專利名稱：檢測、分析和鑒定基因組dna的方法和分子診斷裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及表征可能存在于樣品中的基因組材料的分子診斷裝置。
相關
背景技術：
在生物技術學領域，存在對各種樣品(例如，環(huán)境和醫(yī)學樣品) 的生物例如細菌和病毒的快速鑒定的需要。例如從細菌分離的基因組 材料的快速鑒定(即，細菌的品種和/或株系的鑒定)可能是為例如區(qū) 域供水、醫(yī)院(包括其中的住院患者)或食品加工廠提供質量保證所 必需的；即，就污染生物體的存在監(jiān)控各種樣品(包括但不限于空氣、 塵埃、水、血液、組織、植物、食品等)以及在由公眾消費、暴露和/ 或使用之前或在由公眾使用期間或在從患者或公眾的另 一個成員獲得 的組織或血液樣品中鑒定污染性生物可能是必需的。
用于鑒定生物的標準微生物學方法，例如培養(yǎng)和革蘭氏染色法或 其他生化性質的檢測是不精確的且通常不能區(qū)分不同的生物，更不用 說生物的不同林系。用于鑒定生物的更精確的方法基于所述生物的基 因組DNA。 二個這樣的鑒定方法是聚合酶鏈式反應(PCR),該技術的發(fā) 展(例如，自動化線內PCR平臺)已增加了其產出量和自動化的水平， 和波形表征的更新方法。
因為PCR指數(shù)擴增DNA，因此其可用于檢測少量的基因組材料。 然而，因為PCR需要對于基因組材料的序列是特異性互補的引物(所述引物是已知的且包圍DM目標基因座)，因此PCR的限制在于其只 可用于已知的生物的表征。換句話說，需要研究人員在檢測所述生物 的任何嘗試之前知道或猜測生物的身份(即，用于使用的恰當引物對)。 PCR的另一個限制是除了關于與用于分析的兩個引物互補的序列的信 息外，研究人員，不通過進一步的研究，不能作圖和/或獲得關于擴增 的DNA (和從而分離的基因組材料)的序列信息。此外，自動化線內 PCR平臺通常不能在基因組材料已經歷PCR后提供進一步分析(例如， 作圖)基因組材料的方法?；蚪M材料的進一步的分析(例如，提供 物種和/或林系的更確定的鑒定)可以是更重要的并且用于例如區(qū)分病 原體抹系與非病原體林系、檢測和提供新林系的序列、選擇合適的抗
生素方案等。
為克服PCR的一些限制，發(fā)展了波形表征方法(參見，例如，美國 專利申請11/190, 942和11/356, 807，和日本專利申請/>開號 2003-334082和2003-180351)。波形表征法提供了分析和表征基因組 材料例如從生物例如細菌分離的DNA的方法，而無需研究人員在檢測 之前已知所述生物的身份。
波型表征通常使用利用可檢測的(例如，放射性的、熒光的、化 學發(fā)光的等)試劑(例如，核苷酸、插入劑等)進行的解鏈溫度分析， 所述試劑被整合入通過波形表征法產生的高級DNA結構。隨著樣品的
溫度增加，高級結構離解從而例如損失熒光強度(例如，插入的熒光劑 分離)。將以這些高級結構的離解獲得的熒光強度的改變率作為增加的 溫度的函數(shù)作圖產生了對于生物的基因組DNA和使用的波形引物是獨 特的波形，即，觀察和記錄在不同解鏈溫度(Tm)下的高級DNA結構 的離解以產生生物例如細菌的各個種(或株系)的特征"波形表征"。 因此，波形表征可用于通過使用解鏈溫度分析區(qū)分從第一生物分離的 基因組DNA與從第二生物分離的基因組DM。然而，在沒有進一步的 研究的情況下，波形表征不提供被分析的基因組材料的圖譜或序列。
因為波形表征法是相對新的方法，因此此處描述的進步可用于增 加其通量和/或自動化程度。如上所述，已發(fā)展了增加PCR通量和自動化的水平的新技術。一 個這樣的新技術的實例是微流系統(tǒng)的使用，包括用于微流裝置的控制 器/檢測器界面，如例如美國專利號6, 033, 546 、 6, 238, 538 、 6, 267, 858、 6， 500， 323和6， 670， 153中所描述的。這些微流系統(tǒng)，此 處統(tǒng)稱為自動化線內PCR，在本領域內是熟知的并且通常在本說明書 中進行描述。
大多數(shù)自動化線內PCR平臺使用與控制器/檢測器界面一起工作 的微流芯片以進4亍自動化上樣(sample accession)、孩i流PCR試劑 的混合(assembly) 、 PCR熱循環(huán)和光學檢測光傳學。微流芯片通常 包含具有至少一個可結合至第二板的微蝕刻(micro-etched )流體(微 流)線內反應通道的第一板，在所述第二板中可以是金屬絲(metal trace)和j^液池(fluid reservoir)。當兩塊板結合在一起時，第 一板的各微流反應通道可與第二板的貯液池連接，這樣基因座特異性 試劑可通過貯液池遞送至^:流線內反應通道。
當毛細管或"吸漿管(sipper)，，從例如微量滴定板(其可來自 例如機械處理器)抽吸樣品滴(其可以是或不是DM樣品滴，即包含 從生物分離的基因組材料的樣品滴)入至少 一個微流線內反應通道時， 線內PCR開始進行。在將樣品滴抽吸入微流線內反應通道后，可將吸 漿管移入緩沖液通道中，這樣緩沖液就可被抽入微流芯片。從而，將 樣品滴之間的交叉污染減少至最少或消除，因為各樣品滴與緊鄰的樣 品滴被緩沖液間隔物分開。然后將各樣品滴沿微流線內反應通道移動 并進入所述芯片的PCR裝配區(qū)，其中所述樣品滴通過與PCR所需的試 劑例如引物對、DNA聚合酶和dNTP以及可檢測試劑例如插入劑等混合 變成樣品塞(樣品塞)。任意地，也可將緩沖液間隔物與PCR所需的 試劑混合以用作負對照。在與PCR所需的和可檢測的試劑混合后，樣 品塞(其可以是或可以不是DNA樣品塞，即包含基因組材料的樣品塞) 沿微流線內反應通道的長度方向流入芯片的不同區(qū)域例如擴增區(qū)域， 在該區(qū)域中PCR可在該樣品塞上進行。
一般地，當各樣品塞(例如，DNA樣品塞)流過微流線內反應通道時，其進入溫度受控制的擴增區(qū)，其中以局域化的方式重復地且快 速地加熱和冷卻各孩i流線內反應通道，從而在各樣品塞流過所述反應
通道時對其進行PCR的變性、退火和延伸步驟；將不包含基因組材料 的樣品塞暴露于相同的加熱和冷卻過程等。DNA的擴增只在DNA樣品 塞即包含基因組材料的樣品塞中發(fā)生?？刂茢U增區(qū)中的溫度的方法是 焦耳加熱法(Joule heating)(參見，例如，美國專利5， 965， 410和 6， 670， 153)。 一般地，可以受控和局域化的方式對微流線內反應通道 中或附近折金屬絲施用電壓以獲得PCR各循環(huán)所需的不同溫度?？赏?過使用例如冷卻流過螺旋管從而以熱的形式從微流線內反應通道帶走 熱能的流體，或通過使得能夠快速擴散熱量(例如通過對所述微流芯 片的底面使用冷水，或簡單地輻射對流入大氣或使用散熱裝置進行合 適的熱轉移)來實現(xiàn)反應的冷卻。因為微流通道中的液體體積很小且 金屬絲非常靠近微流線內反應通道，因此通道內液體(從而，樣品塞) 的加熱和冷卻可非?？焖俚貙崿F(xiàn)。結果，DNA樣品塞進行PCR，且以在 少于9分鐘的時間內進行例如30個循環(huán)的方式進行PCR循環(huán)。各DNA 樣品通過芯片的溫度控制區(qū)中的微流通道期間進行的PCR循環(huán)次數(shù)可 通過改變例如l)對所述金屬絲使用的電壓時限和2) DNA樣品塞通過微 流通道的流速中的任一條件或兩個條件來改變。
微流芯片可同時進行與其具有的微流線內反應通道一樣多的聚合 酶鏈式反應。例如，包含基因組材料的樣品可被抽吸入多個不同的微 流線內反應通道，所述各通道中加入了不同的基因座特異性試劑(例 如，包圍基因組材料例如DNA上的不同基因座的不同引物對)。這使 得能夠同時檢測例如從相同生物體分離的基因組材料上幾個不同的基 因座?？蛇x擇地，可將包含一對特異性引物對的試劑抽吸入多個不同 微流線內反應通道。這使得能夠同時檢測例如從不同生物體分離的基 因組材料上的相同基因座。此外，可將多個樣品滴抽吸入相同的微流 反應通道。
檢測區(qū)通常在溫度受控擴增區(qū)的下游，其通常是有利于觀察和檢 測擴增的DNA產物例如PCR產物的透明區(qū)域。在檢測區(qū)，通常將各微流線內反應通道緊靠檢測器且在其下通過。光源擴散穿過微流線內反 應通道，這樣可同時測量通過光學檢測區(qū)的可檢測試劑，例如從各通
道各DNA樣品塞發(fā)射的萸光。在檢測區(qū)之后，各微流線內反應通道通 常將各樣品塞導向廢液孔。
通常使用3種不同的方法在微流線內反應通道內產生流體運動； 所述方法包4舌電動法(electrokinetics )、壓力或兩者的結合(參見， 例如，美國專利6, 238， 538、 6, 670, 153、 6， 787, 088和美國^S開專利 申請2001/0052460)和非機械閥(參見例如，美國專利號6， 681， 788和 6, 779, 559)。在壓流系統(tǒng)(pressure-based flow system)中，可使 用內源或外源于線內反應通道內驅動流體流動。例如，可對各微流線 內反應通道末端的廢液孔施加真空和可將其用于啟動吸漿管從而將流 體沿著微流線內反應通道朝向廢液孔運動?？蛇x擇地，因為基因組材 料帶電荷，因此可使用電動法即產生電壓梯度(例如，通過對金屬絲 施加電壓)來驅動帶電流體沿微流線內反應通道運動。驅動流體沿所 述線內反應通道流動的第3種方法使用電動力和壓力。結果是微流線 內反應通道內的流體的連續(xù)流動，其中樣品塞(例如，DNA樣品塞) 被連續(xù)混合或流動至芯片的不同區(qū)域(例如，PCR裝配區(qū)、溫度控制 區(qū)、檢測區(qū)等)。
可通過與芯片接合的儀器(通常描述于美國專利6， 033， 546和 6， 582， 576)控制涉及微流芯片的電動力和/或壓力驅動的流體運動，加 熱和冷卻循環(huán)，檢測和數(shù)據(jù)獲得。所述儀器的接口通常包含密封芯片 上的試劑小孔的0型圏密封、可與芯片上的金屬絲連接從而為溫度循 環(huán)提供電壓的彈簧針(pogopins)、用于廢液孔的0型圏密封(在所 述廢液孔中可施用真空以使流體通過芯片)、可用于密封靠著循環(huán)冷 卻水的芯片底部和在溫度循環(huán)期間加速冷卻的大0型圏密封和用于例 如熒光檢測的檢測區(qū)帶。污染該系統(tǒng)的可能性最低，因為微流芯片通 常是封閉的系統(tǒng)，物理屏障(例如，緩沖液間隔物)分開DNA樣品塞。 此外，連續(xù)流動阻止了樣品塞回流。
上述自動化線內PCR平臺的限制在于微流芯片應當在使用之后,皮拋棄，不適合用于自動化線內波形表征；此外，使用該平臺分析樣品 需要外來設備。另外，使用吸漿管抽吸樣品滴是獲得快速進行PCR循 環(huán)所需的小體積的無效和浪費的方法。本發(fā)明通過提供分子診斷裝置 來解決這些限制，所述裝置可通過使用制備基因組材料的自動化方法， 然后進行l(wèi))擴增基因組材料和檢測任何擴增的產物和2)對基因組材 料作圖中的任一項或兩者來表征從樣品的生物(例如，細菌、病毒) 分離的基因組材料。本發(fā)明的至少一個示例性實施方案的分子診斷裝 置具有可通過相同的微流芯片處理多個樣品例如患者樣品而無交叉污 染的有利方面。此外，因為在一些示例性實施方案中，裝置是便攜式 系統(tǒng)，本發(fā)明的至少一個示例性實施方案的裝置可用于全美國或世界 其他地方的不同患者保健中心，和可用于遠離醫(yī)院或其他患者保健中 心的患者身邊裝置或被污染的位置。此處公開的分子診斷裝置具有有 利于在樣品采集后短時間篩選樣品的有利方面。
發(fā)明概述
至少一個示例性實施方案涉及經構造用于分離基因組材料的盒式 ji!i存器(cartridge )，其中包含至少一個通道和能夠結合和釋放基因 組材料的固體基質。在至少一個進一步的示例性實施方案中，盒式貯 存器還包含廢液孔。在另一個示例性實施方案中，能夠結合和釋放基 因組材料(即結合與釋放基質)的固體基質包含電荷轉換材料(charge switch material )。
本發(fā)明的至少一個示例性實施方案涉及經構造用于分離基因組材 料的盒式貯存器，其包括反應室，和至少一種結合與釋放基質，其 中至少一種結合與釋放基質位于反應室內，被構造用于結合和釋放部 分包含基因組材料的樣品。在至少一個其他示例性實施方案中，基質 包含電荷轉換材料。在至少一個其他示例性實施方案中，至少部分樣 品的結合和釋放響應于電壓。在至少一個其他進一步的示例性實施方 案中，至少部分樣品的結合和釋放響應與基質接觸的流體的離子組成 的差異，樣品包含在流體中。在至少一個其他的示例性實方案中，至 少部分樣品的結合和釋放響應與基質接觸的流體的PH的差異，樣品包含在流體中。在至少一個其他的示例性實施方案中，基質是顆粒或小 珠。在至少一個其他的示例性實施例中，基質是磁性的或順磁的。在 至少一個其他的示例性實施方案中，基質與反應室的內表面結合。在 至少一個其他的示例性實施方案中，從基質釋放的至少部分樣品的體 積從樣品的體積減少了 。
在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，本發(fā)明涉及構造用于遞 送包含基因組材料的樣品的盒式貯存器，其包括基因組分離和導向系
