專利名稱：微生物學地制備3-羥基丙酸的制作方法
微生物學地制備3-羥基丙酸本發(fā)明涉及相對于其野生型被遺傳修飾的細胞、制備遺傳修飾的 細胞的方法，可用這種方法獲得的遺傳修飾的細胞，制備3-羥基丙酸的 方法，制備聚丙烯酸酯的方法，制備丙烯酸酯的方法和該細胞用于制備 3-輕基丙酸的用途。丙烯酸是工業(yè)上很重要的原料化合物。它特別地用于制備聚丙烯 酸酯，尤其是交聯(lián)、部分中和的聚丙烯酸酯，這種聚丙烯酸酯干燥且基 本上是無水狀態(tài)，具有強大的吸水能力。這些被稱為"超級吸收劑，，的 交聯(lián)聚丙烯酸酯能夠吸收多倍于自身重量的水。由于強大的吸收性，該 吸收聚合物適于摻入吸水結構和物品中，例如嬰兒尿布、失禁產品或衛(wèi) 生巾。才尤^匕而"i侖,參考#0(ie/77 5T;/7er(36sor6e/^尸o/jy/ er rec/wo/c^j// F. L. Buchholz, A. T. Graham, Wiley-VCH, 1998。丙烯酸酯，例如丙烯酸曱酯和丙烯酸丁酯同樣是工業(yè)上重要的原 料化合物，尤其是在制備共聚物時使用它們。這些共聚物通常以聚合物 分散體形式被用作粘合劑、涂抹劑或紡織品、皮革和紙張助劑。丙烯酸在工業(yè)上主要通過丙烯的兩階段催化氣相氧化來制備，丙 烯是通過熱裂解由石油加工產生的汽油獲得的。用這種方法獲得的丙烯 酸視需要隨后通過添加醇被酯化。兩階段法制備丙烯酸的缺點首先是兩個階段都使用的300至450 。C的溫度導致低聚物形成和其它不合意的裂化產物。這導致了不合意的 大量比丙烯酸沸點更高的化合物，或僅能困難地與丙烯酸分開的化合物，例如乙酸。這些化合物通常必須通過蒸餾法^v丙烯酸除去，這又對丙烯酸產生進一步的熱負荷以及隨其相伴的二聚體和低聚物的形成。然 而，高含量丙烯酸二聚體或丙烯酸低聚物是不利的，因為當在交聯(lián)劑存 在下通過丙烯酸自由基聚合來制備超級吸收劑時，這些二聚體或低聚物 嵌入了該聚合物。然而，在聚合后進行的聚合物顆粒表面的后處理過程 中，例如在表面后交聯(lián)過程中，聚合入的二聚體被裂解形成P-羥基丙 酸，其在后交聯(lián)條件下脫水形成丙烯酸。因此，用于制備超級吸收劑的 丙烯酸中高含量的二聚丙烯酸導致聚合物熱處理過程中丙烯酸單體含 量增加，如同后交聯(lián)過程中發(fā)生的一樣。在催化氣相氧化獲得的丙烯酸中還可檢測到其他常常有毒的化合 物。這些雜質尤其包括妨礙聚合進程的醛，產生仍含可觀量的可溶組分 的聚合物?，F(xiàn)有技術中已經描述了解決這些問題的 一 些措施(參見例如EP-A 0 574 260或DE-A 101 38 150)。這個制備丙烯酸的常規(guī)方法的又一缺點是采用的原料物(丙烯)是 由石油產生的，因此是由不可再生的原材料產生的，特別是長期考慮， 從經濟學觀點來看，提取石油是越來越困難的和成本越來越高的。就此而論，現(xiàn)有技術也描述了 一些措施來抗衡這個問題。因此，W0-A 03/62173描述了制備丙烯酸的方法，由丙酮酸最初 發(fā)酵形成oc-丙氨酸，然后借助酶2， 3-氨基變位酶將a-丙氨酸轉變?yōu)镻 -丙氨酸。P -丙氨酸接著經P -丙氨酰-CoA、丙烯酰-CoA、 3-羥丙酰-CoA, 或經丙二酸半醛轉變?yōu)?-幾基丙酸，3-鞋基丙酸脫水后得到丙烯酸。WO-A 02/42418描述了例如從可再生原材料制備3-幾基丙酸的又 一途徑。在這種情況下，丙酮酸最初轉變?yōu)槿樗?，隨后由乳酸形成乳酰 -CoA。然后乳酰-CoA經丙烯酰-CoA和3-羥丙酰-CoA轉變?yōu)?-羥基丙酸。 W0-A 02/42418中描述的制備3-羥基丙酸的又一途徑想象了葡萄糖經丙 酸、丙酰-CoA、丙烯酰-CoA和3-羥丙酰-CoA的轉變。該出版物還描述 了丙酮酸經乙酰-CoA和丙二酰-CoA轉變?yōu)?-羥基丙酸。經各個途徑獲 得的3-羥基丙酸可脫水轉變?yōu)楸┧?。W0-A 01/16346描述了從甘油發(fā)酵制備3-羥基丙酸，其中采用表 達來自克雷白氏桿菌(Klebsiella pneumoniae)的dhaB基因(編碼甘油 脫水酶的基因)和編碼醛脫氫酶的基因的微生物。用這種方法，從甘油 經3-羥丙醛形成3-羥基丙酸，然后3-羥基丙酸可以通過脫水轉變?yōu)楸?烯酸。如上所述用于制備作為合成丙烯酸的原料化合物的3-羥基丙酸 的發(fā)酵方法的缺點尤其是發(fā)酵溶液中形成的3-羥基丙酸的量，對于使用 此發(fā)酵溶液作為起始原料以經濟有利方式來大工業(yè)制備丙烯酸來說是 太低了。本發(fā)明是基于克服現(xiàn)有技術暴露的缺點的目的。 本發(fā)明尤其基于提供重組微生物或由至少兩種重組微生物組成的 重組系統(tǒng)的目的，這種微生物能夠比現(xiàn)有技術中描述的微生物更好地，特別是更有效地從可再生原材料，特別是從碳水化合物和/或從甘油制備3-羥基丙酸，接著3-羥基丙酸可在溫度脫水反應中轉變?yōu)榧儽┧?。一種相對于其野生型被遺傳修飾的細胞為實現(xiàn)上述目的提供了貢獻，該細胞具有性能a)和b)中的至少一種性能，優(yōu)選具有a)和b)兩 種性能a) 與其野生型相比，酶的活性增加，優(yōu)選至少10%,特別優(yōu) 選至少25%，進一步優(yōu)選至少50%,進一步更優(yōu)選至少75%,進一 步優(yōu)選至少100°/。和最優(yōu)選至少500%,最大限度優(yōu)選高達5000%, 特別優(yōu)選高達2500%,所述酶是催化丙酮酸轉變?yōu)椴蒗Ｒ宜岬拿?Ela，或催化磷酸烯醇丙酮酸轉變?yōu)椴蒗Ｒ宜岬拿窫,b,但是優(yōu)選催 化丙酮酸轉變?yōu)椴蒗Ｒ宜岬拿窫h,b) 與其野生型相比，催化天冬氨酸轉變?yōu)镻-丙氨酸的酶E2 的活性增加，優(yōu)選至少10%,特別優(yōu)選至少25%,進一步優(yōu)選至少 50%,進一步更優(yōu)選至少75%,進一步優(yōu)選至少100%和最優(yōu)選至少 500%,最大限度優(yōu)選高達5000%,特別優(yōu)選高達2500%,其中，除a)或b)，優(yōu)選a)和b)之外，該細胞的特征為性能c)或 d)的至少一種性能c) 該遺傳修飾的細胞能夠將P -丙氨酸輸出細胞外；d) 該遺傳修飾的細胞能夠將丙氨酸轉變?yōu)?-羥基丙酸。 用這種遺傳修飾的細胞本身或與可將P -丙氨酸轉變?yōu)?-羥基丙酸的其他細胞組合能夠從碳水化合物或從甘油形成3-羥基丙酸，因為形 成的P-丙氨酸可以轉變?yōu)?-羥基丙酸。"野生型"細胞優(yōu)選是指基因組處于例如通過進化自然產生的狀 態(tài)的細胞。該術語既理解為整個細胞又理解為單獨的基因。因此術語"野 生型，，不包括尤其是其基因序列至少部分經歷使用重組方法人工修飾的 那些細胞或那些基因。術語"酶的活性增加"優(yōu)選是指胞內活性增加。言語"與其野生 型相比，酶的活性增加"也特別包括細胞，其野生型不顯示或至少檢測 不到這個酶的活性，其僅在增加酶活性之后顯示出可檢測到的酶活性， 例如通過過表達。就此而論，術語"過表達"或在下列陳述中使用的言 語"表達增加，，還包括下面的情況，初始細胞，例如野生型細胞，不顯 示或至少檢測不到酶表達，可沖全測的表達卩又通過重組方法才可誘導出。原則上，通過以下方法實現(xiàn)酶活性增加是可能的通過增加編碼酶的的一個或多個基因序列的拷貝數，通過使用強啟動子或通過利用編 碼活性增加的相應酶的基因或等位基因，視需要通過這些方法的組合。 根據本發(fā)明遺傳修飾的細胞例如通過轉化、轉導、這些方法與載體結合 或聯(lián)合而產生，該載體包含期望的基因、這個基因的等位基因或其一部 分和能夠表達該基因的載體。異源表達特別是通過將基因或等位基因整 合入細胞的染色體或染色體外復制型載體來實現(xiàn)。DE-A-100 31 999中給出了增加細胞中酶活性的可能方法的概述, 所述酶例如是丙酮酸歡化酶，其引入這里作為參考，和其中與增加細胞 中酶活性的可能方法相關的公開內容形成本發(fā)明公開內容的一部分。上述和所有下述的酶和基因的表達可以借助于一維和二維蛋白凝 膠分離法和隨后用合適的分析軟件光學鑒定凝膠中的蛋白濃度來檢測。 如果酶活性增加僅僅基于相應基因表達增加，那么通過比較野生型和遺 傳修飾細胞之間 一維或二維蛋白分離法可以以簡單方式定量酶活性增 加。 一種制備棒桿菌蛋白凝膠，和鑒定蛋白的有效方法是Hermann等人 ((2001) Electrophoresis 22: 1712-1723)中描述的程序。蛋白濃度同 樣可以通過以下方法來分析，與待測蛋白特異性的抗體進行Western印 跡雜交 (Sambrook等人,Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. USA, 1989)和隨后用合適的測定濃度的軟件進行光學分析(Lohaus和 Meyer, (1989) Biospektrum 5: 32-39; Lottspeich (1999) Angewandte Chemie 111: 2630-2647)。 DNA結合蛋白的活性可以通過DNA條帶移位 分析(也稱為凝膠阻滯)來測定(Wilson等人(2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155)。 DNA結合蛋白對其他基因表達的影響 可以通過各種報道基因測定法才全測，其在(Sambrook等人，Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. USA, 1989)中已充分描述。酶的月包 內活性可以通過各種描述的方法測定(Donahue等人(2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627; Ray等人(2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277-2284; Freedberg等人(1 973) Journal of Bacteriology 1 15 (3): 81 6-823)。如果在下面陳述中沒有指出測定特 定酶活性的具體方法，那么酶活性增加的測定以及酶活性降低的測定優(yōu)選通過Hermann等人(Electrophoresis 22: 1712-1723 (2001))， Lohaus 等人(Biospektrum 5: 32-39 (1998)), Lottspeich (Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999))和Wilson等人(Journal of Bacteriology 183: 2151-2155 (2001))描述的方法進行。如果酶活性增加是由內源基因突變引起的，那么這種突變可以通 過經典方法隨機產生，例如通過紫外線照射或引起突變的化學品，或通 過遺傳操作方法有目的地產生，例如缺失、插入和/或核苷酸置換。這 些突變產生遺傳修飾的細胞。特別優(yōu)選的酶變體也特別是與其野生型相 比，不再受，或至少較少受反饋抑制支配的那些酶。如果酶活性增加是通過增加酶表達引起的，那么就例如增加相應 基因的拷貝數，或突變位于結構基因上游的啟動子區(qū)和調節(jié)區(qū)或核糖體 結合位點。并入結構基因上游的表達盒以相同方式運作。另外可能通過 誘導型啟動子在任何期望時間增加表達。然而，進一步可能的是給酶基 因分配作為調節(jié)序列的所謂的增強子，這經由改善RNA聚合酶和DM之 間的相互作用，同樣引起基因表達增加。通過延長m-RNA壽命的措施同 樣可以提高表達。此外通過防止酶蛋白降解，酶活性同樣增加。基因或 基因構建體或者以不同的拷貝數存在于質粒中，或者整合入染色體和在 染色體中擴增。