專利名稱：：診斷血栓栓塞病和冠心病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及在體外診斷血栓栓塞病和/或冠心病的方法，其中對(duì)個(gè)體樣品中編碼人EGLN2蛋白質(zhì)的核酸在470位的核苷酸或人EGLN2蛋白質(zhì)在58位的M酸進(jìn)行檢測(cè)。
背景技術(shù)：
：EGLN2，由于其的HIF脯氨酰羥化酶活性，也稱作含有脯氨酰羥化酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)1(PHD1)，其屬于具有由5個(gè)編碼外顯子組成的保守基因組結(jié)構(gòu)的Egl畫Mne基因家族的一組密切相關(guān)蛋白質(zhì)。HIF(hypoxia-induciblefactor,缺氧誘導(dǎo)因子)是在氧穩(wěn)態(tài)的許多方面發(fā)揮關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，但EGLN同種型EGLN1(PHD1)、EGLN2(PHD2)和EGLN3(PHD"在HIF的生理調(diào)節(jié)上所起的作用仍然不明確(Appelhoff,R.J.等人(2004)J.Biol.Chem.，222，38458-38465，No.37)。已報(bào)道，所有EGLN同種型都表現(xiàn)出不同的細(xì)胞特異性和可誘導(dǎo)性行為，這使得可以靈活地調(diào)節(jié)HIF對(duì)缺氧的反應(yīng)。這意味著，對(duì)特定EGLN同種型的特異藥理學(xué)抑制作用可能可以選擇性地調(diào)節(jié)HIF反應(yīng)，這在治療應(yīng)用中將是有用的(Appelhoff,R.J.等人(2004)，見上文)。例如，對(duì)EGLN2的抑制作用廣泛地在一系列處于靜息狀態(tài)的細(xì)胞類型中激活HIF反應(yīng)。相反，對(duì)EGLN3的特異抑制作用選擇性地在高水平表達(dá)該酶的一些組織中增強(qiáng)對(duì)缺氧的反應(yīng)(Appelhoff,R.J.等人(2004),見上文)。這開啟了治療局部缺血性/缺氧性疾病的可能性。與EGLN2和EGLN3相反地，對(duì)EGLN1的生理作用知道得不多
發(fā)明內(nèi)容為了更好地理解EGLN2在冠心病發(fā)生和發(fā)展中的潛在作用，就EGLN2基因在根據(jù)本發(fā)明以索引號(hào)NM一053046.2發(fā)表的EGLN2參考序列的470位的變異，對(duì)一組詳細(xì)表征的患者進(jìn)行了基因型-表型相關(guān)性分析。已經(jīng)已知SNP(單核普酸多態(tài)性)形式的EGLN2基因的不同遺傳變體，并發(fā)表在http:〃www.ncbi.iilm.iiih.gov/SNP/snDref,cgilocusId=112398。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，編碼人EGLN2蛋白質(zhì)的核酸在470位核苷酸的變異、尤其是從胞嘧啶變?yōu)樾叵汆奏?、或者人EGLN2蛋白質(zhì)在58位氨基酸的變異、尤其是從絲氨酸變?yōu)榱涟彼?，與血栓栓塞病和/或冠心病的發(fā)生相關(guān)。因此，本發(fā)明的一個(gè)主題涉及在體外或體內(nèi)診斷血栓栓塞病和/或冠心病，其中對(duì)個(gè)體或患者樣品中編碼人EGLN2蛋白質(zhì)的核酸的470位核苷酸或人EGLN2蛋白質(zhì)的58位氨基酸進(jìn)行確定。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述血栓栓塞病是中風(fēng)、長(zhǎng)期的可逆小生局部缺血性神經(jīng)功能缺損(PRIND，prolongedreversibleischemicneurologicaldeficit)和/或短暫小生局部缺血發(fā)作(transientischemicattach,TIA)，而所述冠心病是心肌梗塞。具體地，如果470位的核苷酸在染色體DNA中被確定為是胸腺嘧咬或在mRNA中被確定為是尿嘧啶或者58位的M酸被確定為是亮氨酸，那么存在更高的中風(fēng)、PRIND和/或TIA的風(fēng)險(xiǎn)。然而，如果470位的核苷酸被確定為;0&嘧啶或58位的M酸被確定為是絲氨酸，那么存在更高的'。肌梗塞、尤其是早發(fā)'性心、W^塞(prematuremyocardialinfarction)的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"EGLN2-C470C"指的是一組在編碼EGLN2的基因的兩個(gè)等位基因上在參考序列NM—053046.2的470位具有胞嘧咬(導(dǎo)致相應(yīng)蛋白質(zhì)58位的氨基酸為絲氨酸)的人。