專(zhuān)利名稱(chēng)：一種細(xì)胞芯片在基因毒理和動(dòng)物毒理上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種細(xì)胞芯片在基因毒理和動(dòng)物毒理上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前國(guó)際上僅有美國(guó)少數(shù)的生物儀器公司和大學(xué)研究部門(mén)在開(kāi)展細(xì)胞芯片 技術(shù)的研究，這些公司在細(xì)胞組織培養(yǎng)芯片儀器領(lǐng)域已經(jīng)有一定的原型產(chǎn)品， 但是目前這些產(chǎn)品大多不是以人的細(xì)胞作為對(duì)象，而是以豬等非人類(lèi)細(xì)胞為研 究材料的，而且目前產(chǎn)品的價(jià)格和效率無(wú)法滿足實(shí)際需要，所以迫切需要開(kāi)發(fā) 新一代的產(chǎn)品。肝臟的組織工程研究在美國(guó)和日本的實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)開(kāi)展多年，國(guó) 內(nèi)目前也有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室從事這方面的研究，但是從事人類(lèi)肝臟細(xì)胞研究的則還 沒(méi)有.將二者結(jié)合實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞芯片上的三維肝臟組織長(zhǎng)期培養(yǎng)尚未有報(bào)道。
另外我國(guó)目前300萬(wàn)慢性乙型肝炎病人，其中有30萬(wàn)肝硬化患者，此外每 年約有2% ~3%的患者發(fā)展至肝硬化.肝硬化患者中每年肝癌的發(fā)生率約為3 %~10%.對(duì)于肝硬化和肝癌，肝臟移植手術(shù)是一種有效的治療手段.但是肝 臟移植有許多條件的限制，并非所有的病患皆有等待換肝的機(jī)會(huì)；再者，肝臟 的供體缺乏，體外培養(yǎng)的肝臟組織可以作為的橋梁來(lái)幫助末期肝病的病人，讓 病人延長(zhǎng)生命以等待適當(dāng)?shù)母闻K捐增者，因此，開(kāi)發(fā)一個(gè)成功的人工肝臟支持 系統(tǒng)將在臨床上有重要意義.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)解決的上述問(wèn)題,本發(fā)明提供了 一種一種細(xì)胞芯片在基因毒理和動(dòng) 物毒理上的應(yīng)用，它利用三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以使體外培養(yǎng)的肝臟細(xì)胞具有與 體內(nèi)肝臟組織具有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)和恒溫，穩(wěn)定pH值等條件，同時(shí)結(jié)合細(xì)胞芯片技 術(shù)達(dá)到活性肝臟組織在體外長(zhǎng)期存活，這對(duì)建立人工肝臟支持系統(tǒng)將致關(guān)重 要。
本發(fā)明釆用了以下技術(shù)方案細(xì)胞芯片在基因毒理和動(dòng)物毒理上的應(yīng)用。 所述的芯片中的三維細(xì)胞培養(yǎng)形成體內(nèi)的結(jié)構(gòu)和功能。所述的芯片中的細(xì)胞培 養(yǎng)芯片為提外細(xì)胞培養(yǎng)創(chuàng)造條件控制，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的長(zhǎng)期存活。
采用了以上技術(shù)方案后，肝臟組織在細(xì)胞芯片上形成與體內(nèi)類(lèi)似的結(jié)構(gòu)以
及相類(lèi)似的PH值、營(yíng)養(yǎng)，溫度，和C02的濃度，這樣肝臟組織在細(xì)胞芯片上存活 時(shí)間達(dá)到一個(gè)月以上，肝細(xì)胞功能基因，如Albumin, HNF4,的表達(dá)達(dá)到與體 內(nèi)相似水平，實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞芯片的大規(guī)模培養(yǎng)，量化人造肝臟在毒理、藥理上的 反應(yīng)，還可以比較人造肝臟、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及離體肝臟、肝細(xì)胞之體外試驗(yàn)對(duì)藥物 的反應(yīng)。


圖1為上皮細(xì)胞在三維組織培養(yǎng)中形成類(lèi)似體內(nèi)組織的結(jié)構(gòu)
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明為一種細(xì)胞芯片在基因毒理和動(dòng)物毒理上的應(yīng)用，細(xì)胞芯片也稱(chēng)人 造肝臟，本發(fā)明中所述的芯片中的三維細(xì)胞培養(yǎng)形成體內(nèi)的結(jié)構(gòu)和功能。所述 的芯片中的細(xì)胞培養(yǎng)芯片為提外細(xì)胞培養(yǎng)創(chuàng)造條件控制，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的長(zhǎng)期 存活。
