專利名稱：：濃縮、純化和除去朊病毒蛋白質(zhì)的方法濃縮、純化和除去朊病毒蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過在容許瓊脂糖凝膠與朊病毒PrPSe蛋白質(zhì)特異性的和高親和性的結(jié)合的條件下使朊病毒PrPSe蛋白質(zhì)與瓊脂糖凝膠接觸、并從所述瓊脂糖凝膠中除去未結(jié)合的非朊病毒蛋白質(zhì)來濃縮和/或純化朊病毒PrpSc蛋白質(zhì)的方法，以及涉及通過在容許瓊脂糖凝膠與朊病毒PrPSe蛋白質(zhì)特異性的和高親和性的結(jié)合的條件下使體液與瓊脂糖凝膠接觸、并從所述瓊脂糖凝膠中除去體液來從體液中除去朊病毒PrpSe蛋白質(zhì)的方法。此外，本發(fā)明涉及通過在容許瓊脂糖凝膠部分與朊病毒PrpSe蛋白質(zhì)的特異性和高親和性結(jié)合以及瓊脂糖凝膠的配體部分與PrPG蛋白質(zhì)結(jié)合的條件下使朊病毒PrPSe蛋白質(zhì)和PrPc蛋白質(zhì)與配體修飾的瓊脂糖凝膠接觸、在容許非朊病毒蛋白質(zhì)和PrPc蛋白質(zhì)從瓊脂糖凝膠的配體部分釋放、而不容許朊病毒PrpSe蛋白質(zhì)的釋放的條件下向與瓊脂糖凝膠結(jié)合的蛋白質(zhì)中添加選擇性釋放試劑、以及從瓊脂糖凝膠中除去非朊病毒蛋白質(zhì)和PrpC蛋白質(zhì)，來從PrpC蛋白質(zhì)中分離和/或富集朊病毒PrpSc蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明的另一個方面涉及上述方法用于濃縮、純化和/或除去朊病毒PrpSe蛋白質(zhì)的用途。
背景技術(shù)：
：天然的朊病毒蛋白質(zhì)，對于細(xì)胞朊病毒蛋白被稱為"PrP。'，是在自然中廣泛分布的，在哺乳動物中是特別好地保守性的。天然PrpC蛋白質(zhì)向?qū)τ诰d羊癢病朊病毒蛋白質(zhì)被稱為"PrpSc，，或?qū)τ诘鞍酌窴抗性朊病毒蛋白質(zhì)被稱為"PrPres"的傳染性蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)變被認(rèn)為導(dǎo)致各種疾病的傳播。朊病毒相關(guān)疾病的實例包括，例如，人類中的苦魯病(kuru)和克雅病(CJD);綿羊中的綿羊癢病、牛中的牛海綿狀腦病(BSE)、可傳播的貂腦病以及在鹿和麋鹿中的消耗性疾病(wastingdisease)。BSE是瘋牛病的一種形式，可傳播給各種其他哺乳動物，包括人類。BSE的人類形式稱為新變體克雅病或vCJD。在20世紀(jì)80年代中晚期在英國估計4千萬人攝食了BSE污染的牛肉。由于口頭傳染的疾病的潛伏期可能是20-30年，該疾病的真實程度可能直到2010年后都不會顯現(xiàn)。除了感染的牛肉的攝食之外，存在著通過輸血在人類中傳播朊病毒相關(guān)疾病的可能性。由于現(xiàn)在有通過輸血的朊病毒傳播的(兩個)直接征兆，對于血液制品的安全性有越來越高的關(guān)注。并且，已經(jīng)顯示了感染的朊病毒在淋巴細(xì)胞上存在，還有證據(jù)表明除了是與細(xì)胞相關(guān)的之外，朊病毒還存在于血漿中。此外，動物也可能通過在朊病毒污染的土壤上放牧或通過攝食含有朊病毒感染的干草螨的干草而被朊病毒相關(guān)疾病感染。從樣品中檢測以及除去朊病毒蛋白質(zhì)的能力在食品工業(yè)和醫(yī)學(xué)部門有深刻的重要性。對于檢測朊病毒蛋白質(zhì)，已經(jīng)開發(fā)了許多基于朊病毒特異性抗體的分析。然而，由于朊病毒蛋白質(zhì)在自然中和在哺乳動物中、特別是在人類血液、用于移植的人類或其他哺乳動物器官中以及在來自哺乳動物的肉類和加工食品中非常低的朊病毒濃度，這些分析需要在先的富集。在過去十年已經(jīng)開發(fā)了許多方法用于純化朊病毒蛋白質(zhì)和其衍生物。親和層析作為適合的純化技術(shù)起到了重要作用。特別是，瓊脂糖凝膠本身已經(jīng)被證明是攜帶親和層析的配體的適合的支持材料。Grathwohl等人(Arch.Virol.(1996)141:1863-1874)公開了通過采用二價銅離子瓊脂糖凝膠作為支持材料的固定金屬(Cu2+)親和層析(IMAC)從感染后不久的綿羊癢病感染的小鼠的小鼠脾臟富集PrPSe。然而，他們發(fā)現(xiàn)，對于在感染的最早期階段的診斷，通過用N-十二烷基肌氨酸鈉和NaCl鹽析提取PrP"是更有效的。WO01/77687比較了使用附著于瓊脂糖凝膠的特異性六肽配體從部分純化的可溶制品中清除PrPc朊病毒蛋白和通過單獨的相同瓊脂糖凝膠材料作為參考材料實現(xiàn)的清除。單獨的SP-瓊脂糖凝膠和DEAE-瓊脂糖凝膠展現(xiàn)了與Prpc的結(jié)合，它比用結(jié)合六肽配體的樹脂所實現(xiàn)的低100倍。事實上，該文件聲明"4///7.4#，艱^^潛凝屋者4A不潛合尸r尸c。"SP瓊脂糖凝膠與PrpC的低結(jié)合相對于Prpe與硅土的結(jié)合、即與非特異性結(jié)合劑的結(jié)合甚至更降低20倍。根據(jù)DEAE瓊脂糖凝膠根本不結(jié)合以及SP瓊脂糖凝膠以非常低和非特異性親和性結(jié)合PrpC的事實，明顯的是，是SP瓊脂糖凝膠的SP(磺丙基基團)部分對低結(jié)合親和性負(fù)責(zé)。因此，WO01/77687實際教導(dǎo)了瓊脂糖凝膠作為Prpc特異性配體的惰性固體支持物，SP瓊脂糖凝膠的SP部分實際可以以低于非特異性結(jié)合劑硅土超過20倍的親和性結(jié)合PrPG。PR.Foster(TransfusionMedicine,1999,9,3-14)的文件在1999年公開，此時朊病毒研究仍處于開始，科學(xué)界還沒有關(guān)于朊病毒PrP"蛋白質(zhì)的物理化學(xué)組成的線索，可傳播海綿狀腦病(TSE)的原因"試劑"的檢測仍然依靠具有很少的定量顯著性的詳細(xì)描述和易出錯的動物研究。此外，該文件指出，PrP"將由于它非常低的水可溶性在沉淀過程中傾向于沉淀在固相中。此外，它表明，PrpSe具有強親水性和疏水性結(jié)構(gòu)域，其將附著于各種表面，特別是，將與用于血漿產(chǎn)品的生產(chǎn)的層析和過濾介質(zhì)相互作用。該文件告知，離子的、陽離子的、疏水性和多種未鑒別的樹脂將結(jié)合PrPSe。甚至特別預(yù)先處理以防止吸附的過濾用醋酸纖維素膜將與PrpSe相互作用。然而，這個文件中的所有研究是基于TSE傳染性的降低，而不是展現(xiàn)了PrPSe與任何吸附劑的實際結(jié)合。特別指出的是，在吸附劑結(jié)合之外，降低的Prpse活性也可以由其他機制引起，例如(i)溶液中PrpSe的沉淀以及固體如過濾器和層析支持物材料的機械滯留，以及(ii)通過與固體接觸或隨時間的PrpSe鈍化。在這點上，作者在他的層析材料討論中注明所有被檢查的吸附劑引起PrPSe的分離一"…^管炎^7不^7^豕謬、差|弄^餘#理。"該文件的表1還公開了當(dāng)與其他吸附劑相比較時，對于陰離子、陽離子和疏水性連接的瓊脂糖凝膠，在Prpse傳染性方面的微弱降低。然的教導(dǎo)，也沒有指出對于與這些瓊脂糖凝膠相關(guān)的實施方式的其他任何公眾可獲得的參考文獻(xiàn)。因此，與基于瓊脂糖凝膠的吸附劑相關(guān)的結(jié)果缺乏足夠的公開。此外，表1的結(jié)果與該文件的說明書抵觸，在其說明書中展現(xiàn)了所采用的SP瓊脂糖凝膠具有高結(jié)合親和性，而Q瓊脂糖凝膠基本上與PrpSe沒有結(jié)合親和性(第28頁的表格)?？紤]到結(jié)果的精確度，作者自己注明"^于一廢^『5五試^f......J以及#身乂"vG/Z)^參理必夢##必多君要/岸。在^乏這^炎孩的餘《7"^^^iM,乂,f^:全餘去^潔4^的任^T"vG/Z)試^/，^卓換4'逸合W辨-定d齊步f^處力82顛#不凝氛""f》"7強源，換句話說，在1999年作者P.R.Foster自己"i人為存在著與血漿分級步驟來有效除去PrPSe的可能性研究相關(guān)的許多固有的難題，并且這個文件的結(jié)果必需在所述環(huán)境中被看作是推測的和初步的。對于純化和/或檢測人類或動物朊病毒蛋白質(zhì)的特別精致、敏感和高度選擇性的方法基于朊病毒蛋白質(zhì)或其衍生物與一種或多種朊病毒重復(fù)結(jié)構(gòu)的可逆的聚集和解離，所述朊病毒重復(fù)結(jié)構(gòu)在6.2到7.8的pH值下與朊病毒蛋白質(zhì)寡聚化，在4.5到5.5的pH值下再次解離。例如，附著于固相支持物的具有朊病毒重復(fù)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)可以與朊病毒蛋白質(zhì)寡聚化從而才企測和除去這些蛋白(PCT/EP2004003060)。目前，本領(lǐng)域仍然需要進(jìn)一步的鑒定方法，其以簡單、低成本、高度選擇性和有效的方式濃縮、純化和/或除去朊病毒PrpSe蛋白質(zhì)。由于PrPSe和PrPc蛋白質(zhì)的相同氨基酸序列，它們一般被同時濃縮和富集，然后在后期階段通過蛋白酶K消化而分離，此時僅PrpC蛋白質(zhì)被選擇性地消化而PrPSe蛋白質(zhì)保持了蛋白酶抗性。因此，除了通過選擇性酶消化之外，還存在著從Prpe蛋白質(zhì)有效地分離PrP"的需要。