專利名稱：4,5－二羥基－2－甲氧基苯甲醛及其發(fā)酵法制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
4，5-二羥基-2-甲氧基苯甲醛及其發(fā)酵法制備和應(yīng)用，屬于生物發(fā)酵及生化分離技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及從雞腿蘑液體發(fā)酵液分離獲得一種新的化合物4，5-二羥基-2-甲氧基苯甲醛，它具有式(I)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，本發(fā)明還涉及該物質(zhì)防治糖尿病的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
雞腿蘑(Coprinus Comatus)，學(xué)名毛頭鬼傘，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)確定為具“天然、營(yíng)養(yǎng)、保健”三種功能為一體的16種珍稀食用菌之一。現(xiàn)代研究表明，雞腿蘑具有降低血糖、防止肝損傷、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力等功效。
糖尿病是一種常見(jiàn)多發(fā)的慢性代謝性疾病，千百年來(lái)它一直嚴(yán)重危害著人類(lèi)的健康與生命。高血糖引起的一系列代謝紊亂是造成糖尿病血管病變的主要因素，多年來(lái)的研究表明其機(jī)理是通過(guò)多種途徑介導(dǎo)的，其中蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)是主要因素之一。該反應(yīng)最終可形成一系列不可逆的糖基化終產(chǎn)物(Advanced glycosylation end products，AGEs)。在糖尿病患者體內(nèi)，隨著AGEs反應(yīng)的發(fā)生和加速，會(huì)導(dǎo)致膠原蛋白發(fā)生交聯(lián)耦合、心室隔膜增厚及動(dòng)脈硬化，從而引起一系列病理生理改變。因此，抑制和減少AGEs的形成也是近年來(lái)糖尿病研究中的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種化合物(I)4，5-二羥基-2-甲氧基苯甲醛。
本發(fā)明的目的之二在于提供化合物(I)的制備方法。
本發(fā)明的目的之三在于提供化合物(I)在制備治療和防治糖尿病疾病藥物或保健品方面的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案化合物4，5-二羥基-2-甲氧基苯甲醛，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下 化合物(I)本發(fā)明所述的化合物(I)的制備方法為
步驟1將雞腿蘑發(fā)酵液3000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心20分鐘，取上清液用AB-8型大孔樹(shù)脂層析柱吸附，吸附結(jié)束后，用超純水洗脫除去蛋白質(zhì)、多糖，直至流出液測(cè)不出糖和蛋白，然后用10倍柱體積20％體積濃度的乙醇洗脫，收集洗脫液濃縮、冷凍干燥，所得組分稱為M1；步驟2將步驟1中冷凍干燥的M1組分用超純水溶解后用C18低壓層析柱分離，每次上樣量為5～8mg，用0.5∶9.5-8∶2的甲醇-水梯度洗脫，流速2mL/分鐘，紫外檢測(cè)器280nm檢測(cè)，收集到4個(gè)組分，按出峰順序取第3個(gè)組分濃縮、冷凍干燥，所得組分稱為M1-3；步驟3將步驟2中冷凍干燥的M1-3組分用超純水溶解后用C18中壓層析柱分離，每次上樣量為0.5～1mg，用0.5∶9.5-6∶4的甲醇-水梯度洗脫，流速1.0～1.6mL/分鐘，紫外檢測(cè)器280nm檢測(cè)，根據(jù)出峰情況收集主峰物質(zhì)，濃縮、冷凍干燥，所得組分稱為M1-3-1；步驟4將步驟3中冷凍干燥的M1-3-1組分按步驟3的柱層析分離和收集條件重復(fù)一次，所收集到的物質(zhì)即為化合物4，5-二羥基-2-甲氧基苯甲醛。