這些人就該EGLN2變體而言是純合的。相應(yīng)地，術(shù)語(yǔ)"EGLN2-C470T"指的是一組在編碼EGLN2的基因的一個(gè)等位基因上具有導(dǎo)致相應(yīng)蛋白質(zhì)58位為絲氨酸的胞嘧啶、并在編碼EGLN2的基因的另一等位基因上具有導(dǎo)致相應(yīng)蛋白質(zhì)58位為亮氨酸的胸腺嘧啶的人。這些人就該EGLN2變體而言是雜合的。編碼人EGLN2蛋白質(zhì)的參考序列的核酸序列優(yōu)選具有SEQIDNO:1的核酸序列，并JLAEGLN2蛋白質(zhì)的^J^酸序列優(yōu)選具有SEQIDNO:2的^J^^列。然而，本發(fā)明也包括人EGLN2的其它變體和其非人同系物，例如其它哺乳動(dòng)物EGLN2同系物、或來(lái)自秀麗隱桿線蟲(Caenorhabdidiselegans)、小鼠或大鼠的EGLN2同系物，條件是在對(duì)應(yīng)于所述參考序列的470位的位置存在自胞嘧啶向胸腺嘧啶的核苷酸交換、和/或在對(duì)應(yīng)于所述參考序列58位的位置存在自絲氨酸到亮氨酸的氨基酸交換、并且進(jìn)一步地該相應(yīng)蛋白質(zhì)具有脯氨酰羥化酶活性、尤其是HIF脯氨酰羥化酶活性。所述酶活性可以例如通過(guò)質(zhì)鐠分析或者通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的酶學(xué)試驗(yàn)來(lái)測(cè)定，其中所述質(zhì)鐠分析可以用于檢測(cè)Pro,例如HIF-la的Pro564的氧化。一般地，470位的特定核苷酸可以通過(guò)核酸測(cè)序法、核酸質(zhì)i普分析、雜交法和/或擴(kuò)增法確定。核酸測(cè)序法的實(shí)例為焦磷酸測(cè)序(pyrosequencing)和/或借助放射性和/或熒光標(biāo)記的核苷酸的測(cè)序。雜交方法的實(shí)例為Southern印跡分析、Northern印跡分析和/或在DNA-微陣列上的雜交法。擴(kuò)增法的實(shí)例為TaqMan分析、RNA差別展示分析和/或代表性的差異分析(ShiM.M.(2002)AmJPharmacogenomics"2(3),197-205;Kozian&Kirschba腿(1999)TrendsBiotechnol.，17(2)，73-8.)此外，58位的氨基酸序列可以通過(guò)測(cè)定特定蛋白質(zhì)的量的方法和/或測(cè)定特定蛋白質(zhì)的活性的方法確定。測(cè)定特定蛋白質(zhì)的量的方法的實(shí)例為Western印跡分析和/或ELISA。測(cè)定特定蛋白質(zhì)的活性的實(shí)例為體外測(cè)試試驗(yàn)和/或用人細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞進(jìn)行的體外全細(xì)胞測(cè)試試驗(yàn)，所有這些都為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。用于檢測(cè)相應(yīng)變體的樣品的實(shí)例為細(xì)胞、組織或體液、尤其是血液的細(xì)胞組分、內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞。優(yōu)選地，樣品用本領(lǐng)域^L術(shù)人員已知的常規(guī)方法預(yù)處理以《更分離和/或純化樣品中的核酸或染色體DNA或蛋白質(zhì)用于進(jìn)行進(jìn)一步的分析。在一個(gè)任選的其它步驟中，可以如實(shí)施例所述，確定個(gè)體患血栓栓塞病和/或冠心病的風(fēng)險(xiǎn)和/或年齡。在另一任選的其它步驟中，可以確定抗血栓栓塞病和/或冠心病的藥物的劑量。一般而言，在EGLN2基因中發(fā)現(xiàn)的該遺傳變異可以根據(jù)本發(fā)明用作對(duì)血栓栓塞病和/或冠心病(也稱作"心血管疾病，，)、尤其是早發(fā)性心肌梗塞、中風(fēng)、PRIND、TIA和/或冠心病進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和/或預(yù)防性治療的遺傳標(biāo)記。此外，該遺傳變異可以根據(jù)本發(fā)明作為遺傳標(biāo)記用于適應(yīng)性調(diào)整治療人、個(gè)體或患者的有效治療劑的劑量、和/或用于鑒定處于臨床試驗(yàn)研究中或者入選臨床試驗(yàn)研究的人、個(gè)體或患者是否具有增加的血栓松塞病和/或冠心病、尤其是早發(fā)性心肌梗塞、中風(fēng)、PRIND、TIA和/或冠心病的風(fēng)險(xiǎn)。