專利名稱：：通過輕度的低溫促進基因表達的序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及在輕度的低溫下促進基因轉(zhuǎn)錄的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(寡核苷酸)、含有該輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的增強子。本發(fā)明還涉及利用該輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(蛋白質(zhì))的測定方法、純化方法。
背景技術(shù)：
：單克隆抗體、生長因子、凝血因子等很多藥物或檢測試劑都是通過生物技術(shù)生產(chǎn)的。通常，在1015。C的低溫下，重組蛋白的正確折疊得到促進，通過其蛋白分解酶進行的分解也受到抑制(Baneyx，F(xiàn).，InvivofoldingofrecombinantproteinsinEscherichiacoli(大腸桿菌中的重組蛋白的折疊)，InManualofindustrialmicrobiologyandbiotechnology,第2版，(Demain,A.L.Davis,J.E.，Altas，R.M.，等人，Eds.)ASM印刷，WashingtonnD.C.，551~565頁，1999)，因此，在細菌中生產(chǎn)重組蛋白時，不是采用37°C，而是在20。C以下的低溫下進行培養(yǎng)。此時，低溫下，通常蛋白質(zhì)合成降低，因此目標蛋白的收量可能變差。利用冷激蛋白CspA的啟動子與5'非翻譯區(qū)(UTR)作為目標蛋白的表達啟動子，貝'J可以解決該問題(Baneyx,F.和Mujacic，M.，Cold-induciblepromotersforheterologousproteinexpression(用于異源蛋白表達的,令"i秀導型啟動子)，MethodsinMolecularBiology,205,1~18,2001)。但是，在細菌和哺乳動物細胞中，蛋白質(zhì)翻譯后的修飾有很大的區(qū)別，特別是對于藥物，糖基化的狀態(tài)對于治療效果很重要。因此，生產(chǎn)重組蛋白藥物常利用哺乳動物細胞(特別是中國倉鼠的細胞株)。為了降低利用該細胞培養(yǎng)的制造成本，必須提高蛋白質(zhì)的收量。在37。C下進行通常的培養(yǎng)時，細胞急劇增殖后死亡，因此，細胞存活并生產(chǎn)目標蛋白的期間縮短。人們通過添加細胞增殖抑制劑、使增殖抑制基因p27表達、以及在輕度低溫(3032。C)下培養(yǎng)、及其它方法嘗試抑制細胞增殖、使細胞長時間存活(參照SchatzSM等人.，Biotechnol.Bioeng,2003年11月20日，84(4):433~438)。其中，輕度低溫下的培養(yǎng)具有以下特征1)細胞比培養(yǎng)溫度為37。C時的存活時間更長，進行蛋白質(zhì)合成。2)蛋白分解酶的活性降低，目標蛋白質(zhì)分解減少。3)蛋白質(zhì)的糖基化或異構(gòu)體的生成與在37°C培養(yǎng)時相同程度。另外，加成唾液酸后反而比在37。C下更好。4)與在細菌中的情形同樣，可能容易改善目標蛋白的正確折疊(KaufmannH，MazurX,MaroneR,BaileyJE,FussenggerM,BiotechBioeng.,2001Mar.20，72(6):592~602;YoonSK,SongJY，LeeGM.,BiotechBioeng.,2003年5月5日，82(3):289~98)。關(guān)于最重要的重組蛋白的收量，由于細胞的存活期間延長，總收量大多增加。但是，如果考慮每個細胞單位時間的蛋白質(zhì)生產(chǎn)量(比產(chǎn)率)時，則會出現(xiàn)偏差(才艮據(jù)細胞的種類或目標蛋白的種類而不同，或者根據(jù)尚未知的因素)，比37。C下的比產(chǎn)率反而降低的例子也有很多(KaufmannH,MazurX，MaroneR，BaileyJE，F(xiàn)usseneggerM.,BiotechBioeng.，2001年3月20日，72(6):592~602;YoonSK，SongJY，LeeGM.，BiotechBioeng.,2003年5月5日，82(3):289~98)?；虮磉_調(diào)控機理不同，因此細菌的冷激蛋白CspA的啟動子和5'非翻譯區(qū)(UTR)無法應用于哺乳動物。另一方面，最單純的真核生物一裂殖糖酵母的基因組大小是1300萬個堿基對，較小，但是具備真核細胞的基本功能，并且30%以上的基因是具有內(nèi)含子，與人的已知同源基因的氨基酸序列保存性高，人的基因在酵母內(nèi)可正常表達，容易進行功能分析等，因此可作為人的模型在生物科學研究中應用(MolecularBiologyoftheCell，第4版，AlbertsB，JohnsonA,LewisJ，RaffM，Roberts,K,WalterP著，GarlandScience公司，紐約，2002)。因此，來自含有酵母的菌類、以及比其更接近于人的真核生物例如植物、線形動物、昆蟲、魚類、兩棲類、鳥類等的細胞可以根據(jù)需要補充適當?shù)幕?，由此可以與哺乳動物同樣地進行蛋白質(zhì)翻譯后的修飾，用于在低溫下生產(chǎn)蛋白質(zhì)。并且，如果利用基因工程技術(shù)，可以獲得含有進行了上述基因的突變的真核生物細胞的真核生物個體，可以進行蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。非專利文獻1:KaufmarmH,MazurX，MaroneR,BaileyJE,FusseneggerM.,BiotechBioeng.,2001年3月20日；72(6):592~602頁；非專利文獻2:YoonSK,SongJY,LeeGM.,BiotechBioeng.,2003年5月5日，82(3):289~98頁；非專利文獻3:FujitaJ"J.Mol.Microbiol.Biotechnol.，1999年11月，1(2):243-55頁；非專利文獻4:MolecularBiologyoftheCell(細胞分子生物學)，第4版,AlbertsB,JohnsonA，LewisJ,RaffM,RobertsK,WalterP著，GalrandScience公司，紐約，2002年
