專利名稱：嚙齒動物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)的制作方法
嚙齒動物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá) 本發(fā)明涉及異源蛋白質(zhì)在嚙齒動物細(xì)胞中的表達(dá)。編碼蛋白質(zhì)的核酸
被提供于附加體上，其處于EB病毒的oriP/EBNA-l-系統(tǒng)的控制和保持下， 其中，oriP和EBNA-l的結(jié)構(gòu)基因位于細(xì)胞中不同的元件上。
背景技術(shù)：
過去數(shù)年間生物技術(shù)生產(chǎn)工藝的作用和影響越發(fā)重要。隨著生物技術(shù) 工藝重要性日益增加，生產(chǎn)的產(chǎn)品的復(fù)雜性也穩(wěn)步增長。
可能用來表達(dá)異源蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞是HEK(人胚腎)、 HeLa(Henrietta Lacks)、 COS(經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化的非洲綠猴腎細(xì)胞)和CHO(中 國倉鼠卵巢)細(xì)胞，因?yàn)樵谶@些宿主中表達(dá)的異源蛋白質(zhì)可按照人細(xì)胞中的 情形被折疊、加工、由蛋白酶使其成熟、糖基化和硫酸化(見，例如Watson， E.,等人，Glycobiol. 4 (1994) 227-37)。
EB病毒(EBV)是人B淋巴細(xì)胞的病原體。其屬于人類皰滲病毒類(皰 瘆病毒科(herpesviridae))。經(jīng)EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞可能不受調(diào)控地增殖 (propagate)(Miller， G"由Fields, B.在Virology中編著，B" Raven Press, N.Y. (1985) 563-5卯)。經(jīng)EBV轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的特征性特點(diǎn)是所謂的EB病毒 核抗原(EBNA)蛋白質(zhì)的表達(dá)。其中，目前已鑒定出了六種不同的變體。
EBNA-1蛋白質(zhì)在EBV核酸在經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的復(fù)制循環(huán)中發(fā)揮重要作 用。與第二 EBV元件(順式作用的復(fù)制起點(diǎn)(oriP))組合，附加體得以在細(xì) 胞中復(fù)制和保持(Lupton， S.，和Levine， A.J.， Mol. Cell. Biol. 5 (1985) 2533-2542; Yates, J.L.，等人，Nature (London) 313 (1985) 812-815)。
oriP片斷由兩個區(qū)域構(gòu)成二重對稱元件和重復(fù)家族。第一種是65bp 的序列片斷。其在病毒的核酸中被大約1000 bp與重復(fù)家族分離開。這一 第二種片斷由重復(fù)了 20次的30 bp的序列組成(Hudson， G.S.，等人，
Virology 147 (1985) 81-98; Rdsman， D.,等人，Mol. Cell, Biol. 5 (1985) 1822-1832)。 30bp重復(fù)家族具有增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的能力，而二重對稱元件則在復(fù) 制中發(fā)揮作用。完整的oriP-片斷協(xié)助對質(zhì)粒的染色體外保持。
EBNA-1蛋白質(zhì)(即，反式作用起始蛋白質(zhì))和oriP的組合允許質(zhì)粒的 構(gòu)建，該質(zhì)粒一旦被引入細(xì)胞，它們可作為附加體穩(wěn)定保持，并且在細(xì)胞 增殖期間穩(wěn)定復(fù)制(見，例如，Yates， J丄.，等人，Nature (London) 313 (1985) 812-815; Rdsman， D.，等人，Mol. Cell. Biol. 5 (1985) 1822-1832)。這兩種 元件利用宿主細(xì)胞的復(fù)制機(jī)制來復(fù)制附加體(Bode， J.，等人，Gene Ther. Mol. Biol. 6 (2001) 33-46)。
Krysan， P.J.，等人(Mol. Cell. Biol. 9 (1989) 1026腸1033)表明，包含 EBV復(fù)制起點(diǎn)重復(fù)家族的質(zhì)?？杀挥谰帽Ａ粲谌祟惣?xì)胞的細(xì)胞核中。因 此，EBNA-1蛋白質(zhì)的存在M夠的，不需要EBV的其它元件(還見Aiyar， A.，等人，EMBO J. 17 (1998) 6394-6403; Hung， S.C.,等人，PNAS 98 (2001) 1865-1870 ; Yates， J.L" in DNA Replication in Eukaryotic Cells, DePhamphilis編著，M丄.，Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1996)第 751-774頁；Yates， J丄.，等人，J. Vir. 74 (2000) 4512-4522)。
EBNA-1蛋白質(zhì)在游離型復(fù)制期間將附加體與宿主細(xì)胞染色體相連， 由此確保了細(xì)胞分裂期間附加體的增殖。
此種相互關(guān)系對于其它一些病毒來說也是已知的，例如，來自猿猴病 毒40(SV 40)的大T-抗原和來自牛乳頭瘤病毒(BPV)的El/E2蛋白質(zhì)(見， 例如Gilbert, D.M.，等人，Cell 50 (1987) 59-68; DuBridge， R.B.，等人， Mutagen. 3 (1988) 1-9; Lebkowski, J.S"等人，Mol. Cell. Biol. 4 (1984) 1951-1960)。
EBV的元件EBNA-1和oriP的組合已用于制備非整合的、染色體外 的、自主復(fù)制的附加體。例如Horlick等人使用穩(wěn)定表達(dá)EBNA-1蛋白質(zhì) 的HEK(人胚腎)細(xì)胞來從含有EBV oriP的質(zhì)粒表達(dá)CRHR(促腎上腺皮質(zhì) 激素釋放激素受體)(Horlick， R.A"等人，Prot. Exp. Purif. 9 (1997) 301-308)。
在美國專利4,686,186中，已報(bào)道了重組載體以及由此轉(zhuǎn)化的真核宿 主。EBV元件oriP和EBNA-1在重組載體上組合。
在WO 2002/0卯533中，才艮道了一種生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的方法，該方法 通過對懸浮培養(yǎng)的人胚腎細(xì)胞(293細(xì)胞系及其遺傳變體)進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染來 進(jìn)行。提供EBV復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒以染色體外方式保持。
在WO 2004/053137中，才艮道了一種在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)重組多肽和/或 未翻譯的RNA分子的方法。WO 2004/018506報(bào)道了可用于被瞬時轉(zhuǎn)染進(jìn) 哺乳動物宿主細(xì)胞的可調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)的組合物和方法。
美國專利申請2002/0086419報(bào)道了用于在真核宿主細(xì)胞中穩(wěn)定維持外 源DNA的重組載體以及該重組載體用于在宿主細(xì)胞中長期穩(wěn)定生產(chǎn)基因 產(chǎn)物的用途。
在美國專利5,707,830中報(bào)道了可用于轉(zhuǎn)染選用的哺乳動物宿主細(xì)胞 的表達(dá)載體。所ii^達(dá)載體含有EB病毒(Epstein-Barr-Virus)重復(fù)家族、 可在宿主細(xì)胞中功能性表達(dá)的EBNA-1基因的拷貝、真核DNA片段(其提 供載體在宿主細(xì)胞中復(fù)制的能力)和表達(dá)盒。
WO 2002/027005報(bào)道了增強(qiáng)的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，其包含附加體保持系統(tǒng)、強(qiáng) 啟動子/增強(qiáng)子、蛋白質(zhì)反式激活系統(tǒng)和編碼異源蛋白質(zhì)的DNA。優(yōu)選的 細(xì)胞系應(yīng)當(dāng)是非嚙齒動物的，因?yàn)楹琽riP的質(zhì)粒不能高效復(fù)制，并且CHO 細(xì)胞，例如，缺乏用于反式激活系統(tǒng)的細(xì)胞因子。
Wysokenski， D.A"和Yates， J丄.，(J. Vir. 63 (1989) 2657-2666)提到， EBV質(zhì)粒復(fù)制不能將物種系從靈長類動物細(xì)胞交叉到嚙齒動物細(xì)胞。這基 于缺乏與DNA復(fù)制所涉及的宿主蛋白質(zhì)(其在嚙齒動物中缺乏)的相互作 用。
Tomiyasu, K-i.，等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 253 (1998) 733-738、 Mizuguchi， H.，等人，F(xiàn)EBS Letters 472 (2000) 173-178和WO 2005/024030才艮道了含有oriP和EBNA-1結(jié)構(gòu)基因以及其它元件的質(zhì)粒。
美國專利5,976,807報(bào)道了生產(chǎn)表達(dá)多種感興趣的蛋白質(zhì)的重組真核 細(xì)胞系的方法。獲得表達(dá)EBNA-1蛋白質(zhì)的經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其含有至少兩
種經(jīng)轉(zhuǎn)染的附加體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了表達(dá)系統(tǒng)，用于在嚙齒動物細(xì)胞系中表達(dá)異源蛋白質(zhì)。
該系統(tǒng)包含EB病毒的oriP/EBNA-l游離型復(fù)制和保持系統(tǒng)。
具體地，本發(fā)明提供了嚙齒動物細(xì)胞，其中，所述嚙齒動物細(xì)胞表達(dá) EB病毒的核抗原l(EBNA-l)，并且含有附加體，其中，所述附加體包含
a) 原核復(fù)制起點(diǎn)；
b) 選擇標(biāo)記；
c) EB病毒(EBV)復(fù)制起點(diǎn)(oriP);
d) 適于在所述嚙齒動物細(xì)胞中表達(dá)異源多肽的表達(dá)盒，其中，所述表 達(dá)盒包含啟動子序列、5'非翻譯區(qū)域、編碼所述異源蛋白質(zhì)的核i^列以 及包含聚腺苷酸化信號的3啡翻譯區(qū)域。
本發(fā)明還提供了一種方法，用于獲得根據(jù)本發(fā)明的嚙齒動物細(xì)胞，其 中，所述方法包括如下步驟
a) 提供嚙齒動物細(xì)胞；
b) 提供下述質(zhì)粒，其包含原核復(fù)制起點(diǎn)、選擇標(biāo)記和針對EB病毒核 抗原l(EBNA-l)的功能性表達(dá)盒，其中，所a達(dá)盒包含啟動子序列、5' 非翻譯區(qū)域、編碼EBNA-1蛋白質(zhì)的核酸序列以及包含聚腺苷酸化信號的 3'非翻譯區(qū)域；
