專(zhuān)利名稱(chēng)：一種新的海洋真菌多糖ycp單克隆抗體及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的海洋真菌多糖YCP單克隆抗體，以及分泌所述單克隆抗體的雜交瘤克隆，本發(fā)明還涉及所述單克隆抗體的制備方法，以及所述單克隆抗體的用途。
背景技術(shù)：
YCP是從海洋真菌Phoma herbarum YS4108菌絲體細(xì)胞中分離純化獲得的水溶性胞內(nèi)多糖。多糖YCP是由葡萄糖和糖醛酸構(gòu)成，不含蛋白質(zhì)和核酸，分子量為1.6×106Da～2.6×106Da，端基碳為α-構(gòu)型，旋光度[α]Dt＝+131.7～+159.4°，多糖的基本骨架由1→4糖苷鍵連接的葡萄糖構(gòu)成，每17個(gè)葡萄糖殘基有一個(gè)側(cè)鏈，側(cè)鏈為葡萄糖和糖醛酸，比例為2∶1，均通過(guò)1→6糖苷鍵與主鏈葡萄糖相連接，構(gòu)成每摩爾多糖分子中葡萄糖與糖醛酸的物質(zhì)的量之比為53∶1(參見(jiàn)“一種多糖及其制法和用途”，中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利.專(zhuān)利號(hào)ZL200310106520.2)。
體內(nèi)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該多糖對(duì)小鼠移植瘤肝癌實(shí)體型(Heps)、肉瘤(S180)以及Lewis肺癌均具有顯著的抑制作用，對(duì)荷瘤動(dòng)物的細(xì)胞免疫和體液免疫功能均有明顯調(diào)節(jié)作用，對(duì)大劑量化療和放療引起的小鼠毒性反應(yīng)具有明顯的減毒作用。體外研究結(jié)果表明該多糖能顯著促進(jìn)鼠脾淋巴細(xì)胞IL-2mRNA、IFN-γmRNA的表達(dá)和提高小IL-2和IFN-γ的合成，并能顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞(MФ)培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-1的活性以及NO的含量，YCP能直接誘導(dǎo)、活化小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，顯著增強(qiáng)MФ吞噬功能。以上這些作用均優(yōu)于或相當(dāng)于陽(yáng)性對(duì)照藥物香茹多糖。急性毒性實(shí)驗(yàn)表明以最大濃度最大體積給藥，小鼠一次ivYCP的最大給藥量為500mg/kg(LD50＞500mg/kg)，該多糖未顯示毒性。一般藥理學(xué)研究表明YCP對(duì)麻醉犬心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)無(wú)明顯影響，對(duì)小鼠神經(jīng)系統(tǒng)也無(wú)明顯興奮或抑制作用。因此，多糖YCP具有抗腫瘤藥用前景。但在將YCP開(kāi)發(fā)成藥過(guò)程中，我們需要一種特異而靈敏的方法對(duì)其進(jìn)行定量分析法。首先，目前，常用的多糖藥代動(dòng)力學(xué)研究方法，如生物檢定法、同位素示蹤法和熒光標(biāo)記法等由于靈敏性低或改變多糖結(jié)構(gòu)等因素(Rice P.J.，Lockhart B.E.，Barker L A.，et al.Pharmacokinetics of fungal(1-3)-beta-D-glucans following intravenousadministration in rats.Int Immunopharmacol.4(2004)1209-1215.)，均不能滿足其需要。其次，在優(yōu)化發(fā)酵條件和提取純化工藝以及菌株改造時(shí)，需要對(duì)多糖YCP的產(chǎn)量和得率進(jìn)行定量分析；而目前采用的糖定量法，如蒽酮比色法和硫酸苯酚法等均為非特異性、低靈敏度方法(Seong K.E.，Young SK.，Chong KL.，et al.Antiherpetic activities of various protein boundpolysaccharides isolated from Ganoderma lucidum.J Ethnopharma.68(1999)175-181)。因此，我們擬通過(guò)制備多糖YCP特異性單克隆抗體，建立特異而靈敏的定量免疫分析法用于YCP藥代動(dòng)力學(xué)研究、發(fā)酵條件和提取工藝優(yōu)化以及菌株改造。
