專利名稱：：用于用具有改善的免疫原性的prrsv抗原免疫接種動(dòng)物的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：總體而言，本發(fā)明涉及包含具有改善的免疫原性的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)抗原的組合物和關(guān)于其使用的方法。本文描述的組合物和方法導(dǎo)致豬針對(duì)PRRSV抗原的改善的免疫應(yīng)答，從而提供了豬針對(duì)PRRSV感染的改善的保護(hù)。相關(guān)l支術(shù)PRRSV是影響豬的在經(jīng)濟(jì)上重要的病原體。用PRRSV感染大母豬和小母豬可以導(dǎo)致生殖失敗。PRRSV還在所有年齡的豬中引起呼吸系統(tǒng)疾病?？梢越o豬接種疫苗以保護(hù)其不被PRRSV感染。然而，目前商購可得的疫苗(其中大多數(shù)是活的減毒疫苗)在某種程度上是無效的并因此應(yīng)當(dāng)進(jìn)行改良。針對(duì)PRRSV的完整的免疫保護(hù)機(jī)制并不清楚；然而，已清楚地顯示，PRRSV中和抗體對(duì)于這種保護(hù)是重要的。不幸的是，PRRSV自身(以其野生型形式)或衍生自其的目前的活疫苗以及時(shí)的方式和以有效的(即，保護(hù)性的)水平誘導(dǎo)病毒特異性中和抗體的能力很差。美國專利號(hào)6,500,662，"InfectiouscDNAcloneofNorthAmericanporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)virusandusesthereof"(Calvert等人，2002年12月31曰)描述了感染性北美PRRSVcDNA克隆的開發(fā)及其作為疫苗的用途。然而，美國專利號(hào)6,500,662并未公開包含低糖基化的PRRSV抗原的PRRSV疫苗。在另一項(xiàng)研究中，將來自各種北美PRRSV毒抹的GP5蛋白(或0RF5蛋白)的序列彼此進(jìn)行比較，并且與被稱為Lelystad毒林的代表性的歐洲PRRSV分離抹相比較，揭示了在GP5共有序列的天冬酰胺44(N44)和天冬酰胺51(N51)處的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)在所檢查的所有PRRSV分離林中都是保守的(Pirzadeh等人，Can.J.VetRes.，1998,62:170-177)。然而，位于GP5共有序列的天冬酰胺31(N31)處的N-糖基化位點(diǎn)在某些北美PRRSV分離林中不存在并且在歐洲PRRSVLelystad毒林分離林中不存在。來自四(4)種北美PRRSV毒林和Leylstad毒株的重組GST-GP5融合蛋白在大腸桿菌(Aco//)中作為不溶性包含體而產(chǎn)生，復(fù)性，并在兔中用作免疫原。在大腸桿菌中產(chǎn)生的此類重組蛋白質(zhì)保留了其天然的N-糖基化位點(diǎn)但不使它們糖基化。用包含CMV啟動(dòng)子與IAF-K1op北美PRRSV分離林的GP5基因的融合物的DNA疫苗接種豬也顯示出，在被免疫的動(dòng)物中提供了針對(duì)PRRSV攻擊的寸呆護(hù)(Pirzadeh和Dea，1998，J.GeneralVirology,79，989-999)。這種特別的GP5基因分離物編碼包含N31、N44和N51天冬酰胺殘基的GP5蛋白，所述天冬酰胺殘基當(dāng)在用DNA疫苗免疫的豬中表達(dá)時(shí)可能是糖基化的。用大腸桿菌產(chǎn)生的GST-GP5免疫接種豬不保護(hù)受病毒攻擊的豬的肺，所述GST-GP5保留IAF-Klop毒林的GP5基因的天然的N-糖基化位點(diǎn)但不使它們糖基化。包含導(dǎo)致表達(dá)低糖基化的PRRSV蛋白質(zhì)的突變的歐洲PRRSV感染性克隆也已得到描述(Wissink等人，2004，J.Gen.Virol.85:3715-23)。這篇特別的參考文獻(xiàn)報(bào)道，包含在PRRSVLelystad毒林GP(5)蛋白的天冬酰胺殘基53(N53)處的突變(該突變阻止那個(gè)位點(diǎn)的N-聯(lián)糖基化)的PRRSV是感染性的，并且可以產(chǎn)生感染性的PRRSVUlystad毒林病毒顆粒。相反地，包含在PRRSVUlystad毒抹GP(5)蛋白的N46處的突變(該突變阻止那個(gè)位點(diǎn)的N-聯(lián)糖基化)的PRRSV是非感染性的，并且不產(chǎn)生感染性的PRRSVLelystad毒抹病毒顆粒。Wissink等人推測，歐洲PRRSVGP^蛋白中的N-聚糖位點(diǎn)，以及照此類推，GP5蛋白的N53位點(diǎn)，可以在天然宿主中在許多不同的水平上發(fā)揮作用，包括受體相互作用或免疫屏蔽。在除PRRSV外的病毒中，聚糖殘基已涉及各種作用。一般而言，N-聯(lián)糖基化對(duì)于蛋白質(zhì)的正確折疊、靶向作用和生物活性是重要的(Helenius，A.和M.Aebi.，A畫.Rev.Biochem.73:1019-1049,2004.;Williams,D.B.和GlycoconjJ.，12:iii-iv，1995;Zhang,等人，Glycobiology14:1229-46，2004)。在許多有包膜病毒中，包膜蛋白通過添加糖部分進(jìn)行修飾，并且包膜蛋白的N-聯(lián)糖基化起著病毒糖蛋白的不同作用，例如受體結(jié)合、膜融合、穿透到細(xì)胞內(nèi)和病毒出芽(Braakman,I.和E.vanAnken，Traffic1:533-9，2000;Doms等人Virology193:545-62,1993)。近期研究已證實(shí)漢坦病毒糖蛋白的N-聯(lián)糖基化在蛋白質(zhì)折疊和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸中(Shi，X.和R.M.Elliott,J.Virol.78:5414-22，2004)以及在流感病毒血凝素(HA)蛋白的生物活性和抗原性中的作用(Abe，Y.，等人，J.Virol.78:9605-11，2004)。此外，已變得顯而易見的是，病毒包膜蛋白的糖基化是由幾種不同的有包膜病毒所使用的用于病毒免疫逃避和持續(xù)的主要機(jī)制，以逃避、阻斷或最小化病毒中和抗體應(yīng)答。這種效應(yīng)的例子已對(duì)于SIV(Reitter，J.N.等人,Nat.Med.4:679—84，1998)和HIV-l(Wei，X.等人，Nature422:307-12,2003)，HBV(Lee，J.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.303:427-32,2003)，流感(Skehel,J.J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1779-83，1984)和動(dòng)脈炎病毒LDV(Chen,Z.等人Virology266:88-98，2000)進(jìn)行了報(bào)道。發(fā)明概述正是考慮到上述問題才發(fā)展了本發(fā)明。證實(shí)了，相對(duì)于由用野生型(wt)或糖基化的GP5免疫的豬產(chǎn)生的中和抗體的水平，PRRSV主要表面蛋白GP5的低糖基化的變體增加了由被免疫的豬產(chǎn)生的PRRSV-中和抗體的水平。(PRRSV)抗原的改善的免疫應(yīng)答的方法，其包括施用包含編碼低糖基化的PRRSVGP5多肽變體的多核苷酸的組合物，在所述變體中相應(yīng)于在SEQIDNO:1的參考GP5蛋白中的天冬酰胺34或天冬酰胺51的至少一個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活。在該方法的某些實(shí)施方案中，相應(yīng)于在SEQIDNO:1中的天冬酰胺34或天冬酰胺51的至少一個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活。該多核苷酸可以包括感染性PRRSVRM分子或編碼感染性PRRSVRNA分子的DNA分子。所述感染性PRRSVRNA分子是北美PRRSV衍生物或歐洲PRRSV衍生物。備選地，該多核苷酸可以包括這樣的DNA分子，在所述DNA分子中將在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有活性的啟動(dòng)子與編碼低糖基化的GP5蛋白的所述多核苷酸有效地連接。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，該啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子。備選地，所述多核苷酸可以是病毒載體?？梢允褂玫拇硇圆《据d體包括痘苗病毒載體、單純皰滲病毒載體、腺病毒載體、曱病毒載體和TGEV載體。各種類型和來源的PRRSV序列可以用于獲得編碼低糖基化的PRRSVGP5多肽變體的多核苷酸，在所述變體中相應(yīng)于在SEQIDNO:1的參考GP5蛋白中的天冬酰胺34或天冬酰胺51的至少一個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，編碼低糖基化的PRRSVGP5多肽變體的所述多核普酸通過直接合成、誘變北美PRRSV分離林GP5核苷酸序列或誘變共有北美PRRSVGP5核苷酸序列來獲得。北美PRRSV分離林GP5核苷酸序列可以選自編碼SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13的GP5蛋白的核苷酸。所述共有北美PRRSVGP5核苷酸序列編碼與SEQIDNO:14至少85%同一的共有GP5蛋白。在本發(fā)聽的其他實(shí)施方案中，編碼低糖基化的PRRSVGP5多肽變體的多核苷酸通過直接合成、誘變歐洲PRRSV分離林GP5核苷酸序列或誘變共有歐洲PRRSVGP5核苷酸序列來獲得。所述歐洲PRRSV分離抹GP5核苷酸序列編碼與SEQIDNO:15至少85%同一的GP5蛋白。使指定的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)失活的各種方法可以用于有效地實(shí)踐本發(fā)明的方法。使相應(yīng)于天冬酰胺51的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)失活的一種優(yōu)選方法是用編碼除天冬酰胺外的氨基酸的密碼子替換天冬酰胺密碼子。這種替換密碼子可以編碼丙氨酸或谷氨酰胺殘基。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，相應(yīng)于在SEQIDNO:1的參考GP5蛋白中的天冬酰胺34和天冬酰胺51的2個(gè)所述N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)均被失活。在其他實(shí)施方案中，相應(yīng)于天冬酰胺34的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活。這個(gè)天冬酰胺34N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)可以通過下述方法被失活用編碼除天冬酰胺外的氨基酸的密碼子替換編碼所述天冬酰胺34的密碼子。所述編碼另一種氨基酸的密碼子可以編碼丙氨酸或谷氨酰胺殘基。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，相應(yīng)于在參考GP5蛋白中的天冬酰胺34和天冬酰胺51的2個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)可以通過下述方法被失活用編碼除天冬酰胺外的氨基酸的密碼子替換編碼天冬酰胺34和天冬酰胺51的密碼子。編碼天冬酰胺34和天冬酰胺51的密碼子這兩者可以用編碼丙氨酸或谷氨酰胺殘基的密碼子替換，以使那些糖基化位點(diǎn)失活。備選地，這2個(gè)密碼子可以用編碼丙氨酸殘基的密碼子替換，以使這兩個(gè)糖基化位點(diǎn)失活。備選地，所述N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)之一通過用編碼除天冬酰胺外的氨基酸的密碼子替換編碼所述天冬酰胺34或所述天冬酰胺51的一個(gè)密碼子而被失活，而另一個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)通過其他技術(shù)來失活。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法使用感染性PRRSVRM分子，其是編碼低糖基化的PRRSVGP5多肽變體蛋白的北美PRRSV衍生物，在所述變體蛋白中相應(yīng)于在SEQIDNO:1的參考GP5蛋白中的天冬酰胺34或天冬酰胺51的至少一個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，相應(yīng)于在SEQIDNO:1的參考GP5蛋白中的天冬酰胺34和天冬酰胺51的2個(gè)所述N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)均被失活。相應(yīng)于在參考GP5蛋白中的天冬酰胺34和天冬酰胺51的2個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)可以通過下述方法被失活用編碼除天冬酰胺外的氨基酸的密碼子替換編碼天冬酰胺34和天冬酰胺51的密碼子。編碼天冬酰胺34和天冬酰胺51的密碼子這兩者可以用編碼丙氨酸或谷"^酰胺殘基的密碼子替換，以使那些糖基化位點(diǎn)失活。備選地，這2個(gè)密碼子可以用編碼丙氨酸殘基的密碼子替換，以使那個(gè)糖基化位點(diǎn)失活。為了實(shí)踐這種方法，包含該多核苷酸的組合物通過皮下注射、靜脈內(nèi)注射、皮內(nèi)注射、腸胃外注射、肌內(nèi)注射、無針注射、電穿孔、口服遞送、鼻內(nèi)遞送、口鼻遞送、或其任何組合來施用。施用的組合物可以進(jìn)一步色含治療上可接受的承載體(carrier)。這種治療上可接受的承載體選自蛋白質(zhì)、緩沖液、表面活性劑和聚乙二醇聚合物，或其任何組合。施用的組合物可以進(jìn)一步包含佐劑。這種佐劑可以是氫氧化鋁、QuilA、氧化鋁凝膠懸浮液、礦物油、甘油酯、脂肪酸、脂肪酸副產(chǎn)物、分枝桿菌和CpG寡脫氧核苷酸，或其任何組合。施用的組合物還可以包含笫二種佐劑，例如白介素1(IL-1)、IL-2、IL4、IL-5、IL6、IL-12、Y干擾素(g-IFN)、細(xì)胞壞死因子、MDP(胞壁酰二肽)、免疫刺激復(fù)合物(ISC0M)和脂質(zhì)體。豬的針對(duì)PRRSV抗原的所述改善的免疫應(yīng)答包括由所述豬產(chǎn)生的PRRSV中和抗體增加。PRRSV中和抗體的產(chǎn)生增加通常在通過本發(fā)明的方法和組合物免疫豬后觀察到。改善的免疫應(yīng)答可以在大母豬(sow)、小母豬(gilt)、公豬(boar)或小豬(piglet)中獲得。本發(fā)明還提供了在豬中引發(fā)針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)抗原的改善的免疫應(yīng)答的方法，其包括給所述豬施用包含低糖基化的PRRSVGP5多肽變體的組合物，在所述變體中相應(yīng)于在SEQIDNO:1的參考GP5蛋白中的天冬酰胺34或天冬酰胺51的至少一個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活。低糖基化的PRRSVGP5多肽變體蛋白可以在細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中通過在先前描述的方法中使用的相同多核苷酸來產(chǎn)生。本發(fā)明還提供了組合物，其包含編碼低糖基化的北美PRRSVGP5多肽變體的多核苷酸和治療上可接受的承載體，在所述變體中相應(yīng)于在SEQIDNO:1的參考GP5蛋白中的天冬酰胺51的至少一個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含其中相應(yīng)于在SEQIDNO:1中的天冬酰胺34和天冬酰胺51的2個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)均被失活的多核苷酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，這種組合物可以包含感染性北美PRRSVRNA分子或編碼感染性北美PRRSVRNA分子的DNA分子。在其他實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含這樣的DNA分子，在所述DNA北美PRRSVGP5多肽變體的所述多核苷酸有效地連接。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，該啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子。