專利名稱：野生葡萄泛素結(jié)合酶基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及野生葡萄泛素結(jié)合酶基因全長(zhǎng)序列，屬于生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
采用改進(jìn)SDS/酚法，提取病原菌誘導(dǎo)的野生葡萄葉片總RNA; 按照Clontech公司SMARTTMcDNA library Construction Kit方法構(gòu)建文 庫(kù)；按照Epicentre公司MaxplaxTMPackaging Extract完成cDNA文庫(kù) 的包裝；用Biosystems 3700 DNA analyzer進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為5，-CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT-3，； 所獲得的序列用 DNASTAR軟件做多序列對(duì)比,檢查有無(wú)重復(fù)；利用NCBI的VecScreen(BLASTN2.2.5)程序識(shí)別并去除測(cè)序結(jié)果中的載體序列,所檢索的數(shù) 據(jù)庫(kù)為 UniVec， 網(wǎng)址如下 htt : 〃www.ncbi.nlm.nih.gom/vecscreen/vecscreen.html;禾'J用NCBI的BLAST(BLASTN2.2.5)程序?qū)θコ溯d體序列的測(cè)序結(jié)果作同源性分析， 所檢索的數(shù)據(jù)庫(kù)，包括非冗余(nr)數(shù)據(jù)庫(kù)(覆蓋 GenBank+EMBL+DDBJ+PDB )禾卩EST 數(shù)據(jù)庫(kù)(覆蓋 GenBank+EMBL+DDBJ)， 網(wǎng)址如下 htt : 〃www.ncbi.nlm.nih.gom/BLAST/;利用簡(jiǎn)單模塊構(gòu)架搜索工具SMART 軟件對(duì)泛素結(jié)合酶基因所編碼的蛋白一級(jí)序列進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析， 網(wǎng)址為http:〃smart.embl-heidelberg.de/;利用DNASTAR軟件對(duì)泛素結(jié) 合酶基因所編碼的蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。由于葡萄組織中多酚、多糖等化合物含量較高，用目前已有的RNA提取試劑盒提取 的總RNA產(chǎn)率低、質(zhì)量不高,不能用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于，提供野生葡萄泛素結(jié)合酶基因序列。 本發(fā)明首次采用構(gòu)建cDNA文庫(kù)技術(shù)進(jìn)行野生葡萄抗白粉病基因的克 隆，獲得了蛋白質(zhì)泛素化途徑關(guān)鍵基因-泛素結(jié)合酶基因，該基因所編 碼的氨基酸序列在1-30位氨基酸殘基之間有HOTLOOPS結(jié)構(gòu)序列， 在32和174位氨基酸殘基之間存在一個(gè)所有泛素結(jié)合蛋白所共有的 保守催化區(qū)域UBCc結(jié)構(gòu)域;該蛋白氨基酸序列全長(zhǎng)為183個(gè)氨基酸， 分子量20.8KD，等電點(diǎn)8.23，該基因所編碼的蛋白質(zhì)屬于泛素結(jié)合蛋 白酶E2 。cDNA片段全長(zhǎng)核苷酸序列為 atgattaagctattt3肌gtg肌gg犯犯gc3gaggga犯ttgcgg3犯atgcteatgg肌肌gc3cctg tcaag肌gc3gagtgcggg3g犯ttecg3cttcate犯gatatc3gtga3ctg3atct3ccca3肌cttgtt gcatatcatttcccaatggcaaggatgacctgatgagctttgaggttaccattcggcctgatgaaggatgct atttaggtggtacattcgtgttctctttccaagtttctcccatctatcctcacgaggcaccaaaagtcaagtgc 肌gacaaaggtcteccatoctagicattgacttgg犯gg3犯cgtctgcctc3acatec1^ag3g3gg3ct ggaaacctgttcttaatataaacactataatttatggattgtttcatcttttcacgcaacccaattacgaagatcc gctcaatcatgatgctgctgctgtgttgagggataacccaaagatgtttgaatcgaatgtgagaagggcga tggctggtgggtatgtggggcagaccttcttcccacggtgcatgtag本發(fā)明的獲取方法是采用改進(jìn)SDS/酚法所提取經(jīng)病原菌誘導(dǎo)的野生葡萄葉片總的RNA質(zhì)量和純度高，總RNA沒有降解；質(zhì)量符合 構(gòu)建cDNA文庫(kù)實(shí)驗(yàn)要求；采用長(zhǎng)距離PCR方法成功構(gòu)建cDNA文 庫(kù)；對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行大量測(cè)序，獲得的序列應(yīng)用目前國(guó)際上通用的序列 分析方法。