然而，作為T(mén)細(xì)胞非依賴(lài)性抗原，多糖無(wú)免疫記憶效應(yīng)，不能直接誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)特異性抗體，但可通過(guò)化學(xué)法將多糖與蛋白質(zhì)等大分子載體偶聯(lián)制備成完全抗原，克服T細(xì)胞非依賴(lài)性，以此增強(qiáng)多糖的免疫原性，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平抗多糖抗體。
本發(fā)明人采用一種新型、無(wú)毒的氰基化活性劑CDAP活化多糖YCP，制備人工完全抗原YCP-BSA；采用多糖YCP直接包被新型高結(jié)合力酶標(biāo)板和明膠作為封閉劑以及羊抗鼠IgG+IgM酶標(biāo)抗體作為聯(lián)合檢測(cè)抗體，極大地簡(jiǎn)化了篩選步聚，排除了假陽(yáng)性，提高了篩選效率，并成功制備出YCP單克隆抗體。
發(fā)明概述本發(fā)明一方面涉及海洋真菌多糖YCP單克隆抗體，其由保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)的保藏號(hào)為CGMCC1661和CGMCC1662的雜交瘤細(xì)胞分泌。
本發(fā)明另一方面涉及保藏于CGMCC的保藏號(hào)為CGMCC1661和CGMCC1662的雜交瘤細(xì)胞。
本發(fā)明再一方面涉及一種制備所述海洋真菌多糖YCP單克隆抗體的方法。
本發(fā)明又一方面涉及所述單克隆抗體用于YCP檢測(cè)、測(cè)定。
發(fā)明詳述已知YCP是一種多糖類(lèi)化合物，其分子量約2.4×106Da。作為胸腺非依賴(lài)性抗原，YCP不能誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價(jià)和高親和力抗體。
為了有效制備YCP抗體，本發(fā)明所述方法采用YCP與BSA的偶聯(lián)結(jié)合物，并應(yīng)用弗氏佐劑加強(qiáng)免疫，使得BALB/c小鼠血清抗體可達(dá)1∶10000以上。同時(shí)，本發(fā)明所述方法還成功的建立了多糖單克隆抗體篩選方法，簡(jiǎn)化了篩選步聚，提高了篩選效率；同時(shí)，克服了假陽(yáng)性和漏篩現(xiàn)象。
具體的，本發(fā)明采用了一步法進(jìn)行篩選和抗小鼠IgG+IgM標(biāo)記抗體聯(lián)合檢測(cè)。
以YCP作為篩選抗原，直接包被高結(jié)合力聚苯乙烯酶標(biāo)板，明膠作為封閉劑；以羊抗鼠IgG+IgM的酶標(biāo)抗體作為檢測(cè)抗體，建立間接ELISA法，進(jìn)行多糖單克隆抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞篩選。
最終篩選出兩株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株，且傳代穩(wěn)定，分別命名為N3F和R10F，由其分泌的單克隆抗體分別稱(chēng)為N3F和R10F。其中，N3F屬于IgM，R10F屬于IgG1；兩株單克隆抗體的相對(duì)親和力介于5×108·M-1-9×107·M-1，親和力一般。
應(yīng)用本方法建立了穩(wěn)定分泌高效價(jià)抗YCP的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并建立了制備和鑒定YCP單克隆抗體的方法，為建立多糖免疫分析法，進(jìn)一步研究YCP藥代動(dòng)力學(xué)特征、優(yōu)化發(fā)酵條件和提取工藝以及篩選高產(chǎn)菌株提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
本發(fā)明又一方面涉及所述單克隆抗體用于YCP的檢測(cè)和測(cè)定的用途。具體地，本發(fā)明所述方法制備的單克隆抗體建立的免疫分析法能夠用于藥代動(dòng)力學(xué)研究、發(fā)酵條件和提取工藝優(yōu)化過(guò)程中測(cè)定分析多糖YCP。


圖1Sephacryl S400柱(1.0cm×100cm)層析洗脫曲線。其中，■表示糖含量，▲表示蛋白質(zhì)含量。
圖2PAGE(左)和SDS-PAGE(右)。其中，泳道1為腹水型單克隆抗體，泳道2為辛酸-硫酸銨沉淀單克隆抗體，泳道3為Sephadex G200柱純化單克隆抗體。
圖3單抗N3F酶結(jié)合物Sephadex G200柱(2.6cm×100cm)層析洗脫曲線。其中，偶聯(lián)反應(yīng)混合物經(jīng)Sephadex G200(2.6cm×100cm)柱層析分離純化。
圖4夾心ELISA測(cè)定多糖YCP含量與相應(yīng)吸光值(492nm)關(guān)系曲線。
圖5Beagle犬經(jīng)靜脈按3mg/kg給藥后血漿中YCP的濃度-時(shí)間曲線。
圖6提取時(shí)間(h)多糖YCP提取效率的影響。
具體實(shí)施例方式