一、器件的設(shè)計(jì)和制作流程 1、首先制作一種配備有溫控和流控集成部件的微流體器件。它大致由兩 部分組成，第一部分由高分子聚合材料PDMS做成，PDMS是一種光學(xué)透明材料 而且可以永久性的沾粘到光滑的硅片表面。微流體通道和表面電極通過(guò)光刻蝕 方法做在芯片的表面。PDMS芯片中心部分被移除來(lái)作為一個(gè)個(gè)小的細(xì)胞培養(yǎng) 皿。這些微流體通道為向微型細(xì)胞培養(yǎng)皿中輸送培養(yǎng)液和其它液體提供了通道。 這些金屬接觸電極將會(huì)與外部的溫度和流速控制電路相連。第二部分由丙烯酸 聚酯做成而且和第一部分相連。鉑電極和銀電極將被做在第二部分上。蜿蜒的 鉑電極將用來(lái)測(cè)量局部的溫度。在第一和第二部分合在一起后，所有的電極將 被密閉到細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi) 第一部分
第一部分用光刻蝕的方法做成.首先微型脊梁樣板用標(biāo)準(zhǔn)光刻蝕法做在4英尺 的硅片上.硅片表面鍍上一層防粘分子，然后l到2亳米厚的液體pdms會(huì)灌注 在硅片上，隨后放在平桌上在室溫下固化.Pdms的上表面在固化以后會(huì)很平滑. 一層50到100納米厚的金屬層用金屬蒸鍍法鍍?cè)趐dms表面。然后一層2微米
厚的正光刻膠旋轉(zhuǎn)到pdtns表面，然后用光刻蝕排版。排好版的光刻膠作為下一 步的金腐蝕掩膜。腐蝕后金屬電極保留在pdms表面而且光刻膠用丙酮溶解。 最后pdms從硅片上揭下來(lái)切成小芯片，在微流通道兩端打孔作為入口和出口。 第二部分
第二部分會(huì)用激光切割技術(shù)制造。首先超平且透明的丙烯酸聚酯被切成直徑為 4英尺的薄片，然后用于感溫的鉑電極和銀電極將會(huì)用標(biāo)準(zhǔn)的光刻蝕方法，電 子束金屬蒸鍍和溶劑協(xié)助抬離法排版在4英尺的丙烯酸聚酯薄片上。接下來(lái)用 激光切割方法4英尺的丙烯酸聚酯片被切成小芯片并且在小芯片上鉆孔。最后 第二部分被用熱擴(kuò)散的方法與第一部分結(jié)合在一起，所后進(jìn)一步的用液體的 PDMS或膠水粘和。
2、 微型流體器件集成和試驗(yàn)裝置
微流細(xì)胞培養(yǎng)皿將與另外的電路芯片集成在一起。電路芯片是一個(gè)硅材料器件 而且表面有一層很薄的二氧化硅作為隔離層。二氧化硅可以通過(guò)氧離子修飾與 pdms表面永久性連結(jié)在一起。隨后微型細(xì)胞培養(yǎng)皿將被封閉起來(lái)并且通過(guò)微 流通道與入口和出口相連。管道和連結(jié)器被裝在入口和出口然后與外部的真空 泵連接。培養(yǎng)液和洗滌液將通過(guò)外部的真空泵控制輸入到微型器件內(nèi)。下圖顯 示了第一代的細(xì)胞培養(yǎng)芯片和各種細(xì)胞。
3、 肝臟組織在細(xì)胞芯片上體外重建
我們將首先從小鼠肝臟中分離出肝細(xì)胞，然后將單個(gè)細(xì)胞種植在胞外基質(zhì)形成 的三維膠體中.在合適的條件下，這些細(xì)胞一周后可以成長(zhǎng)為具有功能組織細(xì) 胞團(tuán)(organoids).我們將實(shí)驗(yàn)不同的胞外基質(zhì)組合，目標(biāo)是摸索出一種最適合 肝細(xì)胞的三維培養(yǎng)環(huán)境.通過(guò)熒光標(biāo)記和激光共聚焦顯微技術(shù)，可以確定這些 組織細(xì)胞團(tuán)是否具有正確的結(jié)構(gòu).利用定量PCR技術(shù)，我們將在長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程 中檢測(cè)幾種肝細(xì)胞功能基因，如Albumin, HNF4.這些基因的表達(dá)量可以做為 肝細(xì)胞活性的指標(biāo). 二、前臨床藥物篩檢
(l)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢查肝臟毒性可分為長(zhǎng)期和短期試驗(yàn)，這些試驗(yàn)均常用大、小 鼠來(lái)進(jìn)行。由于狗對(duì)大多數(shù)毒物較敏感，故有時(shí)也被釆用。受試化學(xué)物給予動(dòng)
物的途徑應(yīng)與人實(shí)際暴露的途徑相同。但吸入試驗(yàn)較困難。
檢驗(yàn)方法有
A、 病理檢查
B、 顯微鏡檢查光學(xué)顯微鏡下可觀察到許多組織學(xué)變化，電子顯微鏡可檢查各 種次細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化。觀察次細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，結(jié)合生化變化，有助于了解毒物 作用機(jī)轉(zhuǎn)。
C、 生化檢查許多血清酶可作為肝損傷的指標(biāo)，由于肝受損，酶從細(xì)胞液體和 細(xì)胞結(jié)構(gòu)(如粒腺體、溶酶體和核)內(nèi)釋放入血。
(2 )體外試驗(yàn)
1、 的廣泛作用。