根據(jù)已有GenBank中的核苷酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)獲得的cDNA序列進(jìn) 行對(duì)比分析表明本發(fā)明獲得的野生葡萄cDNA序列為具有完整閱讀 框的泛素結(jié)合酶基因序列，而且是未公開的葡萄新基因序列；獲得的 野生葡萄泛素結(jié)合酶基因序列是完整的；上述基因序列的獲得為進(jìn)一 步研究野生葡萄泛素結(jié)合酶基因表達(dá)機(jī)理提供了分子依據(jù)。


附圖1是野生葡萄泛素結(jié)合酶核酸序列及其編碼蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié) 構(gòu)序列圖片。附圖2是改良SDS酚法提取野生葡萄葉片總RNA圖片。附圖3是長(zhǎng)距離PCR合成雙鏈cDNA 1.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖片。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明所獲得的野生葡萄泛素結(jié)合酶基因序列其操作步驟如下 在接種后ld、 2d、 3d、 4d、 5d、 6d、 7d分別采樣，提取野生葡萄"白 河-35-l"葉片總RNA;進(jìn)行總RNA的純化和檢測(cè)(見圖2);按照 SMART cDNA library Construction Kit方法，進(jìn)行長(zhǎng)距離PCR-cDNA 文庫(kù)構(gòu)建及檢測(cè)，其中主要步驟包括cDNA第一鏈的合成；cDNA 第二鏈合成(見圖3);蛋白酶K消化，去除多余的DNA聚合酶；S刀/酶消化，獲得具有特異酶切位點(diǎn)的雙鏈DNA分子；經(jīng)syn酶切的cDNA片段與XTriplEx2載體連接；包裝反應(yīng)；cDNA文庫(kù)鑒定；cDNA 文庫(kù)的擴(kuò)增；擴(kuò)增cDNA文庫(kù)滴度、庫(kù)容量及重組率的鑒定；用天為 時(shí)代質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒；重組質(zhì)粒S,7酶切鑒定；用 Biosystems 3700 DNA analyzer進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為5，-CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT-3，；利用生物學(xué)軟件對(duì)泛素結(jié)合酶基因進(jìn)行序列分析(見圖1)，證明本發(fā)明所獲得的基因是蛋白質(zhì) 泛素結(jié)合酶基因。以下是獲取本發(fā)明的具體實(shí)施步驟a.總RNA的提取在接種后ld、 2d、 3d、 4d、 5d、 6d、 7d分 別采樣提取野生葡萄"白河-35-l"葉片總RNA，按照以下操作步驟 進(jìn)行取供試葡萄葉片約0.5g置于用液氮預(yù)冷的研缽中，于液氮中將 葡萄材料充分研成粉末狀；迅速將粉末狀葡萄材料轉(zhuǎn)入8(TC預(yù)熱的含 20ml提取緩沖液(100mmol丄-l LiCl，100mmol丄-lTris,50 mmol丄-lEDTA,lQ/。SDS,用前加入PVP和卩-巰基乙醇，至終濃度分別為16%和 1.5%);加入等體積冰冷氯仿異戊醇(24: 1)，混勻，冰浴10min， 每隔3 4min小心翻轉(zhuǎn)離心管一次；4°C， 12000rpm/min離心15min, 將上清轉(zhuǎn)入一冰浴的50ml離心管中，加入1/3體積5 mol丄-1KAC(pH4.8)，充分混勻，冰浴10min; 4°C， 12000rpm/min離心15min,將上清轉(zhuǎn)入一冰浴的離心管中，加入等體積冰冷氯仿異戊醇(24:1)，混勻，冰浴10min，每隔3 4min小心翻轉(zhuǎn)離心管一次；4°C， 12000rpm/min離心15min，將上清轉(zhuǎn)入一冰浴的離心管中，加入-20。C 預(yù)冷的1/3體積8 mol丄-l (8mol丄-l LiC1，0.5 mol丄-lEDTA) LiCl，混 勻后-20。C放置2h或-80。