備選地，此外可以通過修飾培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)過程實 現(xiàn)相關基因的過表達。本領域技術人員尤其可以在下列文獻中找到對于 此的指導Martin等人(Bio/Technology 5， 1 37-146 (1987)), Guerrero等人(Gene 1 38: 35-41 (1994))， Tsuchiya和Morinaga (Bio/Technology 6: 428-430 (1988))， Eikma謹等人(Gene 102: 93-98 (1991))， EP-A 0 472 869, US 4, 601, 893， Schwarzer和P hler (Bio/Technology 9: 84-87 (1991))，Reinscheid等人(Applied and Environmental Microbiology 60: 126-1 32 (1994))， LaBarre等人 (Journal of Bacteriology 175: 1 00卜1007 (1993))， WO-A 96/15246, Mal畫bres等人(Gene 134: 15-24 (1993))， JP-A-1 0-229891， Jensen 和Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)) 和熟知的遺傳學和分子生物學教科書中。如上所述的措施正如突變也產 生遺傳修飾的細胞。各基因的表達例如通過采用附加型質粒而增加。合適的質粒特別 是在棒桿菌中復制的質粒。很多熟知的質粒載體，例如pZl (Menkel等人，Appl ied and Environmental Microbiology 64: 549-554 (1989))、 pEKExl (Eik畫ns等人，Gene 107: 69-74 (1991))或pHS2-1 (Sonnen 等人，Gene 107: 69-74 (1991))基于隱性質粒p固1519、 pBLl或pGAl。 在同樣的方法中可以使用其他質粒載體，例如基于pCG4的質粒 (US 4, 489， 160)或基于pNG2的質粒(Serwold-Davis等人，F(xiàn)EMS Microbiology Letters 66: 119-124 (1990))或基于pAGl的質粒 (US 5, 158, 891)。此外，可應用于通過整合入染色體而進行的基因擴增方法的那些 質沖立載體也是合適的,如同例如(Applied and Environmental Microbiology 60: 126-1 32 (1994))描述用于復制或擴增hom-thrB-操 縱子。在這個方法中，完整基因克隆入可在宿主(典型的是大腸桿菌)中 復制的質粒載體，該宿主不是谷氨酸纟奉桿菌(Co/T/7e&WeWzy/77 g/〃"歷/c鵬)。合適的載體是例如pSUP301 (Si,等人,Bio/Technology 1: 784-791 (1983))、 pKl8raob或pKl9mob (Schafer等人，Gene 145: 69-73 (1994))、 pGEM-T (Promega Corporation, Madison, Wisconsin, USA) 、 pCR2. :i-T0P0 (Shu細，Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84 (1994))、 pCR⑧Blunt (Invitrogen， Groningen， Nether lands) 、 pEMl (Schrumpf等人,Journal of Bacteriology 173: 4510-4516))或pBGS8 (Spratt等人，Gene 41: 337-342 (1986))。包 含待擴增基因的質粒載體隨后通過結合或轉化期望的谷氨酸棒桿菌菌 抹而傳遞。結合方法例如由Schafer等人，Appl ied and Env i ronmenta1 Microbiology 60: 756-759 (1994)描述。轉化方法由例如Thierbach 等人(Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356-362 (1988)) Dunican和Shivnan (Bio/Technology 7: 1067-1070 (1989))和Tauch 等人(FEMS Microbiology Letters 123: 343-347 (1994))描述。通過 交換事件同源重組后，產生的菌抹包含至少兩個相關基因的拷貝。本發(fā)明的細胞優(yōu)選是遺傳修飾的細胞。這些可以是原核生物或真 核生物。此外它們可以是哺乳動物細胞(例如人細胞)、植物細胞或微生 物，如酵母細胞、真菌或細菌細胞，特別優(yōu)選微生物和最優(yōu)選細菌細胞 和酵母細胞。根據本發(fā)明合適的細菌、酵母和真菌細胞是所有作為野生型菌株 寸呆藏在德、國不倫瑞克的Deutsche Sammlung von Mikroorgani smen undZellkulturen GmbH (DSMZ)的那些細菌、酵母和真菌細胞的那些。合適的纟田菌纟田月包包才舌》丄.^—:..././!^^,.——<l !5,..^L /i￡5.5l. -i./ 1^—9丄51丄§....丄丄0)下歹'J出的 屬。根據本發(fā)明合適的酵母細胞包括http: //www, dsmz. de/species/yeasts. htm下歹'J出的那些屬。和才艮^居本 發(fā)明合適的真菌包括http: //www, dsmz. de/species/fimgi. htm下列出 的真菌。根據本發(fā)明特別優(yōu)選的細胞是以下屬的細胞棒桿菌屬 (Corynebacterium)、 短桿菌屬(Brevibacter ium)、 芽孑包桿菌屬 (Bacillus)、 乳酸斥于菌屬(Lactobaci 1 lus)、 乳J求菌屬(Lactococcus)、 假絲酵母屬(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia)、克魯弗氏酵母屬 (Kluverorayces )、 酵母屬(Saccharomyces)、 芽孑包桿菌屬(Baci 1 lus)、 埃希氏桿菌屬(Escherichia)和梭狀芽孢桿菌(Clostridium),特別優(yōu)選 的是Bacillus flavum、 Bacillus lactofermentum、 大腸4干菌 (Escherichia coli)、酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、 Kluveromyces lactis、 Candida blankii、 鈹褶假絲酵母(Candida rugosa)、 谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、 Corynebacter ium ef ficiens和巴斯德畢赤酵母(Pichia post oris), 最 特選谷氨酸棒桿菌。酶Eh優(yōu)選是羧化酶，特別優(yōu)選丙酮酸羧化酶(EC編號6. 4. 1. 1), 其催化丙酮酸轉變?yōu)椴蒗Ｒ宜?。例如來自Rhizobium etli的丙酮酸羧 化酶基因(pyc基因)(Dunn等人，J. Bacteriol. 178: 5960-5970 (1996),還參見W0-A 99/53035)、 Bacillus subt i 11 i s (Genbank Accession No. Z97025)的pyc基因、結合分斗支^干菌(Mycobacterium tuberculosis) pyc基因 (Genbank Accession No. Z83018)、 熒光假單 月包菌(Pseudomonas f luorescens) pyc基因(W0—A-99/53035)和來自熱 自養(yǎng)曱丈克^干菌(Methanobacter ium thermoautotrophicum)的pyc基因 (Mukhopadhyay, J. Biol. Chem. 273: 5155-5166 (1998))已經#皮克 隆并測序。jt匕夕卜，已纟至斗企測了 Brevibacterium lactof ermentum中丙酉同 酸羧化酶的活性(Tosaka等人，Agric. Biol. Chem. 43: 1513-1519 (1979))和谷氨酸棒桿菌中丙酮酸羧化酶的活性(Peters-Wendisch等人， Microbiology 143: 1 095-1 1 03 (1997))。 DE—A 1 00 31 999， DE-A 198 31 609, US 6， 171, 833， US 6, 403， 351和US 6, 455, 284中也描述了 pyc基因的核苷酸序列。根據本發(fā)明優(yōu)選的丙酮酸羧化酶是由選自包括下組的基因編碼的那些丙酮酸羧化酶PC, Pcx， CG1516, CG1516, pyc-1, PYC2, AAR162Cp, pyrl， accC-2， pycA， pycA2， pca, Cgl0689, pyc, pycB， accC, oadA, acc和accCl,特另寸特選pyc基因。才艮據本發(fā) 明的優(yōu)選丙酮酸羧化酶特別描述在US 6， 455, 284， US 6, 171， 833, US 6， 884, 606， US 6， 403, 351, US 6， 852， 516和US 6, 861, 246中。然而， 原則上使用任何可想到的來源的pyc基因都是可能的，無論它們來自細 菌、酵母、動物、真菌或是植物。進一步可使用pyc基因的等位基因，特別是包括由遺傳密碼簡并性產生的或通過功能性中性突變產生的等 位基因。根據本發(fā)明特別優(yōu)選的丙酮酸叛化酶是"A novel methodology employing Corynebacterium glutamicum genome information to generate a new L-lys ine-producing mutant"(Onishi等人，Applied Microbiology and Biotechnology 58 (2): 217-223 (2002))中描述的 突變體。在這個突變中，458位的氨基酸脯氨酸被絲氨酸取代。在此將 這個出版物與制備丙酮酸羧化酶的可行方案有關的披露內容引入作為 參考并形成為本發(fā)明公開內容的一部分。因此根據本發(fā)明特別優(yōu)選的細 胞是具有如上所述的酶突變體作為外源蛋白的細胞，或具有編碼這種酶 的外源性DNA序列和表達足夠量的這個酶的細胞。特別是在DE-A 1 00 31 999以及DE-A 198 31 609中詳細描述了 丙酮酸羧化酶活性增加的細胞的制備。在此將這些出版物中與增加細胞 中、特別是棒桿菌屬細菌細胞中丙酮酸羧化酶活性的各種可行方案有關 的披露內容同樣引入作為參考并形成為本發(fā)明公開內容的一部分。丙酮酸羧化酶胞內活性優(yōu)選通過Petra Peters-Wendisch在 Forschungszentrum Jiilich GmbH "Anaplerotische Reaktionen in Corynebacterium glutamicum: Untersuchung zur Bedeutung der PEP-Carboxylase und der Pyruvat-Carboxylase im Zentralstoffwechsel und bei der Aminosaureproduktion" (1996) 的論文中描述的方法來測定。