材料與方法1.1動(dòng)物與細(xì)胞株BALB/c小鼠，雌性，七周齡，20±2g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供；小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0，由揚(yáng)州大學(xué)傳染病學(xué)與預(yù)防獸醫(yī)學(xué)農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。
1.2主要試劑YCP(本室分離純化)、50％PEG溶液(Sigma)、HAT和HT培養(yǎng)液(Sigma)、MR1640(Gbico)、降植烷(pristane；Sigma)。
實(shí)施例1.免疫原的制備YCP與BSA偶聯(lián)將CDAP乙睛溶液(100mg/ml)加入YCP水溶液(10mg/ml)中，加入BSA水溶液(10mg/ml)，室溫反應(yīng)后，加乙醇胺終止反應(yīng)。樣品經(jīng)Sephacryl S400柱(1cm×100cm)層析，分部收集。分別采用硫酸—苯酚法和Lowry法測(cè)定第一峰點(diǎn)管的YCP和BSA含量，以每摩爾YCP分子上連接BSA的摩爾數(shù)表示偶聯(lián)物取代度，結(jié)果獲得取代度約為6的偶聯(lián)物，Sephacryl S400分子篩純化結(jié)果見(jiàn)圖1。
實(shí)施例2.動(dòng)物免疫將如實(shí)施例1所制備的免疫原即YCP-BSA偶聯(lián)物溶于生理鹽水，與弗氏完全佐劑等體積混合，經(jīng)充分乳化后，接種于BALB/c小鼠腹腔，50μg結(jié)合多糖/200μl/只；于基礎(chǔ)免疫后，間隔兩周采用相同的抗原劑量與等體積弗氏不完全佐劑混合，進(jìn)行加強(qiáng)免疫；于第二次加強(qiáng)免疫后一周，以間接ELISA法測(cè)定免疫小鼠抗血清效價(jià)。以正常鼠血清為陰性對(duì)照，以(測(cè)定孔A值-空白值)/(陰性對(duì)照孔A值-空白值)≥2.1為判定標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行測(cè)定。小鼠抗血清終點(diǎn)效價(jià)均為1∶10000以上。
選擇血清YCP特異性抗體效價(jià)最高的小鼠用于細(xì)胞融合，并于融合前3天，腹腔接種100μg結(jié)合多糖進(jìn)行沖擊免疫。
實(shí)施例3.細(xì)胞融合細(xì)胞融合采用聚乙二醇法無(wú)菌操作取如實(shí)施例2所述免疫的小鼠脾臟，制成細(xì)胞懸液，離心，細(xì)胞計(jì)數(shù)；將1×108脾細(xì)胞與2×107SP2/0細(xì)胞混合，1000rpm離心10min，棄上清液，將離心管置于37℃水浴中；取1ml預(yù)熱至40℃的50％PEG緩慢滴加到細(xì)胞沉淀上，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞；1000rpm離心10min，棄上清液，加HAT培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，分裝于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，將培養(yǎng)板置37℃、5％的CO2濕潤(rùn)孵箱中培養(yǎng)，5天后用新鮮HAT換出培養(yǎng)板孔中1/2培養(yǎng)基，10天后用HT培養(yǎng)基換出HAT。
實(shí)施例4.融合細(xì)胞的篩選及克隆化培養(yǎng)采用有限稀釋法克隆化雜交瘤細(xì)胞以YCP作為篩選包被抗原，羊抗鼠IgM-HRP+IgG-HRP作為檢測(cè)抗體。陽(yáng)性孔雜交瘤細(xì)胞經(jīng)亞克隆—篩選—亞克隆—篩選—亞克隆—擴(kuò)大培養(yǎng)。
具體的，用小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合后，接種于96孔細(xì)胞板HAT選擇性培養(yǎng)基上，初篩陽(yáng)性率為2.7％(13/480)，經(jīng)三次亞克隆，建立了穩(wěn)定分泌的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為N3F和R10F，其分泌的單克隆抗體分別稱(chēng)為N3F和R10F。本發(fā)明人于2006年3月23日將所述雜交瘤細(xì)胞株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CCGMCC，北京，中關(guān)村)，其保藏號(hào)分別為CGMCC1661和CGMCC1662。