統(tǒng)，以及噴射頭(ejector head)，其中噴射頭中的小室經構造用于 接收包含來自基因組分離和導向系統(tǒng)的基因組材料的至少部分樣品， 其中噴射頭以噴射的樣品滴形式將至少部分接收的樣品噴出盒式貯存 器。在至少一個其他的示例性實施方案中，噴射頭使用由熱能發(fā)生器 提供的熱能。在至少一個其他示例性實施方案中，噴射頭是壓電噴射 系統(tǒng)。
至少一個本發(fā)明的示例性實施方案涉及構造用于分離基因組材料 的盒式貯存器，其包括反應室、至少一種結合與釋放基質(其中至少 一種結合與釋放基質位于反應器內并且被構造用來響應電壓以結合和 釋放包含基因組材料的至少部分樣品)、基因組分離和導向系統(tǒng)以及 噴射頭，其中噴射頭內的小室經構造用以接受至少部分來自基因組分 離和導向系統(tǒng)的樣品，其中噴射頭以噴射的樣品滴形式將至少部分接 收的樣品噴出盒式貯存器。在至少一個其他示例性實施方案中，基質 包含電荷轉換材料。在至少一個其他示例性實施方案中，基質是顆粒 或小珠。在至少一個其他示例性實施方案中，基質是磁性的或順磁的。 在至少一個其他示例性實施方案中，基質結合反應室的內表面。在至 少一個其他示例性實施方案中，噴射頭使用由熱能發(fā)生器提供的熱能。 在至少一個其他示例性實施方案中，噴射頭是壓電噴射系統(tǒng)。
本發(fā)明的至少一個示例性實施方案涉及分子診斷裝置，該裝置包 括至少一個盒式貯存器和至少一個微流芯片，其中芯片經構造用以接 受至少部分從盒式貯存器噴射的樣品，其中芯片包含至少一個用于接 受從盒式貯存器噴射的樣品滴的微流線內反應通道。在至少一個其他示例性實施方案中，可以重復脈沖率來重復脈沖盒式貯存器的噴射頭 以在微流芯片的微流線內反應通道中獲得受控制的總液滴體積。在至
少一個其他示例性實施方案中，重復脈沖率在大約1 kHz至大約100 kHz的范圍內。在至少一個其他示例性實施方案中，重復脈沖率是大 約50kHz。在至少一個其他示例性實施方案中，噴射的樣品滴具有大 約l皮升至大約25皮升的體積。在至少一個其他示例性實施方案中， 噴射的樣品滴具有大約3皮升的體積。在至少一個其他示例性實施方 案中，總液滴體積是大約3皮升至大約100納升。在至少一個其他示 例性實施方案中，微流芯片還包括在第 一 溫度控制區(qū)內的用于擴增 DNA產物的擴增區(qū)和在第二溫度控制區(qū)內的檢測區(qū)，擴增的DNA產物 的檢測可在多個溫度下進行。在至少一個其他示例性實施方案中，裝 置進一步包括矩P車分析區(qū)域(matrix analysis area)。
本發(fā)明的至少一個示例性實施方案涉及包括一個樣品滴接收系統(tǒng) (經構造用以接收從盒式貯存器噴射的包含基因組材料的至少部分樣 品)和矩陣分析區(qū)，其中矩陣分析區(qū)包含發(fā)射器層(emitter layer)、 濾波體層(filter layer)和檢測器層，其中發(fā)射器層發(fā)射發(fā)射波長。 在至少一個其他示例性實施方案中，濾波體層包括通過熒光波長和阻 止發(fā)射波長的涂有濾波體的鏡片。在至少一個其他示例性實施方案中， 微流芯片還包括至少2個室，其中兩個通道經構造用以使包含基因組 材料的樣品流過第一溫度控制區(qū)內的擴增區(qū)以進行DNA產物的擴增，
然后流過第二溫度控制區(qū)內的檢測區(qū)以引發(fā)DNA產物的熒光，其中擴 增的DNA產物的檢測可在多個溫度下進行。
本發(fā)明的至少一個示例性實施方案涉及分子診斷裝置，所述裝置 包括至少一個盒式貯存器和微流芯片，其中盒式貯存器將包含基因組 材料的樣品滴噴射入微流芯片的樣品滴接收系統(tǒng)。在至少一個其他的 示例性實施方案中，矩陣分析區(qū)還包括多個單元，各單元包括至少一 個光子發(fā)生器元件、DNA伸展芯片(DNA stretchchip)和至少一個光 子探測器元件。在至少一個其他的示例性實施方案中，至少一個光子 探測器元件包含卟啉柵材料。在至少一個其他的示例性實施方案中，至少一個光子檢測器元件包含3個薄膜晶體管。在至少一個其他的示
例性實施方案中，裝置是便攜式的。在至少一個其他的示例性實施方
案中，裝置是手持式的。
至少 一 個本發(fā)明的示例性實施方案涉及表征樣品中的基因組材料
的方法，其包括步驟(a)用盒式貯存器分離樣品中的任何基因組材料； (b)將至少一個樣品滴從自盒式貯存器中的液體噴射裝置噴射入微流 芯片的樣品滴接收系統(tǒng)；(c)檢測樣品中的基因組材料；和(d)分析樣 品滴以表征存在的基因組材料。在至少 一個其他示例性實施方案中， 分析樣品滴包括將檢測到的樣品中的基因組材料的條形碼與已知條形
碼的數(shù)據(jù)庫進行比較。
至少一個本發(fā)明的示例性實施方案涉及分子診斷裝置，該裝置包
括至少一個用于分離基因組材料的盒式貯存器；至少一個用于在基因 組材料分離后從盒式貯存器噴射基因組材料的樣品滴的噴射頭，其中 至少一個盒式貯存器可附著至至少一個樣品滴噴射頭；和至少一個用 于分析基因組材料的微流芯片，其中微流芯片包括至少一個用于接收 來自樣品滴噴射頭的噴射的基因組材料的微流線內反應通道和至少一 個用于在微流線內反應通道內進行流體的加熱和/或控制流體運動的 金屬絲，其中至少一個微流線內反應通道通過試劑裝配區(qū)、第一溫度 控制區(qū)內用于擴增DNA產物的擴增區(qū)和檢測區(qū)。在至少一個其他的示 例性實施方案中，檢測區(qū)位于第二溫度控制區(qū)內，擴增的DNA產物的 檢測可在多個溫度下進行。在另一個示例性實施方案中，裝置還包括 矩陣分析區(qū)。在其他示例性實施方案中，矩陣分析區(qū)包括多個單元， 各單元包括至少一個光子發(fā)生器元件、DNA伸展芯片和至少一個光子 檢測器元件。在本發(fā)明的另一個示例性實施方案中，分子診斷裝置是 便攜式的。在至少一個其他的示例性實施方案中，分子診斷裝置的矩 陣分析區(qū)包括512x512個單元的矩陣。
附圖概述


圖1A根據(jù)本發(fā)明的至少一個示例性實施方案舉例說明盒式貯存器設計，和圖1B根據(jù)本發(fā)明的至少一個示例性實施方案的舉例說明具 有芯片的盒式貯存器。
圖2根據(jù)本發(fā)明的至少一個示例性實施方案顯示位于相互之間固 定的位置上的噴射頭和微流端口 (microfluidic port)的示意圖。
圖3根據(jù)本發(fā)明的至少一個示例性實施方案示意性圖解了將微流 線內反應通道(inline reaction channel)內的大塊樣品滴分隔(a massive sample partitioning )入多個子通道。
圖4根據(jù)至少一個示例性實施方案示意性描述了當樣品滴與擴 增試劑混合從而在試劑裝配區(qū)形成樣品塞和在擴增區(qū)內進行擴增的樣 品滴途徑。
圖5根據(jù)至少一個示例性實施方案示意性描述了在樣品塞通過圖 4的溫度控制區(qū)和通過檢測區(qū)后微流線內反應通道內的樣品塞途徑。
圖6A-6C根據(jù)本發(fā)明的至少一個示例性實施方案描述了時序圖的 幾個方面。圖6A描述了 2x2矩陣的圖示，包括行接線(row wiring) (RW)和柱接線(CW)的圖示，以及二進制移位寄存器(binary shift register) (BSR1)的計時脈沖0UT1和0UT2的時序列圖(時序圖2)。 圖6B描述了時序圖1和4,圖6C描述時序圖3(其遵從BSR2的脈沖 INI和IN2的狀態(tài)(如圖6A中所示))。
圖7是至少一個示例性實施方案的裝置的矩陣分析區(qū)域的單通道 毛細管(即，微流)元件的橫截面。
圖8是根據(jù)至少一個示例性實施方案總體顯示熒光檢測系統(tǒng)在應 用中的操作原理的光學圖解。
圖9根據(jù)至少一個示例性實施方案舉例說明矩陣分析區(qū)域內的矩
陣(或陣列)的裝配。
圖10是根據(jù)至少一個示例性實施方案的具有矩陣光學檢測區(qū)帶 的90-通道微流陣列。
圖11顯示玻璃濾波體的波長特征。
發(fā)明詳述至少一個示例性實施方案的下列描述本質上是只用于舉例說明 的，決非限定本發(fā)明、其應用或用途。
相關領域內的技術人員已知的方法、技術、裝置和材料可以不進 行詳細地描述但希望作為授權描述的部分，該描述涉及例如孩￡流通道、 子通道和微通道和其相關材料的合適的裝配。
在此處說明和描述的所有實施例中，任何確定的值例如流體的量 (例如，皮升)應當解釋為只是舉例說明的和非限定性的。因此，示 例性實施方案的其他實施例可具有不同的值。
要指出的是，相似的參考數(shù)字和字母是指此處公開和描述的圖中
的相似的項(item)，從而在一個圖中確定了項后，可以不在下圖中 對其進行描述。
至少一個本發(fā)明的示例性實施方案涉及分子診斷裝置和使用該分 子診斷裝置進行表征樣品的基因組材料的自動化方法的方法。在眾多 示例性實施方案中，所述方法使得制備樣品基因組材料(即，分離任 何材料，和分配樣品)和進行1)擴增和檢測擴增的產物和2 )作圖中 的任一步驟或兩個步驟來鑒定基因組材料成為必需。本發(fā)明的至少一 個示例性實施方案的分子診斷裝置包括至少一個盒式貯存器和至少一 個用于制備(待分析的樣品的基因組材料的分離和分配)的液體噴射 裝置；和至少一個用于擴增從樣品分離的基因組材料和檢測從基因組 材料擴增的產物的微流芯片。在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中， 液體噴射裝置將制備的樣品從盒式貯存器轉移至微流芯片。在本發(fā)明 的另一個實施方案中，本發(fā)明的分子診斷裝置還包括用于基因組材料 作圖的矩陣分析區(qū)。因此，本發(fā)明的至少一個示例性實施方案的分子 診斷裝置可用于表征基因組材料的自動化方法，所述方法包括制備基 因組材料以及l(fā))擴增基因組材料，然后檢測擴增的產物和2)對基因組 材料作圖中的任一或兩者的步驟。
將容易地認識到為了此處的目的，制備樣品的步驟包括從樣品分 離基因組材料(如果存在)和分隔樣品(包括任何分離的基因組材料) 以進行分析。同樣擴增基因組材料的步驟包括將任何分離的基因組材料與合適的擴增劑(例如，引物、dNTP、鹽、緩沖劑等)和任意地檢測 試劑(例如，插入劑)混合，然后對分離的基因組材料進行擴增反應。 可使用本發(fā)明的示例性實施方案的分子診斷裝置進行的擴增反應的非 限定性實例包括PCR和各種形式的波形表征法(參見，例如，美國專利 申請11/190, 942和11/356, 807，其公開內容在此以其全文引用作為 參考)。檢測步驟依賴于使用的擴增方法，即，PCR產物或高級結構的 解離是否依賴于是否分別進行PCR或波形表征法。在制備樣品后，本 發(fā)明的至少一個示例性實施方案的分子診斷裝置可允許任何分離的基 因組材料l)被擴增和通過其擴增的產物進行檢測，2)被擴增和通過 其擴增的產物進行檢測，并且在矩陣分析區(qū)進行作圖，如此處描述的， 或3)在矩陣分析區(qū)內進行作圖，如此處描述的。 分子診斷裝置
在過去的數(shù)年中，已發(fā)展了與多種現(xiàn)有的和熟知的熒光"混合-和-閱讀，，生物化學方法例如TaqMan、 Molecular Beacons 、 Epoch Eclipse Probes和等位基因特異性擴增(Allele Specific Amplif ication)兼容的自動化線內PCR平臺。迄今為止，還沒有自動 化線內平臺使得能夠進行有效的現(xiàn)場(例如，靠近患者)基因檢測，所述 檢測避免了對外部來源的樣品(例如，在醫(yī)生辦公室或在另 一 個近患 者位置采集的患者樣品)的需要。本發(fā)明的目的是提供可用于例如在 相同的地方和在獲得待分析的樣品的短時幀(例如，大約1小時)內 就例如細菌或病毒感染的存在分析患者樣品的分子診斷裝置。如在此 處進一步描述的，本發(fā)明的至少一個示例性實施方案的分子診斷裝置 包括至少一個構造用于分離樣品中的任何基因組材料的盒式貯存器； 至少一個包括至少一個用于分隔任何分離的基因組材料的噴射頭的液 體噴射裝置，其中至少一個盒式貯存器可以附加或臨時附加至少一個 噴射頭；和至少一個用于檢測任何基因組材料的微流芯片，其中微流 芯片包括至少一個用于接收從液體噴射裝置噴射的基因組材料的微流 線內反應通道和至少一個用于在^:流線內反應通道內進行加熱和/或 驅動液體運動的金屬絲，其中至少 一個微流線內反應通道通過試劑裝配區(qū)、第一溫度控制區(qū)內用于擴增DNA產物的擴增區(qū)和微流芯片的檢 測區(qū)。在本發(fā)明的另一個示例性實施方案中，本發(fā)明的分子診斷裝置 還包括用于基因組作圖的矩陣分析區(qū)。 1. 制備基因組材料
本發(fā)明的至少一個示例性實施方案的分子診斷裝置包括盒式貯存 器和液體噴射裝置，兩者都明確參與制備存在于樣品中的任何基因組 材料。換句話說，可通過盒式貯存器從收集的樣品(例如，患者樣品) 分離基因組材料，然后在后來的通過微流芯片進行的擴增和檢測(和/ 或作圖)步驟之前通過液體噴射裝置噴射所述材料。