因此，本發(fā)明的目的是提供簡單、低成本、有效和高度選擇性的方法來濃縮、純化和/或除去PrpSe。另一個目的是提供筒單、低成本、有效和高度選擇性的方法來從Prpe蛋白質(zhì)中分離PrPSe。本發(fā)明的目的是通過濃縮和/或純化朊病毒PrpSe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物的方法而解決的，所述方法包括以下步驟a)在容許瓊脂糖凝膠與朊病毒PrPSe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物的特異性和高親和性結(jié)合的條件下使朊病毒PrPSe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物與瓊脂糖凝膠接觸，b)從所述瓊脂糖凝膠中除去未結(jié)合的非朊病毒蛋白質(zhì)，其中所述瓊脂糖凝膠優(yōu)選地不是Ci^+螯合的瓊脂糖凝膠。令人驚訝地的是發(fā)現(xiàn)，瓊脂糖凝膠本身(即，因而，棵露的、具有鈍化的、除去的、屏蔽配體)具有對PrP"蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物的特異性的和高結(jié)合的親和性。因而，瓊脂糖凝膠與PrP"蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物的結(jié)合足以用于它們的濃縮和/或純化。人們僅僅需要從所述瓊脂糖凝膠中除去未結(jié)合的非朊病毒蛋白質(zhì)。在此使用的術(shù)語"瓊脂糖凝膠與朊病毒PrPSe的特異性的和高親和性的結(jié)合"是表明，瓊脂糖凝膠本身(即，瓊脂糖凝膠核心而不是任何其上的配體)特異性地結(jié)合PrP"而不結(jié)合PrPc。優(yōu)選地，在本發(fā)明的上下文中瓊脂糖凝膠的特異性結(jié)合是指瓊脂糖凝膠本身與PrPSe多聚體而不是與PrPc的結(jié)合。在這點上術(shù)語高親和性的結(jié)合是指與10-6到10-12M或更低、優(yōu)選地10-8到10-12M或更低的離解常數(shù)相關(guān)的結(jié)合親和性。技術(shù)人員可以通過常規(guī)的和簡單的結(jié)合分析容易地測定給定的瓊脂糖凝膠與朊病毒PrPSe的特異性和高結(jié)合親和性。例如，一種這樣的分析將包括以下步驟a)提供要分析的瓊脂糖凝膠并除去、鈍化和/或屏蔽所述瓊脂糖凝膠核心上的任何配體，如果存在，b)將使用的PrpSe稀釋到將避免非特異性消除，例如沉淀、非特異性結(jié)合等等的濃度，c)在適合的緩沖液中在一定條件下孵育a)的瓊脂糖凝膠和b)的PrpSe持續(xù)足以允許相互結(jié)合的時間，d)—個或多個洗滌步驟，優(yōu)選的2到IO倍緩沖體積孵育緩沖液，用于從所述瓊脂糖凝膠洗去任何未結(jié)合的蛋白質(zhì)，e)任選地用過量的、優(yōu)選1000倍過量的非特異性結(jié)合蛋白質(zhì)、優(yōu)選的BSA(牛血清白蛋白)洗滌，以除去或阻斷所述瓊脂糖凝膠上的任何非特異性結(jié)合位點，f)使用包含離液劑，優(yōu)選地包含尿素和/或鹽酸胍和/或SDS的緩沖液的洗脫步驟，以除去與瓊脂糖凝膠結(jié)合的PrpSe,g)檢測洗脫緩沖液中的PrpSe,從而證實瓊脂糖凝膠與PrP&本身的高親和性結(jié)合。為了測定所分析的瓊脂糖凝膠的特異性，重復(fù)上述分析，除了在步驟c)中孵育Prpc代替PrpSc,并且在洗滌溶液中檢測Prpc,從而表明沒有結(jié)合。備選地，可以在步驟c)中同時地孵育PrP"和Prpc與瓊脂糖凝膠，特異性和高親和性瓊脂糖凝膠將引起在洗滌溶液中檢測到PrPc和4又在離液洗脫》爰沖液中;^測到PrPSe。測定瓊脂糖凝膠的特異'性的和高親和'性的結(jié)合的更詳細(xì)和優(yōu)選的方法以下在實施例1中示出。簡而言之，術(shù)語"瓊脂糖凝膠與PrP"蛋白質(zhì)的特異性的和高親和性的結(jié)合"是意味著將使用該術(shù)語的瓊脂糖凝膠和方法與僅非特異性地和以低親和性地結(jié)合PrpSe,例如通過沉淀和/或低吸附的瓊脂糖凝膠和所述方法相區(qū)別。在此使用的術(shù)語"濃縮和/或純化"意思是表明PrP"蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物的濃度被提高、和/或非PrPSe蛋白質(zhì)和/或非蛋白質(zhì)材料被除去。該方法也可以用于有效地/人體液中除去朊病毒PrPSe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物。在這種情況下，它包括以下步驟a)在容許瓊脂糖凝膠與朊病毒PrPSe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物的特異性和高親和性結(jié)合的條件下使包含朊病毒PrPSe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物的體液與瓊脂糖凝膠接觸，b)從所述瓊脂糖凝膠中除去所述體液。優(yōu)選地，所述體液選自由全血、血液級分或腦組織勻漿構(gòu)成的組，優(yōu)選選自血漿。然而，體液也可以包括哺乳動物組織的組織勻漿，特別是腦組織和脊髓組織的組織勻漿。還發(fā)現(xiàn)的是，瓊脂糖本身一般具有極好的與血液的相容性，當(dāng)與血液接觸時，本身對于血液凝固沒有觀察到或最多是可忽略的效果。大多數(shù)連接的、金屬連接的和/或帶負(fù)電的瓊脂糖凝膠也被證明是血液相容性的。這通過以下的表l的結(jié)果展現(xiàn)了，其中測試了根據(jù)本發(fā)明使用的多種瓊脂糖凝膠對常見的生理學(xué)蛋白質(zhì)參數(shù)的影響。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，瓊脂糖凝膠可以與血液或血液級分接觸而不損害或?qū)嵸|(zhì)上改變血液參數(shù)。此外，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，金屬螯合的瓊脂糖凝膠實際上對凝結(jié)因子VII的穩(wěn)定性具有積極效果。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*根據(jù)Quick的促凝血酶原激酶時間**促凝血酶原激酶時間的國際標(biāo)準(zhǔn)化比率(INR)***活化的部分促凝血酶原激酶時間(aPTT))樹脂I=Ni-瓊脂糖凝膠高效(Amersham/GeneralElectrics17-526802)樹脂II=加載了Zn的樹脂I樹脂III=SP瓊脂糖凝膠(SigmaS6532)樹脂IV=瓊脂糖凝膠4B(Sigma4B-200)因而，本發(fā)明的獨立的方面涉及包含凝結(jié)因子VII的新的組合物，優(yōu)選人類凝結(jié)因子VII,并進(jìn)一步包含至少一種金屬螯合的瓊脂糖凝膠、優(yōu)選的Ni-和/或Zn-瓊脂糖凝膠，更優(yōu)選的Zn-瓊脂糖凝膠。另一個獨立的方面涉及金屬螯合的瓊脂糖凝膠、優(yōu)選的Ni-和/或Zn-瓊脂糖凝膠、更優(yōu)選的Zn-瓊脂糖凝膠的用途，用于穩(wěn)定包含凝膠因子VII的血液、血液級分以及固體或液體成分。不希望受到理論的限制假想的是，金屬螯合的瓊脂糖凝膠對于凝結(jié)因子VII的有益效果是基于針對蛋白酶消化和/或折疊穩(wěn)定性的穩(wěn)定效果。要注意的是，原則上，任何連接的或非連接的瓊脂糖凝膠可以用于本發(fā)明的實踐，只要所述瓊脂糖凝膠不被屏蔽，在血液與活細(xì)胞體內(nèi)或體外接觸時，是無毒的。為了實踐用于從血液消除朊病毒蛋白的本發(fā)明的方法，金屬連接的瓊脂糖凝膠是優(yōu)選的，帶負(fù)電的瓊脂糖凝膠是更優(yōu)選的，而非連接的瓊脂糖凝膠和非帶電的瓊脂糖凝膠是最優(yōu)選的。令人驚訝地，用于本發(fā)明的方法的瓊脂糖凝膠不限于任何特定類型的瓊脂糖凝膠，只是瓊脂糖凝膠核心對于朊病毒PrP"蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物的結(jié)合應(yīng)當(dāng)是充分可接近的。優(yōu)選的，用于實踐本發(fā)明的方法的瓊脂糖凝膠選自非連接的瓊脂糖凝膠、更優(yōu)選地選自由瓊脂糖凝膠⑧2B、4B、6B、瓊脂糖凝膠⑧CL-4B、瓊脂糖凝膠⑧-6B、Superdex⑧75、聚丙烯酰胺葡聚糖⑧100HR和交聯(lián)葡聚糖凝月交⑧G10構(gòu)成的組。瓊脂糖凝膠，優(yōu)選地選自由金屬螯合的瓊脂糖凝膠、凝集素瓊脂糖、亞氨基二乙酸瓊脂糖凝膠、蛋白A瓊脂糖、鏈霉抗生物素蛋白瓊脂糖凝膠、石黃丙基瓊脂糖凝膠和羧甲基瓊脂糖凝膠構(gòu)成的組，更優(yōu)選地選自金屬螯合的瓊脂糖凝膠，以及最優(yōu)選地，用于實踐所述方法、組合物或用途的瓊脂糖凝膠是Zn-瓊脂糖凝膠。Zn瓊脂糖凝膠是與生理性液體高度相容的。瓊脂糖凝膠或Zn離子都將不會對體液例如全血、血液級分、優(yōu)選血漿有任何不利影響。因此，Zn瓊脂糖凝膠對于從體液和/或身體器官，例如要再導(dǎo)入動物、優(yōu)選的人類中用于移植的器官中除去PrPSe蛋白質(zhì)和/或功能衍生物是特別有用的。