在另外其他的實(shí)施方案中，組合物中的多核苷酸包括病毒栽體。可以在所述組合物中使用的病毒載體可以是痘苗病毒載體、單純皰疹病毒栽體、腺病毒栽體、甲病毒載體和TGEV載體中的任何一種。在所述組合物的多核苷酸中，N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)通過用編碼除天冬酰胺外的氨基酸的密碼子替換編碼所述天冬酰胺51的密碼子而被失活。所述編碼除天冬酰胺外的氨基酸的密碼子編碼丙氨酸或谷氨酰胺殘基。在這種組合物的其他實(shí)施方案中，另外的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)通過用編碼除天冬酰胺外的氨基酸的密碼子替換編碼天冬酰胺34的密碼子而被失活。該編碼另一種氨基酸的密碼子可以編碼丙氨酸或谷氨酰胺殘基。因此，本申請(qǐng)?zhí)峁┝税幋a低糖基化的北美PRRSVGP5多肽變體蛋白的多核苷酸的優(yōu)選組合物，在所述變體蛋白中相應(yīng)于在SEQIDNO:1的北美參考GP5蛋白中的天冬酰胺34和天冬酰胺51的2個(gè)所述N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)均被失活。2個(gè)所述N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)可以通過用編碼除天冬酰胺外的氨基酸的密碼子替換編碼所述天冬酰胺34和所述天冬酰胺51的密碼子來失活。這些編碼除天冬酰胺外的氨基酸的密碼子可以編碼丙氨酸或谷氨酰胺殘基。在所述組合物中使用的治療上可接受的承載體可以是蛋白質(zhì)、緩沖液、表面活性劑和聚乙二醇聚合物，或其任何組合。所述組合物進(jìn)一步包含至少一種佐劑。這種佐劑可以是氫氧化鋁、QuilA、氧化鋁凝膠懸浮液、礦物油、甘油酯、脂肪酸、脂肪酸副產(chǎn)物、分枝桿菌和CpG寡脫氧核苷酸，或其任何組合。所述組合物可以進(jìn)一步包含選自白介素l(IL-l)、IL-2、IL4、IL-5、IL6、IL-12、y干擾素(g-IFN)、細(xì)胞壞死因子、MDP(胞壁酰二肽)、免疫刺激復(fù)合物(ISC0M)和脂質(zhì)體的第二種佐劑。本發(fā)明還提供了組合物，其包含低糖基化的北美PRRSVGP5多肽變體和治療上可接受的承栽體，在所述變體中相應(yīng)于在SEQIDNO:1的參考GP5蛋白中的天冬酰胺51的至少一個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活。在優(yōu)選實(shí)施方案中，相應(yīng)于在SEQIDNO:1的參考GP5蛋白中的天冬酰胺34或天冬酰胺51的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活。低糖基化的PRRSVGP5多肽變體蛋白可以在細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中通過在先前描述的方法中使用的相同多核苷酸來產(chǎn)生。本發(fā)明還提供了分離的多核苷酸，其編碼低糖基化的北美PRRSVGP5多肽變體，在所述變體中相應(yīng)于在SEQIDNO:1的參考GP5蛋白中的天冬酰胺51的至少一個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活。在某些實(shí)施方案中，提供了其中相應(yīng)于在SEQIDNO:1中的天冬酰胺34和天冬酰胺51的2個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)均被失活的多核苷酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，這種分離的多核苷酸可以包括感染性北美PRRSVRM分子或編碼感染性北美PRRSVRNA分子的DNA分子。在其他實(shí)施方案中，所述分離的多核苷酸包括這樣的DM分子，在所述DNA分子中將在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有活性的啟動(dòng)子與編碼所述低糖基化的北美PRRSVGP5多肽變體的所述多核苷酸有效地連接。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，該啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子。在另外其他的實(shí)施方案中，所述分離的多核苷酸包括病毒載體?？梢栽谒鼋M合物中使用的碎毒載體可以是痘苗病毒栽體、單純皰瘆病毒載體、腺病毒載體、甲病毒載體和TGEV載體中的任何一種。在所述分離的多核苷酸中，N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)通過用編碼除天冬酰胺外的氨基酸的密碼子替換編碼所述天冬酰胺51的密碼子而被失活?；Ｔ谄渌麅?yōu)選的實(shí)施方案中，另外的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)通過用編碼除天冬酰胺外的氨基酸的密碼子替換編碼天冬酰胺34的密碼子而被失活。該編碼另一種氨基酸的密碼子可以編碼丙氨酸或谷氨酰胺殘基。因此提供了編碼低糖基化的北美PRRSVGP5多肽變體蛋白的優(yōu)選多核苷酸，在所述變體蛋白中相應(yīng)于在SEQIDNO:1的北美參考GP5蛋白中的天冬酰胺34和天冬酰胺51的2個(gè)所述N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)均被失活。2個(gè)所述N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)可以通過用編碼除天冬酰胺外的氨基酸的密碼子替換編碼所述天冬酰胺34和所述天冬酰胺51的密碼子來失活。這些編碼除天冬酰胺外的氨基酸的密碼子可以編碼丙氨酸或谷氨酰胺殘基。本發(fā)明還提供了分離的多肽，其是低糖基化的北美PRRSVGP5多肽變體，其中相應(yīng)于在SEQIDNO:1的參考GP5蛋白中的天冬酰胺51的至少一個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活。分離的低糖基化的PRRSVGP5多肽變體蛋白可以在細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中通過在先前描述的方法中使用的相同多核苷酸來產(chǎn)生，并且通過層析法或其他技術(shù)進(jìn)行純化。本發(fā)明的進(jìn)一步的特征和優(yōu)點(diǎn)以及本發(fā)明的各種實(shí)施方案的結(jié)構(gòu)和操作在下文參考附圖詳細(xì)描述。附圖簡述引入說明書并構(gòu)成說明書的一部分的附解說明了本發(fā)明的實(shí)施方案，并且連同說明書一起用于說明本發(fā)明的原理。在附圖中圖1圖解說明了PRRSVGP5和M蛋白的瞬時(shí)表達(dá)。A.雙順反子構(gòu)建體的示意圖，其顯示了位于來自腦心肌炎病毒的IRES(IE)的側(cè)翼的GP5和M編碼區(qū)。所述編碼區(qū)處于在GP5編碼區(qū)緊上游存在的T7RNA聚合酶啟動(dòng)子(黑色矩形)的控制下。彎箭頭顯示了通過來自該載體的T7RNA聚合酶進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄的位置和方向。B.在用該雙順反子栽體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的GP5和M蛋白的表達(dá)。用模擬物(mock)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(泳道l)或用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(泳道2-7)如在材料和方法中所述的進(jìn)行放射性標(biāo)記，用抗Gp5抗體(泳道1-5)或抗M抗體(泳道6-7)進(jìn)行免疫沉淀。免疫沉淀的蛋白質(zhì)不進(jìn)行處理(-)(泳道l、2、6和7)或用EndoH(泳道3)、PNGaseF(泳道4)進(jìn)行處理(+)，并通過電泳進(jìn)行分析。泳道5包含來自用衣霉素處理(+)的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的經(jīng)免疫沉淀的蛋白質(zhì)。顯示了具有以千道爾頓表示的相對(duì)分子量(Mr)的蛋白質(zhì)的遷移率。圖2圖解說明了使用雙順反子質(zhì)粒的WT-GP5及其突變體的糖基化分析。A.該雙順反子栽體和在所顯示的氨基酸位置34、44和51處具有3個(gè)推定的糖基化位點(diǎn)的PRRSVGP5的示意圖。B.在本研究中使用的各種突變體。C.wt和突變型GP5的表達(dá)及其對(duì)EndoH的敏感性。該實(shí)驗(yàn)如圖l的圖例中所述的來進(jìn)行，蛋白質(zhì)用抗GP5抗體進(jìn)行免疫沉淀，用EndoH進(jìn)^f亍消化(+)或不進(jìn)4亍消化(-),并通過電泳進(jìn)行分析。箭頭顯示了突變型GP5蛋白。在右側(cè)顯示了具有以千道爾頓表示的相對(duì)分子量(Mr)的蛋白質(zhì)的遷移率。圖3圖解說明了編碼突變型GP5的突變體病毒的表征。A.wt(FL-12)和各種突變體PRRSV在MARC-145細(xì)胞中的單步生長動(dòng)力學(xué)。在6孔平板中的細(xì)胞用MOI為3的PRRSV進(jìn)行感染，在感染后的指定時(shí)間收集培養(yǎng)物上清液，并測定病毒滴度。顯示了來自3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均滴度與標(biāo)準(zhǔn)差(誤差條)。B.突變體病毒的噬斑形態(tài)。空心箭和箭頭顯示了較不清晰的噬斑。C.反式互補(bǔ)(Trans-complementation)以回收突變體PRRSV。從表達(dá)wtGP5蛋白的細(xì)胞中回收的突變體病毒的定量分析。顯示了來自3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均病毒得率與標(biāo)準(zhǔn)差(由誤差條表示)。圖4圖解說明了摻入突變型病毒粒子內(nèi)并在經(jīng)突變體病毒感染的細(xì)胞中合成的GP5的檢查。A.使來自受感染的細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液的經(jīng)放射性標(biāo)記的病毒粒子形成粒狀沉淀，使GP5蛋白免疫沉淀，用(+)或不用(-)EndoH進(jìn)行處理，并通過電泳進(jìn)行分析。在泳道1和2中用或不用EndoH進(jìn)行消化的GP5由白色括號(hào)顯示。B.對(duì)用各種突變體病毒感染的細(xì)胞進(jìn)行放射性標(biāo)記，使GP5免疫沉淀，用(+)或不用(-)EndoH進(jìn)行處理，并通過電泳進(jìn)行分析。在泳道2和3中用或不用EndoH進(jìn)行消化的GP5由白色括號(hào)顯示。在每一圖版右側(cè)顯示了具有以千道爾頓表示的相對(duì)分子量(Mr)的蛋白質(zhì)的遷移率。圖5圖解說明了北美PRRSVGP5N-末端氨基酸序列與北美PRRSVGP5參考N-末端序列(SEQIDNO:1;毒林NVSL97-7895)的比對(duì)。顯示了200個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)比對(duì)的前60個(gè)N-末端氨基酸。在所述蛋白質(zhì)中的天冬酰胺34"NSS"和天冬酰胺51"NGT"N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)以粗體顯示。位于參考GP5蛋白的殘基29~和35之間的其他N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)加有下劃線。圖6圖解說明了歐洲PRRSVGP5N-末端氨基酸序列與北美PRRSVGP5參考N-末端序列(SEQIDNO:1;毒林NVSL97-7895)的比對(duì)。顯示了約200個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)的完整GP5蛋白的比對(duì)，其中在所述蛋白質(zhì)中的天冬酰胺51"NGT"N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)以粗體顯示(即SEQIDNO:15中的天冬酰胺53)。優(yōu)選實(shí)施方案的詳述定義如本文所使用的，"可接受的承載體"指對(duì)于組合物的其他成分無害并且對(duì)于其將應(yīng)用至的材料無害的承載體。"治療上可接受的承載體"指對(duì)于組合物的其他成分無害并且對(duì)于其的人或其他動(dòng)物接受者無害的承載體。在組合物的其他成分的情況下，"無害的"意指該承載體不會(huì)與其他成分反應(yīng)或使其他成分降解，或者干擾它們的功效。對(duì)成分的功效的干擾不包括僅僅是對(duì)成分進(jìn)行稀釋。在動(dòng)物的情況下，"無害的"意指該承載體對(duì)于植物或動(dòng)物是沒有傷害的或不是致命的。如本文所使用的，"佐劑"指與抗原聯(lián)合使用的任何材料，其增強(qiáng)那種抗原誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力。如本文所使用的，"施用"指給受試者提供多核苷酸、多肽或其組合物的任何方式。施用方式的非限制性例子包括皮下注射、靜脈內(nèi)注射、皮內(nèi)注射、腸胃外注射、肌內(nèi)注射、無針注射、電穿孔、口服遞送、鼻內(nèi)遞送、口鼻遞送、或其任何組合。如本文所使用的，"抗原"指在宿主中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的任何實(shí)體。如本文所使用的，"共有序列"指通過下述方式形成的氨基酸、DM或RNA序列使2個(gè)或更多個(gè)同源序列進(jìn)行比對(duì)，并衍生出表示共同的氨基酸、DNA或RNA序列的新序列。如本文所使用的，"低糖基化的PRRSVGP5多肽變體，，指這樣的PRRSVGP5蛋白，其中包含一個(gè)或多個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)的原始或非變體氨基酸序列已被改變，以便減少在所得到的GP5變體蛋白中的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)的數(shù)目。在這個(gè)定義下，在大腸桿菌中表達(dá)原始或非變體GP5蛋白以產(chǎn)生具有包含相同數(shù)目的糖基化位點(diǎn)的原始GP5序列的GP5蛋白，不會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生低糖基化的PRRSVGP5多肽變體。如本文所使用的，"免疫應(yīng)答，，指結(jié)合、降解或者抑制特定抗原的抗體和/或細(xì)胞(例如T淋巴細(xì)胞)的產(chǎn)生。相關(guān)短語例如"改善的免疫應(yīng)答"涉及使用導(dǎo)致經(jīng)免疫的宿主針對(duì)抗原的應(yīng)答的任何可測量的改善的方法和組合物。例如，免疫應(yīng)答的可測量的改善包括但不限于，相對(duì)于在對(duì)照動(dòng)物中觀察到的產(chǎn)生水平，中和抗體的產(chǎn)生增加(即，抗體滴度增加)，所述對(duì)照動(dòng)物已用缺乏提供改善的免疫應(yīng)答的結(jié)構(gòu)修飾的抗原免疫。"感染性RM分子"指編碼所有對(duì)于當(dāng)被引入許可宿主細(xì)胞內(nèi)時(shí)產(chǎn)生功能性病毒粒子來說的必需元件的RNA分子。如本文所使用的，"感染性克隆"指編碼感染性RNA分子的DNA分子。如本文所使用的，"北美PRRSV"指包含與北美PRRSV分離林相關(guān)的多核苷酸序列的任何PRRSV，所述北美PRRSV分離林例如為但不限于，NVSL97-7895毒林(Truong等人，Virology,325:308-319以及其中包含的參考文獻(xiàn))或者IAF-Klop、MLV、ATCCVR-2332、ATCCVR-2385、IAF-BAJ、IAF-DESR、IAF-CM、IAF93-653、IAF93-2616、IAF94-3182、IAF94-287毒林(在Pirzadeh等人Can.J.VetRes，62:170-177以及其中包含的參考文獻(xiàn)中描述)。對(duì)于本發(fā)明，包含與北美PRRSV分離林相關(guān)的多核苷酸序列的PRRSV是包含這樣的多核苷酸序列的PRRSV，即在所述多核苷酸序列中GP5編碼區(qū)編碼與SEQIDNO:1具有至少85%的蛋白質(zhì)序列同一性的多肽。