專利名稱：一種角質(zhì)酶的分離純化方法
一種角質(zhì)酶的分離純化方法技術(shù)領(lǐng)域一種角質(zhì)酶的分離純化方法，本發(fā)明涉及一種以疏水色譜為主要手段的角 質(zhì)酶的分離純化方法，屬于生物制品分離純化技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景退漿后未經(jīng)加工的織物，其吸水性及白度均不盡人意。傳統(tǒng)精練經(jīng)濃堿煮 練后，需消耗大量清水進行漂洗，產(chǎn)生大量污水，對環(huán)境極為不利。如采用生 物酶對織物進行精練，以除去非纖維素雜質(zhì)，可大大降低對環(huán)境的影響。角質(zhì) 酶可分解纖維表面的角質(zhì)，并將附著的脂質(zhì)等雜質(zhì)一同從棉纖維表面除去，同 時對棉籽殼也有一定的降解作用。將其和果膠酶復(fù)合使用，效果更好。同時r/^rmo^y^a/^M為嗜熱菌，所產(chǎn)角質(zhì)酶耐熱性好，適合紡織工業(yè)的需要。角 質(zhì)酶的分離純化是進行蛋白質(zhì)測序、性質(zhì)應(yīng)用分析和進一步構(gòu)建基因工程菌， 提高角質(zhì)酶產(chǎn)量的基礎(chǔ)，因此，采用簡單有效的方法對角質(zhì)酶進行分離純化成 為研究的熱點。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種角質(zhì)酶的分離純化方法，采用疏水色譜為主要手 段的有效簡便的方法分離純化野生菌所產(chǎn)角質(zhì)酶，使之達(dá)到電泳純，為進行進 一步的蛋白質(zhì)測序、性質(zhì)應(yīng)用分析和基因工程菌構(gòu)建奠定基礎(chǔ)'。本發(fā)明的技術(shù)方案 一種角質(zhì)酶的分離純化方法，工藝步驟為 (1 )硫酸銨沉淀將嗜熱子囊菌77z^7W^折^/^ca發(fā)酵液離心去除菌體后，上清液中加入硫酸銨粉末，達(dá)到60%-80%硫酸銨濃度，70%的硫酸銨濃度更佳，緩慢攪拌使之完 全溶解，并于4'C靜置4-24h，靜置4h更佳，將靜置后的混合液12000 rpm冷 凍離心15-30 min，冷凍離心15 min更佳，收集蛋白沉淀，將沉淀復(fù)溶于適量 pH 7.5的Tris-HCl緩沖液中，并加入硫酸銨粉末達(dá)20 %的硫酸銨濃度，制成上 樣液；(2)疏水色譜采用Phenyl HP疏水柱，以含有20 %硫酸銨的pH 7.5的Tris-HCl緩沖液平 衡過夜；將l個柱體積的上樣液以0.5-1 mL/min的速度加入疏水色譜中，上樣 速度1 mL/min更佳，用pH 7.5的Tris-HCl緩沖液以同樣的速度洗脫至280 nm 紫外吸收峰為0;然后以l個柱體積的去離子水洗脫，收集活性峰，即為所制備 的電泳純角質(zhì)酶溶液。
本發(fā)明的有益效果(1) 分離工藝簡單，周期短。本分離純化工藝由硫酸銨沉淀和疏水色譜兩 部分組成，硫酸銨沉淀約為5h，疏水色譜約為3h。(2) 作用條件溫和，見效快。角質(zhì)酶疏水性很強，必須用沒有離子強度的 去離子水才能將其洗脫，因此不用經(jīng)過高鹽洗脫、梯度洗脫等步驟，可以直接用pH 7.5的Tris-HCl緩沖液將所有雜蛋白去除，隨后用去離子水洗脫，以減少操作時間。


圖l角質(zhì)酶Phenyl HP疏水柱層析圖譜具體實施方式