本發(fā)明涉及本發(fā)明的至少一個示例性實施方案的分子診斷裝置 可用于患者樣品的現(xiàn)場(例如，靠近患者)檢測；此外，可使用本發(fā) 明的分子診斷裝置檢測許多不同類型的樣品。這些樣品包括，但不限 于，水、空氣、塵埃、食物和生物樣品，包括體液(例如，唾液、全 血、血漿、血沉棕黃層、尿等)、細胞(例如，完整細胞、細胞碎片和 細胞提取物)和組織。生物樣品也包括采集用于例如組織學目的組織切 片例如活檢組織和冰凍切片。示例性生物樣品包括但不限于血液、血 漿、淋巴、活檢組織、尿、CSF(腦脊液)、滑膜液和BAL(支氣管肺泡 灌洗液)。在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案，生物樣品是血。
A.盒式J^存器
可使用任何熟知的方法例如用于收集患者血液樣品的注射器收集 樣品，然后將其置于本發(fā)明的至少一個示例性實施方案中的一次性使 用的盒式貯存器內以從樣品分離基因組材料；在至少一個示例性實施 方案中，將樣品直接收集入一次性使用的盒式貯存器。本發(fā)明的至少 一個示例性實施方案的盒式貯存器經構造用以分離樣品中包含的任何 基因組材料，在盒式貯存器內包括至少一個通道(和/或室)；在盒式 貯存器內的至少一個通道中從樣品分離基因組材料。
圖1A根據(jù)至少一個示例性實施方案舉例說明盒式貯存器100a的 非限定性實例，圖1B舉例說明了盒式貯存器100b和芯片190之間的 相互作用。圖1A中舉例說明的盒式貯存器100a包括外部樣品入口(external sample inlet) 110;任意地入口帽(inlet cap) 115; 樣品室A;可被推壓從而允許外部樣品進入樣品室A(例如，可通過泵 入口F1對其抽真空，然后封閉，從而使低壓將外部樣品引進室A)的 推動閥(push valve) Bl;任意地電極140(例如，提供電壓以破碎細 胞膜或細胞壁，從而將基因組材料釋放入室A內)；可被推動從而允許 基因組材料從室A進入室B的推動閥B2;其中結合與釋放基質150可 結合和釋放基因組材料；其中任意地電極160可用于指導基因組材料
(例如，從樣品提取的基因組材料)進入通道D，而廢液可通過通道C 被導出通過廢液出口 13;其中打印頭130收集打印頭E中的基因組并 且可用于將材料噴射入通道例如微流線內反應通道，例如定位沖洗盒 式貯存器(未顯示)；其中可通過洗液插入入口 Il插入洗滌；其中可通
過試劑插入入口 12插入試劑；其中可推動試劑插入閥B3以允許試劑 進入反應室B;其中可推動試劑插入閥B4以允許洗液進入反應室B; 和其中任意地電源系統(tǒng)120可為打印頭130和電極140和160以及結 合與釋放基質150提供電能。在至少 一個本發(fā)明的示例性實施方案中， 電源系統(tǒng)120為與打印頭130連接的或包含在其中的熱能發(fā)生器提供 電能。在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，釋放的基因組材料從 反應室B運動通過通道D進入打印頭E的路徑與基因組材料和任意地 控制基因組材料的運動的聯(lián)動電極160的聯(lián)合運動一起稱為基因組分 離和導向系統(tǒng)。
要指出的是圖1A舉例說明一個非限定性實例；預期在其他示例性 實施方案中存在變化。例如，電源系統(tǒng)120可以是外部的，試劑和洗 液可存在于盒式貯存器的內部室內，可用其他類型的方法(包括推動閥 和受電子手段控制的其他裝置或方法)替換推動閥以阻斷和打開相關 領域內的技術人員已知的液體通道，廢液可貯存在盒式貯存器的內室 中，盡管圖1A說明了來自一個注入的樣品的基因組材料，但可通過倍 增已描述的盒式貯存器的部分來插入來自例如不同個體(例如，患者) 或取樣的其他來源(例如，提供水)樣品的多個插入物，例如每個人(例 如，患者)或取樣的其他來源(例如，提供水)一個插入物。盡管不存在對可收集入本發(fā)明的盒式貯存器的樣品的量的限制，
但預期將盒式貯存器用于確定來自大約100 jjl的樣品的基因組材
料。例如，由本發(fā)明的至少一個示例性實施方案的盒式貯存器包含的
樣品制劑的體積可在IO ial至lml的范圍內。
在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案的盒式貯存器中，只使用均 質的水溶液從樣品分離基因組材料。均質溶液的使用方便地避免了大 多數(shù)分離基因組材料的方法的效率低下的需求(例如，基于酒精或基于 其他有機物的溶液與水溶液之間的轉換和離心)，也促進了盒式貯存器 與本發(fā)明的示例性實施方案的液體噴射裝置的聯(lián)合使用。此外，與其 中將基因組材料與基質結合的方法不同，本發(fā)明的盒式貯存器(整合了 此處描述的"電荷轉換"技術)允許基因組材料在一個條件下對基質結 合或在另一個條件下從基質釋放。因此，在本發(fā)明的范圍內的是在 一些示例性實施方案中，可重新使用盒式貯存器從多個樣品分離基因 組材料。
例如，在至少一個示例性實施方案中，可收集樣品，將其稀釋(例 如，在水性裂解緩沖液中)以獲得一定的體積，然而同時或相繼抽吸 入本發(fā)明的盒式貯存器(例如，進入盒式貯存器的反應室)，其中的條 件促進基因組材料對結合與釋放基質(此處也稱為基質)的表面結合。 在另一個示例性實施方案中，可在盒式貯存器內稀釋裂解緩沖水液。 在將基因組材料對結合與釋放基質結合后，未結合的大分子(例如， 蛋白質、污染物等)被洗出。然后可改變盒式貯存器的條件以將基因 組材料釋放(即，洗脫)入例如緩沖水溶液或水中。然后可通過此處 描述的液體噴射裝置將包含基因組材料的洗脫液送入微流芯片進行分 析。在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，在盒式貯存器與樣品一 起使用后將其拋棄。在本發(fā)明的另一個實施方案中，可清洗盒式貯存 器，包括使盒式貯存器的基質的表面經歷促進基因組材料的結合和/ 或釋放的條件，然后再重新用于從另一個樣品分離基因組材料。
為了本發(fā)明的至少一個實施方案的盒式貯存器的目的，結合與釋 放基質可以是具有固體表面的任何支持物，例如，顆粒、小珠、管、小孔、玻璃、塑料等。具有用于本發(fā)明的至少一個示例性實施方案的 盒式貯存器的固體表面的合適的支持物是這樣的支持物，即其可具有
(例々:使用條件化緩;液)以;更在盒式敢存器內結iZ釋放基因組材 料。用于條件化固體相支持物的表面的合適的方法包括用條件化緩沖 液(例如可在表面上導入電荷(例如，正電荷)，或使表面親水或疏 水等的物質)處理其。此外，合適的支持物是可以磁化的、有磁性的、 順磁的等。在至少一個示例性實施方案中，盒式貯存器的內表面包括 盒式貯存器內的通道的內表面。在本發(fā)明的至少一個其他實施方案中， 盒式貯存器的內表面可用作基質。在另一個示例性實施方案中，盒式 貯存器內的顆?；蛐≈?包括磁化的或可磁化的顆?；蛐≈?可用作 基質。
例如，美國>^開專利申請2003/0054395和2003/0130499 (其各 自在此以其全文引用作為參考)描述了在水溶液中分離基因組材料的 方法，該方法包括條件化固體相基質以結合和隨后釋放基因組材料。 簡而言之，這些申請描述了提供給固相基質(例如，無孔固相基質) 的表面提供可依賴于條件化緩沖液進行轉換的電荷，即存在于固相基 質的內部、表面或實際上包括固相基質的"電荷轉換材料"。根據(jù)美 國公開專利申請2003/0054395,電荷轉換材料是可離子化的。例如， 可通過吸附、離子鍵或共價鍵將包含可離子化的基團的化學物質以單, 體或多聚體的形式固定至固體支持物，或共價附著至聚合物主鏈，然 后將該聚合物主鏈固定至固體支持物?？蛇x擇地可將化學物質整合入 固體和不溶性形式例如小珠、顆粒、路徑、通道等(例如，在盒式貯
存器內)。通常這樣選擇電荷轉換材料以使可離子化基團的pKa適合于 希望在其下將核酸與固體相基質結合和釋放的條件。通常，基因組材 料在低于或大致等于pKa的pH下與電荷轉換材料結合，此時電荷轉換 材料帶正電荷，其在更高的pH (通常高于pKa)下釋放，此時電荷轉換 材料呈現(xiàn)較少的正電荷、中性或帶負電荷。換而言之，在低pH的條件 下，基質表面具有能夠結合帶負電荷的基因組材料的正電荷。污染物例如蛋白質、其他大分子等不被結合，從而可在正常生理溫度下用緩
沖清洗水溶液洗去。增加pH將中和基質表面的電荷，從而實現(xiàn)可用洗 脫緩沖水溶液進行洗脫的基因組材料的釋放。
因此，在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，盒式l&存器的內 壁或盒式貯存器內的通道的內壁可以是提供以可依賴于pH的條件轉 換的電荷的固相基質。在另一個實施方案中，可對其提供可轉換電荷 的小固相顆粒和小珠(例如，磁珠)在盒式l&存器內。該后一個示例 性實施方案通過使用磁場提供了防止小珠與污染物一起被洗去的合適 的方法。在至少一個示例性實施方案中，任意地盒式貯存器內部或外
i。、"' "、 ' - 土 '、
流體(例如，條件化緩沖液、樣品、裂解緩沖液、污染物、洗脫液、 清洗緩沖液等)在盒式貯存器內可采用不同的途徑分離基因組材料，最 終，噴射可包含分離的基因組材料的樣品滴。例如，樣品可沿著直的、 彎曲的或管狀路徑(其可以是任何三維形狀(例如，橫截面為圓形、 半圓形、正方形等的管))行進，連接另一條路徑(例如，從而與裂解 緩沖液混合)，在盒式貯存器內分成兩個或更多個其他路徑，從而允許 與其他材料匯集、混合和/或溫育等。在至少一個本發(fā)明的示例性實施 方案中，毛細作用用于抽吸樣品、條件化緩沖液、裂解緩沖液、污染 物、洗脫劑、清洗緩沖液等通過盒式貯存器至本發(fā)明的至少一個示例 性實施方案的液體噴射裝置。毛細作用可以要求盒式貯存器在導入樣
品之前充滿液體(例如，充滿條件化緩沖液)；在另一個示例性實施 方案中，來自樣品(例如，血)的.注射壓力單獨地可足以推動樣品通過 盒式lie:存器。在本發(fā)明的其他示例性實施方案中，使用真空抽吸樣品 通過盒式貯存器。在另一個實施方案中，電動力驅動樣品或樣品的部 分(例如，從樣品提取的基因組材料)移動通過盒式貯存器。
盒式貯存器的另一個元件是其減少患者樣品的體積的能力。在至 少 一個本發(fā)明的示例性實施方案中，將任何分離的基因組材料洗脫在 少于樣品的原始體積的液體體積中。在本發(fā)明的至少一個其他示例性實施方案中，以微升例如大約1-10 yl，例如大約2.5 u 1的體積洗 脫任何基因組材料。
當此處的方法描述DNA擴增過程的，如果分離的基因組材料是 RNA，在通過微流芯片擴增之前其必須首先被反轉錄成DM例如cDNA。 反轉錄的方法在本領域內是熟知的。在至少一個示例性實施方案中， 分離的基因組材料是生物的總DNA。在另一個示例性實施方案中，使 用熟知的試劑例如RNA酶純化基因組DNA以排除RNA。
本領域技術人員將認識到對于分離技術例如其中相互分開地保持 樣品滴(例如，分離樣品滴使其與其之前的樣品滴和與其之后的樣品 滴分開)，特別是對于分子診斷的需要。盡管大多數(shù)自動線內平臺使 用吸漿管進行該分離，即將制備的樣品抽吸入微流芯片，吸漿管的使 用是浪費的，因為并不檢查小孔中的整個樣品。此外，吸漿管本身不 適于大塊樣品的分隔，即以小體積例如大約2. 5 yl將樣品分成例如 大約一千個分離的(樣品)小滴。本發(fā)明解決了吸漿管的限制，通過 液體噴射裝置幫助大塊樣品分隔。例如，可以以密閉的方式將至少一
個本發(fā)明的示例性實施方案的盒式貯存器附著至或連接至液體噴射裝 置以通過液體噴射系統(tǒng)噴射樣品滴，包括DNA樣品滴，所述噴射系統(tǒng) 適合將樣品滴噴射入或穿過空隙而被微流芯片的微流線內反應通道接 收。
B. 液體噴射機械裝置
如所指出的，或對本發(fā)明的至少一個示例性實施方案的盒式貯存 器提供對液體噴射裝置的連接以通過液體噴射系統(tǒng)噴射樣品滴包括 DNA樣品滴。液體噴射機械裝置反過來可包括一個或多個液體噴射部 分，即，噴射頭(此處也稱為打印頭)。通常用待測試的樣品或微流 芯片內的微流線內反應通道預先確定噴射頭的數(shù)目。為各液體噴射(或 液體發(fā)射)頭提供盛裝液體的貯液池部分以盛裝制備的樣品，噴射端 口通過液體與液體貯液池部分連接(如果需要，與流體路徑一起用于 聯(lián)系液體貯液池部分與相應的噴射端口 )，在噴射端口附近提供能量 發(fā)生裝置。該排列使得可能通過噴射獨立于保留在貯液池部分的制備的樣品滴來進行制備的樣品的大塊分隔。
本發(fā)明的至少一個示例性實施方案的噴射頭適合通常利用熱能發(fā) 生器提供的熱能噴射或發(fā)射樣品滴?？墒褂贸Ｒ?guī)的液體噴射系統(tǒng)例如 通過使用來自電熱轉化器例如加熱器或激光加熱以產生水泡(例如，
液體泡)來噴射液體的發(fā)泡噴射系統(tǒng)(bubble jet system)。此外， 在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，噴射頭是壓電噴射系統(tǒng)。因 此，可使用通過對壓電元件施加電壓來噴射液體的常規(guī)壓電噴射系統(tǒng)。 與壓電噴射系統(tǒng)中的頭相比，與熱噴射系統(tǒng)一起使用的噴射頭具相對 簡單的結構，因此，可以更容易地減小規(guī)模，從而提供多個噴咀。此