如本文所使用的，"歐洲PRRSV"指包含與歐洲PRRSV分離抹相關(guān)的多核苷酸序列的任何PRRSV，所述歐洲PRRSV分離抹例如為但不限于，Lelystad毒林(Wissink等人，J.Gen.Virol.85:3715，2004以及其中包含的參考文獻(xiàn))。對(duì)于本發(fā)明，包含與歐洲PRRSV分離株相關(guān)的多核苷酸序列的PRRSV是包含這樣的多核苷酸序列的PRRSV，即在所述多核苷酸序列中GP5編碼區(qū)編碼與SEQIDNO:15具有至少85%的蛋白質(zhì)序列同一性的多肽。如本文所使用的，"同一性百分比"指序列中在2個(gè)經(jīng)最佳比對(duì)的DNA、RNA或蛋白質(zhì)區(qū)段的指定長度內(nèi)相同的元素(即，氨基酸或核苷酸)的數(shù)目。為了計(jì)算"同一性百分比"，將相同元素的數(shù)目除以在經(jīng)比對(duì)的區(qū)段的指定長度中的元素總數(shù)目，并乘以100。當(dāng)同一性百分比關(guān)于蛋白質(zhì)進(jìn)行使用時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解某些氨基酸殘基可能不是相同的，盡管如此卻是保守的氨基酸置換，其反映了具有相似化學(xué)性質(zhì)的氨基酸殘基(例如，酸性或堿性、疏水性、親水性、氫鍵供體或接納體殘基)的置換。此類置換可能不改變分子的功能性質(zhì)。因此，由于保守置換，可以增加蛋白質(zhì)序列的同一性百分比。引言豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)糖蛋白5(GP5)是最豐富的包膜糖蛋白，并且是體內(nèi)中和抗體的主要誘導(dǎo)物。3個(gè)推定的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)(N34、N44和N51)位于GP5膜外結(jié)構(gòu)域(ectodomain)上，其中還存在主要中和表位。為了確定這些推定的糖基化位點(diǎn)中的哪些在PRRSV生活周期中使用，以及聚糖部分在誘導(dǎo)中和抗體中的作用，我們產(chǎn)生了在這些位點(diǎn)上包含單個(gè)和多個(gè)氨基酸置換的一組GP5突變體。野生型(wt)以及突變型蛋白質(zhì)的瞬時(shí)表達(dá)和后續(xù)生物化學(xué)研究揭示，成熟的GP5在所有3個(gè)位點(diǎn)處包含高甘露糖類型的糖部分。隨后將這些突變摻入全長cDNA克隆中以回收感染性PRRSV。我們的結(jié)果證實(shí)，涉及N44殘基的突變不導(dǎo)致感染性后代的產(chǎn)生，這表明N44是對(duì)于病毒感染性來說最關(guān)鍵的氨基酸殘基。在N34、N51和N34/51處攜帶突變的病毒生長至比wtPRRSV更低的滴度，并且在MARC145細(xì)胞中顯示出減少的致細(xì)胞病變效應(yīng)。在血清中和測定法中，突變體病毒顯示出對(duì)于被wtPRRSV特異性抗體中和的敏感性增強(qiáng)。此外，用突變體病毒接種豬誘導(dǎo)了顯著更高水平的針對(duì)突變體以及wtPRRSV的中和抗體，從而暗示GP5的膜外結(jié)構(gòu)域中聚糖殘基的喪失增強(qiáng)了這些病毒對(duì)于體外中和的敏感性以及附近的中和表位的免疫原性。這些結(jié)果應(yīng)當(dāng)對(duì)于開發(fā)保護(hù)功效增強(qiáng)的PRRSV疫苗具有重大意義。中和抗體已知是針對(duì)PRRSV的保護(hù)的主要關(guān)聯(lián)物。我們已發(fā)現(xiàn)PRRSVGP5蛋白中糖基化位點(diǎn)的清除導(dǎo)致下述能力的顯著增強(qiáng)(1)經(jīng)修飾的PRRSV毒林被PRRSV恢復(fù)期抗血清中和的能力，和(2)當(dāng)用于接種豬時(shí)，這種經(jīng)修飾的PRRSV毒林產(chǎn)生空前水平的PRRSV-中和抗體的能力。將這種概念應(yīng)用至用于針對(duì)PRRSV感染進(jìn)行免疫的任何活的(wt或減毒的)病毒將在其使用中具有顯著影響，以賦予針對(duì)PRRSV感染的有效保護(hù)。目前，存在用于針對(duì)PRRSV感染進(jìn)行免疫的3種主要方法(1)活的減毒疫苗，(2)滅活的疫苗(其基于在體外生長并經(jīng)化學(xué)方法滅活的wtPRRSV),和(3)采用以全身方式對(duì)獸群的所有動(dòng)物用強(qiáng)毒wtPRRSV有目的地進(jìn)行感染。存在關(guān)于這3種方式中的哪一種最有效的許多討論和辯論。不管用于免疫的方法如何，我們的發(fā)明都將是有益的。對(duì)活PRRSV進(jìn)行遺傳改變以修飾其蛋白質(zhì)的糖基化水平可以在下述毒林中進(jìn)行減毒的PRRSV疫苗林，或用于產(chǎn)生滅活疫苗的wtPRRSV毒林，或用于通過大量感染直接接種獸群的wtPRRSV毒林。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)屬于巢狀病毒目(治VoWrWeiO中的動(dòng)脈炎病毒科(Jr&r"/r/Vae)，其還包括馬動(dòng)脈炎病毒(EAV)、乳酸脫氫酶升高癥病毒(lactatedehydrogenase-elevatingvirus,LDV)和猿出血熱病毒(SHFV)。該病毒基因組是長度為約15.0kb的線性、正鏈RNA分子，并且在5，-末端處具有帽結(jié)構(gòu)和在3，-末端處具有poly(A)尾。在病毒基因組中編碼8個(gè)開放讀碼框(0RF)。前2個(gè)開放讀碼框(0RFla和0RFlab)編碼參與多蛋白加工以及基因組轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的病毒非結(jié)構(gòu)(NS)多蛋白。在0RF2-7中編碼的病毒結(jié)構(gòu)蛋白從6個(gè)亞基因組加帽和多腺苷酸化的mRNA表達(dá)，所迷mRM作為在5，-末端處具有共同的引導(dǎo)序列的mRNA的3，-共末端嵌套組而合成。主要病毒包膜蛋白是糖蛋白5(GP5)，其在病毒基因組的0RF5中,編碼。GP5是大小約25kDa的糖基化的跨膜蛋白質(zhì)。它具有推定的N-末端信號(hào)肽并且具有3個(gè)潛在的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)，所述N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)位于包含成熟蛋白質(zhì)的前40個(gè)殘基的小的膜外結(jié)構(gòu)域中。在EAV和LDV中，主要包膜糖蛋白與0RF6基因產(chǎn)物即病毒基質(zhì)(M)蛋白形成二硫鍵連接的異二聚物。PRRSVGP5和M蛋白之間類似的相互作用已被觀察到，但相互作用的方式仍未被限定。已假定GP5和M蛋白的異二聚物的形成可能在感染性PRRSV的裝配中起關(guān)鍵作用。除了其在病毒裝配中的作用外，GP5看起來參與病毒進(jìn)入易感宿主細(xì)胞中。GP5被假定與宿主細(xì)胞受體一一唾液酸粘附素相互作用，以便進(jìn)入豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)(PRRSV的體內(nèi)靶細(xì)胞)中。GP5在受體識(shí)別中的作用得到了N-末端膜外結(jié)構(gòu)域中存在主要中和表位的支持，從而暗示GP5膜外結(jié)構(gòu)域在感染過程中的重要作用。GP5膜外結(jié)構(gòu)域的N-聯(lián)聚糖對(duì)于蛋白質(zhì)的正確機(jī)能可能是關(guān)鍵的。一般而言，N-聯(lián)糖基化對(duì)于蛋白質(zhì)的正確折疊、靶向作用和生物活性是重要的。在許多有包膜病毒中，包膜蛋白通過添加糖部分進(jìn)行修飾，并且包膜蛋白的N-聯(lián)糖基化起著病毒糖蛋白的不同作用，例如受體結(jié)合、膜融合、穿透到細(xì)胞內(nèi)和病毒出芽。近期研究已證實(shí)漢坦病毒糖蛋白的N-聯(lián)糖基化在蛋白質(zhì)折疊和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸中以及在流感病毒血凝素(HA)蛋白的生物活性和抗原性中的作用。此外，已變得顯而易見的是，病毒包膜蛋白的糖基化是由幾種不同的有包膜病毒所使用的用于病毒免疫逃避和持續(xù)的主要機(jī)制，以逃避、阻斷或最小化病毒中和抗體應(yīng)答。這種效應(yīng)的例子已對(duì)于SIV和HIV-1，HBV，流感，和更重要地，在PRRSV的情況下，動(dòng)脈炎病毒LDV進(jìn)行了^L道。近期關(guān)于PRRSV的反向遺傳系統(tǒng)的開發(fā)已由幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室(包括我們的實(shí)驗(yàn)室)報(bào)道。顯然，使用感染性克隆的突變研究已導(dǎo)致更好地理解動(dòng)脈炎病毒的病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制機(jī)制。因此，為了檢查N-聯(lián)糖基化在PRRSV的GP5生物活性(在產(chǎn)生感染性病毒或在體內(nèi)引發(fā)中和抗體方面)中的重要性，我們已構(gòu)建了一系列突變型GP5蛋白，其中每個(gè)潛在的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)已個(gè)別地或以各種組合進(jìn)行了突變。就其糖基化模式、在感染性病毒回收中和在由通過實(shí)驗(yàn)接種針對(duì)wtPRRSV或針對(duì)突變體病毒而產(chǎn)生的抗體所進(jìn)行的交叉中和中的作用來檢查所得到的突變型蛋白質(zhì)。我們的數(shù)據(jù)顯示，所有3個(gè)推定的糖基化位點(diǎn)可用于具有高甘露糖類型聚糖的糖基化，并且在殘基44處的GP5蛋白的糖基化對(duì)于感染性PRRSV的回收來說是關(guān)鍵性的。非常重要的是，來自中和以及抗體應(yīng)答研究的數(shù)據(jù)表明，由PRRSV的天然感染可能涉及基于聚糖屏蔽機(jī)制的免疫逃避，如先前對(duì)于其他病毒所描述的，從而幫助解釋了在被PRRSV感染的動(dòng)物中觀察到的相當(dāng)無效的保護(hù)性體液免疫應(yīng)答。N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)和失活方法糖蛋白中的N-聯(lián)糖基化通常在Asn-Xaa-Ser/Thr(NXS/T)序列處發(fā)生，其中Xaa(X)是除Pro外的任意氨基酸殘基?？梢栽贜-聯(lián)糖基化位點(diǎn)處引入各種突變以提供其失活。優(yōu)選的失活方法包括用編碼除天冬酰胺外的任意氨基酸的殘基置換天冬酰胺殘基。在本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案中，用丙氨酸或谷氨酰胺殘基置換天冬酰胺殘基。此處還考慮了使N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)，特別是使相應(yīng)于SEQIDN0:1的GP5參考蛋白的天冬酰胺34和/或51的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)失活的其他方法。在Xaa位置處某些氨基酸例如脯氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或亮氨酸的置換也可以用于使N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)失活(Kasturi等人，BiochemJ.323(2):415-9，1997)。備選地，用任意非羥基氨基酸(即除絲氨酸或蘇氨酸外的任意氨基酸)置換N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)的最終羥基氨基酸位置(即，NXS/T序列的絲氨酸或蘇氨酸殘基)也可以用于使N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)失活。已用于使N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)失活的非羥基氨基酸的例子包括半胱氨酸(Kasturi等人，J.Biol.Chemistry270(24)，14756-14761，1995)。除了氨基酸置換外，本發(fā)明還考慮了使N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)失活的其他類型的突變，例如氨基酸插入或氨基酸缺失。技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到，N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)可以通過將導(dǎo)致那個(gè)糖基化位點(diǎn)失活的缺失而容易地被失活，所述缺失去除NXS/T序列中的關(guān)鍵氨基酸(即，天冬酰胺殘基)。X殘基或絲氨酸/蘇氨酸殘基的缺失可以類似地使某些N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)失活，其中在天然存在的序列中該S或T殘基后面不是另一個(gè)S或T殘基。當(dāng)X是非羥基氨基酸(即，不是絲氨酸或蘇氨酸)時(shí)，在N殘基的羧基末端處插入任意氨基酸殘基可以使N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)失活。在X殘基的羧基末端處插入任意非輕基氨基酸也可以使N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)失活?？傊?，應(yīng)當(dāng)理解，用于實(shí)踐本發(fā)明的突變的關(guān)鍵特征在于它使在GP5蛋白中的天冬酰胺34和/或天冬酰胺51位點(diǎn)處的N-聯(lián)糖基化失活。盡管不受理論的限制，但據(jù)信這些突變的關(guān)鍵特征在于它們阻止蛋白質(zhì)的某些區(qū)域(即，相應(yīng)于在SEQIDNO:1的GP5參考蛋白中的天冬酰胺34和/或天冬酰胺51位點(diǎn)的殘基)中的糖基化。通過阻止這些位點(diǎn)處的糖基化，去除通常屏蔽野生型病毒的關(guān)鍵表位的糖殘基，從而允許引發(fā)改善的免疫應(yīng)答。因此，預(yù)期許多不同類型的突變(即，氨基酸置換、插入或缺失)可以用于使鑒定的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)失活并獲得將引發(fā)改善的免疫應(yīng)答的抗原。本發(fā)明的PRRSV多核苷酸和多肽的描述本發(fā)明的方法可以用各種不同的多核苷酸進(jìn)行實(shí)踐，所述多核苷酸可以來源于自各種不同的來源。所有多核苷酸的共同特征在于它們編碼低糖基化的PRRSVGP5多肽變體，其中相應(yīng)于在SEQIDNO:1的參考GP5蛋白中的天冬酰胺34、天冬酰胺51、或者天冬酰胺34和天冬酰胺54的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活。為了鑒定相應(yīng)于在SEQIDN0:1的參考GP5蛋白中的天冬酰胺34和天冬酰胺54的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)，可以將非變體且正常糖基化的PRRSVGP5多肽序列與SEQIDNO:1的參考GP5蛋白進(jìn)行比對(duì)。此類比對(duì)的例子在圖5和6中顯示。在這種比對(duì)中使用的具體序列在表1中描述。表l.序列描述<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>NO:1的參考GP5蛋白中的天冬酰胺34或天冬酰胺51的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)，使所需北美PRRSV分離林(圖5)或歐洲PRRSV分離林(圖6)的GP5蛋白與SEQIDNO:1的參考GP5蛋白(北美毒株NVSL97-7895)進(jìn)行比對(duì)。通過使用SEQIDNO:1的GP5蛋白作為參考蛋白，技術(shù)人員可以容易地鑒定任何GP5蛋白中的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)，并隨后構(gòu)建本發(fā)明的低糖基化的GP5蛋白變體。因此顯而易見的是，術(shù)語"相應(yīng)于在SEQIDNO:1的參考GP5蛋白中的(天冬酰胺34和/或天冬酰胺51)充當(dāng)在任何GP5蛋白中的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)的描述符。