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明的目的在于提供在輕度低溫下提高每個細胞單位時間內(nèi)的蛋白質(zhì)產(chǎn)量、提高總收量的方法。本發(fā)明的目的還在于提供輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(蛋白質(zhì))的鑒定方法禾。純^:方法。解決課題的手段如正在申請中的國際專利申請(PCT/JP2005/003385)中所/>開的，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種基因表達調(diào)控序列(以下稱為"輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件")，該序列可發(fā)揮在輕度低溫溫度下促進轉(zhuǎn)錄的增強子的作用。其序列的例子是下述核苷酸序列或與該序列互補的核苦酸序列。tccccgcc本發(fā)明人對輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件進行深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了下述核苷酸序列在輕度低溫中可特異性促進基因的轉(zhuǎn)錄。XlcccX5X6X7(式中，XI表示c、t或a，X5表示g、c、a或t,X6表示c、t、a或g,X7表示c、a、g或t)即，本發(fā)明涉及輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，該元件含有下述核苷酸序列或與該序列互補的核苷酸序列。XlcccX5X6X7(式中，XI表示c、t或a,X5表示g、c、a或t,X6表示c、t、a或g,X7表示c、a、g或t)本說明書中，"輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件"是指在輕度低溫下特異性促進基因的轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列的單元。本說明書中，"輕度低溫"是指15~36°C、優(yōu)選3034。C、特別優(yōu)選32。C的溫度。本發(fā)明的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件對基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮輕度低溫特異性的增強子作用。本發(fā)明的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件單獨使用也可以發(fā)揮其功能，優(yōu)選將2350個、優(yōu)選2~IOO個相同或不同的該序列結(jié)合使用。結(jié)合使用時，可以將相同或不同的該核苷酸序列相互直接連接，也可以在該序列間經(jīng)由任意種類和數(shù)量的核苷酸殘基結(jié)合。使輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件結(jié)合，這在本說明書中稱為"輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子，，或簡稱為"增強子，，。本發(fā)明的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子作為輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，如果只含有連接在t的3'—側(cè)的核苦酸序列ccccgcc、ccccgtc、ccccgct、或ccccgaa;連才妄在g的3，一側(cè)的才亥香酸序歹'J:ccccgcc;連接在a的3'—側(cè)的核苷酸序列ccccgcc;在3'末端的a之前的核苷酸序列g(shù)gcgggg或ggggggg的除外。本發(fā)明的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子與距離啟動子的距離、方向無關(guān)。本發(fā)明中，"輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(蛋白質(zhì))"是指通過輕度的低溫來激活，調(diào)控、大多數(shù)情況下是促進與輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件結(jié)合的、位于元件附近的基因的轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。本發(fā)明涉及含有上述輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子的載體。本發(fā)明還涉及由該載體轉(zhuǎn)化的真核細胞。本發(fā)明又涉及由該載體轉(zhuǎn)化的真核生物。如之后的實施例所示，輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子可以穩(wěn)定地插入到細胞染色體中。本發(fā)明還涉及輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及其控制物質(zhì)的測定方法。該方法包含使含有輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的雙鏈DNA探針與作為測定對象的蛋白質(zhì)溶液接觸，檢測所結(jié)合的雙鏈DNA探針，由此測定與輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件特異性結(jié)合的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的量。