如前所提及的，對于實踐本發(fā)明的方法、組合物或用途必需的是，可選擇的配體不屏蔽瓊脂糖凝膠核心從而朊病毒PrpSe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物具有自由的通路。在先有技術(shù)中采用的配體修飾的瓊脂糖凝膠中這是個難題。技術(shù)人員通?？梢酝ㄟ^簡單地測試瓊脂糖凝膠對PrPSc蛋白質(zhì)的結(jié)合親和性來選擇對于PrPSe結(jié)合是足夠可接近的配體修飾的瓊脂糖凝膠，以及，如果希望，設(shè)計適合的配體修飾的瓊脂糖凝膠，例如，通過采用使配體置于瓊脂糖凝膠合適的距離處使得瓊脂糖凝膠不被配體屏蔽的間隔區(qū)分子。本發(fā)明的方法另一個預(yù)料之外的益處是，與朊病毒PrPSe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物結(jié)合的瓊脂糖凝膠對于朊病毒PrPG蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物是高度選擇性的，朊病毒Prpe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物本身與瓊脂糖凝膠不具有任何顯著的結(jié)合親和性。因而，本發(fā)明的方法不僅容許選擇性地濃縮、純化和/或除去朊病毒PrPSe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物，還實際上也除去了高度類似的朊病毒PrPe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物。當(dāng)使用配體修飾的瓊脂糖凝膠時，其中配體部分結(jié)合朊病毒PrPc蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物，本發(fā)明的方法容許同時濃縮和/或純化朊病毒PrP"和PrpC蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物。然后，朊病毒PrP"和PrPc蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物可以通過從瓊脂糖凝膠選擇性地除去PrPc蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物來分離。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明還涉及從PrpC蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物中分離和/或富集朊病毒PrPSe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物的方法，包括以下步驟a)在一定條件下使朊病毒PrP"蛋白質(zhì)和PrpC蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物與配體修飾的瓊脂糖接觸，所述條件容許(i)所述瓊脂糖凝膠部分與所述朊病毒PrpSe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物的特異性和高親和性結(jié)合，以及(ii)瓊脂糖凝膠的所述配體部分與Prpe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物的結(jié)合，b)任選地從所述配體修飾的瓊脂糖凝膠中除去未結(jié)合的材料，c)任選的等待足夠的時間，使緊密鄰近朊病毒PrPSe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物處的某些或大多數(shù)與配體結(jié)合的PrPG蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物轉(zhuǎn)變成朊病毒PrP"蛋白質(zhì)和/或功能衍生物，d)在一定條件下向來自步驟a)、b)或c)的與瓊脂糖凝膠結(jié)合的蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物中添加選擇性釋放試劑，所述條件容許Prpc蛋白質(zhì)和任選的非朊病毒蛋白質(zhì)從所述瓊脂糖凝膠的配體部分釋放，但不容許朊病毒PrPSe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物從所述瓊脂糖凝膠部分的釋放，以及e)從所述瓊脂糖凝膠中除去PrpG和任選的非朊病毒蛋白質(zhì)。當(dāng)朊病毒PrPSe和PrPc蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物在配體修飾的瓊脂糖凝膠上存在時，預(yù)料不到的發(fā)現(xiàn)是，在很多情況下Prpse的數(shù)量在消耗PrpC的情況下提高。相信的是，PrpC和/或其功能衍生物在緊密接近PrPSe處通過自然的構(gòu)象變化一皮轉(zhuǎn)化，PrPSe看起來伴護(chaperone)了這種變化。這個發(fā)現(xiàn)與以下認(rèn)識相符，PrpSe的存在是PrpSe從PrpC前體"產(chǎn)生"所需的。在上述方法的更優(yōu)選的實施方式中，所述方法進(jìn)一步包括步驟f)從所述瓊脂糖凝膠釋放PrP"朊病毒蛋白質(zhì)和/或其衍生物。對于從瓊脂糖凝月交釋放PrP"朊病毒蛋白質(zhì)和/或其衍生物，優(yōu)選地添加離液劑和/或洗滌劑，優(yōu)選地添加尿素和/或鹽酸胍和/或SDS,更優(yōu)選地添加尿素和/或SDS,最優(yōu)選地添加包含8M尿素和5%SDS的凝月交加載緩沖液并施加電場。當(dāng)然，也可以采用通常用于阻斷酶對聚合物、優(yōu)選的糖衍生的聚合物的親和性的任何其他非破壞性方法。對于實踐根據(jù)本發(fā)明的方法，特別是從PrpC蛋白質(zhì)分離和/或富集朊病毒PrpSe蛋白質(zhì)的方法，優(yōu)選的是采用配體修飾的瓊脂糖凝膠，所述瓊脂糖凝膠是包含二價固定化金屬離子的金屬螯合瓊脂糖凝膠。由于瓊脂糖凝膠部分和任選地瓊脂糖凝膠的帶負(fù)電和/或金屬配體部分與PrpSe的結(jié)合、以及瓊脂糖凝膠的帶負(fù)電和/或金屬配體部分與Prpc的結(jié)合，金屬螯合的瓊脂糖凝膠以及帶負(fù)電的瓊脂糖凝膠例如磺丙基瓊脂糖凝膠和羧曱基瓊脂糖凝膠可以結(jié)合PrpSe以及PrpG蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物。本發(fā)明的分離方法的機制在于PrP"和PrpG對于瓊脂糖凝膠固定的金屬離子的不同結(jié)合性質(zhì)。雖然PrPSe看起來具有對瓊脂糖凝膠、二價金屬離子和負(fù)電荷的內(nèi)在親和性，Prpc看來僅對二價金屬離子和負(fù)電荷具有內(nèi)在親和性。因此，它們對瓊脂糖凝膠的不同親和性可以被用于分離它們。優(yōu)選地，金屬螯合的瓊脂糖凝膠的金屬離子選自由Ni2+、Zn2+、Co2+、Mg2+、Ca2+和Mn2+構(gòu)成的組。Ca"+和Mr^+的結(jié)合是較弱的，兩種離子都僅結(jié)合PrPSe和PrPG的單體。其他所提及的金屬離子Ni2+、Co2+、Zn"和Mn"更強地與PrPSc和Prpc的單體和寡聚體結(jié)合，因此是優(yōu)選的。因為它極好的結(jié)合性質(zhì)和由于它在體內(nèi)生理條件下沒有毒性，Zr^+對于實踐本發(fā)明的方法、用途和組合物的金屬螯合瓊脂糖凝膠是最優(yōu)選的。附帶地，如實施例1中展現(xiàn)的，Cu-瓊脂糖凝膠將不能有效地保持PrP"蛋白質(zhì)。在實施例l中，用C^+重新裝載Ni-高效瓊脂糖凝膠引起了大量BSA的非特異性結(jié)合(還參見附圖4,泳道l),因而，不適合于復(fù)雜的蛋白質(zhì)溶液中朊病毒蛋白質(zhì)的富集。因此，Grathwohl等人介紹的Cu-瓊脂糖凝膠將不能提供PrP"從PrPe中的定量分離所需的差異親和力。因而對于本發(fā)明的所有方法一般優(yōu)選的是，瓊脂糖凝膠不是012+金屬螯合的瓊脂糖凝膠。當(dāng)采用金屬螯合的瓊脂糖凝膠用于實踐本發(fā)明的方法時，選擇性釋放試劑優(yōu)選地是金屬螯合劑，優(yōu)選地是選自EDTA、咪唑和/或EGTA的試劑，更優(yōu)選地是EDTA。對于在本發(fā)明的方法中從金屬螯合的瓊脂糖中分離PrP"和Prpe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物，最優(yōu)選的是，所述金屬是Zi^+以及所述金屬螯合劑是EDTA。還優(yōu)選的是，用于分離PrpSe和PrpG蛋白質(zhì)的、容許Prpe和任選的非朊病毒蛋白質(zhì)從瓊脂糖凝膠固定的金屬離子上釋放的、本發(fā)明的方法的步驟d)中的條件包括，存在濃度5到50mM、更優(yōu)選的10到25mM的金屬螯合劑、最優(yōu)選濃度10到25mM的EDTA。還發(fā)現(xiàn)的是，向復(fù)雜的蛋白級分例如血液級分或腦組織勻漿中添加少量的螯合劑如EDTA、咪唑和/或EGTA可以幫助避免非特異性結(jié)合，并因而幫助從PrpSe和/或PrpC蛋白質(zhì)中分離非特異性材料。例如，對于某些血漿級分，發(fā)現(xiàn)10到25mMEDTA有效地降低非特異性結(jié)合。