低糖基化的GP5蛋白可以得自北美PRRSV分離林，包括但不限于SEQIDNO:1-13，在氨基酸序列水平上與北美PRRSV共有序列例如SEQIDNO:14至少85%同一的北美PRRSV分離林，或北美PRRSV共有序列。低糖基化的GP5蛋白也可以得自歐洲PRRSV分離林，包括但不限于SEQIDNO:15,在氨基酸序列水平上與歐洲PRRSV共有序列例如SEQIDNO:15至少85%同一的歐洲PRRSV分離林，或歐洲PRRSV共有序列。為了獲得編碼低糖基化的GP5變體的多核苷酸，可以通過標(biāo)準(zhǔn)定點(diǎn)誘變技術(shù)來誘變來自上文列出的任何來源的多核苷酸，從而使得它們將編碼低糖基化的GP5變體多肽。備選地，可以構(gòu)建完全合成的DNA序列，其編碼所需的低糖基化的GP5變體多肽。這通常通過使用序列分析程序例如"回譯(backtranslate)"來完成，所述"回譯"將多肽序列轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的多核苷酸序列(GCGWisconsinPackage,Accelrys，Inc，SanDiego,CA)。需要時(shí)，可以將合適的"密碼子偏倚"摻入"回譯"程序中以提供合成基因的設(shè)計(jì)，所述合成基因摻入了適合于在所需表達(dá)宿主(即，哺乳動(dòng)物或酵母)中使用的密碼子。相應(yīng)于在SEQIDNO:1的參考GP5蛋白中的天冬酰胺51的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)存在于圖5中所顯示的所有代表性的北美PRRSV分離林中和存在于代表性的歐洲PRRSVLelystad毒林(圖6)中。在這些示例性且非限制性的北美和歐洲PRRSV毒林中，這個(gè)位置處的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)包含序列"NGT"。然而，還預(yù)期其他PRRSV變體可以包含在這個(gè)位置(即，NXS或T)處的其他在結(jié)構(gòu)上可互換的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)，所述N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)也可以經(jīng)由本文教導(dǎo)的方法被失活。這個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)可以通過用編碼其他氨基酸殘基例如谷氨酰胺或丙氨酸的密碼子置換在相應(yīng)的多核苷酸序列中的天冬酰胺51來失活。在這些情況下，在低糖基化的北美PRRSVGP5蛋白變體中的相應(yīng)氨基酸序列將包含序列例如"QGT，，、"AGT"或"XGT"，其中X是除天冬酰胺外的任意氨基酸。其中相應(yīng)于天冬酰胺51的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活的北美PRRSVGP5蛋白分離株的這些或其他低糖基化的變體也可以與其中其他N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活的其他低糖基化的GP5變體相組合。使N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)失活的其他方法包括NXS/T序列的"X"或"S/T"殘基的氨基酸置換，氨基酸缺失或氨基酸插入，并且在上文得到描述。準(zhǔn)確地相應(yīng)于SEQIDNO:1的參考GP5蛋白的天冬酰胺34的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)僅存在于本文顯示的某些代表性的北美PRRSV分離抹(圖5)中。更特別地，代表性的北美PRRSV分離株IAF-BAJ(SEQIDNO:3)、94-3182(SEQIDNO:7)和94-287(SEQIDNO:8)的GP5蛋白包含準(zhǔn)確地相應(yīng)于SEQIDNO:1的參考GP5蛋白的天冬酰胺34的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)，并且包含N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)"NSS"。當(dāng)然預(yù)期本文未顯示的其他PRRSVGP5分離物也將包含相應(yīng)于SEQIDNO:1的參考GP5蛋白的天冬酰胺34的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)，并且這些其他GP5蛋白的低糖基化的變體也可以使用本文描述的方法來獲得。SEQIDNO:3、7和8的這個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)或包含天冬酰胺34N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)的其他PRRSV分離林，可以通過用編碼其他氨基酸殘基例如谷氨酰胺或丙氨酸的密碼子置換在相應(yīng)的多核苷酸序列中的天冬酰胺34來失活。在其中天冬酰胺34處的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)是"NSS"的這些情況下，在低糖基化的北美PRRSVGP5蛋白變體中的相應(yīng)氨基酸序列將包含序列例如"QSS"、"ASS"或"XSS"，其中X是除天冬酰胺外的任意氨基酸。備選地，"NSS"序列的絲氨酸殘基可以被置換為非羥基氨基酸(即，非絲氨酸或非蘇氨酸)。在這些情況下，在低糖基化的北美PRRSVGP5蛋白變體中的相應(yīng)氨基酸序列將包含序列"NSX"，其中X是除天冬酰胺外的任意氨基酸。"NSS"序列的2個(gè)絲氨酸殘基之間(即，絲氨酸35和36之間)的非羥基氨基酸的插入也可以用于使這個(gè)特定的糖基化位點(diǎn)失活。在缺乏準(zhǔn)確地相應(yīng)于SEQIDNO:1的參考GP5蛋白的天冬酰胺34的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)的其他北美PRRSV分離株中，也可以使位于殘基30(圖5SEQIDNO:2、3、4、6、7、8、9、11、13中的"NAS，，)和殘基33(圖5SEQIDNO:3、8中的"NNS，，；SEQIDNO:6、10中的"NSS";SEQIDNO:11、13中的"NDS")處的其他N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)失活。換言之，位于相應(yīng)于SEQIDNO:1的參考GP5蛋白的殘基30和33的氨基酸位置處的在其他北美分離林中的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)也可以在本發(fā)明的方法中被失活和使用。不受理論限制，位于SEQIDNO:1的GP5參考蛋白的殘基29和35之間的PRRSVGP5蛋白的特定區(qū)域看起來是高變區(qū)(圖5)，其可以耐受各種不同的氨基酸序列(圖5;還參見Pirzadeh等人，Can.J.VetRes.，1998，62:170-177)。盡管某些天然存在的PRRSV分離林在這個(gè)區(qū)域中不包含N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)(即，SEQIDNO:5、12的北美分離株；SEQIDNO:15的歐洲分離株)，但其他分離林在這個(gè)區(qū)域中可以包含l-3個(gè)糖基化位點(diǎn)。因此，本文考慮了在位于SEQIDNO:1的GP5參考蛋白的殘基29和35之間的區(qū)域中給定GP5蛋白的任何一個(gè)糖基化位點(diǎn)的失活，作為用于引發(fā)針對(duì)PRRSVGP5蛋白的改善的免疫應(yīng)答的組合物或方法。此外，本文還考慮了在位于SEQIDNO:1的GP5參考蛋白的殘基29和35之間的區(qū)域中給定GP5蛋白的超過一個(gè)或所有糖基化位點(diǎn)的失活，作為用于引發(fā)針對(duì)PRRSVGP5蛋白的改善的免疫應(yīng)答的組合物或方法。北美和歐洲PRRSV序列的比對(duì)顯示，相應(yīng)于SEQIDNO:1的參考GP5蛋白的天冬酰胺51的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)也存在于代表性的歐洲PRRSV分離林中。在這種特定的情況下，N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)包含序列"NGT"，并且SEQIDNO:1參考序列的天冬酰胺51相應(yīng)于SEQIDNO:15的天冬酰胺53。這個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)可以通過用編碼其他氨基酸殘基例如谷氨酰胺或丙氨酸的密碼子置換在相應(yīng)的歐洲PRRSV多核苷酸序列中的天冬酰胺53來失活。在這些情況下，在低糖基化的歐洲PRRSVGP5蛋白變體中的相應(yīng)氨基酸序列將包含序列例如"QGT，，、"AGT"或"XGT"，其中X是除天冬酰胺外的任意氨基酸。其中相應(yīng)于天冬酰胺51的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活的歐洲PRRSV分離抹的這些或其他低糖基化的變體也可以與其中其他N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活的其他低糖基化的GP5變體相組合。低糖基化的GP5變體蛋白可以由PRRS病毒編碼，所述PRRS病毒可以用于制備活的、殺死的、或減毒的疫苗以用于保護(hù)豬不受PRRSV感染。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的低糖基化的GP5變體蛋白可以被改造成感染性PRRSV克隆，其能夠生產(chǎn)感染性PRRSVRNA。關(guān)于可以進(jìn)行改造以編碼低糖基化的GP5變體蛋白的感染性北美PRRSV克隆的描述在美國專利號(hào)6,500,662，Nielsen等人，J.Virol.77:3702-11，2003，和Truong等人，Virology325:》08-19,2004中找到?？梢赃M(jìn)行誘變以獲得用于在疫苗中使用的PRRSV病毒的北美PRRSV感染性克隆序列包括但不限于，北美毒林NVSL97-7895(SEQIDNO:16)和毒林VR-2332(SEQIDNO:17)。關(guān)于可以進(jìn)行改造以編碼低糖基化的GP5變體蛋白的感染性歐洲PRRSV克隆的描述在美國專利號(hào)6,268,199中找到。在其中疫苗包含活的或減毒的PRRSV的實(shí)施方案中，相應(yīng)于在SEQIDN0:1的參考GP5蛋白中的N44的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)(即，圖5和6中的"NLT"序列)不被失活，因?yàn)檫@個(gè)位點(diǎn)的糖基化是PRRSV的感染性所必需的。在歐洲PRRSV分離抹的情況下，相應(yīng)于在SEQIDNO:1的參考GP5蛋白中的N44的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)是NLT序列，其從代表性的歐洲PRRSV毒林Lelystad(SEQIDNO:15;圖6)的天冬酰胺46開始。歐洲PRRSV毒林的N46N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)也是感染性所必需的，并且在其中使用活的或減毒的PRRSV疫苗的本發(fā)明實(shí)施方案中不被失活。備選地，低糖基化的GP5變體蛋白可以與DNA疫苗一起引入豬內(nèi)。此類DNA疫苗通常包含這樣的DNA分子，其中在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有活性的啟動(dòng)子與編碼所述低糖基化的PRRSVGP5多肽變體的所述多核苷酸有效地連接?？梢杂糜隍?qū)動(dòng)低糖基化的GP5變體蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子包括但不限于，CMV(巨細(xì)胞病毒)即時(shí)早期啟動(dòng)子、RSV(勞斯肉瘤病毒)長末端重復(fù)啟動(dòng)子和SV40(猿猴病毒40)T-抗原啟動(dòng)子。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，這種啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子。在另外其他的實(shí)施方案中，表達(dá)低糖基化的GP5變體蛋白的分離的多核苷酸包括除PRRSV外的病毒栽體。除PRRSV外的病毒載體包括但不限于，痘苗病毒載體、單純皰療病毒栽體、腺病毒載體、甲病毒載體和TGEV載體。此類載體在各種出版物例如美國專利號(hào)7，041，300(關(guān)于TGEV載體)和6，692，750(關(guān)于甲病毒載體)中得到描述。治療上可接受的承載體和佐劑在本發(fā)明的實(shí)踐中，低糖基化的GP5變體多肽或編碼低糖基化的GP5變體多肽的多核苷酸可以與治療上可接受的承載體或賦形劑相組合。此類承栽體的非限制性例子包括生理鹽水或其他類似的鹽水溶液，蛋白質(zhì)例如血清白蛋白，緩沖液例如基于碳酸鹽、磷酸鹽、膦酸鹽或Tris的緩沖液，表面活性劑例如NP40或TritonX100,和聚乙二醇聚合物。此類承載體的任何組合可以在本發(fā)明的組合物和方法中使用。用于包含活的或減毒的PRRSV病毒的組合物的優(yōu)選承栽體是濃度為50—100mg/ml的dl-a-生育酚乙酸酯。還考慮了在包含低糖基化的GP5變體多肽或編碼低糖基化的GP5變體多肽的多核苷酸的組合物中使用佐劑。此類佐劑通常在性質(zhì)上是是水性或油性的?？梢允褂玫淖魟┌ǖ幌抻冢瑲溲趸X、QuilA、氧化鋁凝膠懸浮液、礦物油、甘油酯、脂肪酸、脂肪酸副產(chǎn)物、分枝桿菌和CpG寡脫氧核苷酸，或其任何組合?？梢允褂玫母鞣N類型的CpG佐劑在美國專利號(hào)6，977，245和6,406,705中得到描述。還考慮了使用加強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答的其他佐劑(即，T輔助細(xì)胞(Th.sub.1和Th.sub.2)亞群增強(qiáng)劑)。此類佐劑包括但不限于，白介素1(IL-1)、IL-2、IL4、IL-5、IL6、IL-12、y千擾素(g-IFN)、細(xì)胞壞死因子、MDP(胞壁酰二肽)、免疫刺激復(fù)合物(ISC0M)和脂質(zhì)體。組合物的施用可以通過皮下注射、靜脈內(nèi)注射、皮內(nèi)注射、腸胃外注射、肌內(nèi)注射、無針注射、電穿孔、口服遞送、鼻內(nèi)遞送、口鼻遞送、或其任何組合來完成。無針注射通常用裝置例如Agro-Jet⑧注射器(MedicalInternationalTechnologies,Montreal,Canada)來實(shí)現(xiàn)。實(shí)施例實(shí)施例1.下列實(shí)施例舉例說明了編碼各種低糖基化的北美PRRSVGP5多肽變體的各種PRRSV多核苷酸的構(gòu)建，用于引發(fā)針對(duì)PRRSV抗原的改善的免疫應(yīng)答的包括此類多核苷酸的組合物，以及使用所述多核苷酸和組合物在豬中引發(fā)針對(duì)PRRSV抗原的改善的免疫應(yīng)答的方法。材料和方法細(xì)胞、培養(yǎng)基和抗體。MARC-145細(xì)胞在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中進(jìn)行繁殖，所述DMEM包含10%胎牛血清(FBS)以及100個(gè)單位的青霉素、20個(gè)單位的鏈霉素和20個(gè)單位的卡那霉素/ml生長培養(yǎng)基。這些細(xì)胞用于RNA電穿孔、病毒感染、病毒生長和噬斑測定法。將幼倉鼠腎(BHK-21)細(xì)胞在含有Earl鹽的極限必需培養(yǎng)基(MEM)中維持，所述MEM包含5%FBS和上述抗生素。BHK-21細(xì)胞用于GP5的瞬時(shí)表達(dá)，隨后為免疫熒光測定法(IFA)或放射性標(biāo)記和免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。所有細(xì)胞維持于37C和5%C02的環(huán)境中。針對(duì)PRRSVGP5和M蛋白質(zhì)的兔多克隆抗體由CarlA.Gagnon(UniversUyofQuebec,Montreal,Canada)友情提供。針對(duì)核衣殼蛋白(N)的單克隆抗體(S廳17)購自NationalVeterinaryServicesLaboratories(NVSL,Ames，IA,USA)?？剐∈驛lexa-488得自MolecularProbes,Inc.(Eugene,Oregon,USA)。