外，形成遞送至微流線內反應通道(或端口 )的樣品所需的時間相對短， 這樣可避免通過加熱產生DM的二級結構，從而可提高隨后對例如擴 增引物的雜交功效。因此，熱噴射系統(tǒng)有利地用作用于本發(fā)明的目的 的液體噴射系統(tǒng)。
通常，出于本發(fā)明的目的有利地使用流體噴射器領域的基本原理 以將液體滴噴射(例如，如美國專利4， 723， 129和4， 740， 796中所^^開 的)入樣品滴噴射物。此處可使用所謂的按需(on-demand)類型和連 續(xù)類型法的兩個公開原理。然而，出于本發(fā)明的目的可以有利地使用 按需類型的方法使相應于液體路徑排列的電熱轉化器中產生的熱能減 少至最小。從而，可以以相對于驅動信號的1對1的對應在制備的樣 品中產生液泡。經制備的樣品通過噴射端口的途徑作為液泡的生長和 壓縮的結果以產生至少一個樣品滴而噴射。如果驅動信號是重復的(例 如，1 kHz至100 kHz'例如，50 kHz)，可在短時幀內分配多皮升的液
滴以產生特定分析所需的任何實際大小和體積的液泡。因為可以控制 液泡對包圍介質的體積比，當分配樣品滴(例如包含基因組材料和試 劑的樣品滴)時可獲得已知的稀釋濃度。脈沖形狀的驅動信號，如美 國專利4, 463， 359和4， 345, 262中所描述的，可適當?shù)赜糜谶@些目的。 在至少一個本發(fā)明的分子診斷裝置的示例性實施方案中，可對盒式貯 存器的噴射頭重復脈沖，從而以重復的脈沖率順次形成多個液滴以在 微流芯片的微流線內反應通道(例如，微流線內反應通道的微流端口 )中獲得受控制的總液滴體積。在本發(fā)明的至少一個其他示例性實施方
案中，重復脈沖率在大約1 kHz至大約100 kHz的范圍內。在至少一 個其他示例性實施方案中，重復脈沖率是至少大約50kHz。當在熟知 的條件例如美國專利4， 313， 124中描述的條件下進行時可進一步提改 進品滴的噴射。
在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，噴射的樣品滴具有范圍 在大約1皮升至大約25皮升的體積。在本發(fā)明的至少一個其他示例性 實施方案中，噴射的樣品滴的體積是3皮升。在本發(fā)明的至少一個其 他示例性實施方案中，總樣品滴體積(例如，在微流線內反應通道的孩走 流端口中一起接收到的噴射樣品滴的總和)在大約3皮升至大約100 納升的范圍內。在本發(fā)明的至少一個另外的示例性實施方案中，總樣 品滴體積在大約20皮升至大約IO納升的范圍內。
關于噴射頭的構型，美國專利4, 558， 333和4， 459，600教導的那 些構型在本發(fā)明的范圍之內。此外，可通過為多個電熱轉化器(如在日 本專利申請Laid-open No. 59-123670中公開的)的噴射部分提供共同 的狹長開口 (slit)并且安排用于吸收壓力波的開放的孔(如在日本 專利申請Laid-open No. 59-138461中公開的)來更有效地獲得本發(fā) 明的有利方面。簡而言之，無論液體噴射頭的特定構型是什么，可按 照本發(fā)明準確而有效地實現(xiàn)通過微流線內反應通道捕獲樣品滴。
此外，可有利地使用牢固地固定至儀器主體的串列型 (serial-type )液體噴射頭、通過電力連接至儀器主體的可替換尖頭 型液體噴射頭或提供以整體溶液貯液池的盒式液體噴射頭。
在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，使用包含提供了發(fā)射復 原(ejection-restoring )裝置和/或備用輔助裝置(spare auxiliary apparatus )的液體噴射頭的液體噴射裝置。特定的實例包括用于液體 噴射頭的清潔器，壓縮或抽吸裝置，可以是不同類型的電熱轉化器或 加熱元件或其組合的輔助加熱器，和適合以除了點滴(spotting)外 的形式噴射液體的輔助噴射器。
液體噴射系統(tǒng)通常以比樣品滴小的衛(wèi)星小滴的形式產生廢液。在至少一個示例性實施方案中，這些衛(wèi)星小滴偏轉離開任何微流線內反 應通道以防止污染。通過提供真空或另一種合適的裝置將衛(wèi)星小滴抽 離微流線內反應通道并朝向例如任何熟知的和合適的廢液捕獲裝置，
滴的污染。此外，廢液捕獲裝置可用于從盒式貯存器捕獲廢液例如條 件化緩沖液、清洗廢液等。
在至少一個示例性實施方案中，液體噴射裝置的設計允許噴射頭 和微流線內反應通道以有利于樣品滴從液體噴射頭穿過空隙進入微流 線內反應通道的噴射的方式排列。例如，在至少一個其他示例性實施 方案中，至少一個微流線內反應通道和至少一個噴射頭相互之間處于 固定的位置。然而，噴射頭還可以以不同的方向旋轉至點，例如旋轉 至朝向廢液捕獲裝置的點。此外，可設計微流線內反應通道用以接收 來自不同角度的樣品滴(例如，進入微流線內反應通道的入口可具有漏 斗樣開口)，多個噴射頭對準通道入口。在這樣的示例性實施方案中， 可在相對于液滴運動(來自各自附著的盒式貯存器的)的方向在不同 的角度放置一個或多個樣品滴噴射頭(例如，各種不同的角度允許多 個噴射頭對單個微流線內反應通道提供樣品滴)。在本發(fā)明的范圍內的
是至少一個包含待檢測的患者樣品(制備的)的盒式貯存器或附著 至其本身的噴射頭，和噴射頭能夠對準至少一個微流線內反應通道。
可選擇地，在至少一個其中至少一個噴射頭和至少一個微流線內 反應通道相互之間相對處于固定的位置的其他示例性實施方案中，可 以存在多個導向微流通道的端口。在該示例性實施方案中，希望多個 噴射頭的各噴射頭對準多個微流端口 (例如，和存在的噴射頭一樣多) 的一個端口(例如，與存在的噴射頭一樣多)。各微流端口導向單個微 流線內反應通道(參見，例如，圖2)。在至少一個其他示例性實施方 案中， 一個噴射頭可在裝有(制備的)待測樣品的盒式存貯器(或為 了清洗噴射頭空的盒式存貯器)之間移動。在附著至盒式存貯器后， 可將噴射口角度轉向至少一個處于固定位置的微流線內反應通道(或 當附著的盒式貯存器排出廢液(例如，條件化緩沖液)時或當附著的盒式貯存器是清洗盒式貯存器時朝向廢液捕獲裝置)。在另一個示例性 實施方案中， 一個或多個噴射頭可保留在固定位置，而微流芯片可移 動，這樣至少一個微流線內反應通道與處于不同位置的不同噴射頭對準。
在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案，盒式貯存器包括噴射頭(例
如，本發(fā)明的打印頭)(參見，例如，圖1A)。在本發(fā)明的至少一個其 他示例性實施方案中，包含噴射頭的盒式貯存器經構造用于將包含基 因組材料的樣品遞送至微流芯片例如遞送至微流芯片的微流線內反應 通道的微流端口。在至少一個其他示例性實施方案中，包含基因組材 料的樣品，如在例如打印頭室B中發(fā)現(xiàn)的樣品和/或被導向例如微流端 口的排出的(或噴射出的)樣品(或樣品滴)進一步包含試劑，例如 通過試劑插入入口 12插入盒式貯存器的試劑。 2. 擴增基因組材料和檢測擴增的產物
如上所述，在制備樣品和通過液體噴射裝置重復噴射樣品滴后， 使用微流芯片分析可以為大約1-25 pl (或一些其他合適的體積)的樣 品滴。特別地，微流線內反應通道接收連續(xù)的樣品的樣品滴(例如， 通過漏斗和/或微流端口 )，通過自動化方法分析樣品滴?？倶悠返误w 積(例如，在例如微流線內反應通道的微流端口中一起接收到的噴射 樣品滴的總和)可具有大約3皮升至大約100納升的體積。分析包括將 擴增和/或檢測試劑(在芯片的試劑裝配區(qū)內)混合，擴增基因組材料 (在芯片的擴增區(qū))和檢測擴增的產物(在芯片的檢測區(qū))和/或對基 因組材料作圖(在芯片的矩陣分析區(qū))。
A.撐支流端口
可將樣品滴直接噴射入微流線內反應通道。此外，在本發(fā)明的范 圍內的是將樣品滴噴射入至少一個微流端口，該端口包括入口和通 道，然后導向微流線內反應通道(參見，例如，圖2)。在本發(fā)明的該 示例性實施方案中，可將樣品滴噴向微流端口的入口 (所述入口經制 造大小適合接收噴射的樣品滴(例如，比噴射樣品滴略大))、微流 端口通道和/或微流反應通道等，所述結構中各結構可方便地具有漏斗形狀。在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，樣品滴接收系統(tǒng)例如 微流線內反應通道和/或導向微流線內反應通道的微流端口經構造用 以接收至少部分樣品滴，所述樣品滴是由噴射頭例如包含在盒式貯存 器內的噴射頭噴射的包含基因組材料的樣品滴。在本發(fā)明的至少一個
其他示例性實施方案中，端口的入口是微流端口通道的大小的IO倍。
在至少一個本發(fā)明的其他示例性實施方案中，微流端口的入口的最寬
直徑是例如lmm，端口通道的直徑是例如100 jLim。
可基于基因組材料的負電荷即通過電動力和/或壓力驅動的流動 將樣品滴運輸通過端口通道。在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中， 端口通道內的樣品滴的運動完全或大部分受電動力的控制(例如，通過 正極和負極對)。例如，可將正極方便地置于各微流端口的入口 ，陰極 置于各端口通道的另一端(例如，端口通道導向的微流線內反應通道 內(參見，例如，圖2))。為控制各端口中的液體的流動(如果存 在多個微流端口，從而存在多對負極和正極)，只有在特定的微流端 口已接收到一個或多個樣品的樣品滴后，才可激活各配對控制特定的 微流端口內的液體流動。也在本示例性實施方案的范圍內的是通過 壓力驅動的流動將樣品滴運輸入或通過微流線內反應通道。此外，可 通過使用熟知的流動縮窄器(How constrictor)控制樣品滴通過端 口通道進入微流線內反應通道的運輸。
其他熟知的力例如表面張力可用于驅動樣品滴通過微流端口、通 道和/或線內反應通道。例如，在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中， 可用包含基因組材料的緩沖液例如與洗脫液相同的緩沖液充注微流端 口入口、通道和/或線內反應通道，所述緩沖液通過表面張力增加樣品 滴在微流端口入處的收集。在該示例性實施例中，可觀察到樣品滴變 成緩沖液的部分，并且不保持為分開的液滴。然而，電動力的電滲透 組分(electro-osmotic component )沿通道產生液體的均一塞樣流動， 從而減少或防止基因組材料的擴散。因此，如此處所用的，樣品滴和 樣品塞(包括DM樣品滴和DM樣品塞)是指當橫截面前行通過微流端 口通道進入微流線內反應通道時，液體的連續(xù)流動的塞樣橫截段，所述液體包含作為樣品滴從噴射頭噴射的樣品。類似地，如此處所描述 的，"引物塞"是指在包含特定的擴增和/或檢測試劑的"塞"的液體 的連續(xù)流動的任何時間上的橫截段。
B. 微流線內反應通道
通常，如上所述，微流線內反應通道可包含例如為樣品液體提供 基礎的基于水的液體?？蛇x擇地，微流線內反應通道可以是基于有機 物物的液體，例如大約為60泊的硅油。在至少一個本發(fā)明的示例性實 施方案中，將重復的樣品滴噴射入微流線內反應通道，間隔物分隔樣 品滴。在至少一個其他示例性實施方案中，空氣間隔樣品滴。在至少 一個其他示例性實施方案中，疏水物質例如礦物油或一些其他的基于 有機物的液體或溶劑等用作各樣品滴之間的緩沖間隔物以在微流線內 反應通道中圍繞和將各樣品滴與之前或之后的樣品滴分隔開。此外， 本發(fā)明的至少一個示例性實施方案的分子診斷裝置的微流通道的內壁 可提供以疏水涂層以減少或防止樣品滴之間的交叉污染。在至少 一個 其他示例性實施方案中，如上所述，產生例如樣品塞(例如，DM樣 品塞)的運動的電動力的電滲透元件防止或減少了基因組材料在塞中 的擴散。換句話說，盡管微流中存在固有的運動，但微流線內反應通 道液體和緩沖間隔物(例如，油或空氣)之間的疏水性/親水性差異使 單個的DNA分子能夠在塞子(例如，DNA樣品塞)沿著微流線內反應通 道移動的過程中保持在其中而不與緩沖間隔物或與相鄰的液滴或塞 子混合。
通常，微流芯片的微流線內反應通道直徑可以為50 jam至300 ja m，通常直徑為100 um。至于微流端口通道，孩支流線內反應通道可以 是為球形、半球形、正方型等和玻璃、石英、塑料等形成的管，依賴 于芯片的區(qū)域可用不同材料形成，例如當其在分子診斷裝置的檢測區(qū) 內時用透明材料形成。形成微流芯片中的微流線內反應通道的方法在 本領域內是熟知的。微流線內反應通道可具有任何想要的構型，例如， 其可是直的，可與另一個微流線內反應通道在匯合接合處形成連接或連接器，可在分開的連接處分離成兩個或更多個微流線內反應通道， 可允許液體在其內匯合和/或混合等。此外，如上所述，微流線內反應 通道的流動可受例如電動力、流體動力(即，壓力)或兩者結合的控制。
在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，"親本"微流線內反應 通道也可用于大塊樣品的分隔。例如，微流線內反應通道可導入多個 "子通道"，其各自可具有例如親本微流線內反應通道的十分之一的