c) 將所M粒b)引入所述嚙齒動物細(xì)胞a);
d) 選擇經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的嚙齒動物細(xì)胞；
e) 提供一個或多個下述另一質(zhì)粒，其包含原核復(fù)制起點(diǎn)、選擇標(biāo)記、 EB病毒(EBV)復(fù)制起點(diǎn)(oriP)、適于在經(jīng)轉(zhuǎn)化的嚙齒動物細(xì)胞中表達(dá)異源 蛋白質(zhì)的表達(dá)盒，其中，所i^達(dá)盒包含啟動子序列、5'非翻譯區(qū)域、編 碼異源多肽的核酸序列和包含聚腺苷酸化信號的3'非翻譯區(qū)域，
f) 將所述另 一質(zhì)粒e)引入嚙齒動物細(xì)胞d);
g) 重復(fù)步驟e)至f)多至五次。
本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)異源多肽的方法，其中，所述方法包含
a) 提供根據(jù)本發(fā)明的嚙齒動物細(xì)胞；
b) 在適合表達(dá)所述異源多肽的條件下培養(yǎng)所述嚙齒動物細(xì)胞；
c) 從培養(yǎng)物中回收所述異源多肽。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的嚙齒動物細(xì)胞的試劑盒，其中，所 述試劑盒包含
a) 嚙齒動物細(xì)胞；
b) 第一質(zhì)粒，其包含原核復(fù)制起點(diǎn)、選擇標(biāo)記和針對EB病毒核抗原 l(EBNA-l)的功能性表達(dá)盒，其中，所^達(dá)盒包含啟動子序列、5'非翻譯 區(qū)域、編碼EBNA-1蛋白質(zhì)的核酸序列以及包含聚腺苷酸化信號的3'非翻 譯區(qū)域；
c) 第二質(zhì)粒，其包含原核復(fù)制起點(diǎn)、選擇標(biāo)記、EB病毒(EBV)復(fù)制起 點(diǎn)(oriP)、適于在嚙齒動物細(xì)胞中表達(dá)異源多肽的表達(dá)盒，其中，所述表達(dá) 盒包含啟動子序列、用于引入核酸序列的克隆位點(diǎn)和包含聚腺苷酸化信號 的3'非翻譯區(qū)域。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，嚙齒動物細(xì)胞是CHO細(xì)胞。 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，CHO細(xì)胞選自CHO-K1細(xì)胞、
CHO-DXB11細(xì)胞、CHO-DG44細(xì)胞和表達(dá)EBNA-1蛋白質(zhì)的CHO細(xì)胞。 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，待表達(dá)的異源多肽選自前藥、酶、酶片
段、酶抑制劑、酶激活劑、生物活性多肽、刺猬(hedgedog)蛋白質(zhì)、骨形
態(tài)發(fā)生蛋白、生長因子、促紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、G-CSF、白細(xì)
胞介素、干擾素、免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的組。
在一種實(shí)施方案中，所述異源多肽是免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。 在另一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的對異源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)在瞬時轉(zhuǎn)染下進(jìn)行。
在另一實(shí)施方案中，所述異源多肽分泌進(jìn)培養(yǎng)基。 在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，引入嚙齒動物細(xì)胞的質(zhì)粒含有至少兩種 選擇標(biāo)記，優(yōu)選至少 一種原核選擇標(biāo)記以及至少 一種真核選擇標(biāo)記。
在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，引入一個嚙齒動物細(xì)胞的質(zhì)粒的數(shù)量為
1至5個質(zhì)粒之間。
在本發(fā)明的另 一實(shí)施方案中，在同 一步驟中引入嚙齒動物細(xì)胞的質(zhì)粒 的數(shù)量在1至3之間，優(yōu)選，l至2個質(zhì)粒之間。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了嚙齒動物細(xì)胞，其中，所述嚙齒動物細(xì)胞表達(dá)EB病毒 核抗原l(EBNA-l)，并且含有附加體，其中，所述附加體包含
a) 原核復(fù)制起點(diǎn)；
b) 選捧才示^己；
c) EB病毒(EBV)復(fù)制起點(diǎn)(oriP);
d) 適于在所述嚙齒動物細(xì)胞中表達(dá)異源多肽的表達(dá)盒，其中，所述表 達(dá)盒包含啟動子序列、5'非翻譯區(qū)域、編碼所述異源多肽的核酸序列以及 包含聚腺苷酸化信號的3'非翻譯區(qū)域。
可用于開展本發(fā)明的方法和4支術(shù)4皮描述于，例如，Ausubel, F.M.，編 著，Current Protocols in Molecular Biology,巻I至III (1997); Glover， N.D" 和Hames, B.D.，編著,DNA Cloning: A Practical Approach,巻I和II (1995)， Oxford University Press; Freshney, R.I.(編著)，Animal Cell Culture — a practical approach, IRL Press (1986); Watson, J.D.，等人, Recombinant DNA，第二版，CHSL Press (1992); Winnacker， E丄.，F(xiàn)rom Genes to Clones; N.Y" VCH Publishers (1987); Cdis， J.，編著，Cell Biology, 第二版,Academic Press (1998); Freshney, R.I.， Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques,第二版，Alan R. Liss， Inc., N.Y. (1987)中。
用于本文中的"核酸"指編碼可重組生產(chǎn)的多肽的、至少部分非天然存 在的核酸。"非天然存在，，可指各核苷酸的序列或所用的功能性元件的組合， 所述功能性元件不限于啟動子、3'非翻譯區(qū)域、增強(qiáng)子或復(fù)制起點(diǎn)。核酸 可由核酸片段來構(gòu)成，所述核酸片段優(yōu)選是DNA片段，其是經(jīng)分離的或 通過化學(xué)手段合成的。核酸可被整合進(jìn)另外的核酸，例如，整合進(jìn)質(zhì)?；?br> 真核宿主細(xì)胞的基因組/染色體。質(zhì)粒包括穿梭載體和表達(dá)載體等。通常，
質(zhì)粒還將包含原核增殖單元，其包含復(fù)制起點(diǎn)(例如ColEl復(fù)制起點(diǎn))和選 擇標(biāo)記(例如，氨節(jié)青霉素或四環(huán)素抗性基因)，分別用于在細(xì)菌中復(fù)制和 選擇載體。
同樣地，核酸可通過由各核苷酸構(gòu)成的其核酸序列來表征。
用于本申請中的術(shù)語"核酸序列"指核酸分子和其變體的核苷酸序列，
所述核酸分子和其變體編碼肽、多肽或蛋白質(zhì)或其功能性變體，即，例如， 具有不同M酸序列但具有相同生物學(xué)功能/活性的蛋白質(zhì)。這些改變是由 于，例如，遺傳密碼子的簡并、突變(例如點(diǎn)突變)、缺失、插入等導(dǎo)致的。 蛋白質(zhì)變體的M^列與親本蛋白質(zhì)的M^列有所不同，這是由于 親本蛋白質(zhì)序列中 一個或多個氨基酸殘基的添加、缺失和/或取代導(dǎo)致的。 普遍地，變體將具有與親本蛋白質(zhì)序列有至少卯％氨基#列同一性的氨 基酸序列，更優(yōu)選地，至少95%，最優(yōu)選地，至少99%。
"表達(dá)盒"指這樣的核酸序列，其包含對于在細(xì)胞中表達(dá)和分泌至少其 所含有的結(jié)構(gòu)基因來說必要的元件。
"基因"指這樣的片斷，例如，位于染色體或質(zhì)粒上，其對于表達(dá)肽、 多肽或蛋白質(zhì)來說是必要的。除了編碼區(qū)域之外，基因還包含其它功能性 元件，包括啟動子、內(nèi)含子和終止子。
"結(jié)構(gòu)基因"指基因的編碼區(qū)域，而沒有信號序列。 在本申請中使用的術(shù)語"啟動子"指用于推動下游核酸序列轉(zhuǎn)錄的調(diào)控
性核酸序列。啟動子序列可選自以下的啟動子序列巨細(xì)胞病毒(CMV)、 早期和晚期猿猴病毒40(SV40)(Bernoist， C.，和Chambon， P" Nature 290 (1981) 304-10)、勞斯肉瘤病毒(RSV)3'長末端重復(fù)中含有的啟動子 (Yamamoto等人，Cell 22:787-97 (1980))、甘油糾酸脫氫酶(GADPH)、 逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs、延伸因子la(EF-la)、泛素、單純皰疹病毒的胸苷激酶 (HSVTK)(還見，例如，Lee，A.，等人,Mol. Cell. 7 (1997) 495-501， Wagner 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-45 (1981))以及金屬硫蛋白基因 的調(diào)節(jié)序列(Brinster等人，Nature 296 (1982) 39-42)。優(yōu)選的是強(qiáng)啟動子，
例如，腺病毒啟動子(例如，腺病毒主要晚期啟動子)，清蛋白啟動子，ApoAl 啟動子，P-肌動蛋白啟動子，熱激啟動子，異源啟動子(例如CMV)，人珠 蛋白和生長激素啟動子，可誘導(dǎo)啟動子(例如MMT)，逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟 動子、RSV以及胸苷激酶啟動子(例如單純皰瘆病毒的胸苷激酶啟動子)。 尤其優(yōu)選的是強(qiáng)病毒啟動子，例如，腺病毒啟動子，即時早期和晚期巨細(xì) 胞病毒啟動子(CMV; Boshart等人，Cell 41 (1985) 521-30)，小鼠乳胂瘤病 毒啟動子(MMTV)和來自長末端重復(fù)的勞斯肉瘤病毒啟動子(LTR-RSV; Gorman等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 6777-81)。
用于本申請中的術(shù)語"聚腺苷酸化信號"指用于誘導(dǎo)特定核酸序列片斷 的初級轉(zhuǎn)錄本的切割和聚腺苷酸化的核酸序列。包含聚腺苷酸化信號的3， 非翻譯區(qū)域可選自包含源自SV40、牛生長素(BGH)的基因、免疫球蛋白基 因和胸苷激酶基因(tk，例如，單純皰滲的胸苷激酶聚腺苷酸化信號)的聚腺 苷酸化信號的3'非翻譯區(qū)域構(gòu)成。