2、 離體肝細(xì)胞從大鼠和人體分離的或經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的肝細(xì)胞，已用于各類(lèi)生化研 究。常用新分離的肝細(xì)胞，但它們僅能保存2-6小時(shí)，若置與培養(yǎng)液內(nèi)，能存 活l-5天。正常的肝細(xì)胞很少或沒(méi)有有絲分裂活性。為了研究對(duì)分裂期肝細(xì)胞 的影響，可用于幼齡動(dòng)物的肝細(xì)胞或肝瘤細(xì)胞。 分離的肝細(xì)胞可用于測(cè)定各類(lèi)毒物作用的性質(zhì)
A、 可用于顯微鏡或生化試驗(yàn)以檢查膜損傷。生化方法包括測(cè)定細(xì)胞攝取輔助因 子(如MDPH),極性染料(如錐藍(lán))以及酵解物(如琥珀鹽酸)的能力，測(cè)定 漏逸出的胞漿酶。
B、 檢查大分子的改變，如抑制蛋白和RNA合成以及增加DM合成。
C、 其它包括中間代謝物、肝細(xì)胞活性和生長(zhǎng)的變化。 (3)人造肝臟(肝細(xì)胞芯片)
2.肝臟組織在細(xì)胞芯片上體外重建。 (4 )量化人造肝臟在毒理、藥理上的反應(yīng)
將藥物投注至人造肝臟后，觀察芯片及紀(jì)錄其毒理、藥理上之反應(yīng)，并利用統(tǒng) 計(jì)分析之方法將實(shí)驗(yàn)結(jié)果予以量化。
(5 )比較人造肝臟、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及離體肝臟、肝細(xì)胞之體外試驗(yàn)對(duì)藥物的反應(yīng)將 比較三種不同之前臨床藥物檢驗(yàn)方法，亦即分別將藥物投注至三種不同藥物檢 驗(yàn)?zāi)Ｊ?，比較其實(shí)驗(yàn)結(jié)果之差異性，進(jìn)而找出其彼此間關(guān)聯(lián)性，以期三維肝臟組織能夠輔助甚至取代傳統(tǒng)前臨床藥物檢驗(yàn)方法。
根據(jù)圖l，下面為一實(shí)施例我們將首先從小鼠肝臟中分離出肝細(xì)胞，然后
將單個(gè)細(xì)胞種植在胞外基質(zhì)形成的三維膠體中.在合適的條件下，這些細(xì)胞一
周后可以成長(zhǎng)為具有功能組織細(xì)胞團(tuán)(organoids).我們將實(shí)驗(yàn)不同的胞外基 質(zhì)組合，目標(biāo)是摸索出一種最適合肝細(xì)胞的三維培養(yǎng)環(huán)境.通過(guò)熒光標(biāo)記和激 光共聚焦顯微技術(shù)，可以確定這些組織細(xì)胞團(tuán)是否具有正確的結(jié)構(gòu).利用定量 PCR技術(shù)，我們將在長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中檢測(cè)幾種肝細(xì)胞功能基因，如Albumin， HNF4.這些基因的表達(dá)量可以做為肝細(xì)胞活性的指標(biāo).
權(quán)利要求
1、細(xì)胞芯片在基因毒理和動(dòng)物毒理上的應(yīng)用。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是所述的芯片中的三維細(xì)胞培養(yǎng) 形成體內(nèi)的結(jié)構(gòu)、功能和環(huán)境。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是所述的芯片中的細(xì)胞培養(yǎng)芯片 為人體外細(xì)胞的培養(yǎng)創(chuàng)造條件，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在體外的長(zhǎng)期存活。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是所述的條件包括PH值、營(yíng)養(yǎng)， 溫度和C02的濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)人造肝臟在基因毒理和動(dòng)物毒理的應(yīng)用。它可以使肝臟組織在細(xì)胞芯片上形成與體內(nèi)類(lèi)似的結(jié)構(gòu)以及相類(lèi)似的pH值、營(yíng)養(yǎng)，溫度，和CO₂的濃度等條件，這樣肝臟組織在細(xì)胞芯片上長(zhǎng)時(shí)間存活，肝細(xì)胞功能基因，如Albumin，HNF4的表達(dá)達(dá)到與體內(nèi)相似水平，實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞芯片的大規(guī)模培養(yǎng)，量化人造肝臟在毒理、藥理上的反應(yīng)，還可以比較人造肝臟、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及離體肝臟、肝細(xì)胞之體外試驗(yàn)對(duì)藥物的反應(yīng)。從而替代現(xiàn)有的活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
文檔編號(hào)C12M3/00GK101186876SQ20071002284
公開(kāi)日2008年5月28日 申請(qǐng)日期2007年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月24日
發(fā)明者韌 徐, 徐景宏, 黃金麟 申請(qǐng)人:泰州伯克利生物技術(shù)有限公司;中國(guó)醫(yī)藥城(泰州)國(guó)際生物芯片研發(fā)中心