該遺傳變異也可以根據(jù)'本發(fā)明用于評(píng)價(jià)藥物活性物質(zhì)在特定的人、個(gè)體或患者中的耐受性、安全性和效力，或者用于鑒定適于所述疾病的特定療法的人、個(gè)體或患者。此外，該遺傳變異也可以根據(jù)本發(fā)明作為高通量篩選試驗(yàn)的一部分用于檢測(cè)和評(píng)價(jià)治療所述疾病的藥物活性物質(zhì)。本發(fā)明也可以用于針對(duì)每個(gè)待接受治療或建議的人、個(gè)體或患者鑒定所述疾病的危險(xiǎn)因素。根據(jù)本發(fā)明的用于診斷血栓栓塞病和/或冠心病的一個(gè)優(yōu)選方法包括下列步驟(a)從待研究的個(gè)體或患者，獲取樣品，尤其是細(xì)胞、組織、體液、血液的紳胞組分、內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞；(b)從所述樣品分離核酸探針，尤其是DNA探針；(c)借助引物，尤其是實(shí)施例中詳述的引物，擴(kuò)增包含EGLN2基因470位的特定區(qū)域；(d)測(cè)序擴(kuò)增的區(qū)域；(e)分^t經(jīng)測(cè)序的區(qū)域；和(f)評(píng)估血栓栓塞病和/或冠心病、尤其AA早發(fā)性心肌梗塞、中風(fēng)、PRIND、TIA和/或冠心病的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)本發(fā)明用于診斷血檢栓塞病和/或冠心病的一個(gè)備選方法包括下列步驟(a)從待研究的個(gè)體或患者，獲取樣品，尤其是細(xì)胞、組織、體液、血液的細(xì)胞組分、內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞；(b)從所述樣品分離ENGL2蛋白質(zhì)；(c)確定EGLN2蛋白質(zhì)58位的氨基酸；和(d)評(píng)估血栓栓塞病和/或冠心病、尤其A^:早發(fā)性心肌梗塞、中風(fēng)、PRIND、TIA和/或冠心病的風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)施例中以逐一單獨(dú)的方式或以集合的方式詳述了更加優(yōu)選的步驟，所述步驟在此處引入作為每個(gè)步驟的參考。下列圖、表、序列和實(shí)施例將解釋本發(fā)明，但不限制本發(fā)明的范圍。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示具NCBI號(hào)NM—053046的人EGLN2基因的核酸序列。下劃線為用來(lái)擴(kuò)增在470位(粗體)具遺傳變異C—T的遺傳部分的引物。圖2顯示f汙生自具NCBI號(hào)NM_053046的核酸序列的人EGLN2的氨基酸序列。該EGLN2蛋白質(zhì)中58位的氨基酸以粗體顯示。圖3顯示在患者組中EGLN2在參考序列NM_053042.2的470位的基因型對(duì)冠心病的發(fā)生年齡的影響，其中所述基因型導(dǎo)致EGLN2蛋白質(zhì)58位氨基酸的改變。低于0.05的P值為統(tǒng)計(jì)學(xué)上相關(guān)的。序列描述SEOIDNOl:顯示具NCBI號(hào)NM—053046的人EGLN2蛋白質(zhì)的核酸序列。SEOIDNO2:顯示衍生自具NCBI號(hào)NM—053046的核酸序列的人EGLN2的氨基M列。SEOIDNO3:顯示具有參考序列NM一053046.2.的444-463位核香酸的第一引物序列。SEOINNO4:顯示具有參考序列NM—053046.2.的504-521位威基的互補(bǔ)序列的第二引物序列。實(shí)施例通過(guò)測(cè)序檢測(cè)和分析SNP擴(kuò)增用的寡核苷酸(引物)下列引物用來(lái)檢測(cè)具索引號(hào)NM一053046.2的EGLN2序列在470位從C到T的核苷酸交換引物1:5'-CTGTCCAGGAGTGCCTAGTG陽(yáng)3，(參考序列NM—053046.2的核苷酸444-463;SEQIDNO:3);引物2:5'-GGGCTGGCAGTGGTAGAG-3'(參考序列NM一053046.2的504-521堿基的互補(bǔ)序列；SEQIDNO:4)。用于擴(kuò)增的PCR實(shí)驗(yàn)程序所用試劑購(gòu)自AppliedBiosystems(FosterCity,USA):20ng基因組DNA;1單位T叫GoldDNA聚合酶；lxTaq聚合酶緩沖液；500jiMdNTP;2.5mMMgCl2;上述擴(kuò)增引物對(duì)每個(gè)引物各200nM;1120加至5]111。