"抗性基因"或"選擇標(biāo)記"可在本申請中互換使用，其是這樣的基因， 在存在相應(yīng)選擇劑時，其使得攜帶該基因的細(xì)胞被特異性選出或選掉。有 用的陽性抗性基因是抗生素抗性基因。該選擇標(biāo)記使得經(jīng)該基因轉(zhuǎn)化的宿 主細(xì)胞在存在相應(yīng)抗生素時^i日性選出，而未經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞則不能在 選擇性培養(yǎng)條件下生長或存活。選擇標(biāo)記可以是陽性的、陰性的或雙功能
的。陽性選擇標(biāo)記使得攜帶所述標(biāo)記的細(xì)胞被選出，而陰性選擇標(biāo)記則使 得攜帶所述標(biāo)記的細(xì)胞被選擇性清除。通常，選擇標(biāo)記將賦予對藥物的抗 性或?qū)λ拗骷?xì)胞中代謝或異化缺陷的補(bǔ)償。在原核細(xì)胞中，通常使用賦予
抗氨芐青霉素、四環(huán)素、卡納霉素或氯霉素抗性的基因等。對于真核細(xì)胞 有用的抗性基因包括，例如，針對M糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)(例如潮霉素 磷酸轉(zhuǎn)移酶(hyg)、新霉素和G418 APH)、 二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷 激酶(tk)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(p引咪)、 組氨醇脫氫酶(組氨醇D)的基因和編碼對嘌呤霉素、博來霉素、腐草霉素、 氯霉素、Zeocin和霉酚酸的抗性的基因。其它標(biāo)記基因被描述于WO 92/08796和WO 94/28143中。
除了在存在相應(yīng)選擇物質(zhì)時進(jìn)行選擇之外，選擇標(biāo)記還可提供編碼正
常情況下不存在于細(xì)胞中的分子(例如，綠色熒光蛋白(GFP))的基因。帶有 這種編碼GFP的基因的細(xì)胞可容易地與不帶該基因的細(xì)胞區(qū)分開，這僅通 過探測GFP發(fā)出的熒光即可實(shí)現(xiàn)。
真核表達(dá)載體/質(zhì)?？稍谠思?xì)胞中增殖。因此，真核表達(dá)載體/質(zhì)?？?以并且通常將攜帶不止一種抗性基因，即，可用于原核選擇的一種抗性基 因以及可用于真核選擇的一種抗性基因。
本文中使用的"調(diào)控元件"指編碼感興趣的肽、多肽或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基 因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯必需的、以順式存在的核苷酸序列。轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件通常 包含處于待表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因上游的啟動子、轉(zhuǎn)錄起始和終止位點(diǎn)以及聚腺 苷酸化信號序列。術(shù)語"轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，，指對應(yīng)于基因中將摻入初級轉(zhuǎn)錄本 (即，mRNA前體)的第一個核酸的核酸威基；轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)可與啟動子序 列重疊。術(shù)語"轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)"指通常呈現(xiàn)于待轉(zhuǎn)錄的感興趣基因3'末端的 核苷酸序列，其導(dǎo)致RNA聚合酶終止轉(zhuǎn)錄。聚腺苷酸化信號序列，或多 聚A添加信號，提供了在真核mRNA的3'末端的特定位點(diǎn)進(jìn)行切割以及 在核中向經(jīng)切割的3'末端翻譯后添加大約100-200個腺普酸序列(多聚A尾 巴)的信號。聚腺苷酸化信號序列可包括位于切割位點(diǎn)上游大約10-30個核 苷酸處的共有序列——AATAAA。
為生產(chǎn)分泌的多肽，感興趣的結(jié)構(gòu)基因額外包含編碼信號序列/前導(dǎo)肽 的DNA片斷。信號序列將新合成的肽、多肽或蛋白質(zhì)指導(dǎo)到ER膜上以及 穿過ER膜，在ER膜處，所述多肽可進(jìn)入分泌途徑。在蛋白質(zhì)穿過ER 膜期間，信號序列可凈皮信號肽酶切下。對于信號序列的功能而言，宿主細(xì) 胞分泌機(jī)制的識別是必要的。因此，所用的信號序列必須被宿主細(xì)胞分泌 機(jī)制的蛋白質(zhì)和酶識別。
翻譯調(diào)控元件包括翻譯起始(AUG)和停止密碼子(TAA、 TAG或 TGA)。內(nèi)部核糖體ii^位點(diǎn)(IRES)可包括在一些構(gòu)建體中。
"啟動子"指控制基因/結(jié)構(gòu)基因或與其有效相連的核酸序列轉(zhuǎn)錄的多 核苦酸序列。啟動子包括針對RNA聚合酶結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始的信號。所使
功能。來自多種不同來源的大量的啟動子，包括組成型、誘導(dǎo)型和阻遏型
啟動子是本領(lǐng)域公知的(并被鑒定于數(shù)據(jù)庫，例如GenBank中)，并可(從， 例如，保藏機(jī)構(gòu)，例如ATCC以及其它商業(yè)或個體來源)作為克隆的多核 苷酸獲得，或在克隆的多核苷酸中獲得。"啟動子"包含指導(dǎo)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄 的核苷酸序列。通常，啟動子位于基因的上游區(qū)域(5')，鄰近結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn) 錄開始位點(diǎn)。啟動子中作用于起始轉(zhuǎn)錄的序列元件通常通過共有的核苷酸 序列來表征。這些啟動子元件包括RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，TATA序列， CAAT序列，分化特異性元件(DSE; McGehee， R.E.，等人，Mol. Endocrinol. 7 (1993) 551-60),環(huán)化AMP應(yīng)答元件(CRE)，血清應(yīng)答元件(SRE;Treisman， R.， Seminars in Cancer Biol. 1 (19卯)47-58)，糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件(GRE) 和針對其它轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，例如，CRE/ATF(0，Reilly， M.A.,等人，J. Biol. Chem. 267 (1992) 19938-43)、 AP2(Ye， J"等人，J. Biol. Chem. 269 (1994) 25728)、 SP1、 cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白質(zhì)(CREB; Loeken， M.R.， GeneExpr. 3 (1993) 253-64)和八聚體因子(一般而言，見，Watson等人，編 著，Molecular Biology of the Gene,第4版,The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987和Lemaigre， F.P.和Rousseau, G.G.， Biochem. J. 303 (1994) 1-14)。如果啟動子是誘導(dǎo)型啟動子，那么轉(zhuǎn)錄速率 應(yīng)答于誘導(dǎo)劑增加。相反，如果啟動子是組成型啟動子，轉(zhuǎn)錄速率則不受 誘導(dǎo)劑調(diào)控。阻遏型啟動子也是已知的。例如，當(dāng)生長因素與其細(xì)胞表面 上的受體結(jié)合時，c-fos啟動子^皮特異性激活?？赏ㄟ^由，例如，CMV啟 動子以及接著的兩個Tet-操縱子位點(diǎn)構(gòu)成的人工雜合啟動子來實(shí)現(xiàn)由四環(huán) 素(tet)調(diào)控的表達(dá)。Tet-阻遏子與兩個Tet-操縱子位點(diǎn)結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄。加 入誘導(dǎo)劑四環(huán)素之后，Tet-阻遏子從Tet-操縱子位點(diǎn)釋放，轉(zhuǎn)錄得以進(jìn)行 (Gossen， M.和Bujard， H. PNAS 89 (1992) 5547-5551)。關(guān)于其它i秀導(dǎo)型啟 動子，包括金屬硫蛋白和熱激啟動子，見，例如，Sambrook等人(見前文) 和Gossen，M.，等人，Curr. Opin. Biotech. 5 (1994) 516-520。已被鑒定為用 于高水平表達(dá)的強(qiáng)啟動子的真核啟動子包括SV40早期啟動子、腺病毒主
要晚期啟動子、小鼠金屬硫蛋白-I啟動子、勞斯肉瘤病毒長末端重復(fù)、中
國倉鼠延伸因子la(CHEF-l，見，例如US 5,888,809)、人EF-la、泛素和 人巨細(xì)胞病毒即刻早期啟動子(CMV IE)。
"啟動子，，可以是組成型或誘導(dǎo)型的。增強(qiáng)子(即，作用于啟動子上以增 加轉(zhuǎn)錄的順式作用DNA元件)可能是必要的，以與啟動子一^L揮功能以 增加表達(dá)水平(相對于單獨(dú)用啟動子獲得的)，其可作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件被包 括進(jìn)去。通常，含有啟動子的多核苷酸片斷將還包括增強(qiáng)子(例如，CMV 或SV40)。
本文中使用的"增強(qiáng)子"指增強(qiáng)與其有效相連的編碼序列或基因的轉(zhuǎn)錄 的多核苷酸序列。與啟動子不同，增強(qiáng)子的定向和位置相對獨(dú)立，其,皮發(fā) 現(xiàn)對于轉(zhuǎn)錄單元來說是5，或3'的(Lusky， M"等人，Mol. Cell Bio.， 3 (1983) 1108-22)，位于內(nèi)含子中(Banerji， J.，等人，Cell, 33 (1983) 729-40)以及位于 編碼序列本身中(Osborne, T.F"等人，Mol. Cell Bio" 4 (1984) 1293-305)。 因此，增強(qiáng)子可被放置于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游或下游，或者與啟動子有相 當(dāng)大的距離，雖然實(shí)踐中，增強(qiáng)子可能與啟動子物理和功能重疊。來自多 種不同來源的大量增強(qiáng)子是本領(lǐng)域公知的(并被鑒定于數(shù)據(jù)庫，例如 GenBank中)，并可(從，例如，保藏機(jī)構(gòu)，例如ATCC以及其它商業(yè)或個 體來源)作為克隆的多核苷酸序列獲得，或在克隆的多核苷酸序列中獲得。 多種包含啟動子序列的多核苷酸(例如，商業(yè)使用的CMV啟動子)也包含增 強(qiáng)子序列。例如，上文列出的所有強(qiáng)啟動子也可含有強(qiáng)增強(qiáng)子(見，例如， Bendig， M.M.， Genetic Engineering, 7 (1988) 91-127)。