當(dāng)使用瓊脂糖凝膠固定的金屬離子工作時，人們必需小心，如果PrpG的釋放也不是期望的，螯合劑的降低非特異結(jié)合和釋放PrPc的效果不會重疊。此外，取決于非特異性結(jié)合蛋白質(zhì)的存在和數(shù)量，將必需采用上述優(yōu)選的濃度范圍，即，被提高，來補償非特異性蛋白質(zhì)的存在，所述非特異性蛋白質(zhì)消耗用于Prpc釋放的螯合劑。這種優(yōu)化處于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員的能力之內(nèi)。雖然如果本身不被屏蔽，但是瓊脂糖凝膠本身足以結(jié)合顯著數(shù)量的PrpSe,可能希望的是采用具有至少一種其他配體的瓊脂糖凝膠用于特異性地結(jié)合朊病毒PrPSe和/或PrPc蛋白質(zhì)，其中所述配體直接地或間接地，例如通過例如間隔區(qū)分子的方式，連接到瓊脂糖凝膠。在優(yōu)選的實施方式中，其他配體選自由朊病毒蛋白質(zhì)、朊病毒蛋白質(zhì)的功能衍生物、帶有His標(biāo)簽的朊病毒蛋白質(zhì)、朊病毒蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白、朊病毒蛋白質(zhì)結(jié)合抗體以及朊病毒蛋白質(zhì)特異性配體構(gòu)成的組。更優(yōu)選地，其他配體是朊病毒蛋白質(zhì)，例如朊病毒片段，例如牛PrP(25-241)，其直接或間接地，例如通過金屬螯合劑，結(jié)合到瓊脂糖凝膠。如之前在導(dǎo)言小節(jié)提及的，朊病毒蛋白質(zhì)或其衍生物與一種或多種朊病毒重復(fù)結(jié)構(gòu)的可逆的聚集提供了用于結(jié)合、濃縮、純化和/或除去朊病毒蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物的高度選擇性和有效性的手段(PCT/EP2004003060),所述一種或多種朊病毒重復(fù)結(jié)構(gòu)在6.2到7.8的pH值下與朊病毒蛋白質(zhì)寡聚化，在4.5到5.5的pH值下可以再次解離。對于實踐本發(fā)明，朊病毒重復(fù)結(jié)構(gòu)可以作為其他配體附著于瓊脂糖凝膠，以特異性地與朊病毒蛋白質(zhì)寡聚化從而結(jié)合它們。在更優(yōu)選的實施方式中，其他的配體是朊病毒蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物。用于實踐本發(fā)明的方法的瓊脂糖凝膠上的其他配體可以直接或間接地結(jié)合到瓊脂糖凝膠，優(yōu)選的是通過瓊脂糖凝膠和配體本身之間的間隔區(qū)部分來結(jié)合。雖然本發(fā)明的方法不限于任何特定的朊病毒蛋白質(zhì)或其衍生物，朊病毒蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物選自由來自人類、牛、羊、小鼠、倉鼠、鹿或大鼠來源的朊病毒蛋白質(zhì)和其衍生物構(gòu)成的組。此處在整個說明書和權(quán)利要求中使用的術(shù)語"朊病毒蛋白質(zhì)的功能衍生物"是指朊病毒蛋白質(zhì)的任何衍生物，特別是其片段，其包括至少一個或多個朊病毒重復(fù)結(jié)構(gòu)，優(yōu)選地2到4個、更優(yōu)選地4個朊病毒重復(fù)結(jié)構(gòu)。在優(yōu)選的實施方式中，朊病毒蛋白質(zhì)的功能衍生物具有至少一個朊病毒重復(fù)結(jié)構(gòu)，所述朊病毒重復(fù)結(jié)構(gòu)是八肽、偽八肽、六肽、偽六肽，更優(yōu)選的是具有選自由PHGGGWGQ(人類)、PHGGSWGQ(小鼠)和PHGGGWSQ(大鼠)構(gòu)成的組的序列的八肽，或衍生自所述序列的偽八肽，優(yōu)選地選自PHGGGGWSQ(各種物種)和PHGGGSNWGQ(有袋動物)，或具有選自由PHNPGY(雞)、PHNPSY、PHNPGY(烏龜)構(gòu)成的組的序列的六肽，或是來自所述序列的偽六肽。在更優(yōu)選的實施方式中，至少一個、優(yōu)選地每個所述朊病毒重復(fù)結(jié)構(gòu)包含連接到C-末端卩轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的N-末端環(huán)體構(gòu)象。最優(yōu)選地，用于實踐本發(fā)明的功能衍生物也能夠可逆地聚集和/或解離，即，在水性液體環(huán)境中在6.2到7.8的pH值下寡聚化和/或在4.5到5.5的pH值下使寡聚體聚集物解離。對于實踐本發(fā)明的方法有用的朊病毒蛋白質(zhì)的功能衍生物也可以是特征在于它們結(jié)合非屏蔽的瓊脂糖凝膠達(dá)到顯著的程度。顯著的程度是指相對于衍生所述衍生物的天然發(fā)生的朊病毒蛋白質(zhì)，優(yōu)選地至少50、更優(yōu)選地至少70、再更優(yōu)選地至少80、以及最優(yōu)選地至少90%的所述衍生物結(jié)合到未結(jié)合的瓊脂糖凝膠。為了測定瓊脂糖凝膠結(jié)合朊病毒蛋白質(zhì)衍生物的程度，可以使用例如瓊脂糖凝膠⑧4B(Sigma,產(chǎn)品編碼4B-200)評定瓊脂糖凝月交結(jié)合。這種分一斤的參數(shù)可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)地測定。朊病毒蛋白質(zhì)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解，在此提及的朊病毒蛋白質(zhì)的功能衍生物可以是簡要地和足夠地特征在于它們包含至少一種上述朊病毒重復(fù)結(jié)構(gòu)并能夠結(jié)合未屏蔽的瓊脂糖凝膠。對于牛朊病毒蛋白質(zhì)或其衍生物，朊病毒蛋白質(zhì)與瓊脂糖凝膠的結(jié)合被認(rèn)為受到結(jié)構(gòu)域102-241的影響，其相應(yīng)于人類PrP中氨基酸殘基90到230。其他物種的朊病毒蛋白質(zhì)和其衍生物中的類似區(qū)域具有類似的瓊脂糖凝膠結(jié)合活性。在優(yōu)選的實施方式中，用于實踐本發(fā)明的功能衍生物包括一個或多個氨基酸的刪除、取代和/或插入、和/或一個或多個氨基酸的共價修飾來自朊病毒蛋白質(zhì)。在更優(yōu)選的實施方式中，用于實踐本發(fā)明的功能衍生物包括人類PrP的一個或多個八肽重復(fù)序列，優(yōu)選地包括氨基酸51-卯個，和/或C-末端結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選地包括氨基酸121-230個。如果采用配體修飾的瓊脂糖凝膠，在允許所述瓊脂糖凝膠與朊病毒PrPSe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物的結(jié)合以及任選的配體修飾的瓊脂糖凝膠的配體部分與PrPc蛋白質(zhì)的結(jié)合的條件下使朊病毒PrP"蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物與瓊脂糖凝膠接觸的條件優(yōu)選地是生理條件，更優(yōu)選地是5到8的pH值和2到39°C,更優(yōu)選地是約7的pH值和約20到25°C。用于使瓊脂糖結(jié)合到朊病毒蛋白質(zhì)和其功能衍生物的進(jìn)一步的條件是離子強度、緩沖物質(zhì)等等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以常規(guī)地確定適合的和優(yōu)化的條件用于使瓊脂糖凝膠結(jié)合到朊病毒蛋白質(zhì)。當(dāng)術(shù)語"除去"用于消除未結(jié)合的非朊病毒蛋白質(zhì)、體液和/或PrPG蛋白質(zhì)和/或其衍生物的上下文中時是指用于分離蛋白質(zhì)和瓊脂糖凝膠材料的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如離心、過濾、超濾，等等。朊病毒蛋白質(zhì)的瓊脂糖凝膠，6.2到7.8的pH值是優(yōu)選的。在另一個優(yōu)選的實施方式中，接觸瓊脂糖凝膠和朊病毒蛋白質(zhì)的條件包括存在至少一種洗滌劑和/或細(xì)胞裂解緩沖液。這樣，存在于感興趣的樣品中的細(xì)胞和/或膜級分可以通過根據(jù)本發(fā)明的方法直接地處理，而不需任何預(yù)先步驟用于解放朊病毒蛋白質(zhì)或其功能衍生物并使它們可接近。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明涉及瓊脂糖凝膠、優(yōu)選配體修飾的瓊脂糖凝膠的用途，用于在根據(jù)本發(fā)明的方法中從其他的蛋白質(zhì)中分離和/或除去朊病毒PrPSe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物。在優(yōu)選的實施方式中，瓊脂糖凝月交在上述方法之一中4吏用，用于從全血、血液級分或腦組織勻漿中、優(yōu)選的從血漿中濃縮、純化和/或除去朊病毒PrPSe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方式中，所使用的瓊脂糖凝膠是金屬螯合的瓊脂糖凝膠，優(yōu)選包含二價金屬離子，更優(yōu)選地包含選自由Ni2+、Co2+、Zn"和Mn"構(gòu)成的組的金屬離子，最優(yōu)選地包含Zn2+。