酶E^優(yōu)選是羧化酶，特別優(yōu)選磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(EC 4.1.1.31),其催化磷酸烯醇丙酮酸轉變?yōu)椴蒗Ｒ宜?。根據本發(fā)明優(yōu)選 的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶是由選自包括下組的基因編碼的那些磷酸烯 醇丙酮酸羧化酶F12M16. 21、 F14N22.13、 K15M2. 8、 ppc、 clpA、 pepC、capP、 CgU 585和pepC，特別特選ppc基因。在例如US 6, 599， 732， US 5， 57 3， 945， US 4， 757， 009和US 4， 980, 285中公開了野生型磷酸烯醇 丙酮酸羧化酶或這些酶的突變體的ppc基因。尤其是在US4， 757， 009中 描述了磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性增加的細胞的制備。在此將這個出版 物與在微生物中過表達磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的工序有關的披露內容 同樣引入作為參考并形成本發(fā)明公開內容的一部分。除過表達酶之外， 也可能應用酶與E,a相關措施中提及的另一個方法增加磷酸烯醇丙酮酸 羧化酶的酶活性，特別是包括酶突變體的表達。就此而論，特別優(yōu)選的 突變體是不需要乙酰CoA活化和/或被天冬氨酸反饋抑制的突變體(就 此而論，特別參見US 6, 919， 190)。原則上關于磷酸烯醇丙酮酸羧化酶， 也可使用任何可想到的來源的相應基因，無論它們來自細菌、酵母、植 物、動物或是真菌。在這種情況下，進一步還可能使用ppc基因的全部 等位基因，特別是包括由遺傳密碼簡并性產生的或通過功能性中性突變 產生的基因。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的活性優(yōu)選通過Petra Peters-Wendi sch 在Forschungszentrum J iil ich GmbH "Anaplerot ische Reakt ionen in Corynebacterium glutamic跳 Untersuchung zur Bedeutung der PEP-Carboxylase und der Pyruvat-Carboxylase im Zentralstoffwechsel und bei der Aminosaureproduktion" (1996) 的論文中描述的方法測定。.特別是Sauer和Eikmanns也給出了^粦酸烯醇丙酮酸羧化酶和丙 酮酸羧化酶的概述(FEMS Microbiology Reviews 29: 765-794 (2005))。酶E2優(yōu)選是脫羧酶，特別優(yōu)選谷氨酸脫羧酶或天冬氨酸脫羧酶， 最優(yōu)選panD基因編碼的l-天冬氨酸-l-脫羧酶(EC編號4. 1. 1. 11)。天 冬氨酸脫羧酶催化天冬氨酸轉變?yōu)镻-丙氨酸。天冬氨酸脫羧酶基因 (panD基因)，尤其是來自大腸桿菌(FEMS Microbiology Letters 143: 247—252 (1996))、發(fā)光光斥干^R菌(Photorhabdus luminescens) laumondii亞種、牛分枝桿菌(Mycobacter ium bovis)牛亞種和來自很多 其他微生物的天冬氨酸脫羧酶基因已經被克隆和測序。特別是， DE-A-19855313中描述了來自谷氨酸棒桿菌的panD基因的核苷酸序列。 原則上有可能使用任何可想到的來源的panD基因，無論它們來自細菌、 酵母、植物、動物或是真菌。此外還可使用panD基因的等位基因，特別是包括由遺傳密碼簡并性產生的或通過功能性無義突變產生的基因。 除來自谷氨酸棒桿菌的天冬氨酸脫羧酶之外，根據本發(fā)明特別優(yōu)選的天冬氨酸脫羧酶是大腸桿菌突變體DV9 (Vallari和Rock， Journal of Bacteriology 164 : 1 36-142 (1985))。在此，將這個出版物與上 述突變體有關的披露內容引入作為參考并形成為本發(fā)明公開內容的一 部分。尤其是在DE-A 198 55 314中詳細描述了天冬氨酸脫羧酶活性增 加的細胞的制備。在此，將這些出版物與增加細胞中、特別是棒桿菌屬 細菌細胞中天冬氨酸脫羧酶活性的各種可行方案有關的披露內容同樣 引入作為參考并形成為本發(fā)明公開內容的一部分。根據本發(fā)明特別優(yōu)選 的細胞是具有如上所述來自大腸桿菌的酶突變體DV9或來自谷氨酸棒桿 菌的panD的細胞，和具有編碼這些酶之一的DNA序列和表達足夠量的 這個酶的細月包。通過Dusch等人 (Applied and Environmental Microbiology 65 (4): 1530-1539 (1999))在章節(jié)名稱為"Aspartate decarboxylase activity assay"中描述的測定方法測定天冬氨酸脫羧酶的活性。如果本發(fā)明細胞是遺傳修飾的谷氨酸棒桿菌細胞，那么僅酶E2的 活性增加可能已足夠，因為這些細胞的野生型已經具有相對高的丙酮酸 羧化酶活性。然而，即使當使用谷氨酸棒桿菌時，優(yōu)選本發(fā)明細胞中增 加酶EJ舌性和酶E:活性，或增加酶Eu活性和酶Ed舌性。本發(fā)明細胞的進一步特征在于除性能a)或b),優(yōu)選除a)和b) 之外，它的特征為性能c)或d)的至少一種性能a) 該遺傳修飾的細胞能夠將P -丙氨酸輸出該細胞外；b) 該遺傳修飾的細胞能夠將p-丙氨酸轉變?yōu)?-羥基丙酸。 這里使用的術語"3-羥基丙酸"包括3-羥基丙酸的質子化形式以及3-羥基丙酸的去質子化形式(=3-羥丙酸根)和質子化和去質子化形式 的混合物。術語"輸出"包括p-丙氨酸主動和被動輸出細胞外，進入 圍繞細胞的培養(yǎng)基。滿足條件c)的本發(fā)明細胞優(yōu)選特征在于它們的細胞膜中具有內 源和/或外源的轉移酶，優(yōu)選外源的轉移酶，該轉移酶能夠選擇性或非 選擇性運輸，優(yōu)選選擇性運輸，主動或被動地，視需要，與離子例如鈉、 鉀或氯交換或和這些離子一起，將p-丙氨酸通過細胞膜運輸至外面，也就是說進入細胞的外部區(qū)域(-P-丙氨酸從細胞流出)。就此而論，特 別優(yōu)選根據本發(fā)明的遺傳修飾細胞與其野生型相比表現(xiàn)出P -丙氨酸從細胞流出增加，優(yōu)選增加至少10°/ ,特別優(yōu)選至少25%,進一步優(yōu)選至 少50%,進一步更優(yōu)選至少75%,進一步優(yōu)選至少100°/。和最優(yōu)選至少 500%,最大限度優(yōu)選直至5000%，特別優(yōu)選直至2500%。在此，流出增 加10°/ 意思指與它的野生型相比在相同條件下，特別是在相同胞內和胞 外丙氨酸濃度條件下，遺傳修飾的細胞在限定時間段內能夠將多10% 的p-丙氨酸輸出細胞外。優(yōu)選通過增加上述轉移酶的活性實現(xiàn)增加流 出，這種增加又可以通過已就酶E吣E,b和E2提及的技術(轉移酶突變或 轉移酶基因表達增加)引起。就此而論優(yōu)選的轉移酶是例如所謂的多耐藥性蛋白(MDR蛋白)， 例如基因ebrA和ebrB,和所謂的"多藥物流出運輸蛋白 (Transporter)",特別優(yōu)選例如具有bl t和bmr基因的"多藥物流 出運輸蛋白，，。在，，Handbook of C0,/y7e6scfer/iy/z7 ^7〃fa/7 /c〃/z7" , L. Eggeling和M. Bott，編輯，CRC Press, Boca Raton， USA, 2005，第 IV章，"Genomic Analyses of Transporter Proteins in Cor//7e6a"er/〃/7 g/i^3y77/c〃/77 and C0/y/7e&"er/柳e/Y7c/eW , B. Winnen， J. Felce，和M. H. Saier, Jr., 149-186頁中也描述了合適的 P-丙氨酸運輸系統(tǒng)。Schneider等人(Appl. Microbiol. Biotechnol. 65 (5): 576-582 (2004))中描述了更多合適的P -丙氨酸運輸系統(tǒng)，特 另'J是cycA基因編石馬的那些。Anderson和Thwaites (J. Cell. Physiol. 204 (2): 604-61 3 (2005))， Brechtel和King (Biochem. J. 333: 565-571 (1998)), Guimbal等人(Eur. J. Biochera, 234 (3): 794-800 (1995))， Munck和Munck (Biochim. Biophys. Acta 1235 (1): 93-99 (1995))以及Shuttleworth和Goldstein (J. Exp. Zool. 231 (1): 39-44 (1984))進一步描述了合適的p-丙氨酸運輸系統(tǒng)。滿足條件d)的本發(fā)明細胞能夠將形成的P -丙氨酸轉變?yōu)?-羥基 丙酸。其中在原理上可想到至少兩個變體。在變體A中，細胞可以將(3 -丙氨酸通過P-丙氨酰-CoA、丙烯酰 -CoA和羥丙酰-CoA轉變?yōu)?-羥基丙酸。就此而論，特別優(yōu)選的是，細 胞與其野生型相比顯示出下列酶E3至E6中的至少一種酶，優(yōu)選全部酶的 活性增加，優(yōu)選增加至少10%,特別優(yōu)選至少25%,進一步優(yōu)選至少50%,進一步更優(yōu)選至少75%，進一步優(yōu)選至少100%和最優(yōu)選至少500%,最大限度優(yōu)選直至5000%,特別優(yōu)選直至2500%:-催化P-丙氨酸轉變?yōu)镻-丙氨酰-輔酶A的酶E3， -催化p-丙氨酰-輔酶A轉變?yōu)楸?輔酶A的酶E4， -催化丙烯酰-輔酶A轉變?yōu)?-羥丙酰-輔酶A的酶Es, -催化3-羥丙酰-輔酶A轉變?yōu)?-羥基丙酸的酶E" 其中，根據本發(fā)明特別優(yōu)選的遺傳修飾的細胞是視需要除E,a或Elb,和E2中至少一種酶活性增加之外，下列酶或酶組合活性增加的細胞E3、 E4、 E5、 Ee、 E3E4、 E3E5、 E3E6、 E4E5、 E4E6、 E5Es、 E3E4E5、 E3E4E6、 E3E5E5、E4E5E6、 或E3E4E5E6。在這種情況下，酶E3至E,的酶活性增加也可以通過對于E,a、 Elb和E2酶提及的技術引起，例如突變或增加酶表達。就此而論，進一步優(yōu)選酶E3是輔酶A轉移酶(EC 2.8. 3. l)或輔酶A合成酶，優(yōu)選輔酶 A轉移酶，E,是P -丙氨酰-輔酶A銨裂合酶(EC 4. 3. 1. 6)，E5 是3-羥丙酰-輔酶A脫水酶(EC4.2. l.-，尤其是EC 4. 2. 1. 17),和E6是輔酶A轉移酶(EC 2. 8. 3. 1) , 3-羥丙酰-輔酶A水解酶(EC3. 1. 2-)或3-羥丁酰-輔酶A水解酶(EC 3.1.2.4),優(yōu)選輔酶A轉移酶。優(yōu)選具有輔酶A轉移酶活性的酶是來自Megasphaera elsdenii、 丙酸梭菌(Clostr idium propionicum)、 科氏梭菌(Clostr idium kluyveri)以及來自大腸桿菌的酶。在這一點上可以提及的編碼輔酶A 轉移酶的DNA序列的實例是WO-A 03/062173中來自Megasphaera elsdenii的命名為SEQ ID NO : 24的序列。