"有效相連"指兩種或多種組分的并列，其中，所描述的組分處于允許 它們以其期望的方式發(fā)揮功能的關(guān)系中。例如，如果啟動子和/或增強(qiáng)子順 式作用，以控制或調(diào)節(jié)相連序列的轉(zhuǎn)錄的話，那么啟動子和/或增強(qiáng)子則是 與編碼序列有效相連的。通常但并非必須，"有效相連"的DNA序列是鄰 接的(contiguous),根據(jù)需要將兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)域(例如分泌前導(dǎo)區(qū)和多 肽)連接成鄰接并且符合讀碼框的。但是，雖然有效相連的啟動子通常位于 編碼序列的上游，但其并不一定要與編碼序列鄰接。增強(qiáng)子不必要鄰接。
如果增強(qiáng)子增強(qiáng)了編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么增強(qiáng)子即是與編碼序列有效相連 的。有效相連的增強(qiáng)子可位于編碼序列上游、之中或下游，以及與啟動子 有相當(dāng)大的距離。如果聚腺苷酸化位點(diǎn)位于編碼序列的下游末端，使得轉(zhuǎn) 錄通過編碼序列進(jìn)行至聚腺苷酸化序列，那么聚腺苷酸化位點(diǎn)即是與編碼 序歹'J/結(jié)構(gòu)基因有效相連的。相連通過本領(lǐng)域已知的重組方法來完成，例如，
使用PCR方法和/或通過在方便的限制性位點(diǎn)進(jìn)行連接。如果不存在方便 的限制性位點(diǎn)，那么可根據(jù)常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。
本文中使用的術(shù)語"表達(dá)"指在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。宿主 細(xì)胞中想要的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄水平可基于細(xì)胞中存在的相應(yīng)mRNA的量來測 定。例如，可通過PCR或Northern雜交(見，Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989))來對從選定的序列轉(zhuǎn)錄的mRNA加以定量?？赏ㄟ^多種 方法來對選定的序列編碼的蛋白質(zhì)加以定量，例如，通過ELISA，通過針 對蛋白質(zhì)生物學(xué)活性加以檢測，或者通過使用獨(dú)立于此類活性的檢測，例 如，Western印跡或放射性免疫測定(其中j吏用識別并結(jié)合蛋白質(zhì)的抗 體)(見，前文的Sambrook等人，1989)。
"宿主細(xì)胞"指將向其中引入編碼本發(fā)明多肽的基因的細(xì)胞。宿主細(xì)胞 包括用于質(zhì)粒/載體的增殖的原核細(xì)胞，以及用于表達(dá)結(jié)構(gòu)基因的真核細(xì) 胞。通常，真核細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
"多肽"是通過肽鍵連接的氨基酸殘基的聚合物，無論其是天然生產(chǎn)或 合成生產(chǎn)的。少于大約20個氨基酸殘基的多肽可被稱為"肽"。
"蛋白質(zhì)"是包含一條或多條多肽鏈的大分子，其中，至少一條鏈具有 長度為100個氮基酸或更大的氨基酸長度。蛋白質(zhì)還可包含非肽性組分， 例如，糖類基團(tuán)。糖類和其它非肽性取代基可通過在其中生產(chǎn)蛋白質(zhì)的細(xì) 胞加入到蛋白質(zhì)中，其可隨著細(xì)胞類型變動。本文中將根據(jù)其氨基酸主鏈 結(jié)構(gòu)來限定蛋白質(zhì)；添加(例如，糖類基團(tuán))通常并不特別指出，但也可以 存在。
"異源DNA"或"異源多肽"指天然不存在于給定的宿主細(xì)胞中的DNA
分子或多肽或DNA分子的群或多肽的群。對于特定宿主細(xì)胞來說異源的 DNA分子可含有源自宿主細(xì)胞物種的DNA(即，內(nèi)源DNA),只要該宿主 DNA與非宿主DNA(即，外源DNA)組合即可。例如，含有與包含啟動子 的宿主DNA片斷有效相連的、編碼多肽的非宿主DNA片斷的DNA分子 被認(rèn)為是異源DNA分子。反過來，異源DNA分子可包含與外源啟動子有 效相連的內(nèi)源結(jié)構(gòu)基因。
非宿主DNA分子編碼的肽或多肽是"異源"肽或多肽。 用于本申請中的術(shù)語"質(zhì)粒"和"載體"指用于將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞的栽 體。該物質(zhì)通常(但并不排它)是環(huán)狀核酸分子。根據(jù)質(zhì)粒的意欲用途，其 可額外含有復(fù)制起點(diǎn)以及必要的復(fù)制控制片斷，例如，以使得質(zhì)?？稍谒?主中復(fù)制或轉(zhuǎn)錄。
"克隆栽體"是具有在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的能力的核酸分子，例如質(zhì) 粒、教粒、噬菌粒(phageimid)或細(xì)菌人工染色體(BAC)。通常，克隆栽體 含有一處或少量限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)(這使得核酸分子可以以可決定的 方式插入，而不會損失載體的必要生物學(xué)功能)以及編碼抗性基因的核苷酸 序列，其適用于對經(jīng)克隆載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞進(jìn)行鑒定和選擇。通常，抗性基 因包括提供四環(huán)素抗性或氨千青霉素抗性的基因。
"表達(dá)質(zhì)粒"是編碼將在宿主細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)的核酸分子。通常， 表達(dá)質(zhì)粒包含原核質(zhì)粒增殖單元(例如，對于大腸桿菌(E. coli)而言，包含 復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記)、真核選擇標(biāo)記以及用于表達(dá)感興趣的結(jié)構(gòu)基因的一 個或多個表達(dá)盒。通常，"表達(dá)盒"包含啟動子、5'非翻譯區(qū)域、結(jié)構(gòu)基因 以及包括聚腺苷酸化信號的3'非翻譯區(qū)域?；虮磉_(dá)通常處于啟動子控制 下，此類結(jié)構(gòu)基因被說成是與啟動子"有效相連"的。類似地，如果調(diào)控元 件調(diào)節(jié)核心啟動子的活性，那么調(diào)控元件和核心啟動子;l有效相連的。
"經(jīng)分離的多肽"是這樣的多肽，其基本不含被細(xì)胞組分所污染，例如 糖類、脂類或與多肽天然相關(guān)聯(lián)的其它蛋白質(zhì)性雜質(zhì)。通常，經(jīng)分離的多 肽的制品含有高度純化形式的多肽，即，至少大約80%純，至少大約90％ 純，至少大約95%純，超過95%純或超過99%純。顯示出特定蛋白質(zhì)制
品含有經(jīng)分離的多肽的一種途徑是通過對蛋白質(zhì)制品進(jìn)行十二烷基石危酸鈉
(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳以及對凝膠進(jìn)行Coomassie亮藍(lán)染色之后的單 一條帶的出現(xiàn)來判斷的。但是，術(shù)語"經(jīng)分離得"并不排除以另外的物理形 式(例如二體、突變形式(例如點(diǎn)突變)或者可選地糖基化或衍生化的形式) 存在的同樣的多肽的存在。
術(shù)語"免疫球蛋白"指由基本由免疫球蛋白基因編碼的一種或多種多肽 構(gòu)成的蛋白質(zhì)。已知的免疫球蛋白基因包括不同的恒定區(qū)基因以及無數(shù)的 免疫球蛋白可變區(qū)基因。免疫球蛋白可以以多種形式存在，包括，例如， Fv、 Fab和F(ab)2以及單鏈(scFv)(例如，Huston, J.S.,等人，PNAS USA 85 (1988)5879-5883; Bird等人，Science 242 (1988) 423-426以及， 一般性地， Hood, L E.， Weissman， I.， Wood, W. B.，和Wilson, J. H.， Immunology, Benjamin/Cummings， Menlo Park, California. (1983)和Hunkapiller和 Hood, Nature 323 (1986) 15-16)。
免疫球蛋白通常包含至少兩條輕鏈多肽和兩條重鏈多肽。每條重鏈和 輕鏈多肽鏈可含有可變區(qū)(通常是多肽鏈的氨基末端部分)，其含有能與抗 原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。每條重鏈和輕鏈多肽鏈包含恒定區(qū)(通常是M 末端部分)。重鏈的恒定區(qū)介導(dǎo)抗體與i)帶有Fcy受體(FcYR)的細(xì)胞，例 如，吞噬細(xì)胞，的結(jié)合，ii)帶有新生兒Fc受體(FcRn)(也被稱為Brambell 受體)的細(xì)胞的結(jié)合。其還介導(dǎo)與一些因子的結(jié)合，所述因子包括經(jīng)典補(bǔ)體 系統(tǒng)的因子，例如，補(bǔ)體成分(component)(Clq)。
免疫球蛋白輕鏈或重鏈的可變區(qū)進(jìn)而包含不同片斷，即，四個構(gòu)架區(qū) (FR)和三個高變區(qū)(CDR)。
"免疫球蛋白片段"指包含選自下述的一種或多種片斷的多肽CH1 結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)、Ch2結(jié)枸域、Ch3結(jié)枸域、Ch4結(jié)枸域、Cl結(jié)枸域、Vh 結(jié)構(gòu)域、Vl結(jié)枸域、構(gòu)架區(qū)l、構(gòu)架區(qū)2、構(gòu)架區(qū)3、構(gòu)架區(qū)4、高變區(qū)l、 高變區(qū)2和高變區(qū)3(有或沒有插入、缺失和/或突變)。
在本申請中指出的"包含聚腺苷酸化信號的3'非翻譯區(qū)域"是長度為 50-750個^^iJ t的DNA序列，其提供了用于在真核mRNA的3'末端的特
異性位點(diǎn)進(jìn)行切割以及在細(xì)胞核中向經(jīng)切割的3'末端翻譯后添加大約 100-200個腺普酸序列(多聚A尾巴)的信號。建議采用非常高效的聚腺苷酸 化信號，因?yàn)樾实偷那懈詈途巯佘账峄梢詫?dǎo)致類似操縱子的mRNA形 成，這可能是不想要的，例如，質(zhì)粒編碼的基因表達(dá)的原因。
本申請中使用的術(shù)語"宿主"和"細(xì)胞"指適于接收根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒的 細(xì)胞。優(yōu)選地，該細(xì)胞選自CHO(中國倉鼠卵巢)細(xì)胞、BHK(倉鼠嬰腎)細(xì) 胞和其它嚙齒動物細(xì)胞。優(yōu)選的是CHO或源自CHO的細(xì)胞，其包含 CHO-K1細(xì)胞、CHO-DXB11細(xì)胞、CHO-DG44細(xì)胞和表達(dá)EBNA-1蛋白 質(zhì)的CHO細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明提供的細(xì)胞的后代也包括在內(nèi)。還包括在連 續(xù)世代具有修飾的、根據(jù)本發(fā)明提供的細(xì)胞的后代，所述修飾可能是由于 突變、環(huán)境影響或遺傳密碼的簡并性導(dǎo)致的。術(shù)語"細(xì)胞系"尤其指可體外 增殖一段特定時間段的細(xì)胞群。在該時間段內(nèi)，細(xì)胞生長并通過細(xì)胞分裂 增殖。