附圖圖l說明了重組PrP-(3和PrP-純與Ni瓊脂糖凝膠高效的特異性結(jié)合(實施例1和4)。l:80mMEDTA，2:60mMEDTA，3:50mMEDTA，4:40mMEDTA,5:30mMEDTA,6:20mMEDTA,7:10mMEDTA,8:5mMEDTA,9:無EDTA,IO:標(biāo)準(zhǔn)蛋白。(a)BSA(b)牛PrP(25-241)p形式和純粹形式寡聚體(c)牛PrP(25-241)純形式(d)牛PrP(25-241)P形式(e)小鼠PrP(89-231)p形式。圖2顯示了PrP-(3和PrP-純與各種瓊脂糖凝膠的結(jié)合(實施例1)。l:藍(lán)色瓊脂糖凝膠⑧CL-6B,2:亞氨二乙酸瓊脂糖凝膠⑧，3:01-乳糖-瓊脂糖，4:凝集素瓊脂糖，5:蛋白A瓊脂糖凝膠⑧，6:苯基-瓊脂糖凝膠CL-6B,7:瓊脂糖凝膠⑧CL-4B,8:存在50mMEDTA的情況下的Ni瓊脂糖凝膠高效，9:Ni瓊脂糖凝膠高效，IO:標(biāo)準(zhǔn)蛋白。(a)BSA(b)牛PrP(25-241)p形式和純粹形式寡聚體(c)牛PrP(25-241)純粹形式(d)牛PrP(25-241)(3形式(e)小鼠PrP(89-231)p形式。圖3描繪了PrP-P和PrP-純與各種瓊脂糖凝膠的結(jié)合(實施例1)。1:SP瓊脂糖凝膠⑧，2:CM瓊脂糖凝膠⑧，3:鏈霉抗生物素蛋白畫氧化鐵顆粒，4:EZviewTM紅色鏈霉抗生物素蛋白親和凝膠，5:反應(yīng)性紅色120-瓊脂糖，6:亞氨二乙酸瓊脂糖凝膠⑧，7:瓊脂糖凝膠⑧4B,8:在存在50mMEDTA的情況下的Ni瓊脂糖凝膠高效，9:Ni瓊脂糖凝膠高效。(a)BSA(b)牛PrP(25-241)p形式和純形式寡聚體(c)牛PrP(25-241)純形式(d)牛PrP(25-241)|3形式(e)小鼠PrP(89-231)p形式。圖4展現(xiàn)了在重新加載了各種陽離子之后PrP-P和PrP-純與Ni瓊脂糖凝膠高效的結(jié)合(實施例1)。l:Cu2+，2:空泳道，3:Ag+,4:Mn2+,5:Zn2+，6:Co2+,7:Ni2+,8:Ni2+和在存在0.5%TritonX-100的情況下的結(jié)合，9:NP+和在存在50mMEDTA的情況下的結(jié)合，IO:未處理的基質(zhì)。(a)BSA(b)牛PrP(25-241)p形式和純形式寡聚體(c)牛PrP(25-241)純形式(d)牛PrP(25-241)p形式(e)小鼠PrP(89-231)p形式。圖5it明了在重新加載了各種陽離子之后PrP-p和PrP-純與Ni瓊脂糖凝膠高效的結(jié)合(實施例1)。l:未處理的基質(zhì)，2:N嚴(yán)和在存在50mMEDTA的情況下的結(jié)合，3:Ni2+,4:Mn2+，5:Mg2+,6:Ca2+,7:預(yù)加載BSA的Ni瓊脂糖凝膠基質(zhì)，8:預(yù)加載BSA的Ni瓊脂糖凝膠基質(zhì)。(a)BSA(b)牛PrP(25-241)P形式和純形式寡聚體(c)牛PrP(25-241)純形式(d)牛PrP(25-241)P形式(e)小鼠PrP(89-231)p形式。圖6顯示了在牛血液的各種級分中天然PrPc的濃度。用牛PrP(25-241)純形式預(yù)加載的Ni瓊脂糖凝膠高效用于濃縮(實施例2)。1和2:單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，3和4:嗜中性細(xì)胞，5和6:血小板，7和8:血漿，9:標(biāo)準(zhǔn)蛋白。(a)天然PrPc(b)牛PrP(25-241)純形式(c)具有朊病毒蛋白樣特征的蛋白質(zhì)。圖7描繪了在從牛血液的單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中濃縮之后天然PrPc的蛋白酶K裂解。用牛PrP(25-241)純形式預(yù)加載的Ni瓊脂糖湊是月交高效用于濃縮(實施例2)。1和2:沒有蛋白酶K,3:5i!g/ml蛋白酶K,4:25^g/ml蛋白酶K,5:50^g/ml蛋白酶K。(a)牛PrP(25-241)純形式寡聚體(b)天然PrPc(c)蛋白酶-截短的PrpC(d)牛PrP(25-241)純形式。圖8展現(xiàn)了在從牛的血漿中濃縮之后天然Prpc的蛋白酶K裂解。用牛PrP(25-241)純形式預(yù)加載的Ni瓊脂糖凝膠高效用于濃縮(實施例2)。1和2:沒有蛋白酶K,3:0.5[ig/ml蛋白酶K,4:5pg/ml蛋白酶K,5:50ng/ml蛋白酶K。(a)天然PrPc(b)蛋白酶-截短的PrpC(c)牛PrP(25-241)純形式。圖9說明了在從用天然綿羊癢病腦組織勻漿摻入的緩沖溶液中濃縮之后天然PrP"的蛋白酶K裂解。用牛PrP(25-241)純形式預(yù)加載的Ni瓊脂糖凝膠高效用于濃縮(實施例3)。A:在50mM磷酸鈉緩沖液中。B:在0.32M蔗糖、0.1%NP40、0.1%脫氧膽酸鹽中。1:沒有蛋白酶K,2:5(ig/ml蛋白酶K3:25pg/ml蛋白酶K。(a)天然PrpSe寡聚體(b)天然PrpSe單體形式。圖10顯示了在從牛血液的血小板濃縮之后天然Prpc和PrP&的蛋白酶K裂解。用牛PrP(25-241)純形式預(yù)加載的Ni瓊脂糖凝膠高效用于濃縮(實施例3)。A:沒有刮削腦組織勻漿的血小板溶胞產(chǎn)物。B:在用天然綿羊癢病腦組織勻漿的血小板溶胞產(chǎn)物摻入之后。1:沒有蛋白酶K,2:50pg/ml蛋白酶K。(a)天然PrpSe寡聚體(b)天然PrpC和PrpSe單體形式。圖11描繪了天然PrpSe從重組PrP-純的分離。用牛PrP(25-241)純形式預(yù)加載的Nl瓊脂糖凝膠高效用于濃縮(實施例4)。1:沒有EDTA，2:5mMEDTA,3:10mMEDTA,4:15mMEDTA,5:20mMEDTA，6:30mMEDTA。(a)天然PrPSc寡聚體(b)二-糖基化的PrPSe(c)單糖基化的PrpSe(d)未糖基化的PrPSe(e)牛PrP(25-241)純形式。K裂解。用牛PrP(25-241)純形式預(yù)加載的Ni瓊脂糖凝膠高效用于濃縮(實施例5)。A:用BSE朊病毒實驗性地感染的牛。B:沒有BSE感染的牛。l:沒有蛋白酶K,2:25pg/ml蛋白酶K,3:50pg/ml蛋白酶K。(a)天然PrPc和PrP"形式(b)牛PrP(25-241)純形式。四個箭頭指明從用BSE朊病毒感染的牛一般地觀察到的、而不是從健康對照動物觀察到的PrPSe的蛋白酶K裂解產(chǎn)物。圖13說明了從牛的血漿中總PrP的消除。四個批次的用牛PrP(26-241)純形式預(yù)加載的Ni瓊脂糖凝膠高效用于分步地消除(實施例6)。/人兩個血液供體A和B獲得血漿。l:從血漿A的第一次消除，2:從血漿B的第一次消除，3:從血漿A的第二次消除，4:從血漿B的第二次消除，5:從血漿A的第三次消除，6:從血漿B的第三次消除，7:從血漿A的第四次消除，8:/人血漿B的第四次消除，9:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。(a)牛PrP(25-241)純形式寡聚體(b)天然PrPc(C)牛PrP(25-241)純形式。圖14:顯示了總PrP從人類血漿中的消除。四個批次的用人類PrP(23-230)純形式預(yù)加載的Ni瓊脂糖凝膠高效用于分步地消除(實施例6)。l:第一次消除，2:第二次消除，3:第三次消除，4:第四次消除。(a)牛PrP(25-241)純形式寡聚體(b)二糖基化的天然PrPc(c)天然PrPc的截短的形式(d)牛PrP(25-241)純形式。以下，將通過實施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，實施例將涉及本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式，其不能被看作限制本發(fā)明的范圍。實施例實施例1不同的瓊脂糖凝膠對PrPSe的總體高親和性結(jié)合實驗設(shè)計在存在1000倍過量的BSA的情況下用重組朊病毒蛋白質(zhì)研究了朊病毒蛋白質(zhì)對各種瓊脂糖凝膠的結(jié)合親和性和特異性。重組朊病毒蛋白質(zhì)PrP-純(al謹(jǐn)ag,產(chǎn)品編號P0001)和PrP-(3(aliconag,P0019和P0027)分別用作PrPc和PrPSe的模型物質(zhì)。由于它們的不同電泳運動性，牛PrP(25-241)和小鼠PrP(89-231)的(3-形式和牛PrP(25-241)的純形式可以由SDS-PAGE4艮好地分辨。為了進(jìn)行結(jié)合實驗，將所研究的5昭朊病毒蛋白質(zhì)和5mgBSA溶于含有50mM磷酸鈉、pH7的lml結(jié)合緩沖液中。取決于實驗設(shè)計，結(jié)合緩沖液含有添加劑如EDTA或洗滌劑。將瓊脂糖凝膠基質(zhì)和結(jié)合緩沖液的混合物在1.5ml小瓶中在4。C旋轉(zhuǎn)1h。隨后，在500g離心基質(zhì)，用1ml結(jié)合緩沖液洗滌兩次來除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。瓊脂糖凝膠結(jié)合的蛋白質(zhì)在含有5%SDS和8M尿素的10pl標(biāo)準(zhǔn)凝膠加載緩沖液中變性，通過SDS-PAGE在12%聚丙烯酰胺凝膠上分析。