C放置30min; 4°C ， 12000rpm/min離心15min， 棄上清液，沉淀用冰冷的75%乙醇和無(wú)水乙醇各洗滌一次，室溫下干 燥后溶解于40^ilDEPCH2o中，-20匯暫存放，總RNA的純化和檢測(cè) 每IOO叫I反應(yīng)體系依次加入總RNA 100嗎、RQ Dnase I IOU、 10xBuffer lO(il、 RnasinlOOU、 DEPC-H2o補(bǔ)齊體積100|al; 37。C水浴15min; 加等體積水飽和苯酚氯仿異戊醇(25: 24: 1)，混勻后冰浴15 min; 4°C， 12000rpm/min離心15min，將上清轉(zhuǎn)入一新離心管中，加入等體積氯仿異戊醇(24: 1)，混勻，冰浴10min; 4°C， 12000rpm/min 離心15min，將上清轉(zhuǎn)入一新離心管中；加入冰冷的1/10體積3mol丄-1NaAC (pH5.2)，和2.5倍無(wú)水乙醇，混勻后-20。C放置2h; 4°C， 12000rpm/min離心15min，棄上清液；用冰冷的75%乙醇清洗沉淀兩 次和無(wú)水乙醇洗滌沉淀一次，室溫下干燥；沉淀溶于50^1 DEPC-H20 中，-40"存放，總RNA檢測(cè)取RNAlpl進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電 泳，取10(^1稀釋至2800(il，測(cè)波長(zhǎng)在260nm和280nm處的吸光值， 即A260和A280。b . cDNA文庫(kù)構(gòu)建及檢測(cè)按照SMARTTMcDNA library Construction Kit方法完成；cDNA文庫(kù)的包裝按照MaxplaxTMPackaging Extract kit完成。c.未擴(kuò)增文庫(kù)滴度的鑒定制備90mmLB/MgSO/Tet固體平板6 個(gè)，37"C預(yù)熱和干燥lhr;取40^1未擴(kuò)增文庫(kù)加入360pllxLambda dilution buffer (1: IO稀釋)；分別取上述稀釋后文庫(kù)ljil 、 10^1的包 裝混合物同20(^1過(guò)夜培養(yǎng)的XL,-Blue菌液混合，37"C水浴，使包 裝后的噬菌體吸附細(xì)菌20 min;反應(yīng)結(jié)束后，加3ml融化的LB/MgS04 頂層培養(yǎng)基混勻后迅速倒入LB平板上鋪平，室溫冷卻10 min讓底層 LB平板堅(jiān)固；倒置平板，37。C過(guò)夜培養(yǎng)15hr ，計(jì)算噬菌斑數(shù)目；稀 釋后文庫(kù)lpl平均噬菌斑數(shù)目為29個(gè)，lOpl平均噬菌斑數(shù)目320個(gè)； 未擴(kuò)增文庫(kù)的滴度為3.0xl05pfu/ml，未擴(kuò)增文庫(kù)重組率的測(cè)定:制 備100mm LB/MgS04/Tet固體平板2個(gè)，37"預(yù)熱和干燥lhr;取40^1 未擴(kuò)增文庫(kù)加入360^1按1: 10稀釋的lxLambda dilution buffer;取 上述稀釋后文庫(kù)lOOfil的包裝混合物加入200^tl過(guò)夜培養(yǎng)的XL廣Blue 菌液混合，37t:水浴，使包裝后的噬菌體吸附細(xì)20min;反應(yīng)結(jié)束后分別加入50|il 0.1M的IPTG， 0.1M的X-Gal混勻后加3ml融化 的LB/MgS04頂層培養(yǎng)基混勻后迅速倒入LB平板上鋪平，室溫冷卻 10min讓底層LB平板堅(jiān)固；倒置平板，37。C過(guò)夜培養(yǎng)15 hr，計(jì)算藍(lán)、 白斑噬菌斑數(shù)目；兩個(gè)LB平板的藍(lán)、白斑分別為4個(gè)藍(lán)斑、720個(gè) 白斑；31個(gè)藍(lán)斑、379個(gè)白斑，計(jì)算未擴(kuò)增文庫(kù)的重組率為96.9%。d. cDNA文庫(kù)的擴(kuò)增制備15個(gè)150 mm LB/MgSO/Tet固體平 板；挑 一 個(gè)分離良好的XL, -Blue單菌落接種到15ml LB/MgS04/Maltose液體培養(yǎng)基上，140rpm， 37。C培養(yǎng)過(guò)夜直至 OD600=2.0，在4。C， 5000rpm離心5min，用7.5mll0mM的MgS04 重懸沉淀菌液；取未擴(kuò)增文庫(kù)38^1的包裝混合物加入500^1過(guò)夜培養(yǎng) 的XL, -Blue菌液混合，37。C水浴，使包裝后的噬菌體吸附細(xì)菌20 min; 反應(yīng)結(jié)束后，加5ml融化的LB/MgS04頂層培養(yǎng)基混勻后迅速倒入 LB平板上鋪平，室溫冷卻10min讓底層LB平板堅(jiān)固；倒置平板， 37。C過(guò)夜培養(yǎng)15 hr;每一平板加12ml lxLambda dilution buffer,在4°C 過(guò)夜培養(yǎng)；室溫下50rpm振蕩培養(yǎng)lhr;收集噬菌體裂解液于500ml 燒杯中，加入10ml氯仿溶液，旋渦振蕩2min， 7000 rpm，離心5 rpm; 收集上清液，獲得擴(kuò)增的cDNA文庫(kù)；把擴(kuò)增cDNA文庫(kù)分裝成每份 lml，加入DMSO終濃度為7%，放-7(TC長(zhǎng)期保存。