編碼GP5和PRRSV感染性克隆的質(zhì)粒的遺傳操作用EcoRV和BstZ17I限制酶消化在pBR322中的全長PRRSV感染性cDNA克隆(FL12;SEQIDNO:16),并且使用相同的酶位點(diǎn)在pBR322中克隆包含PRRSV的0RF2的大部分、全部0RF3-7和完整3'UTR的~4.9kbp片段。這種中間質(zhì)粒充當(dāng)用于誘變的模板，以在GP5內(nèi)的潛在的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)(N34、N44和N51)處引入突變(圖2)。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，使用合成引物(表2)通過重疊延伸PCR進(jìn)行誘變。表2.在這項(xiàng)研究中使用的引物及其序列。加下劃線的密碼子序列指明了突變的位點(diǎn)。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>用BsrGI和BstEII限制酶消化PCR產(chǎn)物并放回到中間質(zhì)粒中。通過測序鑒定并驗(yàn)實(shí)包含所需突變的克隆。對(duì)GP5的完整編碼區(qū)進(jìn)行測序以確定所述克隆中不存在另外的突變。使用相同的限制酶位點(diǎn)將來自在GP5編碼區(qū)中包含突變的中間質(zhì)粒的EcoRV-PacI片段移回到全長cDNA克隆中。用PRRSV特異性的內(nèi)部引物再次測序在全長克隆中的GP5編碼區(qū)，以證實(shí)突變的存在。將wtGP5和獨(dú)個(gè)突變體克隆入雙順反子載體中，其中GP5是第一個(gè)順反子，隨后為腦心肌炎病毒(EMCV)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)和M編碼序列(圖1A)。還將全長GP5克隆入CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的栽體(pcDNA3.0，ClonteohLaboratories,Inc.，MountainView,CA，USA)中以用于互補(bǔ)作用研究。為此，將GP5編碼區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆和測序。體外轉(zhuǎn)錄和電穿孔用Acll消化全長質(zhì)粒，并4吏用mMESSAGEmMACHINEUltraT7試劑盒按照制造商(Ambion，Inc.,Austin,Tx，USA)的建議以及如先前所述，將線性化的DNA用作模板以產(chǎn)生加帽的RM轉(zhuǎn)錄物。用DM酶I處理反應(yīng)混合物以消化DNA模板，并用苯酚和氯仿進(jìn)行提取，并且最后用異丙醇進(jìn)行沉淀。通過下列過程來分析體外轉(zhuǎn)錄物的完整性乙二醛瓊脂糖凝膠電泳，隨后為溴化乙錠染色。用約5.0pg體外轉(zhuǎn)錄物連同5.0jtg從MARC-145細(xì)胞中分離的總RNA—起對(duì)MARC-145細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。使用Bio-RadGenePulserXcell(Bio-Rad，Inc.，Hercules，CA，USA)，以250V、950juF，在4.Omm杯池中，將在400pl包含1.25%DMSO的DMEM中的約2xl06細(xì)胞脈沖1次。在正常生長培養(yǎng)基中稀釋細(xì)胞，在60-mm細(xì)胞培養(yǎng)板中鋪板。將小部分的經(jīng)電穿孔的細(xì)胞在24孔平板中進(jìn)行鋪板，以在電穿孔后48小時(shí)時(shí)檢查N蛋白的表達(dá)，這將指明基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。一旦使用間接免疫熒光測定法(IFA)證實(shí)了N蛋白的表達(dá)后，在電穿孔后48小時(shí)收集來自在60-mm平板中的大量經(jīng)電穿孔的細(xì)胞的上清液，進(jìn)行澄清，并在首次用于實(shí)驗(yàn)的MARC-145細(xì)胞上傳代。使用IFA就致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)以及N蛋白的表達(dá)來觀察受感染的細(xì)胞。來自顯示出CPE和陽性熒光的受感染細(xì)胞的上清液被歸屬為包含感染性病毒。在證實(shí)后，培養(yǎng)病毒原種并以小的等分試樣冷凍于-80X:以用于進(jìn)一步的研究。在所有實(shí)驗(yàn)中，包含wtPRRSV基因組的FL12和包含聚合酶缺陷型PRRSV基因組的FL12po1用作對(duì)照。蛋白質(zhì)的代謝放射性標(biāo)記和分析用MOI為3.0的重組痘苗病毒(vTF7-3)感染在6孔平板中的BHK-21細(xì)胞，并隨后用在T7RNA聚合酶啟動(dòng)子下的編碼wt或各種突變型GP5的雙順反子質(zhì)粒DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用Lipofectamine2000按照制造商的方案(LifeTechnologies,USA)進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后16小時(shí)，細(xì)胞用PBS洗滌2次，并且在無甲硫氨酸/半胱氨酸的DMEM中饑餓1小時(shí)，并用包含100pCiExpre35S35SProteinLabelingMix(NENLifeSciences,Boston,MA)/ml培養(yǎng)基的0.6ml無曱硫氨酸/半胱氨酸的DMEM放射性標(biāo)記3小時(shí)。在放射性標(biāo)記后，細(xì)胞在冷PBS中洗滌3次，并在300pi放射免疫沉淀測定法(RIPA)緩沖液(10mMTris-HC1pH8.0、150mMNaCl、1%TritonX-100、0.1%SDS、1%脫氧膽酸鈉和lx蛋白酶抑制劑)中制備細(xì)胞提取物。將經(jīng)澄清的細(xì)胞提取物于40。C與兔抗-GP5或抗-M蛋白抗體一起孵育過夜。添加在100piRIPA緩沖液中的約4.0mg蛋白Asepharose(Pharmacia,Uppsala,Sweden)的漿狀物，并進(jìn)一步孵育2小時(shí)。經(jīng)免疫沉淀的復(fù)合物用500piRIPA緩沖液洗滌3次并用于進(jìn)一步的分析。對(duì)于內(nèi)切糖苷酶H(EndoH)處理，將經(jīng)免疫沉淀的復(fù)合物重懸浮于20pilx變性緩沖液(O.5%SDS、1.0%巰基乙醇)中并煮沸1Q分鐘。收集上清液，調(diào)整至lxG5緩沖液(Q.05M檸檬酸鈉，pH5.5)，并與IOO個(gè)單位的EndoH(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA，USA)—起于37X:孵育16小時(shí)。類似地加工未消化的對(duì)照樣品，但不添加EndoH。在EndoH消化后，使樣品與等體積的2xSDS-PAGE樣品緩沖液相混合，煮沸5分鐘，并在變性條件下與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(ProteinPlusPrecisionStandard,Bio-Rad，Inc)—起通過SDS-12%PAGE進(jìn)行解析。凝膠用10%乙酸固定15分鐘，用水洗滌3次，用0.5M水楊酸鈉處理30分鐘，干燥，并最終于-7(TC暴露于X光片。對(duì)于肽N-糖苷酶F(PNGaseF)(NewEnglandBiolabs，Inc)消化，將經(jīng)免疫沉淀的復(fù)合物重懸浮于lxG7緩沖液(0.05M磷酸鈉pH7.5,1.0%NP-40)中，并通過于37'C與2個(gè)單位的該酶一起孵育16小時(shí)來進(jìn)行消化。為了檢查在衣霉素(Sigma，St.Louis，MO)存在下的GP5合成，將經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用2.0衣霉素/ml培養(yǎng)基處理1小時(shí)，并如上所述在該藥物存在下進(jìn)行3小時(shí)的放射性標(biāo)記。為了獲得經(jīng)》文射性標(biāo)記的由細(xì)胞外病毒粒子或細(xì)胞內(nèi)病毒表達(dá)的GP5,用wt或突變體PRRSV感染MARC-145細(xì)胞。在感染后48小時(shí)，4吏細(xì)胞饑餓1小時(shí)，并用100]iiCiExpre35S35SProteinLabelingMix/ml培養(yǎng)基放射性標(biāo)記24小時(shí)，所述培養(yǎng)基包含90%無甲硫氨酸/半胱氨酸的DMEM和10%常規(guī)的DMEM。在進(jìn)4亍標(biāo)記后，收獲培養(yǎng)物上清液，清除細(xì)胞碎片，并于4x:在ioo，oooxg下使細(xì)胞外病毒粒子形成粒狀沉淀3小時(shí)。將病毒粒狀沉淀重懸浮于200^1RIPA緩沖液中，用抗-GP5抗體進(jìn)行免疫沉淀，并使用或不使用EndoH處理來檢查所述蛋白質(zhì)。對(duì)于由細(xì)胞內(nèi)病毒表達(dá)的GP5的免疫沉淀，如上所述進(jìn)行感染，并在感染后24小時(shí)，使細(xì)胞饑餓1小時(shí)，在制備細(xì)胞提取物之前如上所述進(jìn)行2小時(shí)的放射性標(biāo)記。病毒生長動(dòng)力學(xué)和噬斑測定法用MOI為3.OPFU/細(xì)胞的突變體或wtPRRSV感染MARC-145細(xì)胞，并于37'C在孵育箱中進(jìn)行孵育。在感染后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，收集來自受感染細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液的等分試樣，并且測定上清液中的病毒滴度并表示為組織培養(yǎng)感染量50/ml(TCID50/ml)。進(jìn)行3次病毒生長動(dòng)力學(xué)。為了檢查突變體病毒的噬斑形態(tài)，使用MARC-145細(xì)胞來進(jìn)行噬斑測定法。細(xì)胞用10倍系列稀釋的獨(dú)個(gè)病毒于37。C感染1小時(shí)。受感染的細(xì)胞單層用PBS洗滌，并用包含0.8%Seaplaque瓊脂糖(度Bioproducts,Rockland,MEUSA)的DMEM-5%FBS覆蓋。96小時(shí)后，去除瓊脂糖塞子，并使細(xì)胞單層與染色溶液(20%甲醛、9.0%乙醇和0.1%結(jié)晶紫)一起于室溫孵育30分鐘。細(xì)胞用水輕輕洗滌以去除過量染料，并風(fēng)干，以檢查和計(jì)數(shù)噬斑。通過反式表達(dá)wtGP5對(duì)于病毒回收的互補(bǔ)(complementation)用pcDNA-GP5轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后40小時(shí)，收獲細(xì)胞，并與衍生自編碼突變型GP5的全長PRRSVcDNA的加帽的體外轉(zhuǎn)錄物一起進(jìn)行電穿孔。用新鮮培養(yǎng)基稀釋經(jīng)電穿孔的細(xì)胞，并在6孔平板中鋪板。在電穿孔后48小時(shí)收集來自經(jīng)電穿孔的細(xì)胞的上清液，離心以去除細(xì)胞碎片，并用于感染首次用于實(shí)驗(yàn)的MARC-145細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，如上所述通過IFA就N蛋白的來表達(dá)檢查受感染的MARC-145細(xì)胞。計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞的數(shù)目以確定在上清液中產(chǎn)生的假顆粒(pseudo-particles)的數(shù)目。由3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)計(jì)算陽性細(xì)胞的平均數(shù)目，并呈現(xiàn)為轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)的每微克體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)生的假顆粒數(shù)目。血清中和(SN)測定法4吏用先前描述的熒光病灶中和測定法(fluorescencefocusneutralizationassay)測定血清樣品中的PRRSV中和抗體的滴度。在200TCID50的攻擊病毒存在下將系列稀釋的測試血清在包含5%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基中于37。C孵育60分鐘，所述攻擊病毒由FL12(wtPRRSV)或者編碼GP5突變體的病毒FL-N34A、FL-N51A和FL-N34/51A中的任何一種組成。將混合物加入至包含匯合的MARC-145細(xì)胞的96孔微量滴定板中，所述MARC-145細(xì)胞先前已播種了48小時(shí)。于37。C在包含5。/。C02的增濕氣氛中孵育24小時(shí)后，細(xì)胞用50%甲醇和50%丙酮的溶液固定10分鐘。用PBS充分洗滌后，通過如下方式來檢測PRRSV的N蛋白的表達(dá)以l:500的稀釋度用單克隆抗體SD0W17,隨后與1:100稀釋度的綴合有FITC的山羊抗小鼠IgG(Sigma，St.Louis，MO，USA)—起孵育。中和滴度表示為抑制90%存在于對(duì)照孔中的病灶的最高稀釋度的倒數(shù)。用GP5突變體和wtPRRSV進(jìn)行的豬的實(shí)驗(yàn)性接種將GP5突變體病毒(FL-N34A、FL-N51A和FL-N34/51A)和FL12(wtPRRSV)的高滴度原種(通過在MARC145細(xì)胞中傳代3次獲得)用于感染年幼的豬。21日齡的最近斷奶的豬購自具有不存在PRRSV感染的證明記錄的無特定病原體的獸群。如通過ELISA(IddexLabs，Portland,ME)所測試的，所有動(dòng)物對(duì)于抗PRRSV抗體是陰性的。每組3只豬用FL12wtPRRSV或突變體FL-N34A、FL-N51A和FL-N34/51A進(jìn)行感染。在所有情況下，接種物由在2ml中稀釋的105TICD50組成，并在頸中通過肌內(nèi)施用。接種后(PI)15天監(jiān)控經(jīng)接種的動(dòng)物的直腸溫度。在接種后第4、7和14天時(shí)通過在MARC145細(xì)胞上的常規(guī)分離來測量病毒血癥。每周抽取一次血清樣品，共接種后49天的時(shí)間段。血清樣品用于檢測關(guān)于每種突變體和wtPRRSV的同源和異源交叉中和滴度。結(jié)果PRRSVGP5的表達(dá)和表征PRRSV毒株97-7895的GP5具有3個(gè)推定的糖基化位點(diǎn)(N34、N44和N51)。為了檢查GP5的糖基化模式，首先產(chǎn)生了這樣的雙順反子載體，其中將位于來自EMCV的IRES的側(cè)翼的GP5和M蛋白編碼區(qū)置于T7RNA聚合酶啟動(dòng)子的控制下(圖1A)。關(guān)于構(gòu)建所述雙順反子載體的基本原理是，GP5和M蛋白已知(對(duì)于LDV和EAV)或假定(對(duì)于PRRSV)彼此相互作用，并且此類相互作用可能對(duì)于GP5的蛋白質(zhì)折疊、糖基化、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和/或其他生物活性是重要的。通過所述雙順反子質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染來瞬時(shí)表達(dá)GP5和M,隨后為放射性標(biāo)記和用抗GP5抗體的免疫沉淀，這揭示了2個(gè)主要的蛋白質(zhì)種類。以~25.5kDa的質(zhì)量遷移的蛋白質(zhì)種類是GP5的完全糖基化形式(圖1B，泳道2)。因?yàn)槊總€(gè)N-聯(lián)糖基化給蛋白質(zhì)添加2.5kDa的分子量，所以這指表明所有3個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)可能用于GP5的糖基化。19.0kDa的蛋白質(zhì)種類是病毒的M蛋白，因?yàn)樗€被抗M抗體免疫沉淀(泳道7)。所述結(jié)果表明，GP5和M蛋白在表達(dá)這2種蛋白質(zhì)的細(xì)胞中彼此相互作用。在用去除高甘露糖類型的寡糖鏈的酶EndoH處理后，GP5的大小減少為~18kDa，而M蛋白的大小保持不變(泳道3)。用從蛋白質(zhì)主鏈上去除所有類型的糖的酶PNGaseF處理GP5(泳道4),或者在衣霉素存在下合成GP5(泳道5)導(dǎo)致比用Endo-H處理的蛋白質(zhì)略微更快的電泳遷移率進(jìn)行遷移的蛋白質(zhì)。這是預(yù)料之中的，因?yàn)橐旅顾靥幚砘蛴肞NGaseF消化將產(chǎn)生未糖基化的蛋白質(zhì)，而Endo-H處理將導(dǎo)致在每個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)處保留N-乙酰葡糖胺殘基的蛋白質(zhì)。