進一步優(yōu)選的酶是WO-A 03/062173中描述的輔酶A轉移酶的那些變體。合適的具有P-丙氨酰-輔酶A銨裂合酶活性的酶是例如來自丙酸 ;陵菌的酶。編碼這種酶的DNA序列可以例如如WO-A 03/062173的實施 例IO所述從丙酸梭菌獲得。編碼來自丙酸梭菌的P-丙氨酰-輔酶A銨 裂合酶的DNA序列在WO-A 03/0621 73中表示為SEQ ID NO : 22。合適的具有3-輕丙酰-輔酶A脫水酶活性的酶特別是由選自包括下列的組的基因編碼的那些酶ECHS1, EHHADH, HADHA, CG4389, CG6543 CG6984， CG8778， ech-l, ech-2， ech-3， ech-5, ech-6， ech-7， FCAALL, 314， FCAALL. 21， F0X2， ECI12, ECIl， paaF, paaG， yfcX, fadB， faoA, fadBlx， phaB， echA9， echA17， fad-l， fad-2， fad-3， paaB， echA7， dcaE， hcaA， RSp0671， RSp0035, RSp0648, RSp0647， RS03234， RS03271, RS04421, RS04419， RS02820， RS02946， paaG2， paaGl， ech， badK, crt, ydbS, eccH2， pimF， paaG3， fabJ-l， caiD-2， fabJ-2， ysiB, yngF， yusL， phaA, phaB, fucA， caiD， ysiB， echA3， echA5， echA6， echA7， echA8， echA14， echA15， echA16, echA17, echA18. 1， echA19， echA20， echA21, echA2， echA4， echA9， echAll, echA10， echA12， echA13, echA18， echAl， fadB-l， echA8-l， echA12-2, fadB-2， echA16-2, Cgl0919, fadBl, SCF41. 23， SCD10. 16, SCK13. 22, SCP8. 07c StBAC16H6. 14, SC5F2A. 15， SC6A5. 38， faoA, hbdl， crt, hbd-l, hbd-2， hbd-5， fad-4， hbd-10, fad-5， hbdl， paaF-l, paaF-2， paaF-3， paaF-4. paaF-5， paaF-6和paaF-7?？梢蕴峒暗牟鹏迵景l(fā)明合適的3-羥丙酰-輔酶A脫水酶的實例尤其是來自橙色綠屈撓菌(Chloroflexus aurant iacus)、鈹褶假絲酵母、Rhodospr i 11 ium rubrum和rhodobacter capsulates的酶。編碼3-羥丙酰-輔酶A脫水酶的DNA序列的具體實例 是例如WO-A 02/42418中表示為SEQ ID NO : 40的序列。例如在WO-A 02/42418和W0-A 03/062173的實施例中描述了上述 E3至E6中的至少一種，優(yōu)選全部的酶活性增加的遺傳4,飾的細胞的制 備。在此，將這兩個出版物與在細胞中增加這些酶活性有關的披露內容 同樣引入作為參考并形成本發(fā)明公開內容的一部分。在變體B中，細胞可以將P-丙氨酸通過丙二酸半醛轉變?yōu)?-羥 基丙酸。就此而論，特別優(yōu)選的是，所述細胞與其野生型相比顯示出酶 E7和Es中至少一種酶，優(yōu)選該兩種酶的活性增加，優(yōu)選增加至少10%, 特別優(yōu)選至少25%,進一步優(yōu)選至少50%,進一步更優(yōu)選至少75%,進一 步優(yōu)選至少100%和最優(yōu)選至少500%，最大限度優(yōu)選直至5000%,特別優(yōu) 選直至2500%:-催化P-丙氨酸轉變?yōu)楸岚肴┑拿窫7， -催化丙二酸半醛轉變?yōu)?-羥基丙酸的酶E8。其中，特別優(yōu)選的根據本發(fā)明的遺傳修飾細胞是這樣的細胞，其中除Ela或Elb和E2中至少一種酶活性增加之外，視需要增加下列酶或酶 組合的活性E7、 E*E7E8。在這種情況下，酶E,和Es的酶活性增加也可以通過對于酶Ela、 Eu和E2提及的技術引起，例如突變或增加酶表達。 就此而論，進一步優(yōu)選酶E7是P-丙氨酸-2-酮戊二酸轉氨酶(EC 2. 6. 1. 19)或?；撬?-2-酮戊二酸轉氨酶(2. 6. 1.55),優(yōu)選P -丙氨酸-2-酮戊二酸轉氨 酶5 和Es是3-羥丙酸脫氫酶(EC 1. 1. 1. 59)或3-羥丁酸脫氫酶(EC 1.1.1.30),但是優(yōu)選3-羥丙酸脫氫酶(EC 1.1.1.59)。 已知丙氨酸-2-酮戊二酸轉氨酶基因例如來自Neurospora crassa ("Ober die beta-Alanin-alpha-Ketoglutarat-Transaminase，，, Aurich和Hoppe-Seyler' s， Z. Physiol. Chem. 326: 25-33 (1961))。 關于來自其他微生物的這個酶的基因的其它信息可以取自尤其是KEGG GENE數據庫(KEGG=Kyoto Encyclopedia of Genes and Ge謹es)。來自 各種微生物的3-羥丙酸脫氫酶或3-羥丁酸脫氫酶的基因也可以取自 KEGG GENE數據庫。如果本發(fā)明的細胞滿足條件d),那么進一步優(yōu)選的是，該細胞與 其野生型相比顯示p-丙氨酸流出減少，優(yōu)選減少至少10%,特別優(yōu)選至 少25%,進一步優(yōu)選至少50%,進一步更優(yōu)選至少75%,進一步優(yōu)選至少 100%和最優(yōu)選至少500%，最大限度優(yōu)選直至5000%，特別優(yōu)選直至 2500%。其中，流出減少10°/ 意思指與它的野生型相比，遺傳修飾的細胞 在相同條件下(特別是相同的胞內和胞外的P-丙氨酸濃度)在限定時間段內能夠從細胞中輸出少10%的p-丙氨酸。優(yōu)選通過降低上述轉移酶的活性實現(xiàn)流出減少，減少可通過轉移酶突變或轉移酶基因表達降低而 引起。使用其野生型不能將P -丙氨酸輸出細胞外的那些細胞作為滿足 條件d)的細胞也可能有利。本發(fā)明的細胞單獨(如果滿足條件d))或與能夠由p-丙氨酸制備 3-羥基丙酸的其他微生物聯(lián)合(如果滿足條件c))能夠由丙酮酸形成3-羥基丙酸。以丙酮酸出發(fā)作為制備P -丙氨酸的起點，接著現(xiàn)在可想到本發(fā)明 細胞的兩個不同實施方案。在本發(fā)明細胞的笫一個實施方案中，它們能夠產生制備P-丙氨酸 所需的丙酮酸，特別是也以甘油作為碳源。就此而論，特別優(yōu)選本發(fā)明的細胞與其野生型相比顯示下列酶E9至Eu中的至少一種酶，優(yōu)選全部酶的活性增加，優(yōu)選增加至少10%,特 別優(yōu)選至少25%,進一步優(yōu)選至少50%,進一步更優(yōu)選至少75%,進一步 優(yōu)選至少100%和最優(yōu)選至少500%,最大限度優(yōu)選直至5000%，特別優(yōu)選 直至2500%:-促進甘油擴散入細胞的酶E9， -催化甘油轉變?yōu)?-磷酸甘油的酶Em -催化3-磷酸甘油轉變?yōu)榱姿岫u丙酮的酶Eu, -催化硫轉移至硫受體硫氧還原蛋白1的酶Em -催化磷脂水解形成醇和甘油的酶Eu, -催化3-磷酸甘油運輸入細胞以換為磷酸的酶Em -催化磷酸二羥丙酮轉變?yōu)?磷酸甘油^的酶E^， -催化3-磷酸甘油醛轉變?yōu)?， 3-二磷酸甘油酸的酶E16, -催化1， 3-二磷酸甘油酸轉變?yōu)?-磷酸甘油酸的酶E17, -催化3-磷酸甘油酸轉變?yōu)?-磷酸甘油酸的酶Eu， -催化2-磷酸甘油酸轉變?yōu)榱姿嵯┐急岬拿窫n， -催化磷酸烯醇丙酮酸轉變?yōu)楸岬拿窫2。， -催化甘油轉變?yōu)槎u丙酮的酶En, -催化二羥丙酮轉變?yōu)榱姿岫u丙酮的酶E22。 其中，特別優(yōu)選的根據本發(fā)明的遺傳修飾細胞是這樣的細胞，其 中視需要除Eu或E!b和E2中一種或多種酶的活性增加之外，和視需要除 E3至E6或E7和Es的一種或多種酶的活性增加之外，選自下列的組的酶或 酶組合的活性增加E9、 E1Q、 Eu、 E12、 E13、 E14、 E15、 E"、 E17、 E18、 E19、 E2。、 E21、 E22、 E,。Eu,特別優(yōu)選選自下組的一種或多種酶的活性增加E9、 E10、 E 、 E13、 E14、 En和Eu,和最優(yōu)選E,。和En的酶活性增加。 就此而論，特別優(yōu)選酶E9是甘油易化蛋白(aquaglyceroporin)， 優(yōu)選由glpF基 因編碼，E,。是甘油激酶(EC 2.7.1.30)，優(yōu)選由glpK基因編碼，Eu是甘油-3-磷酸脫氫酶(EC 1.1.99.5)，優(yōu)選FAD依賴性甘油- 3-磷酸脫氬酶，其中甘油-3-磷酸脫氬酶優(yōu)選由glpA基因、glpB 基因、glpC基因或glpD基因編碼，特別優(yōu)選由glpD基因編碼， Eu是由glpE基因編碼的硫轉移酶，E13是甘油磷酸二酯酶(EC 3. 1. 4. 46),優(yōu)選由glpQ基因編碼， Em是3-磷酸甘油透酶，優(yōu)選由glpT基因編碼 E15是丙糖磷酸異構酶(EC 5. 3. 1. 1), E"是甘油醛-3-磷酸脫氫酶(EC 1.2.1.12)， E"是磷酸甘油酸激酶(EC 2. 7. 2. 3), E,s是磷酸甘油酸變位酶(EC 5.4.2.1)， E^是烯醇酶(EC 4.2.1.11), E2。是丙酮酸激酶(EC 2. 7. 1. 40)，En是甘油脫氫酶(EC 1.1.1.6)，其優(yōu)選由gldA基因編碼，和E22是二羥丙酮激酶(EC 2. 7. 1. 29)，其優(yōu)選由dhaK基因編碼。 上述酶的基因序列在文獻中公開并可以取自例如KEGG GENE數據 庫，美國國立醫(yī)學圖書館的國家生物技術信息中心(NCB I)數據庫 (Bethesda, MD,美國)或歐洲分子生物學實驗室(EMBL, Heidelberg,德 國或劍橋，UK)的核苷酸序列數據庫。此外，其它資料來源中公開了編 碼甘油醛-3-石舞酸脫氬酶的gap基因(Eikmanns (1992)， Journal of Bacteriology 174 : 6076-6086)、編碼丙糖磷酸異構酶的tpi基因 (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174 : 6076-6086)，和 編碼3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因(Eikmanns (1992)， Journal of Bacteriology 174 : 6076-6086)。用酶E,至E22的已知基因使得可以制備遺傳修飾的細胞，其中酶 E,至E22中至少一種，特別優(yōu)選至少兩種，進一步優(yōu)選至少三種和最優(yōu)選 全部酶的活性已經通過如上所述關于酶E,8、 E^和E2的技術(酶突變或 增加酶表達)而增加。這些細胞可以在甘油作為唯一碳源(或與碳水化合 物 一 起作為另外碳源)的情況下培養(yǎng)。除E9至E22中一種或多種酶活性增加之外，就此而論，如果本發(fā) 明的細胞中表達下列基因，尤其是異源表達，也可能有利 -glpG基因或b3424基因， -glpX基因或3925基因，-dhaR基因、ycgU基因或M201基因-fsa基因、mipB基因、ybiZ基因或B0825基因 - talC基因、fsaB基因、y ijG基因或b3946基因。 