化，產生粘性末端；第二、用屈o I和S"/ I將權利要求6所述的表達基因片段的載體雙酶切后回收包含4拷貝BMP、兩端含有JWw I和I粘性末端的小片段； 第三、將第一步和第二步得到的基因片段通過T4DNA連接酶進行連接，連接獲得含有8拷貝、12拷貝、16拷貝或拷貝數為4的任意整數倍的BMP表達基因載體； 第四、由于連接反應沒有正反向選擇，需要人為地通過用屈o I和1限制性酶切方法挑出含有正向插入的轉化子，并通過其瓊脂糖凝膠電泳位置確定連接小片段的數量，最終選擇含有16拷貝的BMP的轉化子，即得到16拷貝的BMP基因載體。
8、 一種權利要求4所述的表達載體pPIC9的構建方法，其特征是該構建方法的步驟如下 第一、將權利要求7構建好的含有拷貝數為16的BMP表達基因片段通過五coi I和iVof I雙酶切，回收含有BMP表達基因的小片段； 第二、將用于畢赤酵母的表達載體pPIC9用I和iVw I雙酶切； 第三、將上述第一步和第二步所得的回收小片段和載體大片段通過T4 DNA連接酶連接，使含有拷貝數為16的BMP表達基因片段插入到pPIC9上而得到。
9、 一種權利要求5所述的畢赤酵母工程菌株的構建方法，其特征是該構建方法的步驟如 下第一、將權利要求8構建好的拷貝數為16的BMP表達載體pPIC9用I限制性內切酶 酶切線性化；第二、通過電擊轉化的方法將上步線性化的表達載體pPIC9導入畢赤酵母，發(fā)生重組； 第三、通過組氨酸營養(yǎng)缺陷平板篩選和PCR法鑒定，選出陽性轉化子，即得到重組畢赤 酵母工程菌株。
10、 一種權利要求5所述的畢赤酵母工程菌株在制備多串聯拷貝的牛肉風味肽中的應 用，其特征是該重組畢赤酵母工程菌株通過甲醇誘導，產生含有拷貝數為16的BMP 多肽，并帶有一個6His標記，該標記用于Western Blot進行產物的定性、定量分析，或 與Ni柱親和，進行分離純化。
全文摘要
一種多拷貝牛肉風味肽表達基因及載體和重組畢赤酵母的構建方法。本發(fā)明涉及一種用分子生物技術在畢赤酵母中獲得牛肉風味肽(BeefyMeatyPeptide，BMP)的方法，克服了現有技術提取或化學合成BMP的技術難度大、成本高、產量低等不足。根據畢赤酵母表達翻譯的密碼子偏愛性，設計出含有4拷貝的BMP表達基因的序列，并設計出必要的限制性酶切位點、6His和終止密碼子。通過體外操作，不斷的擴大BMP的拷貝數至16拷貝，并將其插入到表達載體pPIC9上，將pPIC9線性化后通過電轉化的方法將目的片段——含16拷貝的BMP表達基因，重組于畢赤酵母的基因組上。通過發(fā)酵，甲醇誘導畢赤酵母得到高產量的BMP，并通過6His親和柱Ni柱進行分離純化。
文檔編號C12N15/12GK101148669SQ20071005963
公開日2008年3月26日 申請日期2007年9月18日 優(yōu)先權日2007年9月18日
發(fā)明者王艷萍, 邢海鵬, 文 高 申請人:天津春發(fā)食品配料有限公司;天津科技大學