應(yīng)當(dāng)指出，用抗M抗體免疫沉淀出了30kDa分子量的顯著蛋白質(zhì)種類。這種蛋白質(zhì)的身份是未知的，但它可能是與M蛋白相互作用的細(xì)胞蛋白質(zhì)。'來自上文研究的結(jié)果暗示，未糖基化和完全糖基化形式的GP5分別具有18.0kDa和25.5kDa的表觀分子大小?？雌饋硭?個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)均用于產(chǎn)生完全糖基化形式的GP5。添加至這些位點(diǎn)的聚糖部分是高甘露糖類型的，因?yàn)樗鼈儗?duì)于經(jīng)由EndoH的消化敏感。此外，所述結(jié)果表明，未糖基化和完全糖基化形式的GP5看起來均與M蛋白相互作用。用于GP5的糖基化的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)的分析為了更精確地確定所有還是一些在GP5中的潛在N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)用于糖部分的添加，在雙順反子質(zhì)粒中產(chǎn)生一系列突變體，其中所有3個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)N34、N44和N51(圖2A)個(gè)別地或以各種組合被改變成丙氨酸(圖2B)。在經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行放射性標(biāo)記并用抗GP5抗體進(jìn)行免疫沉淀。免疫復(fù)合物不進(jìn)行處理或用EndoH進(jìn)行處理并通過SDS-PAGE進(jìn)行檢查。如由圖2C中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)可見的，攜帶單個(gè)突變(N34A、N44A或N51A)的突變型GP5蛋白作為約23.OkDa的蛋白質(zhì)種類進(jìn)行遷移(泳道4、6和8，箭頭)。EndoH處理后，這些蛋白質(zhì)作為~18.0kDa的蛋白質(zhì)種類進(jìn)行遷移(分別為泳道5、7和9)，其類似于EndoH處理后的wtGP5(泳道3)。所述蛋白質(zhì)的電泳遷移率的較小差異最可能反映了下述事實(shí)與將包含2個(gè)此類殘基的單重突變體相比較，在EndoH處理后wt蛋白質(zhì)將保留所有3個(gè)N-乙酰葡糖胺殘基。雙重突變體(N34/44A、N44/51A和N34/51A)產(chǎn)生以接近于~20.5kDa蛋白質(zhì)進(jìn)行遷移的蛋白質(zhì)種類(泳道10、12和14)，并且在EndoH處理后，所述蛋白質(zhì)的大小減少為18.0kDa(泳道11、13和15)。三重突變體(N34/44/51A)產(chǎn)生作為18.0kDa蛋白質(zhì)進(jìn)行遷移(泳道16)并且對(duì)于EndoH消化具有抗性(泳道17)的蛋白質(zhì)。因此，根據(jù)上述突變研究，顯而易見的是，所有3個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)用于糖基化以產(chǎn)生完全成熟的PRRSVGP5?？雌饋硭?個(gè)糖基化位點(diǎn)通過高甘露糖類型的聚糖部分進(jìn)行修飾。具有GP5突變體的感染性PRRSV病毒的回收為了評(píng)估N-聯(lián)糖基化在感染性PRRSV的產(chǎn)生中的重要性，將突變型GP5蛋白的編碼區(qū)插入全長cDNA克隆中。將從該克隆產(chǎn)生的加帽的體外轉(zhuǎn)錄物電穿孔到MARC-145細(xì)胞中，并檢查感染性PRRSV的產(chǎn)生。我們的結(jié)果顯示，從用在N34、N51和N34/51處包含突變的全長轉(zhuǎn)錄物電穿孔的細(xì)胞中容易地回收到感染性病毒。然而，在類似的病毒回收條件下，回收其他突變體病毒的重復(fù)嘗試是不成功的。盡管回收的病毒的生長動(dòng)力學(xué)類似于wt病毒，但在N34和N51處包含突變的FL-N34A和FL-N51A病毒的總得率在MARC-145細(xì)胞中低大約l個(gè)對(duì)數(shù)，而具有雙重突變(N34/51A)的FL-N34/51A的總得率比wtPRRSV低幾乎1.5個(gè)對(duì)數(shù)(圖3A)。來自受感染細(xì)胞的RNA的RT-PCR擴(kuò)增，隨后進(jìn)行核苷酸測序，表明這些病毒是穩(wěn)定的，包含所需突變，并且在完整的GP5區(qū)域中沒有檢測到其他突變(數(shù)據(jù)未顯示)。在MARC-145細(xì)胞上進(jìn)行病毒噬斑測定法，以監(jiān)控突變體病毒的噬斑表型。由wtPRRSV產(chǎn)生的噬斑是清晰且明顯的，而突變體病毒產(chǎn)生具有不同表型的噬斑。FL-N34A、FL-N51A和FL-N34/51A病毒產(chǎn)生較不明顯的噬斑，并且噬斑內(nèi)的許多細(xì)胞看起來是正常的(圖3B，空心箭頭)。此外，F(xiàn)L-N51A、FL-N34/51A產(chǎn)生其中病毒不能清除細(xì)胞單層的某些噬斑(圖3B，實(shí)心箭頭)。這些數(shù)據(jù)指出，與wtPRRSV相比較，回收的突變體病毒實(shí)際上具有較低的致細(xì)胞病變性。因?yàn)槲覀儾荒芑厥站哂型蛔凅w模板FL-N44A、FL-N31/44A、FL-N44/51A和FL-N31/44/51A的感染性PRRSV,所以GP5編碼區(qū)中的突變可能影響RNA模板的某些其他功能，例如基因組RNA包裝成顆粒。為了解決這點(diǎn)，我們檢查了反式表達(dá)wtGP5的細(xì)胞是否能夠支持突變型RM模板的包裝，所迷突變型RM模板在產(chǎn)生感染性PRRSV方面具有其他方面的缺陷。將經(jīng)pcDNA-GP5轉(zhuǎn)染的BHK-21細(xì)胞用體外轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行電穿孔，并且在電穿孔后48小時(shí)，收集培養(yǎng)物上清液并用于感染首次用于實(shí)驗(yàn)的MARC-145細(xì)胞以確定PRRSV假顆粒的產(chǎn)生。如果產(chǎn)生了假顆粒，那么就可以預(yù)期在這些受感染的MARC-145細(xì)胞中觀察到N蛋白的表達(dá)。只有當(dāng)首次用于實(shí)驗(yàn)的MARC-145細(xì)胞接受全長殼體化的突變型RM基掛組時(shí)，N的表達(dá)才是可能的，所述突變型RNA基因組—在假顆粒進(jìn)入細(xì)胞中后開始復(fù)制。在先前不能被回收的所有突變體中，我們能夠回收包含2種突變型全長基因組(FL-N44A和FL-N34/44A)的假顆粒(圖3C)。受突變體病毒感染的培養(yǎng)物中每個(gè)發(fā)綠色熒光的細(xì)胞代表一個(gè)感染性假顆粒。因?yàn)檫@些顆粒在包膜上只包含功能性wtGP5,但在基因組中包含非功能性突變型GP5的編碼序列，所以它們不能產(chǎn)生感染性顆粒以散布至周圍細(xì)胞?；厥站哂衅渌蛔冃湍０?FL-N44/51A和FL-N31/44/51A)的假感染性顆粒的多重嘗試是不成功的。從這些實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的感染性假顆粒數(shù)目的定量評(píng)估暗示，電穿孔到細(xì)胞內(nèi)的每微克突變型RNA產(chǎn)生約1000個(gè)顆粒(圖3D)。這比用編碼wtGP5的RNA獲得的那種小約100倍。如此低水平的感染性假顆粒的產(chǎn)生可能是由于下述事實(shí)如通過在這些細(xì)胞中的N蛋白表達(dá)可見的，只有約5-10。/。的表達(dá)wtGP5的細(xì)胞接受了全長轉(zhuǎn)錄物。還可能的是，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中wtGP5的低水平表達(dá)可能促成了這些假病毒粒子的低水平產(chǎn)生。摻入突變體病毒內(nèi)的GP5和在受感染細(xì)胞中表達(dá)的GP5的檢查為了確定摻入從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn)生的感染性病毒粒子中的GP5蛋白的性質(zhì)，我們從用wt和突變體病毒感染的細(xì)胞中產(chǎn)生了經(jīng)放射性標(biāo)記的PRRSV。通過超速離心使培養(yǎng)物上清液中存在的細(xì)胞外病毒粒子形成粒狀沉淀，并且使用抗GP5抗體通過免疫沉淀和后續(xù)的電泳分析來檢查在這些病毒粒子中存在的GP5。結(jié)果顯示，摻入病毒粒子中的wtGP5作為~25-27kDa的蛋白質(zhì)種類的寬闊地?cái)U(kuò)散的條帶進(jìn)行遷移(圖4A，泳道l)，其對(duì)于EndoH消化具有部分抗性(泳道2)。摻入病毒粒子中的突變型GP5(N34A和N51A)對(duì)于EndoH敏感?；谠贓ndoH消化后產(chǎn)生的產(chǎn)物的大小，看起來這些單位點(diǎn)突變體中只有1個(gè)聚糖部分是敏感的，而其他的是具有抗性的。相反地，雙重突變體GP5(N43/51A)對(duì)于EndoH具有抗性。此外，來自突變體病毒的GP5的EndoH消化也產(chǎn)生非常少量的GP5蛋白主鏈，這表明這些病毒摻入了包含EndoH抗性的以及EndoH敏感的聚糖部分的GP5蛋白。因?yàn)樵谟秒p順反子載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，wt以及突變型GP蛋白完全是EndoH敏感的(圖1和2)，所以我們對(duì)于在PRRS病毒粒子上的GP5大部分包含EndoH抗性形式的觀察結(jié)果感到驚訝。為了檢查EndoH抗性形式的蛋白質(zhì)是否也在受感染細(xì)胞中合成，對(duì)用wt或突變型PRRSV感染的MARC-145細(xì)胞進(jìn)行放射性標(biāo)記，用抗GP5抗體來免疫沉淀GP蛋白，并采用或不采用EndoH消化通過電泳進(jìn)行分析。此類實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于圖4B中。大多數(shù)wtGP5在所有3個(gè)位點(diǎn)處包含EndoH抗性聚糖(泳道2和3)，而2種單重突變體僅在1個(gè)位點(diǎn)處包含EndoH抗性聚糖(泳道4-7)。雙重突變體中的某些聚糖部分是有抗性的，而其他的對(duì)EndoH敏感(泳道8和9)。盡管EndoH抗性模式類似于對(duì)于病毒粒子相關(guān)GP5所觀察到的那種，但它不同于在表達(dá)GP5和M蛋白的細(xì)胞中觀察到的那種(圖1和2)。這些結(jié)果表明，其他病毒蛋白質(zhì)可能在GP5上的聚糖的進(jìn)一步修飾中起作用。GP5的低糖基化對(duì)于PRRSV被特異性抗體中和的能力的影響。參與與病毒受體的相互作用的病毒糖蛋白的糖基化水平已知影響病毒粒子與病毒中和抗體反應(yīng)的能力。為了測試這種現(xiàn)象是否在PRRSV的情況下發(fā)生，將具有改變的糖基化模式的PRRSVGP5突變體(FL-N34A、FL-N51A和FL-N34/51A)與PRRSVwt(FL12)在它們被恢復(fù)期抗血清中和的能力方面進(jìn)行比較。對(duì)于這點(diǎn)，我們使用來自已用wtPRRSV感染的4只動(dòng)物的恢復(fù)期抗血清(感染后47天)。類似劑量(2，000TCID50)的感染性PRRSVGP5突變體(FL-N34A、FL-N51A和FL-N34/51A)以及感染性克隆衍生的wtPRRSV(FL12)在根據(jù)我們的標(biāo)準(zhǔn)測定法規(guī)程施行的血清中和測定法中用作攻擊病毒，并且4種抗wtPRRSV(FL12)血清的組用作參考。表3顯示了獲得的不同的終末點(diǎn)血清中和滴度。通常，在感染后47-54天收集的PRRSVwt-恢復(fù)期血清樣品包含中等水平的wtPRRSV中和活性(1:8-1:32，表3和4)，這反映了中和抗體應(yīng)答相對(duì)較弱和緩慢的特征，這是被wtPRRSV感染的典型特征。然而，低糖基化的PRRSV突變體(其在GP5膜外結(jié)構(gòu)域上缺乏1個(gè)或2個(gè)聚糖部分)在SN測定法中用作攻擊病毒似乎顯著增強(qiáng)了參考血清的終末點(diǎn)，其中終末點(diǎn)滴度增強(qiáng)為6-22倍(表3)。這個(gè)觀察結(jié)果清楚地暗示，1個(gè)且特別是2個(gè)聚糖部分的去除增加了中和表位對(duì)特異性抗體的易接近性。這些結(jié)果看起來表明，在受wtPRRSV感染的恢復(fù)期血清中存在大量的PRRSV中和抗體，所述中和抗體是以其他方式無法檢測的，因?yàn)樵赟N測定法中通常使用包含完全糖基化的GP5的wtPRRSV。表3.PRRSVGP5的糖基化模式的改變對(duì)于感染性病毒粒子與中和抗體反應(yīng)的能力的影響。<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表3中的數(shù)字相應(yīng)于顯示中和的終末點(diǎn)稀釋度的倒數(shù)(SN終末點(diǎn))。GP5的低糖基化對(duì)于PRRSV在體內(nèi)誘導(dǎo)中和抗體的能力的影響已報(bào)道了一種顯著影響，其中從病毒包膜糖蛋白中去除碳水化合物導(dǎo)致產(chǎn)生高滴度的針對(duì)突變體病毒的中和抗體，當(dāng)這種突變體用于體內(nèi)接種宿主時(shí)；在某些情況下還誘導(dǎo)比wt病毒自身更高滴度的針對(duì)wt病毒的抗體。我們用相同劑量的wtPRRSVFL12或具有改變的糖基化模式的每種突變體感染了豬群體。有趣的是，在感染后4、7和10天通過評(píng)估直腸溫度和評(píng)估病毒血癥來進(jìn)行的對(duì)于感染的臨床/病毒學(xué)評(píng)估表明，在所有群體中具有與先前對(duì)于FL12所描述的類似的感染模式，對(duì)于任一突變體沒有毒力減弱或加重的證據(jù)(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，在48天的時(shí)間段過程中^這些動(dòng)物中對(duì)血清順次取樣表明了wtPRRSV和突變體之間在它們的誘導(dǎo)PRRSV中和抗體應(yīng)答的動(dòng)力學(xué)方面的顯著差異(表4A和4B)。突變體發(fā)展出早期的且比由wtPRRSV發(fā)展出的那種更強(qiáng)的同源中和抗體應(yīng)答，至在突變體的情況下PRRSV中和抗體應(yīng)答的特征性地遲緩且不足的性質(zhì)看起來已被校正的程度(表4B)。突變體-同源的中和抗體的表觀的動(dòng)力學(xué)(表4B)表明更規(guī)則的中和抗體血清轉(zhuǎn)化，這與對(duì)于其他病毒感染例如流感或偽狂犬病病毒但不是對(duì)于PRRSV所描述的相一致。最重要的是下述事實(shí)用GP5糖基化突變體進(jìn)行感染誘導(dǎo)了wtPRRSV特異性中和抗體應(yīng)答，其顯著高于使用wtPRRSV自身時(shí)的應(yīng)答。突變體病毒FL-N3U和FL-NS1A誘導(dǎo)了為wtPRRSV自身水平的5倍(p<0.05)的針對(duì)wtPRRSV的中和抗體滴度水平，而突變體FL-N34/51誘導(dǎo)了為wtPRRSV自身水平的6倍(p<0.01)的wtPRRSV中和抗體滴度水平(表4B)。表4.PRRSVGP5的糖基化模式的改變對(duì)于PRRSV毒林誘導(dǎo)針對(duì)wtPRRSV的中和抗體(4A)或感染同源毒林(4B)的能力的影響(*)表4A和B中的數(shù)字相應(yīng)于所述組(n=3)的SN終末點(diǎn)的幾何平均值。用下列感染的組<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>表4A用下列感染的組在不同的感染后時(shí)間段針對(duì)同源感染性毒抹的終末點(diǎn)滴度<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>表4B討論在本研究中，我們檢查了PRRSV的GP5的糖基化在回收感染性病毒中的影響，其在突變體病毒被抗體中和的能力以及在體內(nèi)誘導(dǎo)中和抗體中的作用。我們發(fā)現(xiàn)GP5中所有3個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)(N34、N44和N51)被用于聚糖部分的添加。我們的結(jié)果揭示出，在N44位點(diǎn)處的聚糖添加對(duì)子回收感染性病毒是最關(guān)鍵的。此外，我們的結(jié)果顯示出，包含低糖基化形式的GP5的PRRSV對(duì)于經(jīng)由抗體的中和極度敏感，并且突變體病毒誘導(dǎo)顯著更高水平的不僅針對(duì)同源突變體病毒而且還針對(duì)wtPRRSV的中和抗體。