被調(diào)控物質(zhì)的活性是通過對與DNA探針結(jié)合的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的量的變化進行定量來測定。本發(fā)明涉及輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的純化方法。該方法包含使含有輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的雙鏈DNA探針與蛋白質(zhì)溶液接觸，獲得與輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件特異性結(jié)合的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(蛋白質(zhì))，接著將輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子分離。發(fā)明效果本發(fā)明的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件在輕度低溫下可以促進基因的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)本發(fā)明，可以鑒定和純化輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(蛋白質(zhì))及其控制物質(zhì)。附圖簡述圖1是表示pCAT3啟動子載體的模式圖。MCS表示多克隆位點，SV40啟動子表示來自SV40病毒的啟動子，CAT表示氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的編碼序列，PA表示來自SV40病毒的多腺苦酸化信號，Ampr表示氨千青霉素抗性基因。圖2是表示pcDNA3.1(+)載體(Invitrogen公司)的模式圖。MCS表示多克隆位點。該多克隆位點的EcoRV和XbaI之間插入螢火蟲熒光素酶的編碼序列，在CMV啟動子的5'—側(cè)插入了輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子。Neor表示G418抗性基因。圖3是以用32P-ATP標記的5'-ttccccgccgacggatccag-3，作為探針，對將小鼠Balb/3T3細胞在37。C(泳道l)或32。C(泳道2)下培養(yǎng)8小時時的核蛋白質(zhì)進行凝膠移位分析，檢測與輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件結(jié)合的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。實施發(fā)明的最佳方式輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的例子包含:ccccgcc、ccccgca、ccccgcg、ccccgct、ccccgtc、■CCCCgt3、,ccccgtg、ccccgtt、CCCCg3C、CCCCg肌、CCCCg3g、CCCCg3t、ccccggc、ccccgga、ccccggg、ccccggt、ccccccc、CCCCCC3、ccccccg、cccccct、ccccctc、cccccte、,ccccctg、ccccctt、CCCCC3C、ccccc肌、cccccag、ccccc站、cccccgc、CCCCCg3、cccccgg、cccccgt、CCCC3CC、cccc3C3、ccccacg、ccccact、ccccatc、ccccato、,CCCC3tg、CCCC3tt、ccccaac、cccca肌、cccc肌g、cccca3t、cccc3gc、ccccag3、CCCC3gg、CCCC3gt、cccctec、cccctcc、tcccgcc、tcccgca、tcccgcg、tcccgct、,tcccgtc、tcccgto、tcccgtg、tcccgtt、tcccgac、tcccgaa、tcccgag、tcccgat、tcccggc、tcccgga、tcccggg、tcccccc、tccccca、tcccccg、tccccct、tcccctc、tccccte、tcccctg、tcccctt、tccccac、tccccaa、tccccag、tccccat、tccccgc、tcccacc、tcccaca、tCCC3Cg、tcccact、tcccatc、tcccata、tcccatg、tcccatt、tcccaac、tcccsaa、tccc肌g、tcccaat、tcccagc、tcccaga、tccctcc、；acccgcc、3CCCgC3、acccgcg、acccgct、8cccgtc、acccgta、acccgtg、acccgtt、3CCCg3C、3cccgas、3CCCg3g、3CCCg3t、acccggc、acccgga、acccggg、acccggt'>3CCCCCC、3ccccca、3CCCCCg、3CCCCCt、3cccctc、accccta、acccctg、acccctt、aCCCC3C、BCCCCM、3CCCCg3、3ccc3cc、accc3ca、acccacg、accc3Ct、acccatc、acccate、scccatg、3cccatt、acccaac、acccaaa、acccaag、acccaat、gcccccc、ggcgggg、agcgggg、gacgggg、ttcgggg、ggggggg、ggcggga、tgcggga、gacggga、tggggga、和ggcgggt,但并不限于此。(i)輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的制備輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子可以使用帶有保護基團的四種脫氧核糖核酸，通過使用磷酰胺(phosphoroamidide)的固相合成法、使用氬膦酸酯的固相合成方法等獲得(例如參照OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach,IRL印刷，35~81，83~115(1984);J.Org.Chem.,49，2139(1984);TetrahedronLett.