用所選的陽離子重新加載Ni瓊脂糖凝膠高效(Amersham,產(chǎn)品代碼17-526802)通過首先用含有50mMEDTA的結(jié)合緩沖液洗滌基質(zhì)兩次來除去結(jié)合的N嚴(yán)來進(jìn)行。將剝離的基質(zhì)用結(jié)合緩沖液洗滌兩次，通過在含有50mM金屬離子的結(jié)合緩沖液中在4。C旋轉(zhuǎn)IO分鐘來重新加載。在用結(jié)合緩沖液洗滌兩次之后除去未結(jié)合的金屬離子。結(jié)果結(jié)果在以下的表l中概述其中"-"代表瓊脂糖凝膠對PrP沒有親和性，"+"代表對單體PrP形式的親和性，"++"代表對單體？^形式的高親和性，"+++"代表對單體和寡聚體形式的PrP的高親和性。術(shù)語"單體"和"寡聚體"PrP形式是指在SDS-PAGE中在非還原條件下觀察到的二硫化物連接的寡聚體，而不是沒有分子間二硫鍵的聚集的PrP形式。未連接的瓊脂糖凝膠以高親和性結(jié)合牛PrP(25-241)的(3形式和小鼠PrP(89-231),而不結(jié)合牛PrP(25-241)的純形式。結(jié)合對單體形式而不對寡聚體形式發(fā)生(圖2泳道7;圖3泳道7)。雖然相對PrP有1000倍過量的BSA,但是與瓊脂糖凝膠基質(zhì)結(jié)合的白蛋白的相對數(shù)量是相對低的，表明PrP結(jié)合是高度特異性的。帶負(fù)電的瓊脂糖凝膠以高親和性結(jié)合牛PrP(25-241)的p形式和小23鼠PrP(89-231)以及牛PrP(25-241)的純形式。結(jié)合發(fā)生在單體和多聚體PrP形式上(圖3泳道1和2)。如對BSA的強結(jié)合所表明的，帶正電的瓊脂糖凝膠顯示了非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合親和性。由于在SDS-PAGE凝膠上加載的大量的總蛋白，不能夠確定結(jié)合的PrP的數(shù)量。測試的某些配體修飾的瓊脂糖凝膠以高親和性結(jié)合牛PrP(25-241)的(3形式和小鼠PrP(89-231)以及牛PrP(25-241)的純形式。結(jié)合發(fā)生在單體上而不發(fā)生在寡聚體的PrP形式上(圖2泳道4和5;圖3泳道3和6)。然而，一些其他配體修飾的瓊脂糖凝膠顯示了非特異性蛋白結(jié)合親和性，如強的BSA結(jié)合所指示的(圖2泳道l-2和6;圖3泳道5)。IMAC-瓊脂糖凝膠以高親性結(jié)合牛PrP(25-241)的(3形式和小鼠PrP(89-231)以及牛PrP(25-241)的純形式。對于某些IMAC-瓊脂糖凝膠，例如Ni瓊脂糖凝膠高效(Amersham)，結(jié)合發(fā)生在單體上以及寡聚體的PrP形式上(圖1泳道9;圖2泳道9;圖3泳道9;圖4泳道10)。然而，許多瓊脂糖凝膠專一性地結(jié)合單體的PrP。IMAC瓊脂糖凝膠與朊病毒蛋白質(zhì)的結(jié)合受到螯合的金屬離子的種類的調(diào)節(jié)。重新加載N嚴(yán)、Zn"或Cc^+的Ni瓊脂糖凝膠高效以高親和性結(jié)合牛PrP(25-241)的p形式和小鼠PrP(89-231)以及牛PrP(25-241)的PrP-純形式(圖4泳道5、6、7和10)。寡聚體PrP形式與Ni瓊脂糖凝月交高效的結(jié)合在用0.5%TritonX-100洗滌之后保持不變(圖4泳道8),表明結(jié)合是特異性的。用BSA對Ni瓊脂糖凝膠高效的預(yù)包被引起了寡聚體PrP形式的更有效的結(jié)合(圖5泳道7-8)。用Cu"對Ni瓊脂糖凝膠高效的重新加載引起大量BSA的非特異性結(jié)合(圖4泳道1),因而不適合于復(fù)雜的蛋白質(zhì)溶液中朊病毒蛋白質(zhì)的特異性富集。用Mn2+、Mg^或Ca"+重新加載的Ni瓊脂糖凝膠高效主要結(jié)合單體的PrP(圖4泳道4;圖5泳道4-6)。解釋PrP-(3與瓊脂糖凝膠的結(jié)合受以下調(diào)節(jié)-瓊脂糖凝膠基質(zhì)的可接近性-瓊脂糖凝膠固定化金屬離子的存在-瓊脂糖凝膠上負(fù)電荷的存在PrP-純與瓊脂糖凝膠的結(jié)合受以下的調(diào)節(jié)-瓊脂糖凝膠固定化金屬離子的存在-瓊脂糖凝膠上負(fù)電荷的存在對(3形式與瓊脂糖凝膠的內(nèi)在親和性負(fù)責(zé)的氨基酸位于牛朊病毒蛋白序列的殘基104到241之內(nèi)。含有八肽重復(fù)的殘基25到103因而不是瓊脂糖凝膠結(jié)合所需的。然而，通過固定的金屬離子和負(fù)電荷的結(jié)合，殘基23到103的存在引起對IMAC瓊脂糖凝膠或陽離子交換瓊脂糖凝膠的提高的親和性?？偨Y(jié)未連接的瓊脂糖凝膠具有對PrP-P(相應(yīng)于PrpSe)而不是對PrP-純(相應(yīng)于PrpC)的內(nèi)在結(jié)合親和性。因而未連接的瓊脂糖凝膠可以用于濃縮、純化和除去朊病毒而不影響PrpG的濃度。當(dāng)用固定的金屬離子(例如Ni2+、Zn2+、Co2+)或負(fù)電荷(例如石黃丙基或羧甲基)修飾基質(zhì)時，PrP-P對瓊脂糖凝膠的結(jié)合親和性被提高，此時這些配體也結(jié)合PrP-純。因而IMAC瓊脂糖凝膠和帶負(fù)電的瓊脂糖凝膠可以用于濃縮、純化和除去各種朊病毒蛋白形式。實施例2血液中天然朊病毒蛋白質(zhì)的濃縮實驗設(shè)計健康人類和動物的血液中Prpc的數(shù)量僅僅是最低限的。沒有任何濃縮步驟，使用常規(guī)的分析方法例如蛋白質(zhì)印跡檢測不到PrPc。然而，將用牛PrP(25-241)純形式預(yù)加載的Ni瓊脂糖凝膠高效應(yīng)用于20ml血液，Prpe變得可見。通過向用50mM磷酸鹽緩沖液平^f的20ml瓊脂糖凝月交中添加5ng重組朊病毒蛋白質(zhì)來制備用牛PrP(25-241)預(yù)加載的Ni瓊脂糖凝膠高效。將混合物渦旋，在4。C下旋轉(zhuǎn)孵育lh?！ㄊ褂脴?biāo)準(zhǔn)方案從新鮮牛血液制備細(xì)胞溶胞產(chǎn)物和血漿。例如，在用檸檬酸鈉1/10稀釋到10mM的終濃度之后，從收集在EDTA試管中的20ml血液制備血漿級分。用Gey，s平衡鹽溶液(Sigma,產(chǎn)品碼G9779)1/1稀釋4寧檬酸血液，小心地混合。^!奪溶液分配到50mlFalcon試管中，每個試管的最大體積為15ml,打開閘時在200g離心7分鐘。向上清液中添加EDTA到終濃度10mM,打開閘時在560g離心10分鐘。通過向每個血液級分中添加用牛PrP(25-241)預(yù)加載的60plNi瓊脂糖凝膠高效來濃縮天然血液PrP。將蛋白溶液在4。C旋轉(zhuǎn)孵育1h,在500g離心2分鐘。丟棄上清液，將瓊脂糖凝膠用含有100mM磷酸鈉、10mMTris、20mM咪唑、pH8的1mL緩沖液洗滌兩次以除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。對于連續(xù)的蛋白酶K消化，將每個血液級分分成三部分。將與瓊脂糖凝膠結(jié)合的蛋白質(zhì)與濃度0jtig/ml到50)Lig/ml之間的蛋白酶K(Sigma，P2308)孵育，在37匸以1400rpm在Eppendorf熱混合器中搖動lh。樣品體積是在0.2mLPCR試管中的80|il，裂解緩沖液由50mM石壽酸鈉、pH7和150mMNaCl組成。為了確保在蛋白酶K反應(yīng)期間瓊脂糖凝月交基質(zhì)的均勻分布，向PCR試管中添加切成0.5cm長度的10(il尖頭(Treff)。通過添加2pl150mMPMSF貯備溶液終止反應(yīng)。渦^走試管，在500g離心2分鐘，丟棄上清液。使與瓊脂糖凝膠結(jié)合的蛋白質(zhì)在含有5%SDS和8M尿素的10jnl凝l交加載緩沖液中變性，并加載到12%丙烯酰胺凝膠上。使用半干的不連續(xù)的三緩沖系統(tǒng)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF上。轉(zhuǎn)移是在1mA/cm2下持續(xù)lh。使用ECL高級蛋白質(zhì)印跡檢測試劑盒(Amersham)、PrP特異性單克隆抗體和過氧物酶聯(lián)結(jié)的抗小鼠單克隆抗體的標(biāo)準(zhǔn)方案分析印跡。結(jié)果在濃縮之后，在各種血液級分中測量到納克數(shù)量的Prpc,包括單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞、血小板和血漿(圖6)。血液細(xì)月包和血漿中的天然PrPc是二糖基化的，具有約35kDa的表觀分子量。嗜中性細(xì)胞不表達(dá)顯著數(shù)量的朊病毒蛋白質(zhì)。與瓊脂糖凝膠結(jié)合的PrP對于蛋白酶K消化是可接近的。在用5嗎/ml蛋白酶K處理來自細(xì)胞溶胞產(chǎn)物或血漿的固定的朊病毒蛋白質(zhì)一小時之后，Prpc部分地降解，顯示約30kDa的表觀分子量(圖7和8)。在IO倍高的蛋白酶K濃度下，朊病毒蛋白質(zhì)被完全地降解?？偨Y(jié)IMAC-瓊脂糖凝膠構(gòu)成了用于從體液濃縮總朊病毒蛋白質(zhì)的極好的基質(zhì)。瓊脂糖凝膠固定的朊病毒蛋白質(zhì)對于朊病毒診斷中采用的進(jìn)一步的生化分析例如蛋白酶消化是可接近的。