這些基因的核苷酸序列可以取自KEGG GENE數據庫，美國國立醫(yī) 學圖書館的國家生物技術信息中心(NCBI)數據庫(Bethesda， MD,美國) 或歐洲分子生物學實'瞼室(EMBL, Heidelberg,德國或劍橋，UK)的核苷 酸序列數據庫。在本發(fā)明細胞的第二個實施方案中，它們不能由甘油獲得制備P _ 丙氨酸所需的丙酮酸或者至少僅以少量范圍從甘油獲得制備P-丙氨酸 所需的丙酮酸。在這種情況下，細胞中丙酮酸的供應主要通過糖酵解產 生。這類型細胞可以在含有碳水化合物例如葡萄糖作為碳源的營養(yǎng)培養(yǎng) 基中培養(yǎng)。在這種情況下，優(yōu)選的是，視需要除上述的酶E,至Eu中的至少 一種酶，優(yōu)選全部酶的活性增加之外，本發(fā)明的細胞與其野生型相比顯 示下列酶E"至E2。和Eu至E27中的至少一種酶，優(yōu)選全部酶的活性增加， 優(yōu)選增加至少10%，特別優(yōu)選至少25%,進一步優(yōu)選至少50%,進一步更 優(yōu)選至少75%,進一步優(yōu)選至少100%和最優(yōu)選至少500%,最大限度優(yōu)選 直至5000%,特別優(yōu)選直至2500%:-促進甘油擴散入細胞的酶E23,-催化葡萄糖轉變?yōu)閍-D-葡萄糖-6-磷酸的酶E2,,-催化a-D-葡萄糖-6-磷酸轉變?yōu)閜-D-果糖-6-磷酸的酶E25,-催化(3-D-果糖-6-磷酸轉變?yōu)?3-D-果糖-l, 6-二磷酸的酶，-催化P-D-果糖-1, 6-二磷酸轉變?yōu)?-磷酸甘油醛和磷酸 二羥丙酮的酶Em-催化3-磷酸甘油醛轉變?yōu)?， 3-二磷酸甘油酸的酶E^ -催化1, 3 二磷酸甘油酸轉變?yōu)?-磷酸甘油酸的酶E17, -催化3-磷酸甘油酸轉變?yōu)?-磷酸甘油酸的酶E18, -催化2-磷酸甘油酸轉變?yōu)榱姿嵯┐急岬拿窫19, -催化磷酸烯醇丙酮酸轉變?yōu)楸岬拿窫2。。 其中，特別優(yōu)選的根據本發(fā)明的遺傳修飾細胞是這樣的細胞，視 需要除Eh或E^和E2中一種或多種酶活性增加之外，和視需要除E,至E6或E7和Es中一種或多種酶活性增加之外，下列酶或酶組合的活性增力口Ew，E17,Eis,E19, E20， E23, E24， E25, D26， E27和Ei6EnEisEi9E2oE23E24E25E26E27。就此而論，特別優(yōu)選酶E23是葡萄糖轉運蛋白，優(yōu)選由選自包括glutl、 gluP或fucP 的組的基因編碼的葡萄糖轉運蛋白，或葡萄糖透酶(2. 7. 1. 6 9)，E"是葡糖激酶(2.7.1.2),E25是葡糖-6-磷酸異構酶(EC 5. 3. 1. 9),Em是6-磷酸果糖激酶(EC 2.7.1.11),E27是果糖-二磷酸醛縮酶(EC 4.1.2.13)，Ew是甘油醛-3-磷酸脫氫酶(EC 1.2,1.12),E,7是磷酸甘油酸激酶(EC 2.7.2.3),E^是磷酸甘油酸變位酶(EC 5.4.2.1),E"是烯醇酶(EC 4. 2. 1, 11)，和E2。是丙酮酸激酶(EC 2.7.1.40)。 這些基因的核苷酸序列可以取自KEGG GENE數據庫，美國國立醫(yī) 學圖書館的國家生物技術信息中心(NCBI)數據庫(Bethesda， MD,美國) 和歐洲分子生物學實驗室(EMBL， Heidelberg,德國或劍橋，UK)的核苷 酸序列數據庫。關于本發(fā)明細胞的第二個實施方案，進一步優(yōu)選，除上述酶Eh或E,b和/或E2之外，和視需要除酶E3至E6、 E7或Es和Eu至E27中至少一種酶之外，磷酸轉移酶系統(tǒng)的酶活性也增加。就此而論，特別優(yōu)選的是， 本發(fā)明細胞中的ptsl和ptsM基因增強，優(yōu)選過表達。就此而論，特別 參考US 6， 680， 187和6， 818， 432,在此將它的與過表達ptsl和ptsM基 因的可行方案相關的披露內容引入作為參考并形成本發(fā)明公開內容的 一部分。另外，在本發(fā)明細胞中可以增加天冬氨酸轉氨酶(EC 2.6. 1.1. A)的活性，無論它們是否使用甘油或葡萄糖作為主要營養(yǎng)來源，也無論它 們是否單獨或其他細胞聯(lián)合而經過丙二酸半醛或通過p -丙氨酰-輔酶A、丙烯酰-輔酶A和3-羥丙酰-輔酶A形成3-羥基丙酸。相應基因(aspB) 的序列可以特別地取自KEGG GENE數據庫。進一步優(yōu)選的是，在本發(fā)明細胞中下列酶活性減低E28其催化草酰乙酸轉變?yōu)榱姿嵯┐急幔缌姿嵯┐急狒燃っ?EC 4.1.1.49)(也參見DE-A 199 50 409)，E2,催化丙酮酸轉變?yōu)橐宜幔绫嵫趸?EC 1.2.2.2)(也參見DE-A 199 51 975),Em催化oc-D-葡萄糖6-磷酸轉變?yōu)镻 -D-果糖-6-磷酸(也參見US 09/396， 478)，E31催化P -丙氨酸轉變?yōu)榧‰?，例如肌肽合?EC 6. 3. 2. 11), E32催化P -丙氨酸轉變?yōu)閏x-丙氨酸，例如丙氨酸氨基變位酶， E33催化P -丙氨酸轉變?yōu)?R)-泛酸，例如泛酸-P -丙氨酸連接酶(EC 6. 3. 2. 1),E34催化卩-丙氨酸轉變?yōu)镹-carbomyl- P -丙氨酸，例如P -脲基丙酸酶(EC 3. 5. 1. 6),E35催化丙酮酸轉變?yōu)槿樗?，例?-乳酸脫氫酶(EC 1. 1. 1. 27)或乳酸-蘋果酸氪轉移酶(EC 1. 1. 99. 7),E36催化丙酮酸轉變?yōu)橐阴］o酶A,例如丙酮酸脫氫酶(EC 1. 2. 1. 51)，E37催化丙酮酸轉變?yōu)橐阴Ａ姿?，例如丙酮酸氧化?EC 1. 2, 3. 3)，E38催化丙酮酸轉變?yōu)橐宜?，例如丙酮酸脫氫?EC 1. 2. 2. 2), E 催化丙酮酸轉變?yōu)榱姿嵯┐急?，例如磷酸烯醇丙酮酸合?EC 2. 7. 9. 2)或丙酮酸-磷酸二激酶(EC 2.7.9.1),和/或 E,。催化丙酮酸轉變?yōu)楸彼?，例如丙氨酸轉氨酶(2. 6. 1. 2)或丙氨酸氧代酸轉氨酶(EC 2.6.1.12),減低優(yōu)選至少10%,特別優(yōu)選至少25%,進一步優(yōu)選至少5oy。，進 一步更優(yōu)選至少75%，進一步優(yōu)選至少100%和最優(yōu)選至少500%,最大限 度優(yōu)選直至5000%的最大值，特別是直至2500%的最大值，特別特選酶 E28、 E3。、 E 、 E35、 Ew牙口 E4。;;舌'l"生;咸〗氐。就此而論，術語"減低"描述細胞中由適當DNA編碼的一種或多 種酶胞內活性降低或消除，例如通過使用弱啟動子或使用編碼相應的低 活性酶的基因或等位基因，或滅活適當的基因或酶和視需要聯(lián)合這些方 法。在本發(fā)明細胞的特殊實施方案中可能特別有意義的是，有目的地 促進戊糖磷酸途徑，例如通過增加葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(EC 1. 1. 1. 49)和6-磷酸葡萄糖酸脫氬酶(EC 1.1.1.44)活性，和同時抑制糖酵解，例 如通過減少葡糖-6-磷酸異構酶活性，如WO-A 01/07626所述。在本發(fā)明細胞的一個特殊實施方案中，其中谷氨酸脫氫酶(EC 1.4. 1.4)的活性通過對于酶E,a、 Eu和E2提及的技術之一而增加。來自 很多微生物的這個酶的基因同樣可以取自KEGG GENE數據庫。此外，US 6, 355， 454和WO-A 00/53726描述了谷氨酸脫氬酶基因和過表達這個酶 的可行方法。在此，將這些出版物與在細胞中進行谷氨酸脫氫酶過表達 有關的披露內容同樣引入作為參考并形成本發(fā)明公開內容的一部分。進一步優(yōu)選本發(fā)明的遺傳修飾的細胞形成P -丙氨酸和oc-丙氨酸 的重量比為至少2:1，特別優(yōu)選至少3: 1和進一步優(yōu)選至少4: 1。形成 P-丙氨酸和cx-丙氨酸的重量比為至少2: 1意思指其中細胞在37°C, 29 小時的時間段內形成，優(yōu)選形成和釋放到圍繞該細胞的營養(yǎng)培養(yǎng)基的P -丙氨酸是oc -丙氨酸的至少兩倍。就此而論特別優(yōu)選本發(fā)明的細胞-增加谷氨酸脫氫酶(EC 1.4. 1.4)活性，和 -增加丙酮酸羧化酶(EC 6.4. l.l)活性，和 -增加天冬氨酸脫羧酶(EC 4. 1. 1. ll)活性，和 -減低葡糖-6-磷酸異構酶(EC 5. 3. 1.9)活性。本發(fā)明特別涉及遺傳修飾的細胞，其顯示出 增加丙酮酸羧化酶(EC 6.4. l.l)活性，優(yōu)選通過"/30Ke/(Ohnishi等人,Appl ied Microbiology and Biotechnology 58: 217-223 (2002))中所述的突變體表達，和天冬氨酸脫羧酶(EC4. 1. 1. ll)活性增加，優(yōu)選通過來自谷氨酸棒 桿菌的天冬氨酸脫羧酶和具有下列性能中至少一種，優(yōu)選全部性能 -增加輔酶A轉移酶(EC 2. 8. 3. l)活性， -增加P-丙氨酰-輔酶A銨裂合酶(EC 4. 3. 1. 6)活性，和 -增加3-輕丙酰-輔酶A脫水酶(EC 4. 2. 尤其是EC 4. 2. 1. 17)活性。本發(fā)明進一步特別地涉及遺傳修飾的細胞，其顯示出-磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(EC 4. 1. 1. 31)活性增加，和-天冬氨酸脫羧酶(EC4. 1. 1. ll)活性增加，優(yōu)選通過來自谷氨酸棒桿菌的天冬氨酸脫羧酶 和下列性能中至少 一種性能，優(yōu)選全部性能 -輔酶A轉移酶(EC 2. 8. 3. l)活性增加， - p-丙氨酰-輔酶A銨裂合酶(EC 4. 3. 1. 6)活性增加，和 -3-羥丙酰-輔酶A脫水酶(EC 4. 2. :i.-,尤其是EC4. 2. 1. 17)活'f生i曾力口。本發(fā)明還涉及遺傳修飾的細胞，其顯示出-丙酮酸羧化酶(EC 6. 4. 1. l)活性增加，優(yōu)選通過"Z70P^/C0廠/77e/^9c/er/〃y7; ^7〃/a歷/'c〃歷《e/70歷e(0hnishi等人，Applied Microbiology and Biotechnology 58: 217-223 (2002))中所述的變體表達，和-天冬氨酸脫羧酶(EC4. 1. 1. ll)活性增加，優(yōu)選通過來自谷 氨酸棒桿菌的天冬氨酸脫羧酶 和下列性能中至少 一種性能，優(yōu)選全部性能-P-丙氨酸-2 酮戊二酸轉氨酶(EC 2. 6. 1. 19)活性增加，和-3-羥丙酸脫氪酶(EC 1. 1. 1. 59)活性增加。本發(fā)明進一步特別地涉及遺傳修飾的細胞，其顯示出 -磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(EC 4. 1. 1. 31)活性增加和 -天冬氨酸脫羧酶(EC 4. 1. 1. ll)活性增加，優(yōu)選通過來自谷 氨酸棒桿菌的天冬氨酸脫羧酶 和下列性能中至少 一種性能，優(yōu)選全部性能-P-丙氨酸-2-酮戊二酸轉氨酶(EC2.6. 1. 19)活性增加，和 -3-羥丙酸脫氪酶(EC 1. 1. 1. 59)活性增加。 本發(fā)明還涉及遺傳修飾的細胞，其顯示出-丙酮酸羧化酶(EC 6. 4. 