，27,469(1986);TetrahedronLett"22,18591862;TetrahedronLett"21,719~722(1980);J.Am.Chem.Soc.,103,3185—3191(1981))。目前可通過市售的DNA合成裝置容易地合成(例如AppliedBiosystem公司制備等)。(ii)所使用的啟動子啟動子可使用原核生物、真核生物、病毒的啟動子。優(yōu)選哺乳動物啟動子和病毒啟動子。優(yōu)選的啟動子的例子包含小鼠胸苷激酶(TK)、巨細胞病毒(CMV)、SV40的啟動子，但并不限于此。(iii)編碼序列要表達的基因可以使用任何編碼蛋白質(zhì)的序列，沒有特別限定。也可以使不編碼蛋白質(zhì)的RNA表達。(iv)所使用的載體將本發(fā)明的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子、啟動子、以及編碼要表達的蛋白質(zhì)的編碼序列或不編碼蛋白質(zhì)的目標序列連接，插入載體中。載體是原核細胞和真核細胞表達用載體。為哺乳動物細胞時，優(yōu)選的載體的例子包括pCMV(Invitrogen公司)、pCAT3啟動子載體(Promega公司)、pSV2-neo載體，但并不限于此。(v)所^f吏用的宿主細胞用該載體轉(zhuǎn)染宿主細胞。宿主細胞優(yōu)選使用真核細胞，特別優(yōu)選使用哺乳動物細胞。優(yōu)選的哺乳動物細胞抹的例子有人類細胞株293、293T、U-20S、Huh-7、HeLa等，猴細胞株COS-7、Vero等，小鼠細月包抹NIH/3T3、Balb/3T3，B-6、Hepal隱6、中國倉鼠細胞株CHO等。轉(zhuǎn)染的方法有磷酸4丐法、脂轉(zhuǎn)染法、反轉(zhuǎn)錄病毒法、電穿孔法等。例如在磷酸4丐法中，邊攪拌邊向磷酸溶液中一滴滴加入含有DNA(載體)的氯化鈣溶液。產(chǎn)生DNA-磷酸鈣的微細沉淀，將該溶液加入到宿主細胞中，則DNA-磷酸鈣的沉淀通過吞噬作用被攝取到宿主細胞中，結(jié)果DNA被攝取到細胞內(nèi)。(vi)培養(yǎng)條件宿主細胞在輕度低溫下培養(yǎng)。培養(yǎng)基無需使用特別原料，可以是各細胞通常所使用的培養(yǎng)基。哺乳動物細胞培養(yǎng)用的典型的培養(yǎng)基的例子是添加10。/。胎牛血清(FCS)的Dulbecco's改性Eagle培養(yǎng)基(D畫MEM)(Invitrogen公司)。本發(fā)明還涉及輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(蛋白質(zhì))及其控制物質(zhì)的測定方法。該方法包含以下內(nèi)容將含有輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的雙鏈DNA探針與作為測定對象的蛋白質(zhì)溶液接觸，通過檢測所結(jié)合的雙鏈DNA探針來測定與輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件特異性結(jié)合的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的量?？刂莆镔|(zhì)的活性通過對與DNA探針結(jié)合的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子量的變化進行定量來測定。首先，按照標準方法制備含有輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的DNA寡核苷酸及其互補鏈。制備的寡核苷酸的末端例如用生物素標記，進行退火，制成雙鏈。或者將寡核苷酸制成雙鏈，然后進行標記，也可以不標記，最后以雙鏈的形式檢測。除此之外還可以利用市售的凝膠移位分析(EMSA:電泳遷移率變動分析)試劑盒(PIERCE公司、MolecularProbes公司等)。接著，將含有雙鏈寡核苷酸、輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、以及根據(jù)情況含有該被調(diào)控物質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液例如核提取物混合，使雙鏈寡核苷酸與輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子反應。接著，通過凝膠電泳例如聚丙烯酰胺凝膠電泳分離寡核苷酸、蛋白質(zhì)、以及兩者的結(jié)合物。游離的寡核苷酸快速流出，流到下部，但蛋白質(zhì)所結(jié)合的寡核苷酸緩慢流動，在上部分出現(xiàn)。以與寡核苷酸特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)的形式檢測輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。例如，如果寡核苷酸用生物素標記，則電泳后將聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)印到尼龍膜上，使用紫外線使膜進行交聯(lián)。膜上的生物素標記和過氧化物酶標記的鏈霉親和素特異性結(jié)合，與化學發(fā)光底物的反應使其發(fā)光，使其在X射線膜上感光，進行檢測。如果是上述的MolecularProbes公司的試劑盒，則可以使用未標記的寡核苷酸進行反應，使其電泳，將凝膠直接用染料染色，檢測蛋白質(zhì)所結(jié)合的寡核苷酸。由該蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的寡核苷酸的量可以測定輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。