以疏水色譜為主要手段對角質(zhì)酶進行分離純化，其具體步驟如下(1) 野生菌發(fā)酵生產(chǎn)角質(zhì)酶以嗜熱子囊菌772^mo6折^/i^o7為出發(fā)菌株，將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的種子接 入發(fā)酵培養(yǎng)基中，5(TC培養(yǎng)50h，得到含角質(zhì)酶的發(fā)酵液。嗜熱子囊菌 T7ze，o&y^a/wca菌株己公開，見應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報2005, 11 (5):608 610。(2) 硫酸銨沉淀將發(fā)酵液12000 rpm冷凍離心10 min去除菌體后，在發(fā)酵上清液中緩慢加 入70%的硫酸銨粉末，并緩慢攪拌使之完全溶解，于4。C靜置4小時使蛋白充分 沉淀，12000rpm冷凍離心15 min，收集蛋白沉淀，將沉淀復(fù)溶于pH 7.5的Tris-HCl 緩沖液中，加入20%硫酸銨制成上樣液。(3) 疏水色譜疏水柱以含有20%硫酸銨的pH7.5的Tris-HCl緩沖液平衡，將1個柱體積 的上樣液以1 mL/min的速度加入疏水色譜中，用pH7.5的Tris-HCl緩沖液以同 樣的速度洗脫至280 nm紫外吸收峰為0;再以1個柱體積的去離子水洗脫，收 集活性峰，即為所制備的電泳純角質(zhì)酶。
權(quán)利要求
1、一種角質(zhì)酶的分離純化方法，其特征是工藝步驟為(1)硫酸銨沉淀將嗜熱子囊菌Thermobifida fusca發(fā)酵液離心去除菌體后，上清液中加入硫酸銨粉末，達(dá)到60％-80％硫酸銨濃度，緩慢攪拌使之完全溶解，并于4℃靜置4-24h，將靜置后的混合液12000rpm冷凍離心15-30min，收集蛋白沉淀，將沉淀復(fù)溶于適量pH7.5的Tris-HCl緩沖液中，并加入硫酸銨粉末達(dá)20％的硫酸銨濃度，制成上樣液；(2)疏水色譜采用Phenyl HP疏水柱，以含有20％硫酸銨的pH7.5的Tris-HCl緩沖液平衡過夜，將1個柱體積的上樣液以0.5-1mL/min的速度加入疏水色譜中，用pH7.5的Tris-HCl緩沖液以同樣的速度洗脫至280nm紫外吸收峰為0；然后以1個柱體積的去離子水洗脫，收集活性峰，即為所制備的電泳純角質(zhì)酶溶液。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述角質(zhì)酶的分離純化方法，其特征是工藝步驟為(1) 硫酸銨沉淀將嗜熱子囊菌T7zermo^/ ^/^ca發(fā)酵液離心去除菌體后，上清液中加入硫 酸銨粉末，達(dá)到70%硫酸銨濃度，緩慢攪拌使之完全溶解，并于(C靜置4h， 將靜置后的混合液12000 rpm冷凍離心15min,收集蛋白沉淀，將沉淀復(fù)溶于適 量pH7.5的Tris-HCl緩沖液中，并加入硫酸銨粉末達(dá)20 %的硫酸銨濃度，制成 上樣液；(2) 疏水色譜采用Phenyl HP疏水柱，以含有20 %硫酸銨的pH 7.5的Tris-HCl緩沖液平 衡過夜，將l個柱體積的上樣液以lmL/min的速度加入疏水色譜中，用pH 7.5 的Tris-HCl緩沖液以同樣的速度洗脫至280 nm紫外吸收峰為0;然后以1個柱 體積的去離子水洗脫，收集活性峰，即為所制備的電泳純角質(zhì)酶溶液。
全文摘要
一種角質(zhì)酶的分離純化方法，屬于生物制品分離純化技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用嗜熱子囊菌Thermobifida fusca為出發(fā)菌株，經(jīng)液體深層發(fā)酵制備的角質(zhì)酶，在經(jīng)過硫酸銨沉淀、疏水色譜之后，得到了電泳純的角質(zhì)酶溶液，可用于后續(xù)的蛋白質(zhì)測序和性質(zhì)研究。本發(fā)明方法步驟簡單，酶純度高，是一種簡便有效的酶分離純化方法。
文檔編號C12N9/18GK101126083SQ200710023719
公開日2008年2月20日 申請日期2007年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月5日
發(fā)明者敬 吳, 堅 陳, 晟 陳 申請人:江南大學(xué)