1. l)活性增加，優(yōu)選通過"(0hnishi等人，Applied Microbiology and Biotechnology 58:217-223 (2002))中所述的變體表達，和-天冬氨酸脫羧酶(EC4. 1. 1. ll)活性增加，優(yōu)選通過來自谷 氨酸棒桿菌的天冬氨酸脫羧酶 和下列性能中至少 一種性能，優(yōu)選全部性能-甘油-3-磷酸脫氫酶(EC 1. 1. 99. 5)活性增加，優(yōu)選通過由 glpD基因編碼的甘油-3-磷酸脫氬酶，和-甘油激酶(EC 2. 7. 1. 30)活性增加，優(yōu)選通過由glpK基因 編碼的甘油激酶，在這種情況下，優(yōu)選細胞是谷氨酸棒桿菌菌株的微生物。 對實現(xiàn)起先提及的目的作出進一步貢獻的是制備遺傳修飾的細胞 的方法，該細胞的特征在于性能C)或D)的至少 一種性能A) 該遺傳修飾的細胞能夠將P -丙氨酸輸出細胞外，B) 該遺傳修飾的細胞能夠將p-丙氨酸轉變?yōu)?-羥基丙酸， 包括該方法步驟A)和B)中的至少一個步驟，或兩個步驟C) 細胞中催化丙酮酸轉變?yōu)椴蒗Ｒ宜岬拿窫h活性增力o,或催 化磷酸烯醇丙酮酸轉變?yōu)椴蒗Ｒ宜岬拿窫, b的活性增加，和D) 細胞中催化天冬氨酸轉變?yōu)镻-丙氨酸的酶E2的活性增力口。 酶E吣Eu和E2優(yōu)選是在本發(fā)明的細胞方面中早先描述過的酶。上述酶活性增加優(yōu)選通過在本發(fā)明的細胞方面描述的基因工程方法來 實現(xiàn)，且達到在本發(fā)明的細胞方面描述的程度。作為酶E,a或E^和/或 E2活性增加的細胞優(yōu)選是在上面本發(fā)明遺傳修飾的細胞方面已經提及的 那些屬和菌林。本發(fā)明方法中特別優(yōu)選使用的細胞是棒狀桿菌屬 (Corynebacterium) 、 4豆斥干菌屬(Brevibacteriuni)、 芽月包^干菌屬 (Bacillus)、 乳斥干菌屬(Lactobaci 1 lus)、乳J求菌屬(Lactococcus) 、 4叚 絲酵母屬(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia) 、 Kluveromyces、酵母屬 (Saccharomyces)、 芽胞桿菌屬(Baci 11 us)、埃希氏菌屬(Escher ichia) 和梭菌屬(Clostridium)的細胞，其中進一步優(yōu)選Baci Uus flavum、 Bacillus lactofermentum、 大腸才干菌(Escherichia coli)、酉良酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 、 Kluveromyces lact is、 Candida blanki i 、 鈹褶假絲酵母(Candida rugosa)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) 、 Corynebacterium eff iciens和巴斯德畢赤酵母的細胞,和最優(yōu)選谷氨酸棒桿菌。本發(fā)明方法中可以使用的細胞特別選自下組 野生型菌林谷氨酸棒桿菌ATCC1 3032、醋谷棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC15806、嗜醋酸才奉才干菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870、 Corynebacterium thermoaminogenes FE詣BP-1 539、 Corynebacterium melassecola ATCC17965、黃色短桿 菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067、 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869和Brevibacterium divaricatum ATCC14020。進一步優(yōu)選已被遺傳修飾的細菌，其中酶E3至E25中至少一種酶或E^、Eu或E2中一種酶活性增加，和視需要，E26至E38中一個或多個酶的活性減低。在這些遺傳修飾的細胞當中，特別優(yōu)選菌抹谷氨酸才奉 桿菌ATCC13032 DM1727 (Georgi等人，Metabolic Engineering 7 : 291-301 (2005)),其具有在458位氨基酸突變的外源丙酮酸羧化酶(脯 氛酉臾凈皮絲氛酸取4義,參見"力"0Ke/ /7 ef力oQ^/c^/ e/z^/oy/^gZ-//i7/2e-/7rofl^c//^鼎/^W (0hnishi等人，Appl ied Microbiology and Biotechnology 58: 217—223 (2002))。能夠將P -丙氨酸輸出細胞外(因此滿足條件C))的細胞優(yōu)選是與 其野生型相比，顯示出丙氨酸從細胞流出增加的那些細胞，優(yōu)選增 加至少10%，特別優(yōu)選至少25%,進一步優(yōu)選至少50%，進一步甚至更優(yōu) 選至少75%,進一步優(yōu)選至少100%和最優(yōu)選至少500%,最大限度優(yōu)選 5000%,特別優(yōu)選2500%,其中這種流出增加優(yōu)選是通過催化P-丙氨酸 從細胞流出的酶活性增加而成為可能。能夠將P-丙氨酸轉變?yōu)?-羥基 丙酸(因此滿足條件D))的細胞特別是在本發(fā)明細胞方面中使描述的酶 E3至E6中至少一種酶，優(yōu)選所有酶活性增加的那些細月包，或在本發(fā)明細 胞方面中使描述的酶E 7和E 8中至少 一 種酶，優(yōu)選兩種酶活性增加的細 胞。根據本發(fā)明的制備遺傳修飾細胞的方法進一步優(yōu)選還包括該方法 的另外步驟，例如增加在本發(fā)明細胞方面描述的酶E,至En中一種或多 種酶的活性增加，或在本發(fā)明細胞方面描述的酶￡28至E4。的活性減低。對實現(xiàn)起先提及的目的作出貢獻的是，通過如上所述方法可獲得 的遺傳修飾細胞。這些細胞單獨或與其他細胞聯(lián)合能夠從碳水化合物或 從甘油形成3-羥基丙酸。對實現(xiàn)起先提及的目的作出進一步貢獻的是，制備3-羥基丙酸的 方法，包括下列方法步驟i)在從碳水化合物或甘油形成P -丙氨酸和P -丙氨酸至少部 分地從細胞到達營養(yǎng)培養(yǎng)基的條件下，使具有性能C)或C)的本發(fā) 明的遺傳修飾細胞接觸含有碳水化合物或甘油的營養(yǎng)培養(yǎng)基，從 而獲得含P -丙氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基，i i)使含P -丙氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基接觸能夠吸收P -丙氨酸 并將其轉變?yōu)?-羥基丙酸的另外的細胞。能夠吸收P -丙氨酸并將其轉變?yōu)?-羥基丙酸的細胞特別優(yōu)選是優(yōu) 選與其野生型相比，酶E3至E6中至少一種，優(yōu)選所有酶活性增加或酶 E，和E8中至少一種酶，優(yōu)選兩個酶活性增加的那些細J包。例如W0-A 02/42418和W0-A 03/62173中描述了這種細胞。進一步特別優(yōu)選除了這 些酶活性增加之外，還使P -丙氨酸運輸或流出細胞增加的酶活性增加 的細胞。就此而論，特別優(yōu)選的是GABA運輸蛋白GAT-2和由cycA基因 編碼和在Schneider等人，(Appl. Microbiol. Biotechnol. 65: 576-582 (2004))中描述的運輸系統(tǒng)。為了制備P-丙氨酸，可以在方法步驟i)中連續(xù)或不連續(xù)地，以 批次法或分批給料法或分批重復給料法使本發(fā)明的遺傳修飾細胞與營 養(yǎng)培養(yǎng)基接觸并進行培養(yǎng)。還可想到GB-A 1 009370中描述的半連續(xù)法。 Chmiel在教牙牛書("^/0;7rc^e5^fec力/7/A入 _57/7尸ii'力rw/ g 7'" d/e j9/c^er尸a/ /"e/^fec力/ /f (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) 或Storhas在教牙牛書 ("^/oreai:f ore/ z// ^//7e/v'p力ere j57刀r/c力f w/2ge"，，, Vieweg Verlag， Brimswick/Wiesbaden， 1994)中描述了已知培養(yǎng)方法 的概述。待使用的培養(yǎng)基必須以適當方式滿足各個菌林的要求。手冊 "#a/2wa/ 0//or (7e/ era/ ^gc/er/o/c^/" of the American Society for Bacteriology (Washington D. C. ， USA, 1981)中有各種 微生物的培養(yǎng)基的描述。作為碳源可以使用糖和碳水化合物作為培養(yǎng)基，例如葡萄糖、蔗 糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉和纖維素、油類和脂肪例如豆油、 葵花油、花生油和椰子脂，脂肪酸例如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸，醇例 如甘油和乙醇，和有才幾酸例如乙酸。這些物質可以單獨或以混合物形式使用。特別優(yōu)選使用碳水化合物，尤其是單糖、低聚糖或多糖，如us6， 01， 494和US 6，136，576所述，「糖或甘油?？梢允褂孟铝形镔|作為氮源含氮的有機化合物，如胨、酵母膏、 肉浸膏、麥芽膏、玉米漿、大豆粉和尿素，或無機化合物，如硫酸銨、 氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。氮源可以單獨或以混合物形式使用?？梢允褂昧姿?、-舞酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，或相應的含鈉鹽作為 磷源。該培養(yǎng)基應該另外包含金屬鹽，例如硫酸鎂或硫酸鐵，這是生長 所需的。最后，除了上述物質，可以使用必需的生長促進劑如氨基酸和 維生素。此外，可能向培養(yǎng)基中添加適當的前體物質。所述起始材料可 以以單批次方式添加到培養(yǎng)物中或者在培養(yǎng)期間以合適的方式供入。使用堿性化合物，如碳酸(氫)鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨 水，或酸性化合物，如磷酸或硫酸以適當方式控制培養(yǎng)物的pH。產生泡 沫可以使用消泡劑，例如脂肪酸聚乙二醇酯來控制。質粒的穩(wěn)定性可以 通過向培養(yǎng)基中添加適當選擇性作用的物質來保持，例如抗生素。為了 保持需氧條件，將氧氣或含氧氣體混合物，例如空氣引入培養(yǎng)中。培養(yǎng) 溫度通常是2(TC至45°C,優(yōu)選"。C至卩(TC。尤其是使用能夠以甘油作 為底物進行轉變的細胞時，可以優(yōu)選使用如US 6, 803, 218中所述的那 些細胞作為細胞，和優(yōu)選這些細胞中的酶E,a或E,b和/或EJ和，視需要， 還有酶E3至EJ的活性增加。在這種情況下，細胞可以在范圍40至100 。C的溫度下培養(yǎng)。同時，隨著P-丙氨酸的形成或從該方法步驟中分離出P -丙氨酸， 使含P -丙氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基接觸能夠吸收P -丙氨酸并將其轉變?yōu)?