并且，通過對該輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的量所帶來的影響進行定量，可以測定該控制物質(zhì)的活性。本發(fā)明還涉及輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的純化方法。該方法包含使含有輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的雙鏈DNA探針與蛋白質(zhì)溶液接觸，獲得與輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件特異性結(jié)合的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，接著分離輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。首先，按照標準方法制備含有輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的DNA寡核苦酸及其互補鏈。接著，例如將制備的寡核苷酸與載體結(jié)合，使其固相化。例如將寡核苷酸進行生物素化，使互補《連退火，以雙鏈的形式與親和素化;f茲珠結(jié)合。接著，將固相化的雙鏈寡核苷酸、將可能含有輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的蛋白質(zhì)溶液例如核提取蛋白按照大小分成的組分混合，使雙鏈寡核苷酸與輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子接觸。接著，例如如果使用磁珠作為載體，則通過》茲鐵回收與輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合的雙鏈寡核苷酸。充分清洗后，洗脫特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)、即輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，這樣可純化輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。根據(jù)需要，還可以通過凝膠電泳或柱層析等進一步純化?？梢詮募兓牡鞍踪|(zhì)中鑒定輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的氨基酸序列、基因。以下通過實施例進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實施例的任何限定。實施例1將三個含有tccccgcc的8個；咸基串聯(lián)連接(tccccgcctccccgcctccccgcc)(SEQIDNo.l》或者是將tccccgcc的5，末端的t突變?yōu)槠渌鼔A基，將三個所得的突變體同樣地串聯(lián)連接，將它們插入到pCAT3啟動子載體(Promega公司)的多克隆位點上。該載體具有SV40的啟動子。作為報道蛋白,具有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因。陰性對照使用未進行任何插入的pCAT3啟動子載體。將這些質(zhì)粒的各2.5~5.0〃g/35mm培養(yǎng)皿與0.5~1.0,g/35mm培養(yǎng)皿的CDM8-LacZ(P-半乳糖苷酶表達載體，用于校正各轉(zhuǎn)染效率。ATCC公司)一起在37。C下培養(yǎng)一天，對人細胞株293進行轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染的細胞分成兩組，一組在32。C下、另一組在37。C下分別培養(yǎng)。培養(yǎng)基是添加了10%FCS的D-MEM。36小時后，通過離心回收細胞，制備全細胞溶解液。用CATELISA試劑盒(RocheDiagnostics公司)測定在各溫度下生成的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)蛋白質(zhì)的量，使用(3-半乳糖苷酶測定試劑盒(Stratagene公司)測定卩-半乳糖苷酶(LacZ)活性。36小時的數(shù)據(jù)如下表所示。轉(zhuǎn)錄活性采用將CAT蛋白質(zhì)量除以P-半乳糖苷酶活性所得的值。使用未進行任何插入的pCAT3啟動子載體作為對照時，以32。C/37。C的比為1,分別表示各突變體的低溫轉(zhuǎn)錄促進(增強子)活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>最初的石咸基突變?yōu)镃、A或G的突變體與野生型顯示大致同等的低溫轉(zhuǎn)錄促進活性。這顯示輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件為含有7個核苷酸的ccccgcc即足夠。使用ttccccgccgttccccgccgttccccgccg(SEQIDNo.2)代替上述輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子tccccgcctccccgcctccccgcc(SEQIDNo.1),也得到了同樣的結(jié)果實施例2實施例1中顯示，8個堿基中的最初的堿基是T、C、A、G的任何一種均與活性沒有關(guān)系，因此，將三個帶有T、C、A或G的8個石威基分另ll與tcccgcc、acccgcc、gcccgcc、ccccgct等^威基序歹寸的5，一側(cè)串聯(lián)連接，將所得與實施例1同樣地插入到pCAT3啟動子載體(Promega公司)的多克隆位點中，測定低溫轉(zhuǎn)錄促進(增強子)活性，得到表2的結(jié)果。轉(zhuǎn)錄活性采用將CAT蛋白質(zhì)量除以p-半乳糖苷酶活性所得的值。作為陰性對照，使用未進行任何插入的pCAT3啟動子載體，此時以32。C/37。C的比為1，陽性對照是將三個野生型tccccgcc串聯(lián)連接使用，此時32。C/37。C的比校正為5,給出了各突變體的低溫轉(zhuǎn)錄促進(增強子)活性。