化合物(I)的結(jié)構(gòu)分析經(jīng)分析，化合物(I)確定為4，5-二羥基-2-甲氧基苯甲醛(4，5-Dihydroxy-2-Methoxy-Benzaldehyde)。HR MS m/z168.0426(計(jì)算值168.0423)，分子式C8H8O4。MSm/z167，165，146，139，137，125，121，109，107。UVλmax206，232，287。IR(KBr)cm-13411.88，3230.09，2925.79，1630.50，1601.12，1486.15，1453.42，1384.80，1229.39，1161.62，1079.46。化合物(I)核磁共振圖譜分析如下由1HNMR(CD3OD)分析可得以下信息化學(xué)位移信號(hào)δ3.74(s，3H，-OCH3)顯示有一個(gè)甲氧基，δ6.5～6.0 ppm的多重峰顯示有苯基存在，且多重峰的耦合常數(shù)j＜1則表明兩個(gè)芳?xì)滟|(zhì)子應(yīng)為對(duì)位取代，δ10.06則可以推斷該結(jié)構(gòu)具有醛基，10.06ppm為醛基的化學(xué)位移。
結(jié)合13CNMR(CD3OD)分析δC192.25和δC61應(yīng)為-CHO和-OCH3的信號(hào)，δC111.58ppm、107.96ppm、149.21ppm、165.78ppm、101.78ppm、166.13ppm為苯基的化學(xué)位移。

本發(fā)明所述的雞腿蘑發(fā)酵液是在培養(yǎng)基中不加苦瓜的條件下按專利公開(kāi)說(shuō)明書(shū)CN166939A所述的方法制備。
按照本發(fā)明的方法，化合物4，5-二羥基-2-甲氧基苯甲醛的應(yīng)用，該化合物(I)添加或不添加賦形劑用于制備治療和防治糖尿病疾病的藥物或保健品。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明涉及從雞腿蘑液體發(fā)酵液分離獲得一種新的化合物4，5-二羥基-2-甲氧基苯甲醛，該產(chǎn)品添加或不添加賦形劑用于制備治療和防治糖尿病疾病的藥物或保健品。


圖1化合物(I)高分辯質(zhì)譜報(bào)告(HR MS)。中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所提供分析檢測(cè)報(bào)告。
圖2化合物(I)核磁共振碳譜(13C)。
圖3化合物(I)核磁共振氫譜(1H)。
圖4化合物(I)質(zhì)譜圖(MS)。中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所提供分析檢測(cè)報(bào)告。
圖5化合物(I)紅外圖譜(IR)。中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所提供分析檢測(cè)報(bào)告。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1雞腿蘑發(fā)酵液的制備在新鮮的斜面培養(yǎng)基中接入雞腿蘑菌絲體，雞腿蘑菌種是CGMCC No.5.252(購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心)，培養(yǎng)溫度25.5℃，待菌絲體長(zhǎng)滿斜面后，將斜面菌種接入裝有75mL搖瓶培養(yǎng)基的250mL三角瓶中(共5瓶)，于25.5℃、150轉(zhuǎn)/分鐘搖床培養(yǎng)130小時(shí)。其中所述搖瓶培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升)葡萄糖25，玉米粉15，麩皮7.5，酵母膏3，玉米漿3，KH2PO43，MgSO44，起始pH值為6.3。
將上述搖瓶菌種接入裝有150mL擴(kuò)大培養(yǎng)基的500mL三角瓶中(共24瓶)，接種量為每500mL三角瓶接入11mL搖瓶種子，于25.5℃、150轉(zhuǎn)/分鐘搖床培養(yǎng)93小時(shí)。其中所述擴(kuò)大培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升)葡萄糖20，玉米粉15，麩皮8，KH2PO43，MgSO44.5，起始pH值為6.3。