流量(參見，例如，圖3)。該結構有利于各樣品滴分隔成"子滴 (subdroplet)",例如，如果親本微流線內反應通道導向10個子通 道，各子通道具有親本微流線內反應通道的十分之一流量，那么各滴 將分成10個子滴，各子滴存在于其自已的子通道內。該分隔，特別是 當重復時，此處是指大塊樣品分隔的實施方案。為了此處的目的，微 流線內反應通道包括所述子通道，樣品滴包括所述子滴。此外，親本 微流線內反應通道可逐漸變細以實現(xiàn)希望的分離。此外，該大塊樣品 的分隔方法可在1)芯片的試劑裝配區(qū)之前和/或之后，2)芯片的擴增 區(qū)之前和/或之后，3)芯片的檢測區(qū)之前和/或之后，和/或4)芯片的 矩陣分析區(qū)之前和/之內發(fā)生。微流線內反應通道(或子通道)可與其 他微流線內反應通道匯合，例如用于加入擴增和/或檢測試劑，例如引 物塞。
C. 試劑裝配/擴增區(qū)
圖4提供了包含一個微流線內反應通道的微流芯片的試劑裝配區(qū) 和擴增,區(qū)的非限性實例。當然，相互之間平行進行的多個微流線內反 應通道和/或子通道在本發(fā)明的范圍之內。在微流芯片中，通過在例如 接頭(10)例如T型接頭中與包含擴增試劑(例如，引物、核苷酸、 聚合酶等)和任選地檢測試劑(例如，可檢測試劑，例如標記，熒光 探針、插入劑等)的引物塞混合來進一步制備存在于微流線內反應通 道(5)中的各樣品滴(8)。本領域技術人員知道應當與各樣品滴混合的 擴增試劑和所述試劑應當使用的濃度。例如，擴增試劑一般包含聚合 酶、dNTP、鎂、緩沖劑和引物或引物對。本領域技術人員也能夠確定使用的引物或引物對；例如，如果進行PCR,引物對是恰當?shù)?。相?地，如果進行波形表征分析，擇波形引物將是恰當?shù)?。這些引物的設 計和選擇在本領域內是熟知的。此外，檢測試劑和使用這些試劑直接 或間接地標記擴增的DM產物的方法是熟知的。
在樣品滴已被噴射入微流端口 (或微流線內反應通道)后，將其 與擴增試劑混合以形成樣品塞，之后將其沿著微流線內反應通道運輸 入本發(fā)明的至少一個示例性實施例的裝置的擴增區(qū)，即第一溫度控制 區(qū)。當在此處使用該技術時，與樣品滴相似，樣品塞可包含或可不包 含基因組材料，如果其包含基因組材料，也可被當作DM樣品塞。
當沿著線內微流反應通道(5 )連續(xù)地抽吸樣品塞(其包含與引物 塞混合的樣品滴)，其被導入擴增區(qū)，即第一溫度控制區(qū)，例如熱控 制板(11)。微流線內反應通道的路徑(12)可以是使其有助于各樣品塞 在熱控制板(11)的低溫區(qū)(13)與高溫區(qū)(14)之間蜿蜒的且交替的通 路中流動的路徑。
本領域技術人員將認識到，可根據(jù)選擇的擴增方法適當?shù)卣{節(jié)(A ) 低溫區(qū)(13)、高溫區(qū)(14)以及低溫和高溫區(qū)之間的區(qū)域的溫度，(B) 微流線內反應通道的路徑(12)，和(C)樣品塞流過微流線內反應通道 的速度。例如，可將低溫區(qū)(13)設置至適合進行退火的溫度，可將高 溫區(qū)(14)設置為進行變性的溫度。此外，在至少一個本發(fā)明的示例性 實施方案中，可設計微流線內反應通道的路徑(12)以促進樣品塞以交 替的方式在低溫區(qū)和高溫區(qū)之間流動，例如大約20至40個變性、退 火和延伸循環(huán)。最后，可將樣品塞(或DNA樣品塞)流過微流線內反 應通道的速度設置為允許樣品塞(或DNA樣品塞)保持在變性、退火 或延伸溫度下合適的時間長度。
如前面所描迷的，也可以局部和/或重復的方式快速加熱和冷卻各 微流線內反應通道或其部分，以使當樣品塞沿微流線內反應通道流動 和通過本發(fā)明的至少一個示例性實施方案的裝置的笫一溫度控制區(qū)時 進行擴增方法(例如，PCR、波形表征)的變性、退火和延伸步驟。例 如，可使用焦耳加熱法沿著本發(fā)明的至少一個示例性實施方案的裝置的各微流線內反應通道的內側和/或在與各反應通道的交叉方向上對 金屬絲使用電壓。加熱微流線內反應槽的可選擇的方法，例如使用熱 水、熱空氣等在本領域內是熟知的。此外，微流線內反應通道或其部 分的冷卻可通過使用流過螺管的冷卻液體帶走熱能，或通過促進熱擴
散來實現(xiàn)。加熱和冷卻微流線內反應通道等的各種方法是熟知的。
隨著想要進行DNA的擴增以進行篩選、鑒定、定量等，DNA樣品 塞接受的溫度、在該溫度下的時間長度和循環(huán)的次數(shù)是可發(fā)生變化。 例如，在至少一個示例性實施方案中，變性溫度是90。C至95X:，退火 溫度是55X:至65'C，延伸溫度依賴于選擇的聚合酶(例如，對于Taq 聚合酶最佳延伸溫度是大約)。同樣，擴增方法可包括"熱起動" 和/或任意地在75'C下進行的DNA樣品的最后溫育。
樣品塞可以50 m m/秒至5000 m m/秒的不同速度例如500 p m/秒流 過微流線內反應通道。依賴于反應的體積，基因組DNA的濃度等，改 變樣品塞流過微流線內反應通道的速度可實現(xiàn)樣品塞在某個溫度(例 如，變性、退火、延伸等所需的溫度等)下保持的持續(xù)時間。例如， 盡管一般的循環(huán)是大約94n進行l(wèi)分鐘，6(TC進行1分鐘，72'C進行 l分鐘(72'C延伸的一般規(guī)律是1分鐘擴增各1000堿基對)等，但本
領域技術人員認識到樣品塞保持在某些溫度下的持續(xù)時間依賴于反應 的體積、基因組DNA的濃度等。此外，所需的擴增循環(huán)次數(shù)能夠確定 微流線內反應通道所需的合適路徑。
在樣品滴被制備，被微流線內反應通道接收，與擴增試劑混合從 而形成樣品塞，并擴增DNA樣品塞內的DNA后，驅動各樣品塞沿著微 流線內反應通道進入裝置的檢測區(qū)，所述區(qū)域也可以是第二溫度控制 區(qū)。如上所述，樣品滴可在被微流線內反應通道接收后和在被吸入檢 測前的任何時間在微流線內反應通道中進行大塊樣品的分隔(即，除 了通過液體噴射裝置進行的大塊分隔外的隔)。本領域技術人員將認 識到只有DNA樣品塞可包含可檢測的擴增的DNA產物。
D.檢測區(qū)設計本發(fā)明的至少一個示例性實施方案的分子診斷裝置使之(A) 使DNA能夠作為樣品滴被微流線內反應通道接收，(B)在試劑裝配區(qū)通 過將樣品滴與包含擴增反應組分和/或檢測組分的引物塞混合形成樣 品塞，(C)當DNA樣品塞沿著微流線內反應通道流過擴增區(qū)即第一溫度 控制區(qū)時進行DM的擴增，和(D)當DNA樣品塞通過檢測區(qū)時幫助檢測 擴增的DNA產 品o
使微流線內反應通道通過第二溫度控制區(qū)內的檢測區(qū)在本發(fā)是的 范圍之內。將微流線內反應通道置于通過第二溫度控制區(qū)內的檢測區(qū) 將使樣品塞能夠在檢測期間沿微流線內反應通道流過溫度或溫度梯度 (或掃描)，即一或多個溫度。本領域技術人員認識到當樣品接受溫 度掃描時，檢測樣品塞例如檢測DNA樣品塞在不同溫度下的熒光有助 于進行例如擴增的DNA產物的解鏈溫度分析。
圖5提供了本發(fā)明的至少一個示例性實施方案的微流芯片的檢測 區(qū)的實例。當沿著微流線內反應通道(5，如圖4中所示)抽吸樣品塞 或樣品塞存在于第一溫度控制區(qū)(例如，11，如圖3中所示)時，其 向下游前進至與鑒定和/或分析相關的區(qū)域，例如，其被導入檢測區(qū)， 即第二溫度控制區(qū)，所述區(qū)域可以是例如第二熱控制板U6)。微流線 內反應通道可具有檢測路徑U7)，當樣品塞流至低溫區(qū)(18)和高溫區(qū) (19)之間時，該路徑有利于在樣品塞中檢測擴增DNA的不存在或存在。 當樣品塞通過光學掃描區(qū)(20)時，任何可檢測試劑(例如，熒光探針、 插入劑等)可用例如三色激光束進行光學激發(fā)，且可測量任何所得的 發(fā)射。
通常，可將檢測區(qū)的低溫區(qū)(18)設置在大約"。C至大約6S。C的溫 度范圍內?？蓪z測區(qū)的高溫區(qū)(19)設置在大約55。C至大約95匸的溫 度范圍之內。在檢測PCR擴增的DNA的情況下，可將檢測區(qū)(16)的 低溫區(qū)(18)和高溫區(qū)(19)設置在同一溫度下，例如大約25'C至大約55。C。
可用于調節(jié)檢測區(qū)內的溫度、激發(fā)DNA樣品塞中的可檢測試劑和 檢測發(fā)射光或發(fā)射光的變化的各種儀器可商購獲得。例如，可用例如200680040577.9
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覆蓋光學掃描區(qū)(20)或更大或更小的掃描區(qū)的紅外電荷耦合器件 (CCD)(未顯示)測量溫度。在至少一個示例性實施方案中，推薦將 精確溫度傳感器置于第二熱控制板上以校準紅外CCD來增加溫度測量 的精確性。
將DNA樣品塞在檢測區(qū)接受溫度梯度或掃描將使得能夠檢測由波 形表征法產生的波形表征。當樣品塞通過溫度之間時，可確定任何所 得的發(fā)射光與樣品塞的溫度相關。此外，可將PCR擴增的DNA經歷溫 度梯度，盡管只需要在一個溫度下檢測發(fā)射?？蛇x擇地，可將低溫區(qū) 和高溫區(qū)設置為一個溫度以檢測PCR擴增的DNA。
當將擴增的DNA接受溫度掃描時，通過測量、檢測和確定分離的 DNA的波形表征，可將檢測臺中的光學系統(tǒng)(未顯示)用于檢測來自 擴增的DNA (例如高級結構)的發(fā)射光的改變。某些波形表征的檢測 可表示被檢查的樣品被污染(例如，被細胞污染)，然后將所得的波 形表征與用已知的引物和從已知的生物分離的DNA產生的波形表征的 數(shù)據(jù)庫進行比較可鑒定所述污染性生物。此外，^果分離的基因組材 料濃縮在樣品溶液中，且已知樣品濃度，則可基于波形表征的檢測定 量污染水平。
當對于樣品是否被污染和/或哪種生物污染樣品知之甚少時，可有 效地使用本發(fā)明的至少一個示例性實施方案的裝置。當然，可使用本 發(fā)明的裝置提供用于分析的PCR產物來進一步確證從波形表征獲得的 生物的鑒定。在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，通過形成幾個 來自相同的生物的DNA樣品滴，將各DNA樣品塞與專門選擇用于確認 生物的鑒定的不同引物混合，使用不同的引物(或引物組)通過PCR 或與波形表征相關的方法擴增各DNA樣品滴，然后檢測擴增的樣品的 不存在或存在來進一步縮小所述生物的鑒定范圍。將擴增產物的存在 與使用的特定引物發(fā)生關聯(lián)可鑒定生物。
如上所述，可使用本發(fā)明的至少一個示例性實施方案中的分子診 斷裝置通過波形表征和/或PCR篩查樣品中生物的存在、鑒定所述生物 和/或定量生物的濃度，所述分子診斷裝置包含l)至少一個用于提取基因組DNA的盒式貯存器等，2)至少一個樣品噴射頭，其中至少一個 盒式貯存器包含或可附著至至少一個用于噴射基因組材料的樣品滴噴 射頭；和3)至少一個用于分析基因組材料的微流芯片，其中微流芯 片包括至少一個用于接收從樣品噴射頭噴射的基因組材料的微流線內 反應通道和至少一個用于加熱微流線內反應加通道和/或控制其內液
體流動的金屬絲或其他元件，其中至少一個微流線內反應通道通過試 劑裝配區(qū)、第一溫度控制區(qū)內的用于擴增DNA產物的擴增區(qū)和檢測區(qū)。 當需要對分離的基因組材料進行更細致的檢查時，本發(fā)明的至少一個 示例性實施方案的分子診斷裝置可用于選擇一個或多個DNA樣品滴或 DNA樣品塞(其可以被擴增或可以不被擴增)以在至少一個本發(fā)明的 示例性實施方案的微流芯片的矩陣分析區(qū)內進行作圖，所述DNA樣品 滴或樣品塞來自目的樣品；在至少一個示例性實施方案中，樣品滴或 樣品塞內的DNA未被擴增。如上所述，樣品滴可在被微流線內反應通 道接收后包括在被抽吸入芯片的矩陣分析區(qū)之前或之后的任何時間在 微流線內反應通道中進行大塊樣品的分隔(例如，除了通過液體噴射 裝置進行的大塊分隔外的隔)。 3. 基因組材料的作圖
本發(fā)明可對存在于DNA樣品中的基因組信息作圖。這樣的作圖預 期(l)作為通過使用上述檢測步驟需要或想要反映污染性生物的部分 特征(例如屬、種)的更多信息的結果，或(2)作為不依賴于上述檢測 步驟表征污染性生物的方法，而采用。進一步預期在本發(fā)明裝置的至 少 一個示例性實施方案的芯片的矩陣分析區(qū)內進行所述作圖。作圖策 略基于最近才艮導的稱為直接線性分析(direct linear analysis)的 技術("DLA，，； 參見Chan等人(20(H) "DNA mapping using microfluidic stretching and single-molecule detection of fluorescent site-specif ic tags" Ce/70iPe Wes. 14 (6): 1137-46， 其在此以其全文引用作為參考)而得到改進。
在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，響應細菌DM (或在芯 片的檢測區(qū)內被監(jiān)測到一些其他形式的基因組DNA)的檢測，如上所