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>再次確認顯示低溫轉(zhuǎn)錄促進活性的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的8個堿基例如tccccgcc中的第1號堿基是T、C、A、G的任何一種對其活性均沒有影響，因此，不僅以8個堿基、還以7個堿基例如ccccgcc為基礎(chǔ)，制作輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子。4吏用ccccgccccccgccccccgcc(SEQIDNo.4)i^一奪上述車5度^氐溫壽爭錄調(diào)控增強子tccccgcctccccgcctccccgcc(SEQIDNo.l),也4尋到了同沖羊的結(jié)果。實施例3由ccccgcc的7個堿基序列的5'末端將第1、第2、第3或第4號的一個堿基c突變成其它堿基，在5，一側(cè)附加tt，在3，一側(cè)附加g或t，制成10個堿基，將它們?nèi)齻€串聯(lián)連接，插入到pCAT3啟動子載體(Promega公司)的多克隆位點中。然后與實施例2同樣地進行，得到以下結(jié)果。結(jié)果如表3所示。[表3第1、2、3或4的一個威基的突變體的低溫轉(zhuǎn)錄促進(增強子)活性<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>第1號堿基突變?yōu)門的突變體顯示與野生型同等的低溫轉(zhuǎn)錄促進活性。突變?yōu)锳的突變體顯示比野生型稍低的低溫轉(zhuǎn)錄促進活性。突變?yōu)镚的突變體的活性低。第2、3或4號的堿基突變?yōu)锳、G、T的突變體的活性低。實施例4研究了將ccccgcc石威基序列的第1號堿基突變?yōu)門、并且還存在1個堿基突變時的低溫轉(zhuǎn)錄促進活性。即，將第1號堿基突變?yōu)門、除此之外將第5號堿基突變?yōu)锳、C或T得到的突變體；將第1號堿基突變?yōu)門、除此之外將第6號堿基突變?yōu)锳、G或T得到的突變體；和將第1號堿基突變?yōu)門、除此之外將第7號堿基突變?yōu)锳、G;或T得到的突變體；串聯(lián)含有三個，將所得寡核苷酸與實施例3同樣地插入到pCAT3啟動子載體(Promega公司)的多克隆位點中，得到以下結(jié)果。結(jié)果如表4所示。[表4兩個堿基的突變體的低溫轉(zhuǎn)錄促進(增強子)活性<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>第1號^5咸基突變?yōu)門、并且還存在一個堿基突變時，以及第5號堿基突變?yōu)镃、A、或T，第6號堿基突變?yōu)門、A或G，第7號石咸基突變?yōu)锳、G或T,其低溫轉(zhuǎn)錄促進活性比野生型降低，但是仍可見顯著的活性。實施例5以上結(jié)果表明，核苷酸序列XlcccX5X6X7(式中，XI表示c、t或a,X5表示g、c、a或t,X6表示c、t、a或g，X7表示c、a、g或t)是輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，將它們連接所得的寡核苷酸序列是增強子，由此可以認為，與這些序列互補的核苷酸序列也可見低溫轉(zhuǎn)錄促進活性。這里，將分別串聯(lián)含有三個符合的序列或者是不符合的單一序列所得的寡核苷酸與實施例3同樣地插入到pCAT3啟動子載體(Promega公司)中，得到以下結(jié)果。結(jié)果如表5所示。[表5各種突變體的低溫轉(zhuǎn)錄促進(增強子)活性<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>以上可見，核苷酸序列XlcccX5X6X7(式中，XI優(yōu)選為c或t，也可以是a;X5優(yōu)選為g,也可以是c或a，還可以根據(jù)情況為t;X6優(yōu)選為c，可以是t或a,根據(jù)情況可以為g;X7優(yōu)選為c,還可以是t、a或g)、以及這些序列的互補核苷酸序列可見低溫轉(zhuǎn)錄促進活性。實施例6由實施例5的結(jié)果可以預測含有兩個ccccgcc的核苦酸序列是輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子。因此，在具有巨細胞病毒(CMV)啟動子的pcDNA3.1(+)載體(Invitrogen公司)(圖2)的多克隆位點(EcoRV和Xbal之間)插入由pGL3-basic載體(Promega公司)切出的螢火蟲焚光素酶cDNA,在CMV啟動子的5，一側(cè)串聯(lián)插入兩個ttccccgccgcaggacaaacgggtcgggaacgcggaagtgggtcagctccgcctccaaatcagctgtccccgcctcctagtcgctag(SEQIDNo.3)。接著，將該質(zhì)粒5.0,g/60mm培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)染人類細胞林U-2OS，在37。C下、在G418(Invitrogen公司)存在下培養(yǎng)三周，獲得將該質(zhì)粒穩(wěn)定地插入到染色體中進行表達的細胞克隆。將該培養(yǎng)細胞分成兩組，均在37。C下培養(yǎng)2天，然后一組在32。C下、另一組在37。C下分別進一步培養(yǎng)。培養(yǎng)基是10%FCS+D-MEM。溫度變更48小時后，通過離心回收細胞，制備全細胞溶解液。使用Dual-焚光素酶報道測定試劑盒(Dual-LuciferaseReporterAssaykit)(Promega乂i^司)觀'J定在各溫度下生成的螢火蟲熒光素酶活性。結(jié)果如表6所示?；钚允且詥挝惶崛〉鞍椎奈灮鹣x熒光素酶活性表示。