將上述擴(kuò)大培養(yǎng)的菌種3600mL接入裝有44.9L一級(jí)種子培養(yǎng)基的75L種子罐中，種子罐中發(fā)酵液的總體積為48.5L；維持罐溫25.5℃，罐壓0.05MPa，攪拌速率120轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1∶0.6v/v/m，發(fā)酵時(shí)間85小時(shí)。其中種子罐中的一級(jí)種子培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升)葡萄糖20，玉米粉20，麩皮8，KH2PO43，MgSO42，起始pH值為6.3。
然后將48.5L一級(jí)種子菌神接入裝有600L發(fā)酵培養(yǎng)基的1000L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中發(fā)酵液的總體為648.5L。維持罐溫25.5℃，罐壓0.05MPa，攪拌速率100轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1∶0.5v/v/m，發(fā)酵時(shí)間96小時(shí)。其中發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為(單位為克/升)葡萄糖15，玉米粉15，麩皮7.5，KH2PO43，MgSO42，起始pH值為6.4。
發(fā)酵結(jié)束，共獲得648.5L雞腿蘑發(fā)酵液。
實(shí)施例2化合物(I)的制備及結(jié)構(gòu)分析制備步驟1取2L雞腿蘑發(fā)酵液3000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心20分鐘，取上清液用AB-8型大孔樹(shù)脂層析柱吸附，吸附結(jié)束后，用超純水洗脫除去蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)，直至流出液測(cè)不出糖和蛋白，然后用10倍柱體積20％乙醇洗脫，收集洗脫液濃縮、冷凍干燥。
制備步驟2將步驟1中冷凍干燥的組合物用超純水溶解后用C18低壓層析柱(26mm×50cm)分離，每次上樣量為5.5mg。甲醇-水梯度洗脫(0.5∶9.5-8∶2)，流速2mL/分鐘，紫外檢測(cè)器280nm檢測(cè)。根據(jù)出峰情況共收集到4個(gè)組分，按出峰順序取第3個(gè)組分濃縮、冷凍干燥。
制備步驟3將步驟2中冷凍干燥的組合物用超純水溶解后用C18中壓層析柱(15mm×40cm)分離，每次上樣量為0.6mg。甲醇-水梯度洗脫(0.5∶9.5-6∶4)，流速1.6 mL/分鐘，紫外檢測(cè)器280nm檢測(cè)。根據(jù)出峰情況收集主峰物質(zhì)，濃縮、冷凍干燥。
制備步驟4將制備步驟3中冷凍干燥的組合物用超純水溶解后用C18中壓層析柱(15mm×40cm)分離，每次上樣量為0.6mg。甲醇-水梯度洗脫(0.5∶9.5-6∶4)，流速1.6mL/分鐘，紫外檢測(cè)器280nm檢測(cè)。收集主峰物質(zhì)，濃縮、冷凍干燥，即為化合物(I)。
化合物(I)的結(jié)構(gòu)分析如上述。
實(shí)施例3化合物(I)的制備制備步驟2中的上樣量為8.0mg。步驟3中的上樣量為1mg，流速為1.0mL/分鐘。步驟4中的上樣量為1mg，流速為1.0mL/分鐘。其余操作同實(shí)施例2。
實(shí)施例4化合物(I)對(duì)體外非酶糖基化(AGEs)抑制率的測(cè)定將化合物(I)用超純水溶解，分別配制成0.5mg/mL，1.0mg/mL，2.0mg/mL三個(gè)濃度，化合物(I)在不同濃度下對(duì)體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率如下

化合物(I)溶液對(duì)體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的測(cè)試方法如下1]體外非酶糖基化系統(tǒng)將BSA(牛血清白蛋白)(10mg/mL)、己二醛(12mg/mL)和NaN3(疊氮化鈉)(2mg/mL)溶于pH7.4、0.2mol/L的PBS(磷酸緩沖液)中。
2]體外非酶糖基化系統(tǒng)，用化合物(I)溶液干預(yù)實(shí)驗(yàn)取1mL上述PBS溶液，干預(yù)組加入1mL化合物(I)溶液，以加1 mL蒸餾水的未干預(yù)組為空白，震蕩混勻，37℃避光孵育15天，而后定容至10mL待測(cè)。