在本申請中使用的術(shù)語"瞬時轉(zhuǎn)染"指這樣的過程，其中，引入細(xì)胞的 核酸沒有整合進(jìn)細(xì)胞的基因組或染色體DNA。其實(shí)際上作為染色體外元 件，例如作為附加體保持于細(xì)胞中。附加體的核酸的轉(zhuǎn)錄過程不受影響， 例如，產(chǎn)生附加體的核酸編碼的蛋白質(zhì)。
本申請中使用的術(shù)語"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化"指外源核酸可遺傳地穩(wěn)定整合進(jìn)宿主 細(xì)胞基因組/染色體。
本文中使用的術(shù)語"生物活性多肽，，指當(dāng)被給予人工生物學(xué)系統(tǒng)(例如 使用細(xì)胞系和病毒進(jìn)行的生物檢測)或體內(nèi)給予動物(包括但不限于鳥和哺 乳動物，包括人)時導(dǎo)致生物學(xué)效果的有機(jī)分子，例如生物大分子，例如， 肽、蛋白質(zhì)、核蛋白、黏蛋白、脂蛋白、合成多肽或蛋白質(zhì)。生物學(xué)效果 可以是(但不限于)酶抑制、激活或變構(gòu)修飾，與受體的結(jié)合(在結(jié)合位點(diǎn)或 周圍)，阻礙或激活受體，信號觸發(fā)或抗原結(jié)合。
EBV的oriP復(fù)制起點(diǎn)、EBV 二重對稱元件和EBV重復(fù)家族的核^ 列表示SEQ ID NO: 01至SEQ ID NO: 03，其已從GenBank條目V01555 獲得。編碼EBNA-1蛋白質(zhì)的序列表示在SEQ ID NO: 04(核酸序列)和SEQID NO: 05(氨基酸序列)。這些序列已分別從V01555(GenBank)和 P03211(SwissProt)獲得。
已經(jīng)4艮好地建立了不同的方法，它們被廣泛用于蛋白質(zhì)純化，例如用 微生物蛋白質(zhì)進(jìn)行的親和色i脊(例如，A蛋白或G蛋白親和色語)、離子交 換色i普(例如，陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(氨基乙基樹脂)和混 合模式交換)、親硫吸附(例如，用卩巰基乙醇和其它SH配體)、疏7jc相互 作用或芳香族吸附色語(例如，用苯基-瓊脂糖凝膠、氮雜-arenophilic樹脂 或間氨基苯硼酸)、金屬螯合親和色語(例如，用Ni(II)-和Cu(II)-親和材料)、 大小排除色i普和電泳方法(例如凝膠電泳、毛細(xì)管電泳)(Vijayalakshmi， M.A.， Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102)。
本發(fā)明提供了方法，用于在嚙齒動物細(xì)胞中表達(dá)目標(biāo)肽、多肽和蛋白 質(zhì)。本發(fā)明還提供了嚙齒動物細(xì)胞，用于生產(chǎn)異源肽、多肽或蛋白質(zhì)，其 中，編碼所述異源肽、多肽或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因是嚙齒動物細(xì)胞內(nèi)的附加 體提供的。由兩個或多個亞基組成的多肽或蛋白質(zhì)，即，例如免疫球蛋白 也可按照本發(fā)明的方法來生產(chǎn)。例如，在免疫球蛋白(由兩對輕鏈和重鏈構(gòu) 成)的情況下，可以使用含有編碼免疫球蛋白兩種鏈的兩個結(jié)構(gòu)基因的一個 附加體。或者，可以使用兩個附加體，例如，其中一個含有編碼輕鏈的結(jié) 構(gòu)基因， 一個含有編碼重鏈的結(jié)構(gòu)基因。
在本發(fā)明中使用指導(dǎo)EBNA-1蛋白質(zhì)表達(dá)的啟動子。優(yōu)選地，使用強(qiáng) 啟動子，優(yōu)選地，使用異源強(qiáng)啟動子，例如，CMV。 EBNA-1蛋白質(zhì)的表 達(dá)盒穩(wěn)定整合進(jìn)染色體DNA導(dǎo)致產(chǎn)生經(jīng)修飾的嚙齒動物細(xì)胞，其表達(dá) EBNA-1蛋白質(zhì)，即，編碼EBNA-1蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，并且將和啟動子 有效連接地整合進(jìn)染色體DNA。
為闡述本發(fā)明的主題，將在下文中對本發(fā)明加以描述。作為第一個步 驟，構(gòu)建表達(dá)EBNA-1蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)嚙齒動物細(xì)胞系。優(yōu)選地，構(gòu)建這樣 的基礎(chǔ)嚙齒動物細(xì)胞系，其在培養(yǎng)物中穩(wěn)定表達(dá)EBNA-1蛋白質(zhì)。之后， 設(shè)計(jì)含有針對一種或多種異源多肽的表達(dá)盒的質(zhì)粒，將其引入基礎(chǔ)嚙齒動 物細(xì)胞系。在適于表達(dá)異源多肽的a下，培養(yǎng)獲得的表達(dá)EBNA-1蛋白
質(zhì)并且攜帶有用于表達(dá)異源多肽的質(zhì)粒的細(xì)胞系(見實(shí)施例1-4)。
提供下述描述和實(shí)施例是為了闡述本發(fā)明的目的，而非限制本發(fā)明范 圍的目的。
構(gòu)建宿主細(xì)胞系
本發(fā)明的宿主細(xì)胞提供編碼EBNA-1蛋白質(zhì)的核酸。
在實(shí)施例2a)中描述了對含有下W達(dá)盒的質(zhì)粒的構(gòu)建，所"達(dá)盒具 有編碼EBNA-1蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。質(zhì)粒的帶注釋圖譜示于圖1。
用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染嚙齒動物細(xì)胞。在選擇性培養(yǎng)制中(用G418作為選擇劑) 下對經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行選擇后，挑出轉(zhuǎn)化體，擴(kuò)展，并針對EBNA-1蛋白 質(zhì)的生產(chǎn)加以測試。
構(gòu)建的用于形成基礎(chǔ)嚙齒動物細(xì)胞系的質(zhì)粒不含EBV oriP序列的功 能性拷貝。這包括oriP的兩個元件——二重對稱元件和重復(fù)家族。
構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒
為表達(dá)異源肽、多肽或蛋白質(zhì)，必須構(gòu)建含有針對相應(yīng)結(jié)構(gòu)基因的表 達(dá)盒的表達(dá)質(zhì)粒。
對蛋白質(zhì)舉例而言，選用單克隆人抗IGF-1R抗體(見US 2005/0008642)。為生產(chǎn)HuMab抗IGF-1R，使用本發(fā)明的基礎(chǔ)嚙齒動物細(xì) 胞系，構(gòu)建出表達(dá)質(zhì)粒(見實(shí)施例3和圖3-5)。構(gòu)建的用于表達(dá)異源多肽的 質(zhì)粒不含EBNA-1結(jié)構(gòu)基因的功能性拷貝。
一般而言，通過亞克隆和重疊PCR，將編碼HuMab抗IGF-1R輕鏈 可變區(qū)(VO和人K-輕鏈恒定區(qū)(QJ的結(jié)構(gòu)基因連接起來，針對HuMab抗 IGF-1R重鏈可變區(qū)(VH)和人yl重鏈恒定區(qū)(CHl-鉸鏈-CH2-CH3)也一樣。隨 后將這些構(gòu)建體插入缺乏或攜帶EBV oriP的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體。
在J^I嚙齒動物細(xì)胞系中表達(dá)多肽
用一種或多種構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒來轉(zhuǎn)染根據(jù)本發(fā)明的基礎(chǔ)嚙齒動物細(xì)胞
系。在適于表達(dá)異源多肽的條件下，例如，在瞬時轉(zhuǎn)染下，進(jìn)行對經(jīng)轉(zhuǎn)染 細(xì)胞的培養(yǎng)。
一般而言，在瞬時轉(zhuǎn)染下的培養(yǎng)允許經(jīng)轉(zhuǎn)染的表達(dá)質(zhì)粒不整合進(jìn)宿 主細(xì)胞的染色體，這是由于不存在選擇劑施加的選擇壓力。由于這些非選 擇性的培養(yǎng)條件，表達(dá)質(zhì)粒不能在所有培養(yǎng)細(xì)胞中以100%的頻率復(fù)制。 這導(dǎo)致總的蛋白質(zhì)表達(dá)率緩慢降低。培養(yǎng)通常進(jìn)行至直到培養(yǎng)物中表達(dá)的 蛋白質(zhì)濃度達(dá)到最大值時。優(yōu)選地，培養(yǎng)進(jìn)行多至20天，優(yōu)選地，多至 10天，更優(yōu)選地，5至10天。
在該時間^，分出上清液，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)， 對產(chǎn)生的分泌的免疫球蛋白進(jìn)行分離和純化。
除了上文所述的分批培養(yǎng)之外，還可使用分流分批(split-batch)工藝來 培養(yǎng)細(xì)胞。在分流分批培養(yǎng)工藝期間，在培養(yǎng)期一半之后更換營養(yǎng)培養(yǎng)基。
因此，本發(fā)明的目的是提供表達(dá)異源多肽的方法，該方法允許在短時 間內(nèi)生產(chǎn)出具有與哺乳動物細(xì)胞(優(yōu)選地，人細(xì)胞)相似的糖基化模式的所 述異源多肽?，F(xiàn)在已經(jīng)吃驚地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的方法滿足此需求。
該方法基于的細(xì)胞系是嚙齒動物細(xì)胞，優(yōu)選地，CHO細(xì)胞，其遵從針 對生產(chǎn)治療性多肽和蛋白質(zhì)的細(xì)胞系建立的規(guī)則，即，不含原癌基因，例 如多瘤病毒的大T抗原。
已經(jīng)吃驚地發(fā)現(xiàn)，在用編碼EBNA-1蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因(優(yōu)選地，與啟 動子有效相連)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，染色體外元件，例如，表達(dá)質(zhì)粒(具有 EB病毒(EBV)復(fù)制起點(diǎn)并且沒有，即，不含編碼EBNA-1蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基 因)在對異源多肽的表達(dá)中發(fā)揮功能。 一般而言，在根據(jù)本發(fā)明的方法中， 源自EB病毒的兩個元件是采用復(fù)制起點(diǎn)(oriP)和編碼EBNA-l蛋白質(zhì)的結(jié)
構(gòu)基因。
本發(fā)明的一個方面是在嚙齒動物細(xì)胞中表達(dá)異源多肽的方法，其特征 在于，所述方法包括
a) 提供經(jīng)編碼EBNA-1蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的嚙齒動物細(xì)胞，
b) 用包含EB病毒(EBV)復(fù)制起點(diǎn)(oriP)的表達(dá)質(zhì)粒來轉(zhuǎn)染所述嚙齒動
物細(xì)胞，
C)在適于表達(dá)所述異源多肽的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞， d)從培養(yǎng)物中回收所述異源多肽。
在一種實(shí)施方案中，所述異源多肽是免疫球蛋白或免疫球蛋白片段，
優(yōu)選地，所述免疫球蛋白是免疫球G蛋白或免疫球蛋白E。
在一種實(shí)施方案中，所述異源多肽是分泌的異源多肽，并且從培養(yǎng)基
中回收所述異源多肽。