[表6插入到染色體中的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子的轉(zhuǎn)錄促進活性<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>該結(jié)果顯示，低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子在穩(wěn)定地插入到細胞染色體中的狀態(tài)下，以及不同的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件經(jīng)由其它的核苷酸序列結(jié)合，可促進32。C下的轉(zhuǎn)錄，使蛋白質(zhì)生產(chǎn)量增加。實施例7使哺乳類細胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)時，可以考慮將兩種蛋白質(zhì)的基因同時插入到一個表達載體中的可能性。這里，在用實施例6中使用的CMV啟動子表達荄火蟲熒光素酶的載體的低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子5'上游一側(cè)沿與另一個熒光素酶表達相反的方向(3，至5'方向)進一步追加CMV啟動子，研究對熒光酶表達的影響。與實施例6同樣，轉(zhuǎn)染人類細胞抹U-20S,—組在32。C下、另一組在37。C下分別進一步培養(yǎng)，此時，由于反向的CMV啟動子被加入到5，上游而使表達沒有降低，相反還見到在32。C下有5~10%的轉(zhuǎn)錄促進，可見蛋白質(zhì)生產(chǎn)增加。由此可以認為，由相反方向的啟動子同時生產(chǎn)兩種蛋白質(zhì)的載體也可以用作低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子。實施例8凝膠移位分析將小鼠Balb/3T3成纖維細胞在添加了10。/。牛血清(CS)的Dulbecco's改性Eagle培養(yǎng)基(D-MEM)(Invitrogen公司)中、在37°C下培養(yǎng)24小時，將一部分在32。C下、其余在37。C下進一步培養(yǎng)8小時，然后按照常規(guī)方法(JohnDavidDignani,RussellM.Lebovitz,和RobertG,Roeder,AccuratetranscriptioninitiationbyRNApolymeraseIIinasolubleextractisolatedfrommammaliannuclei,NucleicAcidsRes.,1983:11:1475-1489)制備核蛋白質(zhì)提取液。將寡核苷酸、5，-ttccccgccgacggatccag-3，(SEQIDNo,5)用T4多核苦酸;敫酶和y-32P-ATP標記，用SephadexG50斗主(AmershamBioscience公司)純化，然后與互補鏈ctggatccgtcggcggggaa(SEQIDNo.6)—起退火，得到5X105cpm/ng的探針。將O.lng該探針與0.5〃gpoly(dl-dC)—起與核蛋白質(zhì)提取液混合，在20。C下放置(該結(jié)合緩沖液的組成是10mMTris(pH7.5)、100mMNaCl、2mMEDTA、10%甘油)。經(jīng)過30分鐘后進行4%聚丙烯酰胺凝膠電泳，將凝膠在80。C下干燥，使X射線膜感光，檢測與輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件結(jié)合的蛋白質(zhì)，輕度4氐溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(圖3)。產(chǎn)業(yè)實用性本發(fā)明可廣泛應用于蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。權(quán)利要求1.輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，該輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件含有下述核苷酸序列或與該序列互補的核苷酸序列X1cccX5X6X7式中，X1表示c、t或a，X5表示g、c、a或t，X6表示c、t、a或g，X7表示c、a、g或t。2.權(quán)利要求1的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其中，核苷酸序列選自ccccgcc、CCCCgC3、ccccgcg、ccccgct、ccccgtc、ccccgte、ccccgtg、ccccgtt、CCCCg3C、ccccg肌、ccccgag、ccccgat、ccccggc、CCCCgg3、ccccggg、ccccggt、ccccccc、cccccca、ccccccg、cccccct、ccccctc、cccccte、ccccctg、ccccctt、CCCCC8C、ccccc犯、ccccc3g、cccccat、cccccgc、CCCCCg3、cccccgg、cccccgt、CCCC3CC、ccccac3、cccc3cg、cccc3ct、ccccatc、ccccato、,ccccatg、ccccatt、cccc肌c、cccca^、cccca昭、ccccaat、ccccagc、cccc3ga、CCCC3gg、CCCC3gt、cccctec、cccctcc、tcccgcc、tcccgca、tcccgcg、tcccgct、tcccgtc、tcccgte、tcccgtg、tcccgtt、tcccgac、tcccgaa、tcccgag、tcccgat、tcccggc、tcccgga、tcccggg、tcccccc、tccccca、tcccccg、tccccct、tcccctc、tccccte、tcccctg、tcccctt、tccccac、tccccaa、tccccag、tccccat、tccccgc、tCCC3CC、tcccaca、tcccacg、tcccact、tcccatc、tcccata、tcccatg、tcccatt、tccc^c、tcccaaa、tccc犯g、tcccaat、tcccagc、tcccaga、tccctcc、acccgcc、acccgca、acccgcg、acccgct、acccgtc、3cccgte、3cccgtg、acccgtt、3CCCg3C、3cccgas、3CCCg3g、acccg3t、axxcggc、acccgga、acccggg、acccggt、3CCCCCC、accccca、acccccg、BCCCCCt、acccctc、accccte、3cccctg、acccctt、3CCCC3C、3ccccaa、3CCCCg3、3CCC3CC、accc3C3、3cccacg、accc3ct、3cccatc、3cccate、scccatg'.3cccatt、3ccc幼c、acccaaa、accc肌g、acccaat、gcccccc、ggcgggg、agcgggg、gacgggg、ttcgggg、ggggggg、ggcggga、tgcggga、gacggga、tggggga、和ggcgggt。