實(shí)施例5.細(xì)胞株及抗體的鑒定特異性和交叉反應(yīng)性采用競(jìng)爭(zhēng)性抑制ELISA分析單抗跟YCP反應(yīng)的特異性和其它相關(guān)寡糖或多糖抗原的交叉反應(yīng)性。將系列倍比稀釋的相關(guān)寡糖、多糖及YCP-E120(YCP經(jīng)α-淀粉酶水解側(cè)鏈Glca1→6GlcU相鄰的主鏈Glca1→4Glc糖苷鍵所得片段)與一定稀釋度的YCP單抗混合，4℃過(guò)夜；然后加入到Y(jié)CP被包的酶標(biāo)板孔中，按ELISA法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算50％抑制常數(shù)(I50)，結(jié)果見(jiàn)表1。表明單抗N3F和R10F對(duì)YCP特異性強(qiáng)，其識(shí)別表位涉及側(cè)鏈Glca1→6GlcU和主鏈Glca1→4Glc結(jié)構(gòu)。
表1 YCP單克隆抗體跟相關(guān)寡糖和多糖抗原(μg/ml)反應(yīng)的抑制常數(shù)(I50)

抗體類(lèi)型及亞類(lèi)分類(lèi)采用抗原介導(dǎo)的間接ELISA法鑒定抗YCP的單抗免疫球蛋白的類(lèi)與亞類(lèi)。取雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，采用鼠獨(dú)特型單克隆抗體測(cè)定試劑盒按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果N3F屬于IgM，R10F屬于IgG1，說(shuō)明多糖YCP與載體蛋白BSA共價(jià)偶聯(lián)后，發(fā)生抗體類(lèi)型轉(zhuǎn)換。
相對(duì)親和力測(cè)定采用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法測(cè)定單抗親和常數(shù)。將細(xì)胞株接種至預(yù)先注射降植烷的BALB/c小鼠腹腔，制備腹水單抗。采用二氧化硅預(yù)處理腹水單抗，得到除去脂質(zhì)的澄清腹水；然后經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀，獲得粗提單抗；最后通過(guò)Sephadex G200柱層析，獲得純化的單抗。測(cè)定純化后抗體蛋白濃度，取一定濃度的純化被檢單抗，按競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法測(cè)定。結(jié)果N3F的親和常數(shù)為5×108.M-1，R10F的親和常數(shù)為9×107·M-1，親和力一般。
傳代穩(wěn)定性測(cè)定體外連續(xù)培養(yǎng)1個(gè)月，約15代，檢測(cè)上清中抗體是否能夠保持同樣水平。
細(xì)胞株培養(yǎng)10代后，間接ELISA法測(cè)定培養(yǎng)上清對(duì)YCP抗體滴度約為1∶10000，與第4代細(xì)胞相比無(wú)明顯差異，說(shuō)明該雜交瘤細(xì)胞分泌YCP特異性單克隆的性能穩(wěn)定。
實(shí)施例6YCP單克隆抗體的制備取10周齡雌性BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml降植烷；一周后接種如實(shí)施例4中所述處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞5×105個(gè)/只；7-10天后采集腹水，5000rpm離心15min，收集上清液；腹水經(jīng)二氧化硅預(yù)處理后，以辛酸-硫酸銨沉淀法沉淀免疫球蛋白，最后通過(guò)Sephadex G200柱層析，獲得純化單抗，分別采用PAGE和SDS-PAGE鑒定單抗純度。結(jié)果見(jiàn)附圖1，說(shuō)明該純化方法對(duì)腹水中單抗的純化效果很好。
實(shí)施例7酶標(biāo)抗體的制備參照劉秀梵主編，單克隆抗體在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用，第一版，安徽科學(xué)技術(shù)出版社，1994，61-62中所述方法，對(duì)腹水單抗R10F進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記；將標(biāo)記物經(jīng)SephadexG200凝膠層析純化，分部收集，合并第一峰，Sephadex G200凝膠層析結(jié)果見(jiàn)圖2。
表2單抗N3F的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物(N3F-HRP)的質(zhì)量鑒定

實(shí)施例8建立夾心ELISA法經(jīng)棋盤(pán)滴淀法，確定以2.0μg/ml R10F的碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)包被酶標(biāo)板，酶標(biāo)抗體N3F-HRP工作濃度為1∶2000。在此工作條件下，檢測(cè)水溶液中多糖YCP的含量線性范圍為1ng/ml～1,000ng/ml，其最小檢測(cè)限為0.1ng/ml，批內(nèi)變異系數(shù)≤6％，批間變異系數(shù)≤8％，結(jié)果見(jiàn)圖3。