通過使用在單個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處具有改變的突變體證實(shí)了所有3個(gè)潛在的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)用于GP5中聚糖的添加(圖2)。生物化學(xué)研究顯示，當(dāng)與M蛋白一起在經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，PRRSVGP5蛋白包含EndoH敏感的高甘露糖類型的聚糖。下列觀察結(jié)果是引起興趣的摻入病毒粒子中的大多數(shù)GP5對(duì)于EndoH有抗性(圖4A)，而在經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中于M蛋白存在下表達(dá)的GP5是完全EndoH敏感的?？赡艿氖?，當(dāng)在M蛋白存在下在經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，GP5主要積聚在ER或高爾基體內(nèi)側(cè)區(qū)域(cis-Golgiregion)中，并因此保持為EndoH敏感的。然而，在受PRRSV感染的細(xì)胞中，GP5可能與另外的病毒蛋白質(zhì)相互作用，并且通過與其他病毒蛋白質(zhì)形成復(fù)合物而促進(jìn)了越過ER或高爾基體內(nèi)側(cè)的GP5運(yùn)輸。與這種相互作用一致，我們觀察到，在受wt或突變型PRRSV感染的細(xì)胞中，GP5蛋白也對(duì)EndoH有抗性。我們提出，在受感染細(xì)胞的ER中合成的GP5被運(yùn)輸至高爾基體中間和/或外側(cè)區(qū)域，在那里大多數(shù)GP5分析在被摻入PRRSV病毒粒子中之前獲得EndoH抗性。^吏用動(dòng)脈炎病毒(包括PRRSV)的幾項(xiàng)研究暗示，GP5和M蛋白形成異二聚物，這可能在病毒感染性中起關(guān)鍵作用。在EAV和LDV中，GP5和M蛋白通過形成二硫橋而產(chǎn)生的直接相互作用已得到證實(shí)。此類相互作用可能在N-聯(lián)寡糖側(cè)鏈的進(jìn)一步加工之前發(fā)生，據(jù)推測在GP5被運(yùn)輸出ER或高爾基體內(nèi)側(cè)區(qū)室外之前。有趣的是注意到，摻入wt和突變體病毒粒子內(nèi)的GP5的EndoH抗性模式是不同的。盡管wtPRRSV中的大多數(shù)GP5分子是EndoH抗性的，但單位點(diǎn)突變體病毒粒子(FL-N34A和FL-N51A)中的大部分GP5分子是EndoH敏感的(圖4A)。此外，在這些突變體的2個(gè)聚糖部分中，只有1個(gè)是敏感的，而另一個(gè)是抗性的。雙重突變體(FL-N34/51A)病毒粒子還摻入了包含聚糖的GP5，所述聚糖中的某些也是對(duì)EndoH敏感的。這些數(shù)據(jù)與下述解釋一致wt以及突變型PRRSV病毒粒子摻入了在不同位點(diǎn)處包含不同聚糖部分的GP5分子的混合群體。證實(shí)了差異糖基化形式的GP5摻入wtPRRSV病毒粒子中的先前研究進(jìn)一步鞏固了我們的解釋。根據(jù)摻入病毒粒子中的GP5的EndoH敏感性的模式，嘗試推測N44位點(diǎn)可能包含EndoH抗性聚糖，盡管在這個(gè)位點(diǎn)處具有EndoH敏感性聚糖的某些GP5分子被摻入病毒粒子中。在GP5中的各個(gè)位點(diǎn)處的這種罕見的聚糖^^莫式和各種形式的GP5摻入病毒粒子中與在受PRRSV感染的動(dòng)物中所見的免疫應(yīng)答模式是否具有關(guān)聯(lián)仍有待研究。在近期研究中，顯示出，在LelystadPRRSV的GP5中的2個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)(N46和N53)中，N46殘基的糖基化是病毒顆粒產(chǎn)生所強(qiáng)烈需要的。對(duì)于N46處的突變，感染性病毒得率減少約IOO倍。我們的結(jié)果暗示，在N44處的聚糖添加(對(duì)于北美PRRSV)對(duì)于回收感染性PRRSV是絕對(duì)必需的。那么可能的是，PRRSV的歐洲和北美分離林可能在它們關(guān)于對(duì)于產(chǎn)生感染性病毒來說N-聯(lián)糖基化的需求方面有一定差異。在這點(diǎn)上，應(yīng)當(dāng)指出，Lelystad病毒只包含2個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)，而在這項(xiàng)研究中我們所使用的北美分離株包含3個(gè)此類位點(diǎn)。GP5是參與PRRSV中和抗體產(chǎn)生和保護(hù)性免疫的最重要的PRRSV糖蛋白。我們的結(jié)果揭示出，在GP5膜外結(jié)構(gòu)域中殘基34和51處聚糖的不存在，在產(chǎn)生存活的PRRSV突變體的同時(shí)，增強(qiáng)這些突變體對(duì)經(jīng)由抗體的中和的敏感性以及附近的中和表位的免疫原性。在突變型PRRSV的GP5中聚糖的不存在的直接效應(yīng)為病毒對(duì)經(jīng)由恢復(fù)期血清的中和的敏感性增加，所述恢復(fù)期血清來自用wtPRRSV感染的豬(表3)。使用HIV-1和SIV的研究已顯示，gpl60的可變環(huán)中聚糖的獲得或去除修飾它們對(duì)中和的敏感性。因此，已假定聚糖在病毒包膜糖蛋白的生物合成過程中起至少2種類型的必需作用。在一種情況下，聚糖的缺乏引起糖蛋白的缺陷，并因此引起在病毒毒林的總體存活力中的缺陷。我們假定，PRRSVGP5的N44處的聚糖發(fā)揮類似的作用。在第二種情況下，聚糖潛在地用于針對(duì)經(jīng)由抗體的中和屏蔽病毒蛋白質(zhì)。對(duì)于PRRSVGP5，N34和N51處的聚糖可能具有類似的作用。在HIV的情況下，"聚糖屏蔽"被假定是解釋中和免疫應(yīng)答逃避的主要機(jī)制，因此確保HIV的體內(nèi)持續(xù)。這引起與PRRSV的某些平行比較。已知在個(gè)體動(dòng)物中持續(xù)數(shù)月的被PRRSV的感染在病毒特異性中和免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)方面呈現(xiàn)罕見行為。充分確定，用PRRSV感染的動(dòng)物通常需要比正常時(shí)間更長的時(shí)間以建立可檢測的PRRSV中和抗體應(yīng)答。建立后，這種PRRSV中和應(yīng)答4艮弱，并且從動(dòng)物到動(dòng)物顯著不同。中和抗體應(yīng)答位置27-30)的存在而引起的，其引發(fā)強(qiáng)烈的、早期的、非保護(hù)性的免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答掩蓋和/或減緩了針對(duì)中和表位(氨基酸位置37-45)的應(yīng)答(26,38)。盡管這是關(guān)于PRRSV中和抗體應(yīng)答的非典型特征的似乎合理的解釋，但它仍有待測試。在我們的實(shí)驗(yàn)室中，誘騙表位的刪除已一致地證實(shí)對(duì)于回收感染性PRRSV是毀滅性的(Ansari等人，未公開的數(shù)據(jù))，從而使得難以測試這種假設(shè)。可能的是，通過對(duì)于HIV和SIV提出的"聚糖屏蔽"現(xiàn)象可以設(shè)想備選或補(bǔ)充機(jī)制以解釋PRRSV中和應(yīng)答的罕見性質(zhì)。在我們的研究中使用缺乏l個(gè)或2個(gè)聚糖部分的突變型PRRSV第一次提供了在受wtPRRSV感染的動(dòng)物血清中存在大量的PRRSV中和抗體的證據(jù)，所述中和抗體是以其他方式無法檢測的，因?yàn)樵赟N測定法中使用wtPRRSV。由于中和表位被GP5上的聚糖部分封閉或屏蔽，PRRSV中和抗體盡管存在于宿主應(yīng)答中，但不能與感染性PRRSV病毒粒子反應(yīng)。對(duì)于乳酸脫氫酶升高癥病毒(LDV)已描述了關(guān)于動(dòng)脈炎病毒中經(jīng)由糖蛋白的糖基化的中和逃避的1個(gè)重要先例。由于其主要糖蛋白VP-3的重大聚糖屏蔽，LDV對(duì)抗體中和具有高度抗性，然而，由于VP-3的膜外結(jié)構(gòu)域上2個(gè)糖基化位點(diǎn)的喪失，某些天然存在的LDV毒株對(duì)于中和是高度易感的。有趣的是，這種中和敏感性表型與宿主中的高度向神經(jīng)性相關(guān)聯(lián)，所述高度向神經(jīng)性通過這些可容易中和的LDV毒林而獲得。此類致神經(jīng)病性增強(qiáng)可能反映了病毒糖蛋白與神經(jīng)細(xì)胞中的受體的相互作用的促進(jìn)，這可能是由于不存在聚糖屏蔽。在用于用PRRSV進(jìn)行接種的年幼豬模型中，無法檢測到任何突變型PRRSV和wtPRRSV之間的病原性差異，盡管我們將觀察限制于溫度和病毒血癥測量?？赡艿氖牵诓煌膶?shí)驗(yàn)條件下(即，在妊娠大母豬模型中)，可能觀察到這些突變型PRRSV的病原性中的某些改變。天然存在的低糖基化的PRRSV毒株的發(fā)現(xiàn)是否是共同事件是未知的，盡管先前報(bào)道已暗示其存在。在我們的實(shí)驗(yàn)中顯著的觀察結(jié)果是，當(dāng)在體內(nèi)感染豬時(shí)，在它們于感染晚期引起相當(dāng)大的wtPRRSV中和應(yīng)答的能力方面，GP5突變體可以勝過wtPRRSV(表4A)。在平行場景中，我們不僅觀察到針對(duì)同源PRRSV突變體的更高的中和滴度，而且還觀察到針對(duì)wtPRRSV的相當(dāng)大的滴度(表4A)。此外，應(yīng)答更早地發(fā)生，中和滴度在感染后14天時(shí)可檢測，這個(gè)觀察結(jié)果在使用wtPRRSV感染時(shí)通常不顯著(表4B)。來自用PRRSV突變體感染的豬的血清對(duì)于wtPRRSV的中和增加暗示，聚糖掩蔽中和表位，所述中和表位在當(dāng)聚糖存在時(shí)不誘導(dǎo)中和抗體。這種觀察結(jié)果對(duì)于更佳的、更有效的PRRSV疫苗的設(shè)計(jì)具有重大意義，暗示新的、合理設(shè)計(jì)的疫苗應(yīng)當(dāng)攜帶在GP5的糖基化模式中的修飾，以便增強(qiáng)中和抗體的產(chǎn)生。此外，研究碳水化合物從免疫上突出的P.RRSV糖蛋白中的這種去除對(duì)于增加的SN滴度可能具有的影響將是重要的，所述SN滴度不僅針對(duì)同源免疫毒林而且還針對(duì)不同的無關(guān)PRRSV毒林。實(shí)施例2.在北美和歐洲PRRSV分離林中的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)的鑒定為了鑒定可以在本發(fā)明的方法中被失活和使用的相應(yīng)于SEQIDNO:1的參考GP5蛋白中的天冬酰胺34或天冬酰胺51的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)，使所需北美PRRSV分離抹(圖5)或歐洲PRRSV分離株(圖6)的GP5蛋白與SEQIDNO:1的參考GP5蛋白(北美毒林NVSL97-7895)相比對(duì)。在這個(gè)實(shí)施例中，釆用Jotun-Hein的比對(duì)方法(Hein，J.J.，MethodsinEnzymology，第183巻第626-645頁，1990)使用來自DNASTAR，Inc.(Madison,WI，USA)的MegAlignTM程序來進(jìn)行比對(duì)。多重序列比對(duì)參數(shù)是缺口罰分11和缺口長度罰分3。對(duì)于成對(duì)比較，使用2的Ktuple值。在圖5中，明顯地看出，相應(yīng)于SEQIDN0:1的參考GP5蛋白的天冬酰胺51的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)存在于所示的所有北美PRRSV分離林中，并且包含N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)"NGT"。這個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)可以通過下述方法被失活用編碼其他氨基酸殘基例如谷氨酰胺或丙氨酸的密碼子置換相應(yīng)的多核苷酸序列中的天冬酰胺51。在這些情況下，低糖基化的北美PRRSVGP5蛋白變體中的相應(yīng)氨基酸序列將包含序列例如"QGT"、"AGT"或"XGT"，其中X是除天冬酰胺外的任意氨基酸。其中相應(yīng)于天冬酰胺51的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活的北美PRRSV分離林的這些或其他低糖基化的變體也可以與其中其他N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活的其他低糖基化的GP5變體相組合。由圖5還可明顯地看出，準(zhǔn)確地相應(yīng)于SEQIDNO:1的參考GP5蛋白的天冬酰胺34的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)僅存在于某些北美PRRSV分離抹中。更特別地，北美PRRSV分離林IAF-BAJ(SEQIDNO:3)、94-3182(SEQIDNO:7)和94-287(SEQIDNO:8)的GP5蛋白包含準(zhǔn)確地相應(yīng)于SEQID掘1的參考GP5蛋白的天冬酰胺34的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)，并且包含N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)"NSS"。SEQIDNO:3、7和8的這個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)可以通過下述方法被失活用編碼其他氨基酸殘基例如谷氨酰胺或丙氨酸的密碼子置換相應(yīng)的多核苷酸序列中的天冬酰胺34。在這些情況下，低糖基化的北美PRRSVGP5蛋白變體中的相應(yīng)氨基酸序列將包含序列例如"QSS"、"ASS"或"XSS"，其中X是除天冬酰胺外的任意氨基酸。在缺乏準(zhǔn)確地相應(yīng)于SEQIDNO:1的參考GP5蛋白的天冬酰胺34的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)的其他北美PRRSV分離林中，也可以使位于殘基30(圖5SEQIDNO:2、3、4、6、7、8、9、11、13中的"MS")和殘基33(圖5SEQIDNO:3、8中的"NNS";SEQIDNO:6、10中的"NSS"，SEQIDNO:11、13中的"NDS")處的其他N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)失活。換言之，位于相應(yīng)于SEQIDNO:1的參考GP5蛋白的殘基30和33的氨基酸位置處的在其他北美分離林中的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)也可以在本發(fā)明的方法中被失活和使用。在圖6中，明顯地看出，相應(yīng)于SEQIDNO:1的參考GP5蛋白的天冬酰胺51的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)也存在于代表性的歐洲PRRSV分離林中，并且包含N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)"NGT"。這個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)可以通過下述方法被失活用編碼其他氨基酸殘基例如谷氨酰胺或丙氨酸的密碼子置換相應(yīng)的多核苷酸序列中的天冬酰胺51。在這些情況下，低糖基化的歐洲PMSVGP5蛋白變體中的相應(yīng)氨基酸序列將包含序列例如"QGT，，、"AGT，，或"XGT"，其中X是除天冬酰胺外的任意氨基酸。其中相應(yīng)于天冬酰胺51的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活的歐洲PRRSV分離林的這些或其他低糖基化的變體也可以與其中其他N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活的其他低糖基化的GP5變體相組合。考慮到前文所述，將可看出完成和達(dá)到了本發(fā)明的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。選擇并描述實(shí)施方案以便最佳地解釋本發(fā)明的原理及其實(shí)踐應(yīng)用，由此使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在各種實(shí)施方案中最佳地利用本發(fā)明，并且考慮適合于特定用途的各種修飾。