實施例3在用腦組織勻漿摻入之后濃縮血液中的PrPSe實驗設(shè)計血液中天然PrPSe的性質(zhì)是未知的，然而看起來它具有與腦中發(fā)現(xiàn)的PrpSe相似的生物化學(xué)性質(zhì)。我們使用來自腦組織勻漿(Prpse濃度在1pg/ml和lng/ml之間)的PrpS"乍為模型底物來分析它與牛PrP(25-241)預(yù)加載的Ni瓊脂糖凝膠高效的結(jié)合。濃縮實驗如實施例2中描述的進(jìn)行，只是向樣品中添加各種數(shù)量的綿羊癢病腦組織勻漿。結(jié)果在向腦組織勻漿中摻入1mL磷酸鈉緩沖液pH8到1ng/mlPrPSe的終濃度和隨后的200倍濃縮之后，二糖基化的、單糖基化的和未糖基化的PrP"以及多聚體形式可以在蛋白質(zhì)印跡中檢測到(圖9)。因而，獨立于聚集和糖基化狀態(tài)，PrpSe有效地結(jié)合瓊脂糖凝膠。在存在5和25昭/ml蛋白酶K的情況下，約70個殘基從固定的PrPSe的N-末端除去。高達(dá)5000倍濃縮的PrpSc、以及在含有0.5%TritonX-IOO、0.5%脫氧膽酸鹽和0.43%蔗糖的磷酸鹽緩沖液中獲得了類似的結(jié)果。甚至在N-末端截斷之后，PrPSe與瓊脂糖凝膠的結(jié)合不由于洗滌劑或碳水化物的存在而減少。使用血小板溶胞產(chǎn)物和血漿獲得了類似的結(jié)果。來自腦組織勻漿的天然血液Prpc和PrpSe通過瓊脂糖凝膠基質(zhì)被共同濃縮。在存在5昭/ml蛋白酶K的情況下，天然PrpC被完全降解(圖10A),而濃縮的PrpSe顯示了二糖基化、單糖基化和未糖基化形式的典型模式(圖10B)?？偨Y(jié)IMAC-瓊脂糖凝膠構(gòu)成了用于從體液濃縮傳染性朊病毒的極好的基質(zhì)。瓊脂糖凝膠固定的PrpSe質(zhì)對于朊病毒診斷中采用的進(jìn)一步的生化分析例如蛋白酶K消化是可接近的。實施例4濃縮的朊病毒蛋白質(zhì)的構(gòu)象特異性洗脫實驗設(shè)計如之前的實施例所提及的，Ni瓊脂糖凝月交高-爻以高親和性結(jié)合重組蛋白PrP-p和PrP-純以及結(jié)合天然PrpG和PrPSe。為了研究瓊脂糖凝膠基質(zhì)的洗脫性質(zhì)，我們使用了與之前相同的實驗設(shè)計，唯一例外是結(jié)合緩沖液含有各種濃度的EDTA。結(jié)果在存在10mMEDTA的情況下，專門地，重組PrP的二聚形式一皮乂人瓊脂糖凝膠基質(zhì)上釋放。在存在40mMEDTA的情況下，牛PrP(25-241)的純形式被釋放，而(3形式甚至在80mMEDTA濃度下保持結(jié)合到瓊脂糖凝膠(圖1)。當(dāng)用Ni瓊脂糖凝月交高效處理時，PrpSe的三種糖形式和重組牛PrP(25-241)被共同濃縮。在用提高濃度的EDTA洗滌瓊脂糖凝膠基質(zhì)之后，牛PrP(25-241)被逐漸地釋放，而PrpSM呆持結(jié)合(圖11)。因而，代表天然PrPc的純形式從瓊脂糖凝膠上特異性地釋放。摻入了來自綿羊癢病腦組織勻漿后的血液的天然PrPc獲得了類似的結(jié)果。解釋向Ni瓊脂糖凝膠高效添加EDTA引起獨立的Ni^從瓊脂糖凝膠上的剝離。在瓊脂糖凝膠固定的Ni+的數(shù)量低于某一值的EDTA濃度下，沒有足夠可用的結(jié)合位點，Prpc從瓊脂糖凝膠上釋放。相比之下，PrP"保持結(jié)合，因為它的另外的瓊脂糖凝膠結(jié)合活性。總結(jié)IMAC-瓊脂糖凝力交構(gòu)成了用于從體液濃縮Prpc和PrPSe、隨后在存在EDTA的情況下分離兩種PrP構(gòu)象體的極好的基質(zhì)。實施例5來自BSE感染的牛的血液中天然PrpSe的檢測實驗設(shè)計在用BSE朊病毒感染的牛的血液中PrPSe的數(shù)量僅僅是最低限度的。沒有任何濃縮步驟，使用常規(guī)的分析方法例如蛋白質(zhì)印跡檢測不到PrPSe。然而，將用牛PrP(25-241)純形式預(yù)加載的Ni瓊脂糖凝膠高效應(yīng)用于用BSE實驗地感染的牛的20ml血液，PrpSc變得可見。對于這些實驗，我們使用了與實施例2中相同的實驗設(shè)置。結(jié)果在用25昭/ml或50pg/ml蛋白酶K處理來自血漿的固定朊病毒蛋白質(zhì)之后，存在著四種朊病毒蛋白質(zhì)條帶的積累，對于BSE感染的牛這是一般檢測到的(圖12A)。相對于沒有蛋白酶K的情況下未降解的PrPG,微克數(shù)量的PrP"移位了。對照牛沒有觀察到這樣的條帶。(圖12B)?？偨Y(jié)IMAC-瓊脂糖凝膠構(gòu)成了用于纟僉測來自BSE感染的牛的體液的天然PrpSe的極好的基質(zhì)。實施例6通過過濾除去血液中的天然朊病毒蛋白質(zhì)實一瞼設(shè)計根據(jù)早先的實施例，結(jié)果是所使用的少量的瓊脂糖凝膠具有納克范圍內(nèi)的結(jié)合能力。因而瓊脂糖凝膠可以用于總朊病毒蛋白質(zhì)從體液，例如人類和動物血漿中的完全消除。對于血漿過濾實驗，我們使用如實施例2中描述的相同的實驗設(shè)置，只是連續(xù)地向相同的血漿中添加四批次的瓊脂糖凝膠基質(zhì)。將用于過量人類和牛血漿的Ni瓊脂糖凝^I交高效分別用人類PrP(23-230)、牛PrP(25-241)的純形式預(yù)先加載。結(jié)果在10ml來自牛血液的血漿中孵育l小時之后，用牛PrP(25-241)純形式預(yù)加載的第一批次20plNi瓊脂糖凝膠高效結(jié)合納克數(shù)量的天然朊病毒蛋白質(zhì)(圖13)。第二批次的瓊脂糖凝膠完全沒有朊病毒蛋白質(zhì)，達(dá)到lpg的檢測極限。對于第三和第四批次的瓊脂糖凝膠獲得了相同的結(jié)果。因而，在與瓊脂糖凝膠基質(zhì)第一次孵育時間之后已經(jīng)從血漿中除去了全部朊病毒蛋白質(zhì)。在10ml來自人的血漿中孵育1小時之后，用人PrP(23-230)純形式預(yù)加載的第一批次20plNi瓊脂糖凝膠高效也結(jié)合納克數(shù)量的天然朊病毒蛋白質(zhì)(圖14)。當(dāng)與之前的批次比較時，第二和第三批次的瓊脂糖凝膠分別結(jié)合相對更少的朊病毒蛋白質(zhì)。第四批次的瓊脂糖凝膠完全沒有朊病毒蛋白質(zhì)，達(dá)到lpg的^f企測極限。因而，所有朊病毒蛋白質(zhì)已經(jīng)從人血漿中除去。在人血漿中約4倍數(shù)量的Prpc解釋了當(dāng)與牛血漿相比時對于人血漿的過濾需要更大數(shù)量的瓊脂糖凝膠?？偨Y(jié)IMAC-瓊脂糖凝膠構(gòu)成了用于從體液例如人類和牛血漿中除去天然朊病毒蛋白質(zhì)的極好的基質(zhì)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>+++prpSe單體和多聚體結(jié)合++PrPSe單體結(jié)合+PrPSe單體結(jié)合但有比++更低的親和性-沒有PrpSe結(jié)合權(quán)利要求1.一種濃縮和/或純化朊病毒PrPSc蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物的方法，包括以下步驟a)在容許瓊脂糖凝膠與朊病毒PrPSc蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物的特異性的和高親和性的結(jié)合的條件下使朊病毒PrPSc蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物與瓊脂糖凝膠接觸，b)從所述瓊脂糖凝膠中除去未結(jié)合的非朊病毒蛋白質(zhì)，其中所述瓊脂糖凝膠不是Cu2+螯合的瓊脂糖。2.—種從體液中除去朊病毒PrPSe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物的方法，包括以下步驟a)在容許瓊脂糖凝膠與朊病毒PrPSe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物的特異性的和高親和性的結(jié)合的條件下使包含朊病毒PrPSe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物的體液與瓊脂糖凝膠接觸，b)從所述瓊脂糖凝膠中除去所述體液。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述體液選自全血、血液級分或腦組織勻漿，優(yōu)選地選自血漿。4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項的方法，其中所述瓊脂糖凝膠選自未連接的瓊脂糖凝膠，優(yōu)選地選自由瓊脂糖凝膠2B、4B、6B、瓊脂糖凝膠CL-4B、瓊脂糖凝膠-68@、Superdex75、聚丙烯酰胺葡聚糖100HI^和交聯(lián)葡聚糖凝膠Gl(f構(gòu)成的組。5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項的方法，其中所述瓊脂糖凝膠選自配體修飾的瓊脂糖凝膠，優(yōu)選地選自由螯合金屬的瓊脂糖凝膠、凝集素瓊脂糖、亞氨基二乙酸瓊脂糖凝膠、蛋白A瓊脂糖、鏈霉抗生物素蛋白瓊脂糖凝膠、磺丙基瓊脂糖凝膠和羧甲基瓊脂糖凝膠構(gòu)成的組，更優(yōu)選地選自螯合金屬的瓊脂糖凝膠，以及最優(yōu)選地，所述瓊脂糖凝膠是Zn-瓊脂糖凝膠。6.