3.輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子，該輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子是相同或不同的權(quán)利要求1的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件連接而成，其中作為輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，如果只含有連接在t的3，一側(cè)的核苷S吏序列ccccgcc、ccccgtc、ccccgct、或ccccgaa',連才妾在g的3，——4則的才亥普酉臾序列ccccgcc;連接在a的3'—側(cè)的核苷酸序列ccccgcc;在3'末端的a之前的核苷酸序列g(shù)gcgggg或ggggggg,則除外。4.輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子，該輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子是相同或不同的權(quán)利要求1的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件經(jīng)由其它核苷酸殘基結(jié)合而成，其中作為輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，如果只含有連接在t的3，一側(cè)的核苦酸序歹寸ccccgcc、ccccgtc、ccccgct、或ccccgaa;連才妄在g的3'—側(cè)的核苷S臾序列ccccgcc;連接在a的3'—側(cè)的核苷g臾序列ccccgcc;在3，末端的a之前的核苦酉^f歹l):ggcgggg或ggggggg，貝'j除外。5.輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子，該輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子具有核芬酸序列ttccccgccgcaggacaaacgggtcgggaacgcggaagtgggtcagctccgcctccaaatcagctgtccccgcctcctagtcgctag(SEQIDN0.3)。6.載體，該載體含有權(quán)利要求1或2的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，或者是權(quán)利要求3~5中任一項的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子。7.真核細胞，該真核細胞由權(quán)利要求6的載體轉(zhuǎn)化而成。8.真核生物，該真核生物由權(quán)利要求6的載體轉(zhuǎn)化而成。9.輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及其控制物質(zhì)的測定方法，該方法包含以下內(nèi)容將含有權(quán)利要求1或2的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的雙鏈DNA探針與作為測定對象的蛋白質(zhì)溶液接觸，通過檢測所結(jié)合的雙鏈錄調(diào)控因子的量。10.輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的純化方法，該方法包含以下內(nèi)容將含有權(quán)利要求1或2的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的雙鏈DNA探針與蛋白質(zhì)溶液接觸，；獲得與輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件特異性結(jié)合的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子；然后分離該輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。全文摘要本發(fā)明的目的在于在使用真核生物、特別是哺乳動物細胞的重組DNA法中，使生產(chǎn)的蛋白質(zhì)增加。該目的通過使用輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件、或輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件連接而成的輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控增強子實現(xiàn)，其中所述輕度低溫轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件含有核苷酸序列X1cccX5X6X7(式中，X1表示c、t或a，X5表示g、c、a或t，X6表示c、t、a或g，X7表示c、a、g或t)或與該序列互補的核苷酸序列。文檔編號C12N5/10GK101300347SQ200680040630公開日2008年11月5日申請日期2006年9月4日優(yōu)先權(quán)日2005年9月5日發(fā)明者藤田潤申請人:藤田潤