在一種實(shí)施方案中，所述嚙齒動物細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
在一種實(shí)施方案中，所述編碼EBNA-1蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因與啟動子，
優(yōu)選地，強(qiáng)啟動子，尤其優(yōu)選地，源自CMV的啟動子有效相連。
在一種實(shí)施方案中，所述表達(dá)質(zhì)粒包含單個源自EBV的元件——EB
病毒(EB V)復(fù)制起點(diǎn)(oriP)。
在一種實(shí)施方案中，所ii^達(dá)質(zhì)粒不包含編碼EBNA-1蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。
在一種實(shí)施方案中，所述表達(dá)質(zhì)粒額外包含 -原核復(fù)制起點(diǎn) -選擇標(biāo)記
-適于在所述嚙齒動物細(xì)胞中表達(dá)異源多肽的表達(dá)盒，其中，所a 達(dá)盒包含啟動子序列、5'非翻譯區(qū)域、編碼所述異源蛋白質(zhì)的核酸序列(結(jié) 構(gòu)基因)和包含聚腺苷酸化信號的3'非翻譯區(qū)域。
在一種實(shí)施方案中，如果異源多肽是分泌的異源多肽，那么所述表達(dá) 盒額外飽含與編碼所述異源多肽的結(jié)構(gòu)基因有效相連的信號序列。
在一種實(shí)施方案中，表達(dá)異源多肽的方法作為分批工藝、分流分批工 藝或作為連續(xù)工藝進(jìn)行。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法作為分批或分流 分批工藝進(jìn)行。
在一種實(shí)施方案中，表達(dá)異源多肽的方法額外含有步驟e)純化所述異 源多肽。
一般性的色譜方法及其用途是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。見，例如，
Chromatography, 第五版,部分 A: Fundamentals and Techniques, Heftmann， E.(編著)，Elsevier Science Publishing Company, New York (1992); Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl， Z.(編著)，Elsevier Science BV， Amsterdam, The Netherlands (1998); Chromatography Today, Poole， C. F.，和Poole， S. K.， Elsevier Science Publishing Company, New York (1991》 Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); Sambrook， J.，等人(編著)， Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)，或Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel， F. M.，等人(編著)"John Wiley & Sons, Inc., New York。
一般而言，對免疫球蛋白的純化工藝包含多步驟的色傳部分。在第一 個步驟中，通過親和色謙，例如用A蛋白將非免疫球蛋白多肽和蛋白質(zhì)與 免疫球蛋白級分分開。之后，可進(jìn)行離子交換色語來分離各免疫球蛋白的 類以及除去從第一柱上共洗脫下來的痕量A蛋白。最后，必須進(jìn)行第三個 色譜步驟，來將同一類的免疫球蛋白單體與多體和片段分開。聚集物的量 有時較高(5%或更高)，在第三個純化步驟中不可能對它們高效分離，因此 還需要后續(xù)純化步驟。
隨著對特定免疫球蛋白的重組生產(chǎn)，用于分離不同的免疫球蛋白類的 分離步驟不再是必需的。因此，對重組產(chǎn)生的免疫球蛋白的整個純化工藝 可減至兩個色i普步驟。
通常，在低于各免疫球蛋白等電點(diǎn)的pH值下，在陽離子交換材料上 對A蛋白洗脫物進(jìn)行色鐠加工。
在一種實(shí)施方案中，表達(dá)異源多肽的方法在瞬時轉(zhuǎn)染下進(jìn)行。
在所述用于表達(dá)異源多肽的方法的一種實(shí)施方案中，所述編碼 EBNA-1蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因是編碼EBNA-1蛋白質(zhì)的全長結(jié)構(gòu)基因(SEQ ID NO: 4)，所i4^達(dá)質(zhì)粒不包含編碼EBNA-1蛋白質(zhì)的全長結(jié)構(gòu)基因(SEQ ID NO: 4)。
下述實(shí)施例、序列表和附圖被提供來輔助理解本發(fā)明，本發(fā)明的實(shí)際 保護(hù)范圍示于所附的權(quán)利要求中。應(yīng)當(dāng)理解，可在不偏離本發(fā)明宗旨的情 況下對示出的流程加以改變。


圖1:質(zhì)粒pcDNA3—EBNA-1的圖i普，該質(zhì)粒含有EBNA-1蛋白質(zhì)的 表達(dá)盒。
圖2:對EBNA-1表達(dá)的Western印跡分析。
圖2a)的圖例道l: 293 EBNA， 65pg蛋白質(zhì)；道2: CHO-DG44, 100將蛋白質(zhì);道3: DG-700畫IIH7， 100將蛋白質(zhì);道4: DG-700-IIID9， 100pg蛋白質(zhì)；道5: DG-700畫IIIE3， lOOpg蛋白質(zhì)；道6: DG-700-IIIE8， lOOpg蛋白質(zhì)；道7: DG畫700國IIIF1 ， 100 ing蛋白質(zhì)；道8: DG曙700-IIIG10, IOO照蛋白質(zhì)；道9: DG-700-IIIH8, 100)Lig蛋白質(zhì)。
圖2b)的圖例道l:蛋白標(biāo)準(zhǔn)；道2: 293 EBNA， 100pg蛋白質(zhì)； 道3: DG-700-IIIE3subl，第4代，第6天，100 jug蛋白質(zhì)；道4: DG-700國IIIE3subl ，第15代，第37天，100照蛋白質(zhì)；道5: DG-700-IIIE3subl,第18代，第48天，100 pg蛋白質(zhì)；道6: DG-700-IIIE3subl，第20代，第54天，IOO照蛋白質(zhì)。 圖3a:質(zhì)粒p4816-pUC-L-IR18- k Bsml的圖鐠 圖3b:質(zhì)粒p4817-pUC-H-IR18- Y 1 Bsml的圖鐠 圖4a:質(zhì)粒p4818-pUC-Hyg-OriP-重-IR18-Bsml的圖傳 圖4b:質(zhì)粒p4819-pUC-Hyg-OriP-輕-IR18-Bsml的圖谞 圖5:質(zhì)粒p4821-pUC-Hyg-OriP-IR18-重-輕-Bsml的圖語 圖6:對抗體在不同細(xì)胞系中以及通過不同表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)進(jìn)行的比
序列描述
SEQIDNO:01: EBVoriP的核絲列；V01555 (GenBank); Yates
J丄.，等人，Proc Natl Acad Sci USA 81 (1984) 3806-3806。
SEQ ID NO: 02: EBV 二重對稱元件的核酸序列；V01555 (GenBank);
Reisman， D,，等人，Mol. Cell Biol. 5 (1985) 1822-1832。
SEQ ID NO: 03: EBV重復(fù)家族的核酸序列；V01555 (GenBank);
Reisman等人，1985。
SEQ ID NO: 04:編碼EBNA-l蛋白質(zhì)的核酸序列；V01555
(GenBank)。
EBNA-l蛋白質(zhì)的^J^紗列；P03211 (SwissProt)。 引物寡核苦酸l。 引物寡核苷酸2。 引物寡核苷酸3。 引物寡核苷酸4。
SEQ ID NO: 05 SEQ ID NO: 06 SEQ ID NO: 07 SEQ ID NO: 08 SEQ ID NO: 09
實(shí)施例描述
實(shí)施例l: 一般性技術(shù)。
實(shí)施例2:構(gòu)建表達(dá)EBNA-l蛋白質(zhì)的CHO細(xì)胞系。
實(shí)施例3:構(gòu)建攜帶有EBV oriP和針對人單克隆抗IGF-1R抗體的輕
鏈及重鏈的表達(dá)盒的質(zhì)粒。
實(shí)施例4:通過EBNA-l陽性的DG-700-IIIE3subl細(xì)胞從攜帶oriP
的質(zhì)粒生產(chǎn)抗體。
實(shí)施例1 一般性技術(shù) a)重組DNA技術(shù)
按照S腿brook, J" Fritsch, E.F.和Maniatis, T. (1989)， Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York所述，用標(biāo)準(zhǔn)方法來操作DNA。按照廠商 說明書來使用分子生物學(xué)試劑。b) DNA序列測定
通過在麥蒂基因公司(MediGenomix GmbH)(Martinsried，德國)上進(jìn) 行雙鏈測序來測定DNA序列。
c) DNA和蛋白質(zhì)序列分析和序列數(shù)據(jù)管理
用GCG(麥迪遜遺傳計(jì)算機(jī)公司(Genetics Computer Group), Madison, Wisconsin)的軟件包版本10.2和Infomax，s Vector NTI Advance套裝版本 8.0來產(chǎn)生序列、進(jìn)行圖鐠定位、分析、注釋和闡述。
d) 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)
按照Current Protocols in Cell Biology (2000)， Bonifacino， J.S.， Dasso， M.， Harford, J.B.， Lippincott-Schwartz， J.和Yamada， K.M.(編著)，John Wiley & Sons, Inc所述，使用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。
e) 對EBNA-1表達(dá)進(jìn)行Western印跡分析
通過在200 xg離心收獲細(xì)胞，用PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)洗，在裂解緩 沖液(50 mM Tris'HCl(三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽)，pH 8.0， 120 mM NaCl， 0.5%(v/v)Nonidet P40， 10。/q(v/v)甘油，5 mM DTT(二硫蘇糖醇)，1 mM EGTA(亞乙基-雙-(氧亞乙基次氨基)四乙酸)，l%(v/v)Trasylol ， 2 mM PMSF(苯甲基磺酰氟)、50照/ml亮抑酶肽(Leupeptin))中于冰上孵育30分 鐘。在13,000 x g離心之后，收獲可溶的上清液，按照廠商方案，使用 Bio-Rad蛋白質(zhì)測定(Cat-Nr.: 5000-0001)針對蛋白質(zhì)質(zhì)濃度加以測試。