—種從PrPc蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物中分離和/或富集朊病毒PrPSe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物的方法，包括以下步驟a)在一定條件下使朊病毒PrP"蛋白質(zhì)和PrpG蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物與配體修飾的瓊脂糖凝膠接觸，所述條件容許(i)所述瓊脂糖凝膠部分與所述朊病毒PrP"蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物的特異性的和高親和性的結(jié)合，以及(ii)瓊脂糖凝膠的所述配體部分與PrpG蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物的結(jié)合，b)任選地從所述配體修飾的瓊脂糖中除去未結(jié)合的材料，c)任選地等待足夠的時間，以便在緊密鄰近朊病毒PrpSe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物處的某些或大多數(shù)與配體結(jié)合的PrPc蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物轉(zhuǎn)變成朊病毒PrpSe蛋白質(zhì)和/或功能衍生物，d)在一定條件下向來自步驟a)、b)或c)的與瓊脂糖凝膠結(jié)合的蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物中添加選擇性釋放試劑，所述條件容許Prpc蛋白質(zhì)和任選的非朊病毒蛋白質(zhì)從所述瓊脂糖凝膠的配體部分釋放，但不容許朊病毒PrPSe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物從所述瓊脂糖凝膠部分釋放，以及e)從所述瓊脂糖凝膠中除去PrPc和任選的非朊病毒蛋白質(zhì)。7.權(quán)利要求6的方法，進(jìn)一步包括步驟f)從所述瓊脂糖凝膠釋放PrP"朊病毒蛋白質(zhì)和/或其衍生物。8.權(quán)利要求7的方法，其中通過添加離液劑和/或洗滌劑，優(yōu)選地添加尿素和/或鹽酸胍和/或SDS，更優(yōu)選地添加尿素和/或SDS,最優(yōu)選地添加包含8M尿素和5%SDS的凝膠加載的緩沖液并施加電場來完成PrPSe朊病毒蛋白質(zhì)和/或其衍生物的釋放。9.權(quán)利要求5到8中任一項的方法，其中所述配體修飾的瓊脂糖凝膠是包含二價的固定的金屬離子的金屬螯合的瓊脂糖凝膠。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述金屬離子選自由Ni2+、Co2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+和Mn2+構(gòu)成的組。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述金屬離子選自由Ni2+、Co2+、Zn2+和Mn2+構(gòu)成的組。12.權(quán)利要求ll的方法，其中所述金屬離子是Zi^+。13.權(quán)利要求6到8中任一項的方法，其中所述配體修飾的瓊脂糖凝膠是根據(jù)權(quán)利要求9到12中任一項的金屬螯合的瓊脂糖凝膠，所述選擇性釋放試劑是金屬螯合劑，優(yōu)選地是選自EDTA、咪唑和/或EGTA的試劑。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述金屬螯合劑是EDTA。15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述金屬螯合的瓊脂糖凝膠包含Zn2、所述金屬螯合劑是EDTA。16.根據(jù)權(quán)利要求6到15中任一項的方法，其中容許非朊病毒蛋白質(zhì)和Prpc從瓊脂糖固定的金屬離子上釋放的權(quán)利要求6的步驟d)中的條件包括存在濃度5到50mM的金屬螯合劑、更優(yōu)選的10到25mM，最優(yōu)選的濃度10到25mM的EDTA。17.權(quán)利要求1到16中任一項的方法，其中用于結(jié)合朊病毒PrpSe和/或PrPc蛋白質(zhì)的至少一種其他配體直接或間接地與所述瓊脂糖凝膠結(jié)合。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述其他配體選自由朊病毒蛋白質(zhì)、朊病毒蛋白質(zhì)的功能衍生物、帶有His標(biāo)簽的朊病毒蛋白質(zhì)、朊病毒蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白、朊病毒蛋白質(zhì)結(jié)合抗體以及朊病毒蛋白質(zhì)特異性配體構(gòu)成的組。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述其他配體是朊病毒蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物。20.權(quán)利要求17到19中任一項的方法，其中所述其他配體直接地或間接地，優(yōu)選地通過間隔區(qū)部分結(jié)合到瓊脂糖凝膠。21.根據(jù)權(quán)利要求1到20中任一項的方法，其中所述朊病毒蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物選自由來自人類、牛、羊、小鼠、倉鼠、鹿或大鼠來源的朊病毒蛋白質(zhì)和其衍生物構(gòu)成的組。22.權(quán)利要求1到21中任一項的方法，其中所述功能衍生物通過一個或多個氨基酸刪除、取代和/或插入，和/或一個或多個氨基酸的共價修飾從朊病毒蛋白質(zhì)衍生得到。23.權(quán)利要求1到22中任一項的方法，其中所述功能衍生物包含人類PrP的一個或多個八肽重復(fù)序列，優(yōu)選包含氨基酸51-90個，和/或C-末端結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選包含氨基酸121-230個。24.權(quán)利要求1到23中任一項的方法，其中用于瓊脂糖凝膠與朊病毒PrpSe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物結(jié)合的條件是生理條件，優(yōu)選5到8的pH值和2到39°C,更優(yōu)選約7的pH值和約2到。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述條件包括存在至少一種洗滌劑和/或細(xì)胞裂解緩沖液。26.具有對Prpse的特異性和高親和性結(jié)合的瓊脂糖凝膠在根據(jù)權(quán)利要求1到25中任一項的方法中用于從其他蛋白質(zhì)中濃縮、純化和/或除去朊病毒PrPSe蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物的用途。27.才艮據(jù)權(quán)利要求26的瓊脂糖凝膠的用途，用于/人全血、血液級分或腦組織勻漿中、優(yōu)選地從血漿中濃縮、純化和/或除去朊病毒PrPSc蛋白質(zhì)和/或其功能衍生物。28.權(quán)利要求26或27的用途，其中所述瓊脂糖凝膠是金屬螯合的瓊脂糖，優(yōu)選地包含二價金屬離子，更優(yōu)選地包含選自由Ni2+、Co2+、Zn"和Mi^+構(gòu)成的組的金屬離子，最優(yōu)選地包含Zn2+。全文摘要本發(fā)明涉及通過在容許瓊脂糖凝膠與朊病毒PrP^Sc蛋白質(zhì)特異性的和高親和性的結(jié)合的條件下使朊病毒PrP^Sc蛋白質(zhì)與瓊脂糖凝膠接觸、并從所述瓊脂糖凝膠中除去未結(jié)合的非朊病毒蛋白質(zhì)來濃縮和/或純化朊病毒PrP^Sc蛋白質(zhì)的方法，以及涉及通過在容許瓊脂糖凝膠與朊病毒PrP^Sc蛋白質(zhì)特異性的和高親和性的結(jié)合的條件下使體液與瓊脂糖凝膠接觸、并從所述瓊脂糖凝膠中除去體液來從體液中除去朊病毒PrP^Sc蛋白質(zhì)的方法。此外，本發(fā)明涉及通過在容許瓊脂糖凝膠部分與朊病毒PrP^Sc蛋白質(zhì)的特異性的和高親和性的結(jié)合以及瓊脂糖凝膠的配體部分與PrP^C蛋白質(zhì)結(jié)合的條件下使朊病毒PrP^Sc蛋白質(zhì)和PrP^C蛋白質(zhì)與配體修飾的瓊脂糖凝膠接觸、在容許非朊病毒蛋白質(zhì)和PrP^C蛋白質(zhì)從瓊脂糖凝膠的配體部分中釋放、而不容許朊病毒PrP^Sc蛋白質(zhì)的釋放的條件下向與瓊脂糖凝膠結(jié)合的蛋白質(zhì)中添加選擇性釋放試劑、以及從瓊脂糖凝膠中除去非朊病毒蛋白質(zhì)和PrP^C蛋白質(zhì)，來從PrP^C蛋白質(zhì)中分離和/或富集朊病毒PrP^Sc蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明的另一個方面涉及上述方法用于濃縮、純化和/或除去朊病毒PrP^Sc蛋白質(zhì)的用途。文檔編號C12P21/02GK101316933SQ200680040473公開日2008年12月3日申請日期2006年10月25日優(yōu)先權(quán)日2005年10月28日發(fā)明者A·埃爾格戴利,N·弗蘭斯西尼,R·扎恩,S·弗拉尼特扎,U·馬瑟伊申請人:艾利康股份公司