-羥基丙酸的另外的細胞。其中，本發(fā)明細胞可以和另外的細胞在營養(yǎng)培 養(yǎng)基中一起培養(yǎng)，使得本發(fā)明細胞釋放的丙氨酸幾乎以新生狀態(tài)4皮 另外的細胞吸收并轉變?yōu)?-羥基丙酸。然而，還想到首先形成含p-丙氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基，從該營養(yǎng)培養(yǎng) 基中除去本發(fā)明的細胞，然后僅使含P -丙氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基接觸另外 的細胞。不過特別優(yōu)選本發(fā)明細胞和另外的細胞同時培養(yǎng)。本發(fā)明制備3-羥基丙酸的方法還可以包括該方法的另外步驟 iii)從營養(yǎng)培養(yǎng)基中純化最終獲得的3-羥基丙酸?？梢杂帽绢I域技術人 員已知的任何純化方法進行這種純化。因而為了分離出細胞，可以使用 例如沉淀、過濾或離心法。可以通過從無細胞的含3-羥基丙酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基中提取、蒸餾、離子交換、電滲析或結晶而分離3-羥基丙酸。在本發(fā)明方法的一個特定實施方案中，連續(xù)從培養(yǎng)液中純化3-羥 基丙酸，就此而論，進一步優(yōu)選也連續(xù)進行發(fā)酵，使得進料物酶促轉變形成3-羥基丙酸，直至從營養(yǎng)培養(yǎng)基中純化3-羥基丙酸的全過程可以 連續(xù)進行。為從營養(yǎng)培養(yǎng)基中連續(xù)純化3-羥基丙酸，物質連續(xù)通過用于 除去發(fā)酵中所用細胞的裝置，優(yōu)選通過排阻尺寸范圍在20至200kDa的 過濾器，在其中進行固/液分離。還可想到使用離心機，適當的沉淀裝 置或這些裝置的組合，特別優(yōu)選最初通過沉淀分離出至少一部分細胞， 隨后將已部分無細胞的營養(yǎng)培養(yǎng)基添加到超濾或離心裝置。3-羥基丙酸含量被富集的發(fā)酵產物在分離掉細胞后優(yōu)選通過多級 分離裝置。在這個分離裝置中，提供了多個先后進行的分離階段，從每 一階段回流管流出并返回到第二個發(fā)酵罐。此外，從各個分離階段引出 排出管。各個分離階段可以根據電滲析、反滲透、超濾或納米過濾原則運作。通常，在各個分離階段涉及膜分離裝置。各個分離階段的選擇取 決于發(fā)酵副產物和底物殘渣的性質和程度。除了通過電滲析、反滲透、超濾或納米過濾分離出3-羥基丙酸(在 這種過程中得到含水的3-羥基丙酸溶液作為最終產物)之外，也可以通 過從無細胞的培營養(yǎng)養(yǎng)基提取的方法分離出3-羥基丙酸，在這種情況下 可以最終獲得純的3-羥基丙酸。向3-輕基丙酸以銨鹽形式存在的營養(yǎng) 培養(yǎng)基中添加例如高沸點有機胺可以通過提取法分離出3-羥基丙酸。然 后加熱這樣獲得的混合物，在此過程中，氨和水揮發(fā)，3-羥基丙酸被才是 取進入有機相。這個方法被稱為鹽分離(Salt-Splitting),在W0-A 02/090312中可找到，其中關于從營養(yǎng)培養(yǎng)基中分離出3-羥基丙酸的公 開內容在此引入作為參考并形成本申請公開的一部分。對實現(xiàn)起先提及的目的作出貢獻還有制備3-羥基丙酸的方法，包 括方法步驟在從碳水化合物或甘油形成3-羥基丙酸的條件下，使具有 性能d)或D)的本發(fā)明細胞接觸含碳水化合物或甘油的營養(yǎng)培養(yǎng)基。以 基本上與如上所述制備3-羥基丙酸相同的方法進行培養(yǎng)，盡管在這種情 況下使用能夠將P -丙氨酸轉變?yōu)?-羥基丙酸的本發(fā)明的遺傳修飾細 胞。起先已經詳細描述了能夠如此的本發(fā)明細胞。這個制備3-羥基丙酸的方法還可以包括該方法的另外步驟從營 養(yǎng)培養(yǎng)基中純化3-羥基丙酸。對實現(xiàn)起先提及的目的作為進一步貢獻的是制備丙烯酸的方法， 包括下列方法步驟I) 通過如上所述方法制備3-羥基丙酸，視需要繼之以一個或 多個純化步驟，II) 3-羥基丙酸脫水形成丙烯酸。3-羥基丙酸的脫水原則上可以在液相或氣相中進行，優(yōu)選液相脫 水。根據本發(fā)明進一步優(yōu)選在催化劑存在下進行脫水，所用催化劑的類 型取決于進行的是氣相還是液相反應。適當的脫水催化劑既可以是酸性 催化劑，也可以是堿性催化劑。特別優(yōu)選酸性催化劑，因為其形成低聚劑使用?？诿撍?，獲得含丙i酸的相f視需要可以通i進一步的純化步 驟進行純化，尤其是通過蒸鎦法、提取法或結晶法，或通過這些方法的 組合。對實現(xiàn)起先提及的目的作出進一步貢獻的是制備聚丙烯酸酯的方 法，包括下列方法步驟I) 通過如上所述方法之一制備3-羥基丙酸，視需要繼之以一 個或多個純化步驟，II) 通過如上所述方法將3-羥基丙酸脫水形成丙烯酸，視 需要繼之以一個或多個純化步驟，III) 丙烯酸的自由基聚合。丙烯酸的自由基聚合通過本領域技術人員已知的聚合方法進行， 既可以在乳液或懸液也可以在水溶液中進行。另外在聚合過程中可存在 共聚單體，尤其是交聯(lián)劑。特別優(yōu)選在交聯(lián)劑存在下，以至少部分中和 形式對該方法步驟II)獲得的丙烯酸進行自由基聚合。這種聚合產生水 凝膠，該水凝膠然后可以被粉碎、研磨，和視需要被表面改性，特別是 交聯(lián)后表面改性。這樣獲得的聚合物特別適于用作衛(wèi)生用品中的超級吸 收劑，例如尿布或衛(wèi)生巾。對實現(xiàn)起先提及的目的作出進一步貢獻的是制備丙烯酸酯的方 法，包括下列方法步驟I) 通過如上所述方法之一制備3-羥基丙酸，視需要繼之以一 個或多個純化步驟，II) 通過如上所述方法將3-羥基丙酸脫水形成丙烯酸， 一見需要繼之以一個或多個純化步驟， III)丙烯酸的酯化。丙烯酸的酯化通過本領域技術人員已知的酯化方法進行，特別優(yōu)選使該方法步驟n)獲得的丙烯酸接觸醇，優(yōu)選甲醇、乙醇、i-丙醇、2-丙醇、正丁醇、叔丁醇或異丁醇，和加熱至至少5(TC的溫度，特別優(yōu) 選至少10(TC的溫度。視需要，可以添加適當的分離助劑通過共沸蒸餾 從反應混合物中除去酯化過程中形成的水。對實現(xiàn)起先提及的目的作出進一步貢獻的是相對于其野生型被遺 傳修飾并顯示出性能a)和b)中至少一種性能，優(yōu)選兩種性能的細胞用 于制備3-羥基丙酸的用途a) 與其野生型相比，酶的活性增加優(yōu)選至少10%,特別優(yōu)選 至少25%,進一步優(yōu)選至少50%,進一步更優(yōu)選至少75%,進一步 優(yōu)選至少100%和最優(yōu)選至少500%,最大限度優(yōu)選直至5000%，特 別優(yōu)選直至2500°/。，所述酶是催化丙酮酸轉變?yōu)椴蒗Ｒ宜岬拿窫,a, 或催化磷酸烯醇丙酮酸轉變?yōu)椴蒗Ｒ宜岬拿窫lb,但是優(yōu)選催化丙 酮酸轉變?yōu)椴蒗Ｒ宜岬拿窫,a,b) 與其野生型相比，催化天冬氨酸轉變?yōu)镻-丙氨酸的酶E2 的活性增加優(yōu)選至少10%,特別優(yōu)選至少25%,進一步優(yōu)選至少50%, 進一步更優(yōu)選至少75%，進一步優(yōu)選至少100%和最優(yōu)選至少500%， 最大限度優(yōu)選直至5000%,特別優(yōu)選直至2500°/?！，F(xiàn)在通過非限制性附圖和實施例更詳細地解釋本發(fā)明。

圖1顯示了從葡萄糖或甘油經由丙酮酸、草酰乙酸和天冬氨酸形 成P-丙氨酸的反應圖解。圖2顯示了從P-丙氨酸經由P-丙氨酰-輔酶A、丙烯酰-輔酶A 和3-羥丙酰-輔酶A或經由丙二酸半醛形成3-羥基丙酸的反應圖解。 圖3顯示了質粒載體pVWexl-panD。圖4顯示了質粒載體pVWexl-glpKDB.c。 圖5顯示了質粒載體pVWexl-panD-glPKDEc.。 實施例制備表達異源基因glpK、 glpD和同源基因pyc和panD的谷氨酸 棒桿菌菌林的遺傳修飾細胞。步驟如下使用的起始菌林是野生型菌株ATCC1 3032 (保藏在不倫瑞克的Deutsche Sammlimg von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, 保藏號DSM 20300)和DM1 727菌林。Georgi等人(Metabolic Engineering 7: 291-301 (2005))描述了 DM1727菌抹,它代表遺傳修 飾的谷氨酸棒桿菌菌抹，相對于野生型菌抹，其顯示出丙酮酸羧化酶活 性增加。這種酶增加活性可歸因于第458位的氨基酸突變(脯氨酸被絲 氨酸替換)。關于這點，還參見"A novel methodology employing Corynebacterium glutamicum genome information to generate a new L-lys ine-producing mutant"(0hnishi等人，Appl ied Microbiology and Biotechnology 58: 217-223 (2002))。1. 質粒載體的制備 首先，合成下列兩個PCR引物(被下劃線的核苷酸對應于大腸桿菌 MG1655基因組(Genom)中的堿基對(GenBank參照序列NC 00091 3 ,096),切割位點被加粗):glpKrev: 5， TCTAGAITATTCGTCGTGTTCTTCCCACGCC(SEQ. ID NO. 2)(被下劃線的核苷酸對應于MG1655基因組中 的堿基對4113737，和切割位點對應于Xbal切割位點) glpKf。r: 5,GGGACGTCGACX^WW7>/7^^TGACTGAAAAAAAATATATC (SEQ. ID NO. 3)(被下劃線的核苷酸對應于MG1655基因組中的堿基 對41 15245，和切割位點對應于Sail切割位點)引物對應于大腸桿菌glpK基因的堿基411 3737至411 3762和 4115225至4115245?？梢杂眠@些引物，借助Innis等人(PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990， Academic Press)關于 非簡并、同源引物的標準方法通過PCR擴增如Eikmanns等人 (Microbiology, 140 : 1817-1828 (1994))所述分離的大腸桿菌染色體 DNA的1533個堿基對的片段。這個PCR片段克隆入質粒載體pGEM-T (Promega Corporation, Madison, Wisconsin, USA)，獲得質粒載體pGEM-T-glpKE.c.。隨后，合成下列兩個PCR I物(被下劃線的核苷酸對應于大腸桿菌 MG1655基因組中的石威基對，切割位點凈皮加粗和斜體字區(qū)域標記核糖體結glpDf : 5， TCTAGA/^6Y^6^7^7^^TGGAAACCAAAGATCTG (SEQ. ID NO. 4)(被下劃線的核苷酸對應于MG1655基因組中的堿基 對356GQ36,和切割位點對應于Xbal切割位點)glpDrev:5， GTTAATTCTAGAITACGACGCCAGCGATAA (SEQ. ID NO. 5)(被下劃線的核普酸對應于MG1655基因組中的堿基 對3561541，和切割位點對應于Xbal切割位點)引物對應于大腸桿菌plpD基因的堿基3560036至3560053和 3561524至3561541 。用這些引物，可以采用Innis等人(PCR protocol s, A guide to methods and applications, 1990, Academic Press)關于 非簡并、同源引物的標準方法通過PCR擴增如Eikmanns等人 (Microbiology, 140 : 1817-1828 (1994))所述分離的大腸桿菌染色體 DM的1524個堿基的片段。