35述，通過液體噴射頭產生 一 連串樣品滴例如連串的新配制的樣品滴， 然后將其導向通過至少一個導向芯片的矩陣分析區(qū)的微流線內反應通 道。在到達矩陣分析區(qū)之前或其內向樣品滴中加入染料(嵌入染料和/ 或其他染料)，從而形成樣品塞。
矩陣是芯片的矩陣分析區(qū)的整體部分。在包含幾個用于微流樣品
成矩陣或所述矩陣包含在玻璃基質內:'"陣分析區(qū)的各單元(;"像素:)
反過來包含至少三個此處描述的元件。矩陣分析區(qū)的各單位能夠(1)
通過孩t流MA伸展孩走芯片的微通道(DNA-stretching microchip)分 離和"伸展"DNA分子；(2)產生多個波長的可見光光子束以激發(fā)多種 結合至DNA分子的染料；和(3)檢測光子束與染料的相互作用的結果。 在至少 一 個本發(fā)明的示例性實施方案中，各樣品滴與包含進行分 析所必需的試劑的液滴(或塞)混合。為了該目的，可將微流線內反 應通道與其他微流線內反應通道匯合，例如加入矩陣分析區(qū)內分析所 必需的染料和/或其他試劑。在本發(fā)明的至少一個其他示例性實施方案 中，所述試劑包括至少兩種可結合存在于液滴中的DNA的染料。 一種
染料是非特異性的從而以非特異性的方式(即，用插入劑均勻地對DNA 染色)與DNA結合(或插入)(參見，例如，Chan等人(2004) ^/ o/z/e i es. 14 (6): 1137-46);另 一種染料是位點專一性的；例如，熒光肽核 酸(PNA)靶向例如特定的7-8 bp的位點(參見，例如，Chan等人 (2004))。
如上所述(關于芯片的檢測區(qū))，可通過大塊樣品的分隔實現(xiàn)液 滴對矩陣分析區(qū)的幾個單位的分配。親本微流線內反應通道可逐漸變 細從而產生想要的分隔。為了快速和均勻地將樣品滴(和子滴)分配 至矩陣分析區(qū)內的恰當?shù)奈恢茫?l)從親本通道分支的子通道的數(shù)目可 以是本發(fā)明的至少 一個示例性實施方案的裝置內可容納的任何數(shù)目 (即，10、 100、 250、 500、 1000或更多)，和(2)子通道可從其他子通 道分支。在至少一個示例性實施方案中，子通道來自其他更大的子通 道。在至少一個其他示例性實施方案中，512個子通道直接或間接從依次從親本通道分支的512個更大的子通道的各子通道分支而來。此 外，可在芯片的矩陣檢測區(qū)之前或其內進行該大塊樣品的分隔。微流 線內反應通道或子通道可與其他微流線內反應通道或子通道匯合，例 如為了加入通過DLA技術進行的矩陣分析區(qū)的分析步驟所必需的染料 和/或真他試劑。
在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，通過一連串微流線內反 應通道(親本通道，和從其分支的子通道，和(任意地)依次來從其分 支的更小的子通道)，矩陣分析區(qū)內的矩陣包含512x512個矩陣，從而 包含大約260， 000 (例如，262， 144)個用于通過DLA技術分析DNA分 子的單元(或像素)。在本發(fā)明的至少一個其他示例性實施方案中， 矩陣可以是2x2、 3x3、 9x10、 10x10、 100x100、 256x256、 1024x1024， 或任何合適的正方形或非正方形二維結構(dimension)。
可通過許多方法使樣品滴或子滴移動通過本發(fā)明的至少一個示例 性實施方案的裝置的通道和子通道，可通過所述方法控制預先確定的 液滴運動速率。例如，可使用對通道或子通道的開始部分施加正壓力 和/或對通道或子通道或對廢液孔等施加負壓(即，真空)來移動液滴 或子滴。此外，可使用電動力以及本領域技術人員已知的任何其他方 法移動液滴和子滴。
在至少 一 個示例性實施方案中，已與包含試劑的液滴混合的樣品 塞向前通過一連串微流線內反應通道或從親本微流線內反應通道分離 的子通道。分裂裝置("分裂器(splitter)")控制液滴沿著串聯(lián) 的不同微流線內反應通道或子通道的流動。例如，3x3矩陣(三通道) 的非限性實例能夠接收來自分裂器的樣品滴。
在該示例性實施方案中，連串的液滴或塞沿著親本微流線內反應 通道朝向分裂器移動。分裂器的遠端是三通道(此處編號為1、 2和3), 各自附著至真空裝置以沿著微流線內反應通道拉動液滴。以下列方式 處理第一個9液滴(編號1至9)。分裂器使得液滴進入(通過附著至 通道1的真空裝置)通道1，而液滴1、 2和3沿著該通道移動直至其 各自位于預先確定的位置。然后釋放或移走對準通道l的真空裝置，然后開始針對通道2的真空裝置(即，將真空裝置用于通道2，從而 使液滴4、 5和6沿著通道2移動至預先確定的位置)。然后針對通道 3重復該方法。
可將該方法擴展至任何數(shù)目的通道。在至少一個本發(fā)明的示例性 實施方案中，使用512個通道，從而512個液滴沿著各個通道移動直 至各液滴位于預先確定的位置。從而在通道512的真空循環(huán)結束時， 512x512個液滴的矩陣排列存在于裝置中。
在上述3x3矩陣的示例性實施方案中，在對通道3的真空循環(huán)結 束時，9個液滴位于矩陣上預先確定的位置中。在這些預先確定的位 置的各位置上是進入本發(fā)明的至少一個示例性實施方案的單元(或"像 素，，)的進入端口。因此，在3x3矩陣中，存在本發(fā)明的至少一個示 例性實施方案的九(9)個單元。本發(fā)明的至少一個示例性實施方案的 單元，無論單元的數(shù)目是多少，包含三個主要元件。 一個元件包括光 源(例如，光子發(fā)生器)。第二元件包括微流DNA伸展微芯片(參見Chan 等人(2004))或使用直接線性分析(DLA)技術的相似結構。第三元件包 括光檢測器(例如，光子檢測器)。
通常，存在幾種可獲得的光源和檢測器形式(即，有源光器件)。 此外，存在幾種可獲得的可與有源光器件一起使用的無源光器件形式， 例如平面光波導、顯微鏡頭(microlense)和濾波體。關于有關各種 形式的光源器件在微流裝置中的使用的綜迷，參見，例如，Mogensen 等人(20(H) We"，力ore""5: 3498-512; Sia和Whi tes ides (2003) ^7e"ro; 力( res/s 24: 3563-76。
其中已知用于微流裝置的光源和檢測器是發(fā)光二極管(LED)，包 括有機發(fā)光二極管(OLED)(例如，LED與單模平面波導的組合、Si光敏 檢測器(photodetector)和聚(二甲基硅醚)(PDMS)中的微流通道管 型在本領域內是已知的，對于通過常規(guī)互補式金氧半導體 (complementary metal oxide silicon) (CMOS)加工和人工底蝕 (underetching)產生的LED、 Si光敏探測器和微流通道的整合體也 是這樣。在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，光源(例如，光子發(fā)生器)也稱為發(fā)射器層。
激光也可用于微流裝置。垂直腔面發(fā)射激光器(VCSEL)已應用于旋 涂在聚-(甲基異丁烯酸)(P麗A)基質上的熒光基團的近紅外熒光檢
測，其中基質的裝配還包括用于檢測的高通濾波體和光電二極管。在 至少 一個本發(fā)明的示例性實施方案中，濾波體也稱為濾波體層(filter layer),光檢測器(例如，光子檢測器例如光電二極管)也稱為檢測器 層(detector layer )。
另 一個有用的光源是孩t;改電光源(microdischarge light source),例如，由金屬陽極和用BaC12的水溶液充注的孩史流陰極組 成的微放電光源(其用于用SYBR熒光基團標記的DNA分子的激發(fā))。
用于微流系統(tǒng)的光檢測器(例如，半導體光檢測器)包括其中將 光電二極管等作為微流通道的部分裝配在相同基質中的系統(tǒng)(例如， 在用于DNA分析的裝置中，可整合干涉濾波體以抑制激發(fā)光)。在另一 個光檢測器系統(tǒng)中，將商購可獲得的CMOS圖像儀芯片與PDMS中的微 流通道網絡管型結合(溴酚藍和橙黃G的測量是可能的，對于熒光的測 量也如此，因為CMOS圖像儀整合了干涉濾波體)。另一個已知的技術 包括使用低溫薄膜沉積技術(low-temperature thinf i lm depos i t ion technique )在玻璃基質的上面產生具有濾波體的無定型硅光電二極管 (與二極管在半導體晶片內的整合正好相反)。
顯微鏡頭和平面波導在微流裝置中的整合通常通過將光聚焦在通 道中以增加用于熒光測量的激發(fā)能或通過使用平面波導增加吸收檢測 的光程長度來提高檢測。平面波導的其他有利方面是可對多點檢測進 行光束分裂；從而當與適當?shù)墓庠春凸鈾z測器整合時可獲得緊湊的裝 置?？蓪@微鏡頭裝配在基質的上面(以與晶片垂直的路徑中構造光 的形狀)或裝配在裝置的平面中。2D平面顯微鏡頭可用于裝配微流裝 置。平面波導(例如，聚合物波導、玻璃波導、光電子帶隙傳感器 (photonic bandgap sensor)等)也可用于i殳計微流裝置。特別有趣 的是光子晶體結構光電子晶體可視為半導體晶體的光學等同物，其 特征在于其中不允許某些波長范圍內的光通過的帶隙?？稍谖墨I(例如，Mogensen等人，同上)中獲得關于用于微流裝置的光學系統(tǒng)的其 他信息。
在下面更詳細地公開本發(fā)明的至少一個示例性實施方案中的光源 (例如，光子發(fā)生器)和DNA伸展微芯片。
A. 光子發(fā)生器
光子發(fā)生器元件("PGC")(例如發(fā)射器層中的)產生至少兩種不 同波長(例如，WV. I和WV. II)的光子，其中至少一種波長(例如，WV. II) 分裂成兩個不同的束(例如，WV.IIa和WV. lib)(通常參見Chan等人 (2004));產生該不同波長的該光子和光束的幾種方法和裝置在本領域 內是已知的。將PGC包埋在玻璃基質中，所述基質包含本發(fā)明的至少 一個示例性實施方案的矩陣芯片，且可提供"光導"將光子束導向微 流DNA伸展微芯片的微通道("線性DNA微通道")中的至少兩個準 確的位置。
B. DNA伸展微芯片
在微流DM伸展微芯片("DNA伸展芯片")中，與非特異性染料 (或熒光標簽)結合的個別DM分子(例如，雙鏈的)流經"后場(post field)，，和"漏斗"，并且在該過程中變成線性的或伸展的，從而使 每次只有一個DM分子通過微通道(線性DNA微通道)，在所迷微通道 中不同光束和波長的光聚焦在DNA分子上。在至少一個本發(fā)明的示例 性實施方案中，線性DNA微通道的寬度為5釁。在本發(fā)明的至少一個 其他示例性實施方案中，可見光是光的形式。
DNA伸展芯片包括通過例如照相平板印刷術蝕刻入基質中和夾入 兩塊基質之間(例如，如下面詳細描述的)的一連串通道(例如，包含 后場和漏斗的線性DNA微通道的微流線內反應通道和/或子通道)。
隨著各個DNA分子通過線性DNA微通道，伸展的分子遇到光子束 在其上聚焦的至少兩個位置。在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中， 存在兩個光速聚焦至其上的位置 一個位置(第一位置，如以流過線 性DNA微通道的方向運動的DNA分子遇到的位置)包含兩個光子束， 一束檢測位點專一性染料(例如，WV. I)，一束檢測非特異性染料(例如，WV. IIa)。在第二位置，在進一步沿著流入線性DNA微通道的方向上的 某一預設的距離上，檢測非特異性染料(例如，WV. IIb)的另外的光子 束發(fā)生聚焦。在預設的距離上被分開的檢測非特異性染料的兩束光(例 如，WV. IIa和WV. IIb)用于在各DNA分子通過線性DNA微通道時確定 其的長度。檢測非特異性染料的光束用于鑒定和分析各DNA分子。在 DNA分子上結合相對少量的幾個堿基對(bp)的位置的位點專一性染 料可用于對從其提取所述基因組DNA的生物作圖(例如，鑒定和/或表 征)。作為非限定性實例，位點專一性染料可靶向例如7-8 bp的位置。
在一些情況下，沿著基因組DNA的雙鏈分子的長度結合的位點專 一性染料的位置的分析稱作"條碼制作(barcoding)"。當不同的 DNA分子通過線性DM微通道時它們的該條碼制作可鑒定特定類型的 基因組DNA(例如，當與數(shù)據(jù)庫的條形碼比較時，分類學類型，例如 DNA分子的條形碼可鑒定特定的家族、屬、種、林系等)。
C. 光子檢測器
在至少一個示例性實施方案中，本發(fā)明的光子檢測器(例如，光 檢測器、光探測器、光子計數(shù)器)元件("PDC")包含至少一個三維(3D) 光子晶體(所述晶體在相對低的溫度下進行操作并在玻璃基質上形成 或生長)和至少一個也在玻璃基質上形成的場發(fā)射晶體管(FET)，例如， 薄膜晶體管(TFT)(例如，TFT可具有硅的薄膜，使用該膜層裝配晶體 管)。在至少一個其他示例性實施方案中，可使用除了 FET外的合適類 型的晶體管。在至少一個示例性實施方案中，PDC也稱作檢測層。在 至少一個示例性實施方案中，光子檢測器是數(shù)字光子檢測器。在至少 一個本發(fā)明的其他示例性實施方案中，玻璃是基質，盡管也可使用提 供本發(fā)明所需的光學特性的任何其他相容性基質(例如，透明塑料)。 例如，幾篇綜述論文涉及用于至少一個本發(fā)明的示例性實施方案的芯 片中的多個類型的基質(參見，例如，Mogensen等人，同上；Sia和 Whitesides，同上)。