按照廠商推薦，使用]\1^八0￡@凝膠系統(tǒng)(英杰生命技術(shù)公司 (Invitrogen))，對蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS/聚丙烯酰胺凝膠電泳(十二烷基硫酸鈉， SDS-PAGE)和電印跡(electro-blotting)。簡言之，將蛋白質(zhì)裂解物(100 |ng 蛋白質(zhì))與4倍體積的還原LDS(十二烷基硫酸鋰)樣品緩沖液合并，在70°C 孵育10分鐘，上樣到10% NuPAGE Novex Bis/Tris凝膠(英杰生命技術(shù) 公司(Invitrogen)， Cat-Nr.: NP0301)上。對蛋白質(zhì)的分離發(fā)生在還原 NuPAGE MES SDS(4-嗎啉代乙磺^/十二烷l^克酸鈉)運(yùn)行緩沖液中。為 將蛋白質(zhì)從SDS/聚丙烯酰胺凝膠電轉(zhuǎn)移，使用標(biāo)準(zhǔn)尼龍膜。在電轉(zhuǎn)移之后， 在50 mM TrisHCl, pH7.5， 150 mM NaCl(TBS, tris緩沖鹽水)中洗膜，
在TBS ， l%(w/v)Western封閉試劑(羅氏7>司(Roche), Cat Nr.: U921673001)中于4°C對非特異性結(jié)合位點(diǎn)封閉過夜。針對EBNA-1的小 鼠單克隆抗體E8.26(昂科基因公司(Oncogene), Cat Nr.: DP15L)用作為一 抗，其是用TBS， l%(w/v)Western封閉溶液進(jìn)行了 l:l，OOO稀釋的。在 TBS中洗兩次以及在補(bǔ)充有0.05%(v/v)Tween-20的TBS(TBST)中洗兩次 之后，用偶聯(lián)過氧化物酶的抗小鼠/抗兔IgG抗體(羅氏公司(Roche)， Cat. No. 1520709)作為二抗，其是用具有l(wèi)%(w/v)Western封閉溶液的TBS進(jìn) 行了 1:10,000稀釋的。在用TBST洗兩次以及用TBS洗三次之后，使用 LumiLightPlus底物溶液(羅氏公司(Roche), Cat. Nr. 12015196001)和 Lumi-Imager Fl分析儀(羅氏分子生物化學(xué)公司(Roche Molecular Biochemicals)),通過化學(xué)發(fā)光來檢測結(jié)合的過氧化物酶綴合物。 f)對細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的重組抗體進(jìn)行定量
使用人Fc檢測試劑盒(CIS生物公司(Cis Bio)， Cat-Nr.: 62HFCPEB), 通過竟?fàn)幮悦庖邷y定來對細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的抗體加以定量。該測定基 于HTI^^技術(shù)(均相時間分辨熒光)。簡言之，在稀釋緩沖液中對樣品進(jìn)行 1:10至1:100的稀釋。將50 經(jīng)稀釋的樣品與25^1抗人IgG Fc-穴狀化合 物(cryptate)和25 pi人IgG-XL665在96孔板OptiPlates(普金艾爾莫公司 (Perkin Elmer), Cat-Nr.: 6005279)中合并。在室溫下對測定混合物孵育過 夜。在320 nm激發(fā)后，使用Victor 1420分析儀(普金艾爾莫公司 (Perkin-Elmer))，在620 nm和665 nm處測量熒光發(fā)射。通過與校準(zhǔn)曲線 比較，從665nm/620nm之比推斷出抗體濃度。
實(shí)施例2
構(gòu)建表達(dá)EBNA-1蛋白質(zhì)的CHO細(xì)胞系
a)構(gòu)建用于在CHO細(xì)胞中表達(dá)EBNA-1蛋白質(zhì)的質(zhì)粒 pcDNA3—EBNA畫l
用限制性核酶Sacl和DraIII切質(zhì)粒pcDNA3.1(英杰生命技術(shù)公司 (Invitrogen)， Cat-Nr.: V790-20),將得到的4715 bp的片段連接到通過退火
寡核苷酸l(SEQ ID NO: 06)和寡核苷酸2(SEQ ID NO: 07)獲得的DNA接 頭上。用HindIII和DraIII切得到的質(zhì)粒。將4748 bp的載體片段連接到 編碼EBNA-1的HindlII/DralH cDNA片段上，該片段是用pCEP4(英杰生 命技術(shù)公司(Invitrogen)， Cat-Nr.: V044-50)作為模板，寡核苷酸3(SEQ ID NO: 08)和寡核苷酸4(SEQ ID NO: 09)作為引物，通過聚合Sl^式反應(yīng)獲得 的。將針對EBNA-1的真核表達(dá)質(zhì)粒命名為pcDNA3—EBNA-l(圖1)。 b)用pcDNA3_EBNA-l轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞以及選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子 在濕潤的溫育箱中，于37。C和5% pC02下，在DHI培養(yǎng)基(Schlaeger， E.J.， J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199)中，在旋轉(zhuǎn)瓶(spinner flask) 中，保持對不含血清的懸浮培養(yǎng)物預(yù)適應(yīng)的CHO-DG44細(xì)胞。
在轉(zhuǎn)染之前，將細(xì)胞以lxl(^個細(xì)胞/ml接種進(jìn)24孔板。按照廠商方 案，使用LipofectAmine 2000(英杰生命才支術(shù)/^司(Invitrogen), Cat-Nr.: 11668-027)來進(jìn)行轉(zhuǎn)染。簡言之，在OptiMEM I-培養(yǎng)基(英杰生命技術(shù)公 司(Invitrogen), Cat-Nr.: 31985-047)中稀釋LipofectAmine 2000和DNA， 以1:3至1:6的照DNA對pi LipofectAmine 2000之比對它們進(jìn)行合并。 在室溫下孵育20分鐘后，將混合物加入到細(xì)胞中。24小時后，在DHI培 養(yǎng)基中稀釋細(xì)胞，以300個細(xì)胞/孔接種進(jìn)96孔板。再24小時后，向培養(yǎng) 基中以700照/ml力口入G418。轉(zhuǎn)染后10天，擴(kuò)展G418抗性菌落，通過 Western印跡雜交(圖2a)針對EBNA-1蛋白質(zhì)的表ii^以分析。將穩(wěn)定表 達(dá)EBNA-1蛋白質(zhì)的HEK 293細(xì)胞(HEK 293 EBNA或HEK 293 E)和未 經(jīng)轉(zhuǎn)染的CHO-DG44細(xì)胞用作為參照。克隆DG-700-IIIE3對于EBNA-1 來說是強(qiáng)陽性的，通過有限稀釋對其亞克隆。連續(xù)培養(yǎng)EBNA-1陽性亞克 隆DG-700-IIIE3subl ，通過Western印跡雜交檢查EBNA-1表達(dá)(圖2b)。 如圖2b所示，EBNA-1蛋白質(zhì)水平在54天的培養(yǎng)中保持不變。
實(shí)施例3
構(gòu)建攜帶EBV oriP和針對人單克隆抗IGF-1R抗體的輕鏈和重鏈的表 達(dá)盒的質(zhì)粒
通過亞克隆和重疊PCR，將編碼抗IGF-1R抗體輕鏈可變(ViJ區(qū)和人 k-輕鏈恒定(Ct)區(qū)的基因片斷精確連接，對針對抗IGF-1R抗體可變重鏈 (VH)區(qū)和人yl-重鏈恒定(CHl-CH2-CH3)區(qū)的基因也一樣。通過DNA測序驗(yàn) 證編碼抗IGF-1R抗體結(jié)構(gòu)基因(k-輕鏈和yl-重鏈)的DNA序列，隨后將其 插入缺乏或攜帶有EBV oriP的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體中。
HuMab抗-IR18 k-輕鏈表達(dá)載體p4816-pUC-L-IR-18- k -Bsml(p4816) 由下述元件組成
-來自載體pUC18的復(fù)制起點(diǎn)，其使得該質(zhì)粒能在大腸桿菌中復(fù)制 (pUC ori)
-B-內(nèi)酰胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予氨節(jié)青霉素抗性(Amp) -用于表達(dá)抗IGF-lR抗體k-輕鏈的轉(zhuǎn)錄單元，其由下述元件組成 -來自人巨細(xì)胞病毒的主要即時早期啟動子和增強(qiáng)子(hCMV
IE1)
-合成的S'-UTR，其包括Kozak序列
-鼠免疫球蛋白重鏈信號序列，其包括信號序列內(nèi)含子(L1一內(nèi)含
子—L2)
-克隆的抗IGF-1R抗體可變輕鏈cDNA，其在5，末端安排有唯 一的Bsm I限制性位點(diǎn)，以及在3'末端安排有剪接供體位點(diǎn)和唯一的Notl 限制性位點(diǎn)(V。
-基因組性的人k-輕鏈基因恒定區(qū)，其包括內(nèi)含子性的小鼠Ig-k 增強(qiáng)子[Notl一小鼠-Ig-k-增強(qiáng)子-內(nèi)含子-2一人-內(nèi)含子-2—C-k
-人k-免疫球蛋白3' UTR，其包括聚腺苷酸化信號序列(3' UTR
C-k)
-分別處于5'和3'末端的唯一限制性位點(diǎn)Sse83711和Fsel,以使
得能將表達(dá)盒轉(zhuǎn)入備選的表達(dá)質(zhì)粒。
p4816-pUC-L-IR-18-k-Bsml的質(zhì)粒圖語如圖3a)所示。
抗IGF-1R抗體yl-重^^達(dá)載體p4817-pUC-H-IR-18-yl-Bsml(p4817)
由下述元件組成
-來自載體pUC18的復(fù)制起點(diǎn)，其使得該質(zhì)粒能在大腸桿菌中復(fù)制 (pUC ori)
-B-內(nèi)酰胺酶基因，其在大腸桿菌中賦予氨爺青霉素抗性(Amp) 誦用于表達(dá)抗IGF-lR抗體yl-重鏈的轉(zhuǎn)錄單元，其由下述元件組成 -來自人巨細(xì)胞病毒的主要即時早期啟動子和增強(qiáng)子(hCMV
IE1)
-合成的5'-UTR，其包括Kozak序列
-鼠免疫球蛋白重鏈信號序列，其包括信號序列內(nèi)含子(L^內(nèi)含
子JL2)
-克隆的抗IGF-1R抗體可變重鏈cDNA,其在5'末端安排有唯 一的Bsm I限制性位點(diǎn)，以及在3'末端安排有剪接供體位點(diǎn)和唯一的Notl 限制性位點(diǎn)
-基因組性的人yl-重鏈基因恒定區(qū)，其包括小鼠Ig-mu0i)-增強(qiáng) 子[Notl—小鼠-Ig卞-增強(qiáng)子Jmman-內(nèi)含子-2—CH1-CH2-CH3,其具有間插內(nèi) 含子
-人yl-免疫球蛋白3'UTR，其包括聚腺苷酸化信號序列 國分別處于5'和3'末端的唯一限制性位點(diǎn)SgrAI和Ascl，以使得 能將表達(dá)盒轉(zhuǎn)入備選的表達(dá)質(zhì)粒。
p4817-pUC-L-IR-18-yl-Bsml的質(zhì)粒圖i普如圖3b)所示。 通過引入下述兩個元件，分別^粒p4817-pUC-H-IR18-yl-Bsml和 p4816-pUC-L-IR18-K陽Bsml獲得如圖4所示的質(zhì)津立p4818-pUC-Hyg-OriP-重-IR18畫Bsml(p4818)和p4819-pUC國Hyg-OriP畫輕誦IR18畫Bsml(p4819): -潮霉素抗性基因，其適合用作為真核細(xì)胞中的選擇標(biāo)記 -EB病毒的復(fù)制起點(diǎn)oriP
p4818-pUC-Hyg-OriP-重誦IR18-Bsml和p4819-pUC-Hyg-OriP誦輕 -IR18-Bsml的質(zhì)粒圖i普如圖4a)和圖4b)所示。
通過將p站l8的SgrAI/AscI片段(包^yl-重鏈轉(zhuǎn)錄單元)引入p站l9的 SgrAI和Ascl限制性位點(diǎn)，來構(gòu)建質(zhì)粒p4821-pUC-Hyg-OriP-IR18-重-輕