鑒定基因型的PCR擴(kuò)增程序95°C10分鐘xl個(gè)循環(huán)95。C30秒70。C30秒x2個(gè)循環(huán)；95。C30秒65。C30秒x2個(gè)循環(huán)；95°C30秒60。C30秒x2個(gè)循環(huán)；95°C30秒56。C30秒72。C30秒x40個(gè)循環(huán)；72°C10分鐘4°C30秒xl個(gè)循環(huán)；用于微測(cè)序和檢測(cè)SNP的實(shí)驗(yàn)程序所用試劑購(gòu)自AppliedBiosystems(FosterCity,USA)。2jal純化的PCR產(chǎn)物，1.5ialBigDye-Terminator試劑盒，200nM上述測(cè)序引物；H20加至10nl。用于測(cè)序的擴(kuò)增程序96°C2分鐘xl個(gè)循環(huán)；96。C10秒55。C10秒65。C4分鐘x30個(gè)循環(huán)；72°C7分鐘4°C30秒xl個(gè)循環(huán)；測(cè)序產(chǎn)物的分析首先用Sequenz分析軟件(AppliedBiosystems,FosterCity,USA)分析序列來(lái)獲得初步數(shù)據(jù)，然后用軟件Phred，Phrap，PolyphredundConsed處理。Phred，Phrap，PolyphredundConsed由華盛頓大學(xué)的PhilGreen編寫(http:y7www.geiioine.washiiigtoii.edu)。結(jié)杲該組個(gè)體的特征表1顯示所研究的該組個(gè)體的特征表l<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>缺血發(fā)作)的發(fā)生的影響。P值小于0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)上相關(guān)的。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>結(jié)果1.相比具EGLN2-C470T的患者，具EGLN2-C470C的患者顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)上更高的早發(fā)性心肌梗塞發(fā)病率。2.相比具EGLN2-C470C的患者，具EGLN2-C470T的患者顯示顯著增加的遭受中風(fēng)、PRIND和/或TIA的風(fēng)險(xiǎn)。EGLN2變體對(duì)冠心病患者年齡的影響圖3顯示在患者組中EGLN2在參考序列NM—053042.2的470位的基因型對(duì)冠心病的發(fā)生年齡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比具EGLN2-C470T(EGLN2Ser58Leu)的患者年齡，具EGLN2-C470C(EGLN2Ser58Ser)的患者年齡與冠心病的早發(fā)顯著相關(guān)。結(jié)論編碼EGLN2的基因的遺傳變體和/或上述蛋白質(zhì)EGLN2之間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著相關(guān)性清楚地指明，在血栓栓塞病和/或冠心病的發(fā)生中涉及所述遺傳變體。因此，所述遺傳變體是用于預(yù)后血栓栓塞病和/或冠心病、尤其是預(yù)后早發(fā)性心肌梗塞和/或中風(fēng)、PRIND和/或TIA的生物標(biāo)記。權(quán)利要求1.在體外診斷血栓栓塞病和/或冠心病的方法，其中對(duì)個(gè)體樣品中編碼人EGLN2蛋白質(zhì)的核酸在470位的核苷酸或人EGLN2蛋白質(zhì)在58位的氨基酸進(jìn)行確定。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的血栓栓塞病選自中風(fēng)、長(zhǎng)期的可逆性局部缺血性神經(jīng)功能缺損(PRIND)和/或短暫性局部缺血發(fā)作(TIA)。3.權(quán)利要求l的方法，其中所述的冠心病為心J3^使塞。4.權(quán)利要求2的方法，其中470位的核苷酸在染色體DNA中被確定為是胸腺嘧咬或在mRNA中被確定為是尿嘧咬或58位的氨基酸被確定為是亮氨酸，有中風(fēng)、PRIND和/或TIA的風(fēng)險(xiǎn)。5.權(quán)利要求3的方法，其中470位的核苷酸被確定為是胞嘧啶或58位的M酸被確定為是絲氨酸，有心肌梗塞、尤其是早發(fā)性心肌梗塞的風(fēng)險(xiǎn)。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的編碼人EGLN2蛋白質(zhì)的核酸具有SEQIDNO:1的核苦酸序列7.