在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，用不同的染料(如上面 所解釋的)激發(fā)光子，所述光子來自幾束對通過線性DNA微通道的DM分子聚焦的光束(例如，WV. I、 WV. IIa、 WV. IIb)，激發(fā)的熒光反射 至朝向至少一個光子檢測器的"光導"?？捎霉庾泳w(例如，針對 三原色的)實現(xiàn)該光導線內檢測器。在至少一個本發(fā)明的其他示例性 實施方案中，3D光子晶體能夠進行濾波，從而使多種(例如，2、 3 種)波長的光可到達光子檢測器，在另一個示例性實施方案中，使用 2、 3或更多種不同的3D光子晶體(各自進行濾波以允許不同的波長 通過)。將本發(fā)明的至少一個示例性實施方案的光子晶體整合入矩陣 芯片的各個單元；芯片中的光子晶體使用波導將光子導入芯片內的新 檢測器(芯片內檢測器)。芯片內檢測器由TFT光檢測器組成。在一 些本發(fā)明的示例性實施方案中，將多種TFT(例如，2、 3或更多種TFT) 整合入矩陣芯片的各單元(以監(jiān)測光的多個波長)。在一些其他示例性 實施方案中，將光擴增TFT整合入矩陣芯片的各個單元以進行有效的 光子發(fā)射檢測。
然而，至少一些以標準形式存在的TFT不太適用于光的光子的直 接檢測。因此，在至少 一個本發(fā)明的示例性實施方案中，構建(pre-TFT) "門電路(gate)"，從而使光子的光能轉換成以電子的形式存在的能 量，所述能量可被至少 一個本發(fā)明的示例性實施方案的TFT直接檢測。 門電路包括門控材料("卟啉柵材料")，其主要組分是包含卟啉的三 維(3D)單晶聚合物。該卟啉柵材料可由例如可見光鐠中的光子激發(fā)， 且可用作半導體材料。關于涉及該聚合物和其作為柵材料的用途的公 開內容,參見H. Segawa "Nanostructured molecular systems that freely manipulate photons and electrons,，，可在 jstore. jst. go. jp/image/research/pdf/R99/R993100836. pdf獲得；也參見Segawa等 人(1994) /. j邁.Soc. 116: 11193-94; Susumu等人(1995) C力e邁. Ze". (No. 10):929-30; Segawa等人(1995) 5^A"/c淑ah 71: 2151-54; Susumu等人(1995) /.尸/ ^. C力ei 99:29-34; Susumu等 人(1995) /.脂tocAe瓜？Ao^/o/. A' C力e邁.92: 39-46; Shimidzu 等人(1995) /.戶力ofoc力e邁.PAofoWo/.丄.C力e瓜92:121-27; Susumu 等人(1996) re"a力e^ro72 37 (46): 8399-402 ; Shimidzu和Segawa (1996) 77 // So//(//7//z^ 273: 14—19。簡而言之，以建立進 行光誘導的電子傳遞的分子系統(tǒng)的方式連接(作為p卜啉陣列)多個吟 啉；將這些卟啉陣列直接連接在正中間位置。以一、二和三維分子結 構構建卟啉陣列(參見Segawa，同上)。
矩陣分析區(qū)還可包括CMOS型門控機制和傳輸來自幾個矩陣單元 的數(shù)據(jù)的CCD型方法。用于執(zhí)行所述技術以完成與至少一個本發(fā)明的 示例性實施方案的矩陣裝置相關的電數(shù)據(jù)收集的方法在本領域內是已 知的。
在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，本發(fā)明的光子檢測器(如 上所述的)減少或消除了對AC電源(對于Chan等人(2004)中描述的光 檢測器，所述電源和放大器一起都是需要的)的需要。至少一個本發(fā)明 的示例性實施方案的該改進的光子檢測器有助大減少對電的需要(例 如，通過使用TFT)和大大減小儀器的大小。根據(jù)事實這是特別有利 的考慮因素，所述事實是至少一個本發(fā)明的示例性實施方案的矩陣 的各個單元(或像素)包括與其結合的光子檢測器，在至少一個本發(fā) 明的其他示例性實施方案(即512x512矩陣)中，262，144個單元被整 合入矩陣芯片。此外，至少一個本發(fā)明的示例性實施方案的單元消除 了對Chan等人(2004)中公開的外部激發(fā)激光和相關外部光學系統(tǒng)的 需要。
通過檢測矩陣分析區(qū)的PDC中的光子產生的數(shù)據(jù)(即，在至少一個 示例性實施方案中，在通過介于線性DNA微通道與TFT之間的基于卟 啉(例如卟啉柵材料)的晶體轉導光子信號后檢測電子)被傳輸至預先 確定的目的地，例如記錄設備或其他貯存設備例如計算機芯片或高速 緩沖存儲器等，或顯示設備或其他類型的用戶可視輸出界面。通過在 預先確定的時限讀出數(shù)據(jù)(代表檢測的光)來協(xié)調來自矩陣分析區(qū)的 數(shù)據(jù)至預先確定的目的地的傳輸。
至少 一個本發(fā)明的示例性實施方案涉及用于讀出代表檢測的光
(即，在一些示例性實施方案中，由卟啉柵材料轉導的光)的數(shù)據(jù)的 矩陣結構，如圖6A中描述的。在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，矩陣是5"x512的單位(像素)矩陣，盡管為了方便只在圖中顯示了 2乘2(2x2)的單位的矩陣。矩陣包括以圖6中顯示的方式相互連接的多個行接線(RW)、多個 柱接線(CW)、電容器、光敏晶體管(phototransistor)(例如，上述 的卟啉柵材料/TFT)、柵晶體管(gating transistor)和二進制移位 寄存器(BSR1和BSR2)。在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，晶體 管是FET(例如，TFT)，盡管在其他示例性實施方案中，也可使用其他 適合類型的晶體管。以上述方式獲得的代表光(例如，通過卟啉柵材料轉導產生的光) 的電信號用于相應的光敏晶體管，如果電信號具有預先確定的閾電壓 水平，將其以電荷的形式貯存在相應的電容器中。用以從矩陣讀出信號的方式可在觀察圖6A-6C中顯示的時序圖中 得到理解。例如，對連接至相應的行接線的晶體管的門電路使用計時 脈沖(0UT 1或0UT2;圖6A)導致從電容器讀出。將計時脈沖(0UT1、 0UT2)用于根據(jù)時序圖2(圖6A)的門電路以響應由用于二進制移位寄 存器(BSR1)的整個系統(tǒng)的控制器(例如，CPU)(未顯示)產生的計時脈 沖。然后將讀出電荷作為相應的信號向前傳輸通過相應的晶體管至與 該晶體管連接的相應的柱接線。然后通過柱接線將信號向前傳輸至相 關的二進制移位寄存器(BSR2)的相應的輸入端(IN1或IN2)。時序圖l(圖6B)是表示測量周期(即，其間檢測光子的周期)是如 何與其間從電容器讀出信號的周期相關并且在各讀出周期內讀出信號被讀至相應于脈沖0UT1和0UT2的行接線的計時的實例。如時序列圖 4中所示(圖6B)，從偶聯(lián)至行接線(相應于讀出期的前半期內的計時 脈沖0UT1)的電容器輸出信號，然后從偶聯(lián)至行接線(相應于讀出期 的后半期內的計時脈沖0UT2)的電容器輸出信號。在時序圖3 (圖6C)中顯示了相應于用于BSR2的終端IN1和IN2 (參見圖6A)的信號的可能的狀態(tài)的實例。按照從柱接線接收到其的 順序，依次從BSR2輸出代表所述狀態(tài)的數(shù)據(jù)。與矩陣分析區(qū)相關的上述時序圖包括可與本發(fā)明一起使用的至少一個示例性實施方案。在其他示例性實施方案中，可使用其他合適的
時序，只要信號可在不同的時間讀出，以進行隨后的展示、^存和/
或處理。
時序圖還可用于控制樣品滴和子滴通過矩陣分析區(qū)的運動，用于
協(xié)調(l)子滴通過線性DNA微通道的運動和(2)矩陣分析區(qū)的單元(或 像素)的相關PGC和PDC的激活。
如通常由Chan等人(2004)所教導的，樣品滴或子滴以預先確定的 速度通過DNA伸展區(qū)。大體上，將速率設置在對于結合染料的DNA分 子的分析仍然準確的最大速率附近。 一個考慮是流動不應當以這樣的 快速率進行，所述速率使得多個DNA分子同時存在于不同光束在其中 聚焦的線性DNA微通道的部分。另一個考慮是控制速率以避免DNA伸 展芯片的后場和漏斗元件的堵塞。在至少一個示例性實施方案中，1 飛升液滴(即，子滴、塞等。)在大約0. 12毫秒內穿過至少一個本發(fā)明 的示例性實施方案的DNA伸展芯片；在這樣的示例性實施方案中，矩 陣的大小可以是大約512x512個單位(或像素)。該示例性實施方案經 計算(l)對于從例如2. 5 pl包含基因組材料的洗脫液產生的(經回朔， 在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案的盒式貯存器中從例如100 pi 血液產生的)液滴(即，子滴、塞等)的數(shù)目，用以考慮分辨率、動態(tài) 范圍、信噪比等的合適的水平以及(2)進行大約1小時的分析時間。
在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，分子診斷裝置(包括至 少一個本發(fā)明的示例性實施方案的盒式貯存器、液體噴射裝置、擴增 區(qū)和檢測區(qū)以及矩陣分析區(qū))是便攜式的(例如，容易移動的、方便 攜帶的)。在至少一個其他的示例性實施方案中，分子診斷裝置是手 持式的。在一些示例性實施方案中，裝置用于在病人身邊(即，現(xiàn)場； 遠離醫(yī)院或醫(yī)生辦公室)幫助檢測和分析來自例如細菌的基因組DNA。
在一些其他示例性實施方案中，裝置使用AC電源和/或DC電源(參見， 例如，圖6A中的電源電壓(V))。在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案 中，裝置在無需AC電源的情況下工作；例如，裝置完全使用來自附帶 (或包含的)、便攜式(例如，手持)來源的DC電源工作。在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，預期裝置主要產生"0檢測"，即，大部由例如本發(fā)明的檢測區(qū)產生的數(shù)據(jù)將顯示例如細菌基因組DNA的0檢測。在該情況下，例如細菌基因組DNA的檢測(即，"非Q檢測")將導致裝置的矩陣分析區(qū)的激活和導致液滴(例如， 子滴、塞等)朝向和流入矩陣芯片。在至少一個本發(fā)明的其他示例性 實施方案中，響應非O檢測的該激活和運動是自動的(即，由例如CPU 控制的)。如上所述，特定的基因組MA分子的條形碼可用于鑒定MA的分 類范疇(例如，家族、屬、種、林系等)。條形碼用作DNA的核酸序列 的部分代表，其可與代表已知分類學實體的條形碼(例如，已知條形 碼的數(shù)據(jù)庫中的)進行比較?？蓪l形碼數(shù)據(jù)的解釋自動化，并且在 至少一個示例性實施方案中，條形碼數(shù)據(jù)的解釋包括在本發(fā)明的分子 診斷裝置內。在一些示例性實施方案中，解釋功能直接連接至裝置的 矩陣分析區(qū)。在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，裝置的解釋功能設計用 以解釋在給定的分類學鑒定水平內(例如，在物種水平上)天然發(fā)生的預期的序列變化。在至少一個示例性實施方案中，該預期的變化在 序列同一性上可高達75%的變化。在至少一個本發(fā)明的示例性實施方 案中，將概率解釋特征整合入本發(fā)明的解釋功能以幫助通過裝置的矩 陣芯片分析的基因組DM的來源的最適鑒定。在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，將數(shù)據(jù)庫(例如，包含 已知的或預期的病原體的條形碼信息)作為裝置的部分包含在其。因 此可將裝置的矩陣分析區(qū)中分析的基因組DNA的未知分子的條形碼與 數(shù)據(jù)庫中的進行比較和對比(例如，匹配)來潛在地確定未知DNA分 子(即，被分析的DAN分子)的同一性。于是至少一個本發(fā)明的示例 性實施方案的分子診斷裝置，通過包括這樣的數(shù)據(jù)庫，可鑒定相應于 給定的被分析的DNA分子的來源生物，通過包括概率解釋特征的解釋 功能，可提供對不同的分類學鑒定水平的相似性的計算(例如，借助于 概率準確度估計)。例如，在達到本發(fā)明的特定示例性實施方案的位點專一性染色和條形碼制作能夠準確地鑒定未知的基因組DNA分子的序 列的特定部分的程度時，成套的該DNA分子的條形碼數(shù)據(jù)可顯示與數(shù) 據(jù)庫中成套的條形碼數(shù)據(jù)100%的相似性或同一性。在該情下，裝置 可鑒定例如來源的屬和種。在另一種情況下，例如，當顯示83%的同 一性，裝置可鑒定相同的屬和種，但準確性分析指出檢測的變化范圍。 在另一種情況下，例如，錄顯示50%的同一性，裝置只可鑒定屬(對 該同一性水平使用準確性分析)，但關于種未給出指示。