3]AGEs的測(cè)定及抑制率的計(jì)算采用Hitachi Fluorescence Spectrophotometer 650-60型熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度，測(cè)定時(shí)激發(fā)波長(zhǎng)選擇370nm，狹縫5nm，發(fā)射波長(zhǎng)選擇440nm，狹縫6nm。
化合物(I)溶液對(duì)非酶糖基化反應(yīng)的抑制作用以抑制率表示。抑制率根據(jù)下列公式計(jì)算 實(shí)施例5含化合物(I)的組合物片劑的制備將實(shí)施例2獲得的化合物(I)與一定的輔料按一定比例混合，制備成化合物(I)組合物片劑。其配方如下(質(zhì)量百分比)化合物(I)，90％；微晶纖維素，6％；膠體二氧化硅，2％；硬酯酸鎂2％。該片劑用于制備治療和防治糖尿病疾病的藥物或保健品。
以上已詳細(xì)描述了本發(fā)明的實(shí)施方案，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)很顯然可以做很多改進(jìn)和變化而不會(huì)背離本發(fā)明的基本精神。所有這些變化和改進(jìn)都在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.化合物4，5-二羥基-2-甲氧基苯甲醛，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為
2.權(quán)利要求1所述化合物4，5-二羥基-2-甲氧基苯甲醛的制備方法，其特征在于從雞腿蘑發(fā)酵液中制備，方法為步驟1將雞腿蘑發(fā)酵液3000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心20分鐘，取上清液用AB-8型大孔樹(shù)脂層析柱吸附，吸附結(jié)束后，用超純水洗脫除去蛋白質(zhì)、多糖，直至流出液測(cè)不出糖和蛋白，然后用10倍柱體積20％體積濃度的乙醇洗脫，收集洗脫液濃縮、冷凍干燥，所得組分稱為M1；步驟2將步驟1中冷凍干燥的M1組分用超純水溶解后用C18低壓層析柱分離，每次上樣量為5～8mg，用0.5∶9.5-8∶2的甲醇-水梯度洗脫，流速2mL/分鐘，紫外檢測(cè)器280nm檢測(cè)，收集到4個(gè)組分，按出峰順序取第3個(gè)組分濃縮、冷凍干燥，所得組分稱為M1-3；步驟3將步驟2中冷凍干燥的M1-3組分用超純水溶解后用C18中壓層析柱分離，每次上樣量為0.5～1mg，用0.5∶9.5-6∶4的甲醇-水梯度洗脫，流速1.0～1.6mL/分鐘，紫外檢測(cè)器280nm檢測(cè)，收集主峰物質(zhì)，濃縮、冷凍干燥，所得組分稱為M1-3-1；步驟4將步驟3中冷凍干燥的M1-3-1組分按步驟3的柱層析分離和收集條件重復(fù)一次，所收集到的物質(zhì)即為化合物4，5-二羥基-2-甲氧基苯甲醛。
3.權(quán)利要求1所述化合物4，5-二羥基-2-甲氧基苯甲醛的應(yīng)用，其特征在于4，5-二羥基-2-甲氧基苯甲醛添加或不添加賦形劑用于制備治療和防治糖尿病疾病的藥物或保健品。
全文摘要
4，5－二羥基－2－甲氧基苯甲醛及其發(fā)酵法制備和應(yīng)用，屬于生物發(fā)酵及生化分離技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及從雞腿蘑液體發(fā)酵液分離獲得一種新的化合物4，5－二羥基－2－甲氧基苯甲醛，其制備方法為將雞腿蘑發(fā)酵液離心取上清液，上清液用AB－8型大孔樹(shù)脂層析柱吸附，超純水洗脫去蛋白質(zhì)和糖，收集乙醇洗脫液，濃縮、冷凍干燥，再依次用C18低壓層析柱、C18中壓層析柱分離提純，制備得到該產(chǎn)品。4，5－二羥基－2－甲氧基苯甲醛添加或不添加賦形劑用于制備治療和防治糖尿病疾病的藥物或保健品。
文檔編號(hào)C12P7/24GK101088977SQ200710019728
公開(kāi)日2007年12月19日 申請(qǐng)日期2007年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月5日
發(fā)明者章克昌, 陸兆新, 丁重陽(yáng) 申請(qǐng)人:章克昌, 陸兆新