這個PCR片l更克隆入質粒載體pGEM-T (Promega Corporation, Madison, Wisconsin, USA),獲得質粒載體pGEM-T-glpDBc.。然后用Xball把1524個堿基對片段從質粒載體pGEM-T glpDEc. 中切下來并克隆入已用Spel-SAP (SAP-蝦石咸性磷酸酶(Shrimp Alkaline phosphatase))切割的質粒載體pGEM-T-glpKB.。.，以產生質粒載體 pGEM-T-glpKDE.c.。然后用Sail將glpKDu.片段切下來并克隆入用Sail 切割的質粒載體pVWExl (Peters-Wendisch等人，Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology 3: 295-300 (2001)描述了這個表達 質粒)，獲得質粒載體pVWExl-glpKDE.c.。隨后，合成下列兩個PCR引物(被下劃線的核苷酸對應于谷氨酸棒 桿菌基因組(NC003450)中的石咸基對，切割位點;故加粗和斜體字區(qū)域標記 核糖體結合位點)NCgl0133f。r: 5， GGACACTAGTAAGGAGATATAG丄TGCTGCGCACCATCC丁C (SEQ. ID NO. 6)(被下劃線的核苦酸對應于谷氨酸棒桿 菌基因組中的堿基對145570,和切割位點對應于Spel 切割位點)NCgl0133， 5， CTAAAACGGGTACCCTAAATGCTTCTCGACGTC(SEQ. ID NO. 7)(被下劃線的核苷酸對應于谷氨酸棒桿 菌基因組中的堿基對147980,和切割位點對應于Kpnl 切割位點)引物對應于谷氨酸棒桿菌panD基因的堿基M7570至147588和 147964至147980。用這些引物可以采用Innis等人(PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press)關于非 簡并、同源引物的標準方法通過PCR擴增如Eikmanns等人 (Microbiology, 140 : 1817-1828 (1994))所述分離的谷氨酸棒桿菌染 色體DNA的大約430個堿基對的片段。這個PCR片段克隆入質粒載體pGEM-T (Promega Corporation, Madison, Wisconsin, USA),獲得質粒載體pGEM-T-panD。然后使用Spel和Kpnl將panD片段從pGEM-T-panD中切下來并克 隆入已用Xbal和Kpnl切割的質粒載體pVWExl,獲得質粒載體 pVWExl-panD。此外，用spel和Kpnl從pGEM-T-pand中切下來的panD 片段克隆入Xbal和Kpnl切割的質粒載體pVWEx卜glpKDE.。.，獲得質粒載 體pVWExl-panD-glpKDE.c. (SEQ. ID NO. 1)。圖3至5中顯示了質粒載體pVWExl-panD、 pVWExl-glpKDu.和 pVWExl-panD-glpKDEc. (SEQ. ID NO, 1)。2. 細胞的轉化表達質粒pVWExl、 pVWExl-panDc.。 pVWExl-glpKDEc> pVWExl-glpKDE.c.panDc.s.通過電穿孔(按照van der Rest等人,Appl. Microbiol. Biotechnol, 52: 54H45 (1999))導入起先提及的起始菌林中。3. 細胞的培養(yǎng)用葡萄糖作為碳源用這些質粒轉化的菌林在Georgi等人(Metabolic Engineering 7: 291-301 (2005))和Marx等(US 6， 355， 454)描述的CGXII培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 該培養(yǎng)基含有40 g/kg葡萄糖。通過HPLC檢測cx或p-丙氨酸的濃度。Georgi等人(MetabolicEngineering 7: 291-301 (2005))和Marx等人(US 6， 355， 454)描述了 該方法。使用適當的標準鑒定oc-丙氨酸或p-丙氨酸信號。細胞培養(yǎng)29小時后，測定營養(yǎng)培養(yǎng)基中a-丙氨酸和p-丙氨酸的 濃度如下谷氨酸棒桿菌菌林oc-丙氨酸B-丙氨酸ATCC13032 (pVWExl)2 0. 4 mM< 1 mMATCC1 3032 (pVWExl-panD")15. 5 mM2 3. 9 mM薩1727 (pVWExl-panD")5. 0 mM18. 6 mM3.2.用甘油作為碳源用這些質粒轉化的菌林在Georgi等人(Metabolic Engineering 7: 291-301 (2005))和Marx等人(US 6, 355, 454)描述的CGXII培養(yǎng)基中 培養(yǎng)。該培養(yǎng)基含有9 g/kg甘油。通過HPLC檢測oc-或P -丙氨酸的濃度。Georgi等人(Metabolic Engineering 7: 291-301 (2005))和Marx等人(US 6, 355, 454)描述了該 方法。使用適當的標準筌定oc-丙氨酸或p-丙氨酸信號。細胞培養(yǎng)24小時后，測定營養(yǎng)培養(yǎng)基中a-丙氨酸和P -丙氨酸的 濃度如下谷氨酸棒桿菌菌林ot -丙氨酸P-丙氨酸ATCC1 3032 (pVWBxl-glpKDE.c.)2. 8 mM< 1 mMATCC13032 (pVWExl-glpKDE.c.panDc.s.)3 mM0. 5 mM畫7 2 7 (p兩x 1 -g 1 pKDE. c. panDc. g.)0. 4 mM0. 5幽
權利要求
1. 一種細胞，相對于其野生型被遺傳修飾并具有性能a)或b)至少一種a)與其野生型相比，催化丙酮酸轉變?yōu)椴蒗Ｒ宜岬拿窫1a、或催化磷酸烯醇丙酮酸轉變?yōu)椴蒗Ｒ宜岬拿窫1b的活性增加，b)與其野生型相比，催化天冬氨酸轉變?yōu)棣?丙氨酸的酶E2的活性增加，其中，除性能a)或b)之外，該細胞的特征為性能c)或d)的至少一種c)該遺傳修飾的細胞能夠將β-丙氨酸輸出細胞外；d)該遺傳修飾的細胞能夠將β-丙氨酸轉變?yōu)?-羥基丙酸。
2. 權利要求l的細胞，其中酶Ei是丙酮酸羧化酶。
3. 權利要求1或2的細胞，其中酶E,的活性增加是通過野生型 細胞的丙酮酸羧化酶基因的突變實現(xiàn)的。
4. 前述權利要求之一的細胞，其中酶E2是天冬氨酸脫羧酶。
5. 前述權利要求之一的細胞，其具有性能d),其中，與其野生 型相比，該細胞具有下列酶E3至E6中至少一種酶的活性增加-催化p-丙氨酸轉變?yōu)镻-丙氨酰-輔酶A的酶E3， -催化p-丙氨酰-輔酶A轉變?yōu)楸?輔酶A的酶E4， - 催化丙烯酰-輔酶A轉變?yōu)?-羥丙酰-輔酶A的酶Es, -催化3-羥丙酰-輔酶A轉變?yōu)?-羥基丙酸的酶E"
6. 權利要求5的細胞，其中酶E3是輔酶A轉移酶或輔酶A合成酶， E4是P-丙氨酰-輔酶A銨裂合酶， E5是3-羥丙酰-輔酶A脫水酶，和E6是輔酶A轉移酶、3-羥丙酰-輔酶A水解酶或3-羥丁酰-輔 酶A水解酶。
7. 權利要求1至4之一的細胞，其具有性能d),其中，與其野 生型相比，該細胞具有下列酶E,和Es中至少一種酶的活性增加-催化P-丙氨酸轉變?yōu)楸岚肴┑拿窫7， -催化丙二酸半醛轉變?yōu)?-羥基丙酸的酶Es。
8.權利要求7的細^^其中酶E7是P-丙氨酸-2-酮戊二酸轉氨酶，和 E8是3-羥丙酰脫氫酶或3-羥丁酸脫氫酶。
9. 前述權利要求之一的細胞，其中，與其野生型相比，該細月包具 有降低的葡糖磷酸異構酶活性。
10. —種制備遺傳修飾的細胞的方法，該細胞的特征為具有性能 C)或D)中的至少一種:A) 該遺傳修飾的細胞能夠將P -丙氨酸輸出細胞外，B) 該遺傳修飾的細胞能夠將p-丙氨酸轉變?yōu)?-羥基丙酸， 包括方法步驟A)和B)中的至少一個步驟，優(yōu)選兩個步驟A) 增加細胞中催化丙酮酸轉變?yōu)椴蒗Ｒ宜岬拿窫la或催化磷 酸烯醇丙酮酸轉變?yōu)椴蒗Ｒ宜岬拿窫a的活性，或B) 增加細胞中催化天冬氨酸轉變?yōu)閨3-丙氨酸的酶E2的活性。
11. 權利要求10的方法，其中酶E^是丙酮酸羧化酶，酶E,b是磷 酸烯醇丙酮酸羧化酶。
12. 權利要求IO或11的方法，其中酶E2是天冬氨酸脫羧酶。
13. 可由權利要求10至12之一的方法獲得的細胞。
14. 一種制備3-羥基丙酸的方法，包括下列方法步驟i)在由碳水化合物或甘油形成P -丙氨酸并且P -丙氨酸至少 部分地從細胞到達營養(yǎng)培養(yǎng)基的條件下，使具有性能c)的權利要 求1至9或13之一的細胞接觸含有所述碳水化合物或甘油的營養(yǎng) 培養(yǎng)基，從而獲得含P-丙氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基，i i)使含P -丙氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基接觸能夠吸收P -丙氨酸 并將其轉變?yōu)?-羥基丙酸的另外的細胞。
15. —種制備3-羥基丙酸的方法，包括下列方法步驟在由碳水 化合物或甘油形成3-羥基丙酸的條件下，使具有性能d)的權利要求1 至9或13之一的細胞接觸所述含有所述碳水化合物或甘油的營養(yǎng)培養(yǎng) 基。
16. —種制備丙烯酸的方法，包括下列方法步驟I) 用權利要求14或15的方法制備3-羥基丙酸，II) 3-羥基丙酸脫水形成丙烯酸。
17. —種制備聚丙烯酸酯的方法，包括下列方法步驟 I)用權利要求14或15的方法制備3-羥基丙酸，II) 3-羥基丙酸脫水形成丙烯酸，III) 丙烯酸的自由基聚合。
18. —種制備丙烯酸酯的方法，包括下列方法步驟I) 用權利要求15或16的方法制備3-羥基丙酸，II) 3-羥基丙酸脫水形成丙烯酸，III) 丙烯酸的酯化。
19. 一種相對于其野生型被遺傳修飾并具有性能a)或b)中至少一 種性能的細胞用于制備3-羥基丙酸的用途a) 與其野生型相比，催化丙酮酸轉變?yōu)椴蒗Ｒ宜岬拿窫吣或 催化磷酸烯醇丙酮酸轉變?yōu)椴蒗Ｒ宜岬拿窫lb的活性增加，b) 與其野生型相比，催化天冬氨酸轉變?yōu)镻-丙氨酸的酶E2 的活性增加。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種細胞，該細胞相對于其野生型被遺傳修飾并具有性能a)或b)中的至少一種性能a)與其野生型相比，催化丙酮酸轉變?yōu)椴蒗Ｒ宜岬拿窫₁、或催化磷酸烯醇丙酮酸轉變?yōu)椴蒗Ｒ宜岬拿窫_1b的活性增加，b)與其野生型相比，催化天冬氨酸轉變?yōu)棣?丙氨酸的酶E₂的活性增加，其中，除性能a)或b)之外，該細胞的特征為性能c)或d)的至少一種性能c)該遺傳修飾的細胞能夠將β-丙氨酸輸出細胞外，d)該遺傳修飾的細胞能夠將β-丙氨酸轉變?yōu)?-羥基丙酸。本發(fā)明還涉及制備遺傳修飾的細胞的方法，可用這種方法獲得的遺傳修飾的細胞，制備3-羥基丙酸的方法，制備丙烯酸的方法，制備聚丙烯酸酯的方法、制備丙烯酸酯的方法和該細胞用于制備3-羥基丙酸的用途。
文檔編號C12P7/40GK101283095SQ200680037690
公開日2008年10月8日 申請日期2006年10月9日 優(yōu)先權日2005年10月10日
發(fā)明者A·馬克斯, D·里特曼, S·巴克霍爾茨, V·F·溫迪什 申請人:贏創(chuàng)德固賽有限責任公司