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述的人EGLN2蛋白質(zhì)具有SEQIDNO:2的氨基酸序列。8.根據(jù)權(quán)利要求1-4和6中任意一項(xiàng)所述的方法，其中470位的核苷酸通過(guò)選自核酸測(cè)序法、核^i瞽分析、雜交法和/或擴(kuò)增法的方法測(cè)定。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述的核酸測(cè)序法選自焦磷酸測(cè)序和/或借助放射性和/或熒光標(biāo)記的核苷酸的測(cè)序。10.權(quán)利要求8的方法，其中所述的雜交法選自Southern印跡分析、Northern印跡分析和/或在DNA-微陣列上的雜交法。11.權(quán)利要求8的方法，其中所述的擴(kuò)增法選自TaqMan分析、RNA差別展示分析和/或代表性的差異分析。12.根據(jù)權(quán)利要求l-3、5和7中任意一項(xiàng)所述的方法，其中58位的氨基酸序列通過(guò)選自以下的方法確定測(cè)定該特定蛋白質(zhì)的量的方法和/或測(cè)定該特定蛋白質(zhì)的活性的方法。13.根據(jù)權(quán)利要求12中所述的方法，其中特定蛋白質(zhì)的量通過(guò)選自western印跡分析和/或ELISA的方法測(cè)定。14.根據(jù)權(quán)利要求12中所述的方法，其中特定蛋白質(zhì)的活性通過(guò)體外測(cè)試試驗(yàn)和/或用人細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞或酵母細(xì)胞進(jìn)行的體外全細(xì)胞測(cè)試試驗(yàn)測(cè)定。15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任意一項(xiàng)所述的方法，其中樣品選自細(xì)胞、纟且織和/或體'液。16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任意一項(xiàng)所述的方法，其中在一個(gè)其它的步驟中確定個(gè)體患血栓栓塞病和/或冠心病的風(fēng)險(xiǎn)。17.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任意一項(xiàng)所述的方法，其中在一個(gè)其它的步驟中確定藥物的劑量。18.才艮據(jù)^L利要求1-17中任意一項(xiàng)所述的方法，其包括下列步驟(a)從待研究的個(gè)體獲取樣品；(b)從所述樣品分離核酸探針，尤其是DNA探針；(c)借助引物擴(kuò)增包含EGLN2基因470位的特定區(qū)域；(d)測(cè)序擴(kuò)增的區(qū)域；(e)分析經(jīng)測(cè)序的區(qū)域；和(d)評(píng)估血栓栓塞病和/或冠心病、尤其是心Wt塞、中風(fēng)、PRIND、TIA和/或冠心病的風(fēng)險(xiǎn)。19.根據(jù)權(quán)利要求18中所述的方法，其中所述的心肌梗塞為早發(fā)性心肌梗塞。20.根據(jù)權(quán)利要求18或19中所述的方法，其中所述的引物選自SEQIDNO:3和/或SEQIDNO:4。21.根據(jù)權(quán)利要求l-3、5、7或12-17中任意一項(xiàng)所述的方法，其包括下列步驟(a)從待研究的個(gè)體或患者獲取樣品、尤其是細(xì)胞、組織、體液、血液的細(xì)胞組分、內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞；(b)從所述樣品分離ENGL2蛋白質(zhì)；(c)確定ENGL2蛋白質(zhì)58位的M酸；和(d)評(píng)估血栓栓塞病和/或冠心病、尤其是早發(fā)性心*塞、中風(fēng)、PRIND、TIA和/或冠心病的風(fēng)險(xiǎn)。22.根據(jù)權(quán)利要求20中所述的方法，其中所述的心肌梗塞為早發(fā)性心肌梗塞。全文摘要本發(fā)明涉及在體外診斷血栓栓塞病和/或冠心病的方法，其中對(duì)來(lái)自人的樣品中編碼人EGLN2蛋白質(zhì)的核酸在470位的核苷酸或人EGLN2蛋白質(zhì)在58位的氨基酸進(jìn)行確定。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101287846SQ200680037600公開日2008年10月15日申請(qǐng)日期2006年9月30日優(yōu)先權(quán)日2005年10月12日發(fā)明者D·科齊安,M·赫爾曼申請(qǐng)人:塞諾菲-安萬(wàn)特股份有限公司