e. 野生葡萄泛素結(jié)合酶基因克隆及序列分析在對(duì)葡萄白粉病菌 誘導(dǎo)的cDNA文庫(kù)進(jìn)行隨機(jī)測(cè)序的過(guò)程中，獲得一個(gè)638bp長(zhǎng)的 cDNA克隆，該cDNA克隆含有80bp的5'側(cè)翼序列、 一個(gè)552bp完 整的開放閱讀框架和6bp長(zhǎng)的3'非翻譯區(qū)，5，側(cè)翼序列在-3為處堿基 是腺嘌呤A，利用生物學(xué)軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，野生葡萄泛素結(jié)合酶 基因所編碼的氨基酸殘基在1-30位之間有HOTLOOPS結(jié)構(gòu)序列，在32和174位氨基酸殘基之間存在一個(gè)泛素結(jié)合蛋白所共有的保守催化 區(qū)域UBCc結(jié)構(gòu)域；該蛋白氨基酸序列全長(zhǎng)為183個(gè)氨基酸，分子量 20.8KD，等電點(diǎn)8.23，以上分析表明，該克隆編碼的蛋白屬于泛素結(jié) 合蛋白酶E2類(見圖1)。
權(quán)利要求
1.野生葡萄泛素結(jié)合酶基因序列，其特征是首次采用構(gòu)建cDNA文庫(kù)技術(shù)進(jìn)行野生葡萄抗白粉病基因的克隆，獲得了蛋白質(zhì)泛素化途徑關(guān)鍵基因-泛素結(jié)合酶基因，該基因所編碼的氨基酸序列在1-30位氨基酸殘基之間有HOTLOOPS結(jié)構(gòu)序列，在32和174位氨基酸殘基之間存在一個(gè)所有泛素結(jié)合蛋白所共有的保守催化區(qū)域UBCc結(jié)構(gòu)域；該蛋白氨基酸序列全長(zhǎng)為183個(gè)氨基酸，分子量20.8KD，等電點(diǎn)8.23，該基因所編碼的蛋白質(zhì)屬于泛素結(jié)合蛋白酶E2。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的野生葡萄泛素結(jié)合酶基因序列， 其特征是cDNA片段全長(zhǎng)核苷酸序列為 atgattaagctatttaaagtgaaggaaaagcagagggaaattgcggaaaatgctaatggaaaagcacct gtcaagaagcagagtgcgggagaattacgacttcataaagatatcagtgaactgaatctacccaaaactt gttgcatatcatttcccaatggcaaggatgacctgatgagctttgaggttaccattcggcctgatgaaggat gctatttaggtggtacattcgtgttctctttccaagtttctcccatctatcctcacgaggcaccaaaagtcaag tgcaagacaaaggtctaccatcctaacattgacttggaaggaaacgtctgcctcaacatcctaagagagg actggaaacctgttcttaatataaacactataatttatggattgtttcatcttttcacgcaacccaattacgaag 3tccgctcaatc3tgatgctgctgctgtgttg3gggat犯ccc3犯gatgtttg3atcg3atgtg嗎犯gg gcgatggctggtgggtatgtggggcagaccttcttcccacggtgcatgtag。
全文摘要
本發(fā)明公開了野生葡萄泛素結(jié)合酶基因序列，它是首次采用構(gòu)建cDNA文庫(kù)技術(shù)進(jìn)行野生葡萄抗白粉病基因的克隆，獲得了蛋白質(zhì)泛素化途徑關(guān)鍵基因-泛素結(jié)合酶基因，該基因所編碼的氨基酸序列在1-30位氨基酸殘基之間有HOTLOOPS結(jié)構(gòu)序列，在32和174位氨基酸殘基之間存在一個(gè)所有泛素結(jié)合蛋白所共有的保守催化區(qū)域UBCc結(jié)構(gòu)域；該蛋白氨基酸序列全長(zhǎng)為183個(gè)氨基酸，分子量20.8KD，等電點(diǎn)8.23，該基因所編碼的蛋白質(zhì)屬于泛素結(jié)合蛋白酶E₂。該序列的構(gòu)建為進(jìn)一步研究野生葡萄泛素結(jié)合酶基因表達(dá)機(jī)理提供了分子依據(jù)。
文檔編號(hào)C12N15/52GK101220365SQ20071001900
公開日2008年7月16日 申請(qǐng)日期2007年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月6日
發(fā)明者炎 徐, 王躍進(jìn) 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)