因?yàn)榭稍诒疚拿枋龊团e例說明的構(gòu)建和方法中進(jìn)4亍各種修飾而不背離本發(fā)明的范圍，所以希望在前文說明書中包含的或在附圖中顯示的所有內(nèi)容應(yīng)當(dāng)被解釋為舉例說明性的而不是限制性的。因此，本發(fā)明的寬度和范圍不應(yīng)受任何上文描述的示例性實(shí)施方案的限制，而是應(yīng)當(dāng)只根據(jù)所附的下述權(quán)利要求及其等價(jià)形式來限定。本文公開了各種專利和非專利參考文獻(xiàn)，每個(gè)所述參考文獻(xiàn)明確地整體引入本文作為參考。權(quán)利要求1.在豬中引發(fā)針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)抗原的改善的免疫應(yīng)答的方法，其包括施用包含編碼低糖基化的PRRSVGP5多肽變體的多核苷酸的組合物，從而引發(fā)所述豬針對(duì)PRRSV抗原的改善的免疫應(yīng)答，在所述變體中相應(yīng)于在SEQIDNO1的參考GP5蛋白中的天冬酰胺34或天冬酰胺51的至少一個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述多核苷酸包括感染性PRRSVRM分子。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述多核苷酸包括編碼感染性PRRSVRNA分子的DNA分子。4.權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的方法，其中所述感染性PRRSVRNA分子是北美PRRSV衍生物或歐洲PRRSVf汴生物。5.權(quán)利要求2的方法，其中所述感染性PRRSVRNA分子是編碼低糖基化的PRRSVGP5多肽變體蛋白的北美PRRSV衍生物，在所述變體蛋白中相應(yīng)于在SEQIDNO:1的參考GP5蛋白中的天冬酰胺34或天冬酰胺51的至少一個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活。6.權(quán)利要求5的方法，其中相應(yīng)于在SEQIDNO:1中的天冬酰胺51的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活。7.權(quán)利要求5的方法，其中相應(yīng)于在SEQIDNO:1的參考GP5蛋白中的天冬酰胺34和天冬酰胺51的2個(gè)所述N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)均被失活。8.權(quán)利要求7的方法，其中2個(gè)所述N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)通過用編碼除天冬酰胺外的氨基酸的密碼子替換編碼所述天冬酰胺34和所述天冬酰胺51的密碼子而被失活。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述編碼另一種氨基酸的密碼子編碼丙氨酸或谷氨酰胺殘基。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述密碼子編碼丙氨酸殘基。11.權(quán)利要求l的方法，其中所述多核苷酸包括DNA分子，在所述DNA分子中將在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有活性的啟動(dòng)子與編碼低糖基化的GP5蛋白的所述多核苷酸有效地連接。12.權(quán)利要求ll的方法，其中所述啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子。13.權(quán)利要求1的方法，其中所述N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)通過用編碼除天冬酰胺外的氨基酸的密碼子替換編碼所述天冬酰胺51的密碼子而被失活。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述編碼另一種氨基酸的密碼子編碼丙氨酸或谷氨酰胺殘基。15.權(quán)利要求l的方法，其中相應(yīng)于天冬酰胺34的所述N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)通過用編碼除天冬酰胺外的氨基酸的密碼子替換編碼所述天冬酰胺34的密碼子而被失活。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述編碼另一種氨基酸的密碼子編碼丙氨酸或谷氨酰胺殘基。17.權(quán)利要求l的方法，其中所述多核苷酸編碼低糖基化的PRRSVGP5多肽變體蛋白，在所述變體蛋白中相應(yīng)于在SEQIDNO:1的參考GP5蛋白中的天冬酰胺34和天冬酰胺51的2個(gè)所述N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)均被失活。18.權(quán)利要求17的方法，其中2個(gè)所述N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)通過用編碼除天冬酰胺外的氨基酸的密碼子替換編碼所述天冬酰胺34和所述天冬酰胺51的密碼子而^皮失活。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述編碼另一種氨基酸的密碼子編碼丙氨酸或谷氨酰胺殘基。20.權(quán)利要求17的方法，其中所述N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)之一通過用編碼除天冬酰胺外的氨基酸的密碼子替換編碼所述天冬酰胺34或所述天冬酰胺51的一個(gè)密碼子而被失活。21.權(quán)利要求l的方法，其中所述組合物通過皮下注射、靜脈內(nèi)注射、皮內(nèi)注射、腸胃外注射、肌內(nèi)注射、無針注射、電穿孔、口服遞送、鼻內(nèi)遞送、口鼻遞送、或其任何組合來施用。22.權(quán)利要求l的方法，其中所述組合物進(jìn)一步包含治療上可接受的承載體。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述承載體選自蛋白質(zhì)、緩沖液、表面活性劑和聚乙二醇聚合物，或其任何組合。24.權(quán)利要求l的方法，其中所述組合物進(jìn)一步包含佐劑。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述佐劑選自氬氧化鋁、QuilA、氧化鋁凝膠懸浮液、礦物油、甘油酯、脂肪酸、脂肪酸副產(chǎn)物、分枝桿菌和CpG寡脫氧核苷酸，或其任何組合。26.權(quán)利要求1的方法，其中所述多核苷酸包括選自痘苗病毒栽體、單純皰滲病毒載體、腺病毒載體、甲病毒載體和TGEV載體的病毒載體。27.權(quán)利要求1的方法，其中所述豬的針對(duì)PRRSV抗原的所述改善的免疫應(yīng)答包括由所述豬產(chǎn)生的PRRSV中和抗體增加。28.權(quán)利要求l的方法，其中所述豬是大母豬、小母豬、公豬或小豬。29.權(quán)利要求l的方法，其中編碼低糖基化的PRRSVGP5多肽變體的所述多核苷酸通過直接合成、誘變北美PRRSV分離林GP5核苷酸序列或誘變北美PRRSV共有GP5核苷酸序列來獲得。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述北美PRRSV分離林GP5核苷酸序列編碼選自SEQIDN0:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13的肽。31.權(quán)利要求29的方法，其中所述共有北美PRRSVGP5核苷酸序列編碼與SEQIDNO:14至少85%同一的共有GP5蛋白。32.權(quán)利要求1的方法，其中編碼低糖基化的PRRSVGP5多肽變體的所述多核苦酸通過直接合成、誘變歐洲PRRSV分離林GP5核苷酸序列或誘變共有歐洲PRRSVGP5核苷酸序列來獲得。33.權(quán)利要求32的方法，其中所述歐洲PRRSV分離林GP5核苷酸序列編碼與SEQIDNO:15至少85%同一的GP5蛋白。34.權(quán)利要求33的方法，其中所述歐洲PRRSVGP5核苷酸序列是SEQIDNO:15。35.在豬中引發(fā)針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)抗原的改善的免疫應(yīng)答的方法，其包括給所述豬施用包含低糖基化的PRRSVGP5多肽變體的組合物，從而引發(fā)所述豬針對(duì)PRRSV抗原的改善的免疫應(yīng)答，在所述變體中相應(yīng)于在SEQIDNO:1的參考GP5蛋白中的天冬酰胺34或天冬酰胺51的至少一個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活。36.組合物，其包含編碼低糖基化的北美PRRSVGP5多肽變體的多核苷酸和治療上可接受的承載體，在所述變體中相應(yīng)于在SEQIDNO:1的參考GP5蛋白中的天冬酰胺51的至少一個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活。37.權(quán)利要求36的組合物，其中所述多核苷酸包括感染性北美PRRSVRNA分子。38.權(quán)利要求36的組合物，其中所述多核苷酸包括編碼感染性北美PRRSVRNA分子的DNA分子。39.權(quán)利要求36的組合物，其中所述多核苷酸包括DNA分子，在基化的北美PRRSVGP5多肽變體的所述多核苷酸有效地連接。40.權(quán)利要求39的組合物，其中所述啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子。41.權(quán)利要求36的組合物，其中所述N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)通過用編碼除天冬酰胺外的氨基酸的密碼子替換編碼所述天冬酰胺51的密碼子而4皮失活。42.權(quán)利要求41的組合物，其中所述編碼除天冬酰胺外的氨基酸的密碼子編碼丙氨酸或谷氨酰胺殘基。43.權(quán)利要求36的組合物，其中所述多核苷酸編碼低糖基化的北美PRRSVGP5多肽變體蛋白，在所述變體蛋白中相應(yīng)于在SEQIDNO:1的北美參考GP5蛋白中的天冬酰胺34和天冬酰胺51的2個(gè)所述N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)均被失活。44.權(quán)利要求43的組合物，其中2個(gè)所述N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)通過用編碼除天冬酰胺外的氨基酸的密碼子替換編碼所述天冬酰胺34和所述天冬酰胺51的密碼子而被失活。45.權(quán)利要求44的組合物，其中所述編碼另一種氨基酸的密碼子編碼丙氨酸或谷氨酰胺殘基。46.權(quán)利要求43的組合物，其中所述N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)之一通過用編碼除天冬酰胺外的氨基酸的密碼子替換編碼所述天冬酰胺34或所述天冬酰胺51的一個(gè)密碼子而被失活。47.權(quán)刮要求36的組合物，其中所述治療上可接受的承載體選自蛋白質(zhì)、緩沖液、表面活性劑和聚乙二醇聚合物，或其任何組合。48.權(quán)利要求34的組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包含至少一種佐劑。49.權(quán)利要求48的組合物，其中所述佐劑選自氫氧化鋁、QuUA、氧化鋁凝膠懸浮液、礦物油、甘油酯、脂肪酸、脂肪酸副產(chǎn)物、分枝桿菌和CpG寡脫氧核苷酸，或其任何組合。50.權(quán)利要求48的組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包含選自白介素l(IL-1)、IL-2、IL4、IL-5、IL6、IL-12、y干擾素(g-IFN)、細(xì)胞壞死因子、MDP(胞壁酰二肽)、免疫刺激復(fù)合物(ISC0M)和脂質(zhì)體的第二種佐劑。51.權(quán)利要求36的組合物，其中所述多核苷酸包括選自痘苗病毒載體、單純皰療病毒載體、腺病毒載體、甲病毒載體和TGEV載體的病毒載體。52.組合物，其包含低糖基化的北美PRRSVGP5多肽變體和治療上可接受的承載體，在所述變體中相應(yīng)于在SEQIDNO:1的參考GP5共有蛋白中的天冬酰胺51的至少一個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活。53.分離的多核苷酸，其編碼低糖基化的北美PRRSVGP5多肽變體，在所述變體中相應(yīng)于在SEQIDN0:1的參考GP5蛋白中的天冬酰胺51的至少一個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活。54.權(quán)利要求53的分離的多核苷酸，其中相應(yīng)于在SEQIDNO:1中的天冬酰胺34和天冬酰胺51的2個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)均被失活。55.權(quán)利要求53的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括感染性北美PRRSVRNA分子。56.權(quán)利要求53的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括編碼感染性北美PRRSVRNA分子的DNA分子。57.權(quán)利要求53的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括DNA分子，在所述DNA分子中將在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有活性的啟動(dòng)子與編碼所述低糖基化的北美PRRSVGP5多肽變體的所述多核苷酸有效地連接。58.權(quán)利要求57的分離的多核苷酸，其中所述啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子。59.權(quán)利要求53的分離的多核苷酸，其中相應(yīng)于天冬酰胺51的所述N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)通過用編碼除天冬酰胺外的氨基酸的密碼子替換編碼所述天冬酰胺51的密碼子而被失活。60.權(quán)利要求59的分離的多核苷酸，其中所述編碼另一種氨基酸的密碼子編碼丙氨酸或谷氨酰胺殘基。61.權(quán)利要求53的分離的多核苷酸，其中相應(yīng)于在SEQIDNO:1的參考GP5蛋白中的天冬酰胺34的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活。62.權(quán)利要求61的分離的多核香酸，其中通過用編碼除天冬酰胺外的氨基酸的密碼子替換編碼所述天冬酰胺34的密碼子來失活。63.權(quán)利要求61的分離的多核苷酸，其中所述編碼另一種氨基酸的密碼子編碼丙氨酸或谷氨酰胺殘基。64.權(quán)利要求61的分離的多核苷酸，其中所述N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)之一通過用編碼除天冬酰胺外的氨基酸的密碼子替換編碼所述天冬酰胺34或所述天冬酰胺51的一個(gè)密碼子而被失活。65.權(quán)利要求53的分離的多核苷酸，其中所迷多核苷酸包括選自痘苗病毒載體、單純皰滲病毒載體、腺病毒載體、甲病毒載體和TGEV載體的病毒載體。66.分離的多肽，其是低糖基化的北美PRRSVGP5多肽變體，其中相應(yīng)于在SEQIDN0:1的參考GP5蛋白中的天冬酰胺51的至少一個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)被失活。全文摘要相對(duì)于由用野生型(wt)或糖基化的GP5免疫的豬產(chǎn)生的中和抗體的水平，用豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)主要表面蛋白GP5的低糖基化變體攻擊的豬顯示出PRRSV-中和抗體的產(chǎn)生增加。本發(fā)明提供了在豬中獲得針對(duì)PRRSV的改善的免疫應(yīng)答的方法，對(duì)于獲得改善的免疫應(yīng)答來說有用的組合物，以及編碼PRRSV主要表面蛋白GP5的低糖基化變體的分離的多核苷酸。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101300363SQ200680040532公開日2008年11月5日申請(qǐng)日期2006年8月30日優(yōu)先權(quán)日2005年8月30日發(fā)明者A·K·派特奈克,F·A·奧索里奧,I·H·安薩利申請(qǐng)人:內(nèi)布拉斯加大學(xué)董事會(huì)