實(shí)施例9YCP藥代動(dòng)力學(xué)研究取SD大鼠24只，隨機(jī)分成3組，每組8只，雌雄各半，給藥前12h禁食，自由飲水；將受試藥物多糖YCP溶于適量滅菌0.9％生理鹽水中，按6mg·kg-1經(jīng)尾靜脈推注給藥，分別于給藥后15、90和720min放血處死，摘取腦、心、肝、脾、肺、腎、胸腺、胃、小腸、肌肉、生殖器等臟器，并分別用清水洗凈后，吸水紙吸干，稱(chēng)重；加3倍體積0.01M PBS(pH 7.2)，利用高速分散器制成組織均漿；經(jīng)Sevag法去蛋白，10,000rpm離心10min，取上清液，采用實(shí)施例8所建立的夾心ELISA法進(jìn)行測(cè)定，得到多糖YCP的組織分布情況。結(jié)果見(jiàn)圖5。
實(shí)施例10監(jiān)測(cè)分離提取液中多糖YCP取100g菌絲體，加入500ml蒸餾水進(jìn)行勻漿；將勻漿液置80℃水浴中浸提，分別于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12h取樣，8000rpm離心10min，收集上清液。采用實(shí)施例8所建立的夾心ELISA法監(jiān)測(cè)留樣樣品中多糖YCP的含量，結(jié)果見(jiàn)圖6，表明利用多糖YCP的特異性單克隆抗體所建立的夾心ELISA法可用于監(jiān)測(cè)多糖YCP的提取。
權(quán)利要求
1.一種新的海洋真菌多糖YCP單克隆抗體，識(shí)別表位涉及多糖YCP的側(cè)鏈Glcα1→6GlcU和主鏈Glcα1→4Glc二糖結(jié)構(gòu)單元，其由保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCC1661和CGMCC1662的雜交瘤細(xì)胞分泌。
2.一種制備權(quán)利要求1所述海洋真菌多糖單克隆抗體的方法，其特征是YCP與小牛血清白蛋白BSA偶聯(lián)，免疫BALB/c小鼠，取該小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，以選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，采用有限稀釋法克隆化，將抗體陽(yáng)性單克隆雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，注入同系小鼠腹腔誘生腹水單抗或體外培養(yǎng)，分離獲得多糖YCP的單克隆抗體。
3.如權(quán)利2要求所述的制備方法，其特征是所述的多糖YCP與小牛血清白蛋白BSA偶聯(lián)是將YCP溶于蒸餾水中，加入CDAP室溫活化，然后加入BSA，4℃反應(yīng)過(guò)夜，Sephacryl S-400柱層析純化所得。
4.如權(quán)利2要求所述的制備方法，其特征是所述的免疫小鼠是將YCP與BSA偶聯(lián)物溶于生理鹽水中，與弗氏佐劑等體積混合，接種于小鼠腹腔。
5.一種能產(chǎn)生權(quán)利要求1所述抗體的雜交瘤細(xì)胞系。一種保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCC1661的雜交瘤細(xì)胞。
6.一種能產(chǎn)生權(quán)利要求1所述抗體的雜交瘤細(xì)胞系。一種保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCC1662的雜交瘤細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1所述YCP單克隆抗體用于YCP藥代動(dòng)力學(xué)研究。
8.權(quán)利要求1所述YCP單克隆抗體用于YCP的生產(chǎn)工藝研究。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的海洋真菌多糖YCP單克隆抗體，以及分泌所述單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，本發(fā)明還涉及所述單克隆抗體的制備方法，以及所述單克隆抗體的用途。
文檔編號(hào)C12N5/18GK101024673SQ20071001921
公開(kāi)日2007年8月29日 申請(qǐng)日期2007年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月4日
發(fā)明者高向東, 趙虎, 張華 , 龐秀炳, 王峰 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)