-BsmI。得到的質(zhì)粒含有與p4819相同的元件，包括EBVoriP和針對K-輕 鏈的轉(zhuǎn)錄單元，加上yl-重鏈轉(zhuǎn)錄單元。
p4821-pUC-Hyg-OriP-IR18-重-輕-Bsml的質(zhì)粒圖i普如圖5所示。
實(shí)施例4
通過EBNA-1 P日性的DG-700-IIIE3subl細(xì)胞從攜帶oriP的質(zhì)粒生產(chǎn)
抗體
在37。C和5 % C02下，在靜置培養(yǎng)中，在ProCH04-CDM(康伯斯公 司(Cambrex)，Cat畫Nr.:BE12-029Q)、 2mM谷氨酰胺、2%(v/v)50 x HT補(bǔ) 充物(英杰生命技術(shù)公司(Invitrogen)， Cat-Nr.: 41065-012)和300照/ml G418中，對DG-700-IIIE3subl和未經(jīng)修飾的CHO-DG44型細(xì)胞加以保 持。在轉(zhuǎn)染前1小時，通過離心收獲細(xì)胞，將其以0.5 x 106個細(xì)胞/1111重 新懸浮于DHI培養(yǎng)基(Schlaeger， E.J.， J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199)中。
<吏用LipofectAmine 2000(英杰生命才支術(shù)7>司(Invitrogen)， Cat國Nr.: 11668-027)來進(jìn)行轉(zhuǎn)染。為轉(zhuǎn)染1 ml體積的培養(yǎng)物，合并下述組分200 pl OptiMEM I(英杰生命技術(shù)公司(Invitrogen)， Cat畫Nr.: 31985-047)、 2照 DNA和6plLipofectAmine。在室溫下孵育5至30分鐘后，將混合物加入 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后5-10天，收集細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，按照實(shí)施例lf)所述針對 抗體濃度對其加以測試。
已將三組不同的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)了 CHO-DG44細(xì)胞系或表達(dá)EBNA-1的 源自CHO-DG44的細(xì)胞系DG-700-IIIE3subl。將用于表達(dá)抗體輕鏈的質(zhì) 粒p4816與用于表達(dá)抗體重鏈的p4817共轉(zhuǎn)染。兩種質(zhì)粒都缺乏EBV oriP。 將用于表達(dá)抗體輕鏈的質(zhì)粒p4819與用于表達(dá)抗體重鏈的p4818共轉(zhuǎn)染。 兩種質(zhì)粒都攜帶有EBVoriP。最后，單獨(dú)轉(zhuǎn)染用于表達(dá)抗體輕鏈和重鏈的 質(zhì)粒p4821。質(zhì)粒p4821攜帶有EBVoriP。
如圖6所示，在EBNA-1陽性的DG-700-IIIE3subl細(xì)胞中轉(zhuǎn)染攜帶 有oriP的質(zhì)粒p4818和p4819導(dǎo)致抗體表達(dá)較之向相同細(xì)胞系或向
EBNA-1陰性的CHO-DG44細(xì)胞中轉(zhuǎn)染沒有oriP的p4816和p4817而言 增加2至3倍。當(dāng)針對抗體輕鏈和重鏈的表達(dá)盒組合于攜帶oriP的單個質(zhì) 粒(例如p4821)中時，DG-700-IIIE3subl細(xì)胞中的抗體表達(dá)甚至更強(qiáng)。相 反，攜帶oriP的質(zhì)粒p4817/p4818和p4821在EBNA-1陰性的CHO-DG44 細(xì)胞中不產(chǎn)生增加的抗體表達(dá)水平。結(jié)果，當(dāng)攜帶oriP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn) EBNA-1陽性的CHO細(xì)胞中時，獲得了免疫球蛋白的最大表達(dá)。
權(quán)利要求
1.嚙齒動物細(xì)胞，其特征在于所述嚙齒動物細(xì)胞a)表達(dá)EB病毒核抗原1(EBNA-1)；b)含有附加體，其中，所述附加體包含i)原核復(fù)制起點(diǎn)；ii)選擇標(biāo)記；iii)EB病毒(EBV)復(fù)制起點(diǎn)(oriP)；iv)適于在所述嚙齒動物細(xì)胞中表達(dá)異源多肽的表達(dá)盒，其中，所述表達(dá)盒包含啟動子序列、5′非翻譯區(qū)域、編碼所述異源多肽的核酸序列以及包含聚腺苷酸化信號的3′非翻譯區(qū)域。
2. 獲得嚙齒動物細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟a) 提供嚙齒動物細(xì)胞；b) 提供下述質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含(i) 原核復(fù)制起點(diǎn)；(ii) 選擇標(biāo)記；(iii) 針對EB病毒核抗原l(EBNA-l)的功能性表達(dá)盒，其中，所述表 達(dá)盒包含啟動子序列、5'非翻譯區(qū)域、編碼EBNA-1的核酸序列以及包含 聚腺苷酸化信號的3啡翻譯序列；c) 將所述質(zhì)粒b)引入所述嚙齒動物細(xì)胞a)，以及選擇經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的嚙 齒動物細(xì)胞；d) 提供一個至四個下述另一質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含(i) 原核復(fù)制起點(diǎn)；(ii) 選擇標(biāo)記；(iii) EB病毒(EBV)復(fù)制起點(diǎn)(oriP);(iv) 適于在所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的嚙齒動物細(xì)胞中表達(dá)異源多肽的表達(dá)盒，其 中，所a達(dá)盒包含啟動子序列、5'非翻譯區(qū)域、編碼異源多肽的核^ 列和具有聚腺苷酸化信號的3'非翻譯區(qū)域；e)將所述另一質(zhì)粒d)引入所述經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的嚙齒動物細(xì)胞。
3. 生產(chǎn)異源多肽的方法，其特征在于，所述方法包括a) 提供根據(jù)權(quán)利要求1的嚙齒動物細(xì)胞；b) 在適于表達(dá)所述異源多肽的條件下培養(yǎng)所述嚙齒動物細(xì)胞；c) 從培養(yǎng)物中回收所述多肽。
4. 用于生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求l的嚙齒動物細(xì)胞的試劑盒，其特征在于， 所述試劑盒包含a) 嚙齒動物細(xì)胞；b) 第一質(zhì)粒，其包含 ①原核復(fù)制起點(diǎn)；(ii) 選擇標(biāo)記；(iii) 針對EB病毒核抗原l(EBNA-l)的功能性表達(dá)盒，其中，所述表 達(dá)盒包含啟動子序列、5'非翻譯區(qū)域、編碼EBNA-1的核酸序列以及包含 聚腺苷酸化信號的3'非翻譯區(qū)域；c) 第二質(zhì)粒，其包含(i) 原核復(fù)制起點(diǎn)；(ii) 選擇標(biāo)記；(iii) EB病毒(EBV)復(fù)制起點(diǎn)(oriP);(iv) 適于在所述嚙齒動物細(xì)胞中表達(dá)異源多肽的表達(dá)盒，其中，所述 表達(dá)盒包含啟動子序列、5，非翻譯區(qū)域、用于引入核酸序列的克隆位點(diǎn)和 包含聚腺苷酸化信號的3'非翻譯區(qū)域。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2至3中任意一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述異源多 肽選自前藥、酶、酶片段、酶抑制劑、酶激活劑、生物活性多肽、刺猬蛋 白質(zhì)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、生長因子、促紅細(xì)胞生成素、血小板生成素、G-CSF、 白細(xì)胞介素、干擾素、免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。
6. 在嚙齒動物細(xì)胞中表達(dá)異源多肽的方法，其特征在于，所述方法包括a)提供經(jīng)編碼EBNA-1蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的嚙齒動物細(xì)胞，b) 用包含EB病毒(EBV)復(fù)制起點(diǎn)(oriP)的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染所述嚙齒動物 細(xì)胞，c) 在適于表達(dá)所述異源多肽的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，d) 從培養(yǎng)物中回收所述異源多肽。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2至3和5至6中任意一項(xiàng)的方法，其特征在于，所 述異源多肽是分泌的異源多肽。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2至3和5至7中任意一項(xiàng)的方法，其特征在于，所 ii^達(dá)質(zhì)粒不包含編碼所述EBNA-l蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2至3和5至8中任意一項(xiàng)的方法，其特征在于，所 述培養(yǎng)在瞬時轉(zhuǎn)染下進(jìn)行。
10. 根據(jù)權(quán)利要求2至3和5至9中任意一項(xiàng)的方法，其特征在于， 所述嚙齒動物細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于，所述CHO細(xì)胞選自 CHO-DBX11細(xì)胞、CHO-K1細(xì)胞、CHO-DG44細(xì)胞和表達(dá)EBNA-1的 CHO細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明描述了用于在嚙齒動物細(xì)胞中表達(dá)異源多肽的方法。所述方法包括EB病毒(EBV)的oriP/EBNA-1游離型復(fù)制和保持系統(tǒng)。隨著EBNA-1蛋白質(zhì)表達(dá)盒在啟動子控制下穩(wěn)定整合進(jìn)嚙齒動物細(xì)胞的基因組，在細(xì)胞中獲得EBNA-1蛋白質(zhì)的表達(dá)。異源蛋白質(zhì)從包含EBV復(fù)制起點(diǎn)和所述異源蛋白質(zhì)的功能性表達(dá)盒的附加體表達(dá)。本發(fā)明還包含經(jīng)轉(zhuǎn)化的嚙齒動物細(xì)胞系、在所述細(xì)胞系中生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)的方法以及用于構(gòu)建所述細(xì)胞系的試劑盒。
文檔編號C12N15/869GK101341252SQ200680040367
公開日2009年1月7日 申請日期2006年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月28日
發(fā)明者E·科佩特茨基, U·格普費(fèi)特 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司