在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，數(shù)據(jù)庫不作為裝置的部 分包括在其中；相反分子診斷裝置與中心數(shù)據(jù)庫進行無線電通訊。
本申請中引述的所有科學論文綜述、專利和專利申請在此以其全 文引用作為參考。
實施例
列出下列實施例以幫助理解本發(fā)明但不希望，和不應當解釋為以 任何方式限定其范圍。實施例不包括對于本領域技術人員來說是熟知 的常規(guī)方法的詳細描述。
實施例1 分子診斷裝置的矩陣分析區(qū)
在至少一個示例性實施方案中，單元(分子診斷裝置的矩陣分析 區(qū)的)的光子發(fā)生器元件(PGC)和光子檢測器元件(PGC)被描述為具有 整合的濾波體的微毛細管波導，并且描述于圖7-11中。在生產過程中 將單波長濾波體整合入微毛細管夾層的 一半。這導致了將光檢測器置 于非?？拷⒚毠軝z測管從而增加接收熒光發(fā)射光譜的光效率的能 力。關于有關涉及至少一個本發(fā)明的示例性實施方案的裝置的成本的 有利方面，由于微毛細管生產材料與濾波材料共享相同的材料(例如， 它們是相同的)的事實，因此制造成本可以低得多。
在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，矩陣分析區(qū)包括發(fā)射器 層、濾波體層和檢測器層。
圖7顯示矩陣分析區(qū)的一個單元(或"像素")的部分。如上面 所指出的，各單位具有至少三個元件。在該圖中，PGC是"光子激光"，PDC是"光檢測器"。"毛細管通道"(例如，半圓形毛細管通道) 用作DNA伸展芯片的部分。微毛細管裝置的兩塊板顯示于圖7中。微 毛細管裝置的一塊板(下方)，"染色的濾波體材料和波導"，由想 要的濾色片材料制造，從而控制從毛細管通道至光檢測器的熒光發(fā)射 的光語性質和波長，在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，濾波體 層包括通過熒光波長和阻止發(fā)射波長的涂有濾波體的玻璃。在至少一 個示例性實施方案中，下方的板的二維dl (dimension dl)在大約10 微粒至大約150微米的范圍內。在至少一個其他的示例性實施方案中， dl是大約60微米。其他板，"激發(fā)波導玻璃射流晶片(excitation waveguide glass fluidic wafer)"(圖7中上方的板)是光學透明 的，從而允許激發(fā)光(例如，發(fā)射波長)從激光到達反應區(qū)域。DNA 伸展芯片內的微流通道或子通道(此處也稱為毛細管通道)，在至少 一個非限定性示例性實施方案中，直徑或寬度大約50微米的區(qū)域(包 含后場)和直徑或寬度大約5微米的線性DNA微通道，流體和DNA通 過漏斗樣端口 (例如，在大約20 pm的長度上將通道的寬度從大約50 減少至大約5jim)(參見，例如，Chan等人UO(H))從50孩史米的區(qū)域 流至大約5微米的DNA伸展微通道。在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，如圖8所示的用于矩陣 分析區(qū)的單元中的和參與光("激光激發(fā)"、熒光)的透射和"熒光 發(fā)射"的濾波體和波導可包含一種或多種光學材料，包括但不限于光 子晶體、具有有機涂層的塑性樹脂、Schott光學玻璃、有色石英、有 色玻璃、涂有濾波體的玻璃等。在至少一個示例性實施方案中，圖8 中的二維d2在大約20微米至大約300微米之間。至少一個其他示例 性實施方案中，d2是大約120微米。如上面所提及的，在至少一個示 例性實施方案中，濾波體層包括通過熒光波長和阻止發(fā)射波長的涂有 濾波體的玻璃。在至少一個其他示例性實施方案中，單元包括3D光子晶體o在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，使用照相平板印刷術制 造矩陣分析區(qū)的單元和特別地此處獲得的微流通道。照相平板印刷術可用于在玻璃或石英基質的一側產生微流通道、子通道和/或微通道 (照相平板印刷術方法可置于基質的任一側上進行)。然后將蝕刻的 基質與另一個(例如，扁平的)基質結合，從而形成微流通道陣列。如載面為半圓形的通道，以及在結合之前匹配兩塊基質上的蝕刻可用 于在橫截面上產生具有對稱形狀(例如，圓形)的通道。在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，將多個單元(各單元包含3個主要的單元元件(即，PGC、 DNA伸展芯片和PDC)在矩陣中排列 在一起。如圖9中所示(也參見圖10中的上視圖)，可使用共同的整 合的濾波體制作許多PDC。該示例性實施方案的有利方面是一個制造 部分可為許多檢測通道(即，線性DNA微通道)形成光學熒光濾波體。 事實上，當使用該方案時，必須要考慮到光"竄擾"的可能性并使用 方法避免該問題。本領域技術人員將認識到用于芯片的矩陣分析區(qū)的玻璃濾波體的 波長特征和厚度的重要性。玻璃濾波體的波長特征的實例顯示于圖 11。通過使用微光刻制作(microlithography fabrication)領域內 已知的方法，可4吏光學玻璃濾波體材料在0. 1 mm至480 mm的厚度范 圍內。在至少一個矩陣分析區(qū)的示例性實施方案中，材料的厚度可在 of 0. 5 mm至5 mm,或1 mm至3 mm的范圍內。通過4吏用本領域內熟 知的方法和計算，選擇濾波體材料(例如，濾波體層中的)的波長和 厚度以將激發(fā)光譜以足夠的光學SNR (信噪比)與熒光發(fā)射光譜分開； 因此，濾波體層可包括濾波體，例如，涂有濾波體的玻璃，該濾波體 允許熒光波長通過但阻止來自發(fā)射器層的光的波長。在至少一個本發(fā)明的示例性實施方案中，用矩陣芯片的各單元(或 像素)監(jiān)測多個波長的光(例如，2、 3或更多波長)。在至少一個本 發(fā)明的其他示例性實施方案中，將多個TFT(例如，2、 3或更多個TFT) 整合入矩陣芯片的各個單元(以監(jiān)測多個波長的光)。
權利要求
1.經構造用以分離基因組材料的盒式貯存器，其包括反應室；和至少一種結合與釋放基質，其中所述至少一種結合與釋放基質位于反應室內且經構造用以結合和釋放包含基因組材料的至少部分樣品。
2. 權利要求l的盒式貯存器，其中所述基質包含電荷轉換材料。
3. 權利要求l的盒式貯存器，其中所述至少部分樣品的結合與釋 放響應電壓。
4. 權利要求l的盒式貯存器，其中所述至少部分樣品的結合與釋 放響應與基質接觸的流體的離子組成的差異，和其中所述樣品包含在流 體中。
5. 權利要求l的盒式貯存器，其中所述至少部分樣品的結合與釋 放響應與基質接觸的流體的pH的差異，和其中所述樣品包含在流體中。
6. 權利要求l的盒式貯存器，其中所述基質是顆?；蛐≈椤?br> 7. 權利要求l的盒式貯存器，其中所述基質是磁性的或順磁的。
8. 權利要求l的盒式貯存器，其中所述基質與反應室的內表面結合。
9. 權利要求l的盒式貯存器，其中從基質釋放的至少部分樣品的 體積從樣品的體積減去。
10. 經構造用以遞送包含基因組材料的樣品的盒式貯存盒，其包括基因組分離和導向系統(tǒng)；和噴射頭，其中所述噴射頭中的室經構造用以接收來自基因組分離 和導向系統(tǒng)的包含基因組材料的至少部分樣品，其中所述噴射頭將至少 部分接收的樣品作為噴射樣品滴排出盒式貯存器。
11. 權利要求10的盒式貯存器，其中所述噴射頭使用通過熱能發(fā) 生器提供的熱能。
12. 權利要求10的盒式貯存器，其中所述噴射頭是壓電噴射系統(tǒng)。
13. 經構造用于分離基因組材料的盒式貯存器，其包括 反應室；至少一種結合與釋放基質，其中所述至少一種結合與釋放基質位 于反應室內且經構造用以響應電壓而結合和釋放包含基因組材料的至 少部分樣品；基因組分離和導向系統(tǒng)；和噴射頭，其中所述噴射頭中的室經構造用以接收來自基因組分離 和導向系統(tǒng)的至少部分樣品，其中所述噴射頭將至少部分接收的樣品作 為噴射樣品滴排出盒式貯存器。
14. 權利要求13的盒式貯存器，其中所述基質包含電荷轉換材料。
15. 權利要求13的盒式貯存器，其中所述基質是顆?；蛐≈?。
16. 權利要求13的盒式貯存器，其中所述基質是磁性的或順磁的。
17. 權利要求13的盒式貯存器，其中所述基質與反應室的內表面結合。
18. 權利要求13的盒式貯存器，其中從基質釋放的至少部分樣品 的體積從樣品的體積減去。
19. 權利要求13的盒式貯存器，其中所述噴射頭使用通過熱能發(fā) 生器提供的熱能。
20. 權利要求13的盒式貯存器，其中所述噴射頭是壓電噴射系統(tǒng)。
21. 分子診斷裝置，其包括至少一個權利要求l、 10和13中任一項的盒式貯存器；和 至少 一 個微流芯片，其中所述芯片經構造用以接收至少部分噴射 的樣品滴，其中所述噴射的樣品滴是從盒式貯存器噴射的樣品滴，其中 所述芯片包括至少一個用于接收噴射的樣品滴的微流線內反應通道。
22. 權利要求21的分子診斷裝置，其中可對盒式貯存器的噴射頭 進行重復脈沖，從而以重復脈沖率順次形成多個液滴，從而在微流芯片 的微流線內反應通道中獲得受控制的總液滴體積。
23. 權利要求22的分子診斷裝置，其中所述重復脈沖率在大約1 kHz至大約100 kHz的范圍內。
24. 權利要求23的分子診斷裝置，其中所述重復脈沖率是大約50kHz。
25. 權利要求21的分子診斷裝置，其中所述噴射的樣品滴具有大 約1皮升至大約25皮升的體積。
26. 權利要求25的分子診斷裝置，其中所述噴射的樣品滴具有大 約3皮升的體積。
27. 權利要求22的分子診斷裝置，其中所迷總樣品滴體積是大約 3皮升至大約100納升。
28. 權利要求21的分子診斷裝置，其中所述微流芯片還包括第一 溫度控制區(qū)內的用于DNA產物擴增的擴增區(qū)，和第二溫度控制區(qū)內的檢 測區(qū)，其中所述擴增的DNA產物的檢測可在多個溫度下進行。
29. 權利要求21的分子診斷裝置，其中所述裝置進一步包括矩陣 分析區(qū)。
30. 微流芯片，其包括經構造用以接收由盒式貯存器噴射的包含基因組材料的至少部分 才羊品滴；和矩陣分析區(qū)，其中所述矩陣分析區(qū)包括發(fā)射器層，其中所述發(fā)射器層發(fā)射發(fā)射波長；濾波體層；和檢測層。
31. 權利要求30的微流芯片，其中所述濾波體層包括通過熒光波 長但阻止發(fā)射波長的涂有濾波體的玻璃。
32. 權利要求30的微流芯片，其還包括至少2個通道，其中所述2個通道經構造用以將包含基因組材料 的樣品流過第一溫度控制區(qū)內用于擴增DNA產物的擴增區(qū)，和笫二溫度 控制區(qū)內用于激發(fā)DNA樣品的熒光的檢測區(qū)，和其中擴增的DNA產物的 檢測可在多個溫度下進行。
33. —種分子診斷裝置，其包括至少一個權利要求l、 10和13中任一項的盒式貯存器；和權利要求30的微流芯片，其中所述盒式貯存器將包含基因組材料 的樣品滴噴射入微流芯片的樣品滴接收系統(tǒng)。
34. 權利要求33的分子診斷裝置，其中所述矩陣分析區(qū)進一步包 含多個單元，其中所述各單元包含至少一個光子發(fā)生器元件、DNA伸展 芯片和至少一個光子檢測元件。
35. 權利要求34的分子診斷裝置，其中所述至少一個光子檢測器 元件包含卟啉柵材料。
36. 權利要求34的分子診斷裝置，其中所述至少一個光子檢測器 元件包含3個薄膜晶體管。
37. 權利要求33的分子診斷裝置，其中所述裝置是便攜式的。
38. 權利要求37的分子診斷裝置，其中所述裝置是手持式的。
39. 表征樣品中的基因組材料的方法，其包括步驟(a) 用盒式貯存器分離樣品中的任何基因組材料；(b) 將至少一個樣品滴從盒式貯存器中的液體噴射裝置噴射入微 流芯片的樣品滴接收系統(tǒng)；(c) 檢測樣品滴中的基因組材料；和(d) 分析樣品滴以表征存在的基因組材料。
40. 權利要求39的方法，其中所述分析樣品滴包括將來自樣品基 因組的檢測的條形碼與已知的條形碼的數(shù)據(jù)庫進行比較。
全文摘要
至少一個本發(fā)明的示例性實施方案涉及分子診斷裝置，所述裝置包括經構造用以將包含基因組材料的樣品噴射入微流芯片，所述微流芯片包括擴增區(qū)、檢測區(qū)和矩陣分析區(qū)。
文檔編號C12Q1/68GK101300352SQ200680040577
公開日2008年11月5日 申請日期2006年9月1日 優(yōu)先權日2005年9月1日
發(fā)明者G·A·戴爾, I·T·奈特, R·R·科維爾, 井上裕司 申請人:佳能美國生命科學公司