專利名稱：用于檢測母系遺傳線粒體耳聾基因C1494T突變的TaqMan MGB探針及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體用于診斷母系線粒體遺傳耳聾疾病的探針及其用途，更具體的是涉及用于檢測母系遺傳線粒體耳聾基因C1494T突變的實時定量TaqMan MGB探針及其用途。本發(fā)明還涉及所述MGB探針及其相關(guān)產(chǎn)品在制備用于診斷母系遺傳線粒體耳聾疾病的試劑盒或類似產(chǎn)品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
氨基糖甙類抗生素(鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素及小諾霉素等)因其廣譜高效的抗菌作用以及低廉的價格在臨床上被廣泛用于控制革蘭氏陰性和陽性菌感染，但此類抗生素具有嚴(yán)重的耳毒性副作用，可使患者發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的聽力損失。近十年來研究發(fā)現(xiàn)，部分氨基糖甙類抗生素致聾患者有母系遺傳家族史，并與線粒體DNA 12S rRNA基因(以下簡稱為線粒體基因，或mtDNA)第1494位C→T(以下簡稱C1494T突變)均質(zhì)性點突變有關(guān)(Zhao H et al，American Journal of Human Genetics，2004，74139-152；Wang Q et al，BiochemBiophys Res Commun.2006，340583-588)。單次劑量的氨基糖甙類藥物應(yīng)用即可導(dǎo)致攜帶此突變個體的重度聽力損失。根據(jù)目前已有的研究結(jié)果可知，幾乎攜帶此突變的個體在應(yīng)用不同劑量的氨基糖甙類抗生素后均發(fā)生嚴(yán)重或較嚴(yán)重的聽力損失，是后天性獲得性耳聾發(fā)生的重要原因。鑒于這一耳聾有明確的基因變化和誘發(fā)因素，使得該種耳聾成為一種可以預(yù)防的疾病。
線粒體基因C1494T突變(mtDNA C1494T突變)是新近明確的可以由氨基糖甙類藥物單次劑最應(yīng)用導(dǎo)致中毒耳聾的線粒體基因突變類型，在中國已發(fā)現(xiàn)線粒體基因C1494T突變突變母系遺傳耳聾家系4個，各家系發(fā)病人數(shù)從2-28人不等，考慮到尚有很多同類家系尚未被發(fā)現(xiàn)、報道，以及此突變在散發(fā)性耳聾的致病機制中占有一定的比例，對這種耳聾的預(yù)防變得更為重要。其預(yù)防的關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于通過篩查，檢測發(fā)現(xiàn)攜帶mtDNA C1494T突變的個體，絕對禁止此類個體接觸氨基糖甙類抗生素，從而避免嚴(yán)重的耳毒性反應(yīng)發(fā)生。
自2004年發(fā)現(xiàn)mtDNA C1494T與耳聾的關(guān)系以來，對此突變的檢測主要應(yīng)用直接測序的方法，序列測定雖然是評價基因突變的有效方法，但成本高、步驟繁瑣、耗時長，為解決這些問題我們設(shè)計了一種簡單、快速、準(zhǔn)確、減少污染而且成本低廉的檢測方法，以滿足對mtDNA C1494T突變進行廣泛篩查的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的通過下述原理實現(xiàn)為了檢測在母系遺傳線粒體基因序列(SEQ ID NO5)中的C1494T突變，設(shè)計覆蓋所述基因序列的1494bp位點在內(nèi)的TaqMan MGB探針(探針序列跨度為1482bp-1508bp)，并且在該MGB探針片段的5’末端標(biāo)記了熒光報告基團、3’末端標(biāo)記了非熒光淬滅基團MGB，其中如果MGB探針在1494bp相應(yīng)的堿基C被替換為T，則稱為突變型實時定量MGB探針(或突變型MGB探針、突變型Taqman MGB探針)；如果MGB探針在1494bp相應(yīng)的堿基仍舊是C，則稱為野生型實時定量MGB探針(或野生型MGB探針、野生型Taqman MGB探針)；由于突變型和野生型兩種MGB探針的5’端熒光報告基團不同，即二者發(fā)射波長不同的熒光(不同波長的熒光在實時定量熒光PCR儀器上能被分別記錄下來，在分析軟件中以不同的顏色或不同的標(biāo)記反映出來)，因此，突變型MGB探針能與發(fā)生C1494T突變的模板完全匹配而不能與野生型模板完全匹配；而野生型MGB探針不能與發(fā)生C1494T突變的模板完全匹配、而只能與野生型模板完全匹配；并且不同MGB探針結(jié)合模板可發(fā)射不同波長的熒光。
在實時定量PCR擴增體系中，加入用于擴增母系遺傳線粒體耳聾基因序列SEQ ID NO5的正向引物和反向引物(可以根據(jù)任何生物引物軟件進行設(shè)計)，并加入突變型實時定量MGB探針，如果需要，還可加入野生型實時定量MGB探針。
由于MGB探針很短(12-25bp左右)，5′端熒光報告基團吸收能量后可將能量轉(zhuǎn)移給鄰近的3′端非熒光淬滅基團，而3′端非熒光淬滅基團則可抑制5’端熒光報告基團的熒光發(fā)射。因此，MGB探針完整時，即5’端熒光報告基團未脫離3’非熒光淬滅基團的屏蔽時，檢測不到MGB探針5′端熒光基團發(fā)出的熒光。
在一個實施方案中，將引物和突變型MGB探針和野生型MGB探針同時加入實時定量PCR反應(yīng)體系中。當(dāng)體系中的模板變性后低溫退火時，引物與MGB探針均與模板結(jié)合。在引物的介導(dǎo)下，沿模板向前延伸至MGB探針結(jié)合處，Taq酶的5′-3′外切酶活性(此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈MGB探針不受影響)將MGB探針5′端連接的熒光報告基團從MGB探針上切割下來，游離于反應(yīng)體系中，從而脫離3′端非熒光淬滅基團的屏蔽，接受光刺激發(fā)出熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，也就是熒光信號的強度與相應(yīng)PCR產(chǎn)物量成線性函數(shù)關(guān)系。當(dāng)模板為C1494T突變型時，則突變型MGB探針會與之全匹配結(jié)合，PCR反應(yīng)中5’端熒光報告基團不斷被Taq酶切下，脫離3′端非熒光淬滅基團的屏蔽，其熒光強度隨PCR產(chǎn)物量的增多而不斷增加。而野生型MGB探針因與之存在一個堿基的差別不能結(jié)合，故只檢測到突變型MGB探針發(fā)射所對應(yīng)的熒光信號；當(dāng)模板為C1494C野生型時，野生型MGB探針會與模板全匹配結(jié)合，突變型MGB探針因與之存在一個堿基的差別不能結(jié)合，故只檢測到野生型MGB探針發(fā)射所對應(yīng)的熒光信號。由于突變型和野生型MGB探針的5’端分別連接不同的熒光報告基團，因此根據(jù)所發(fā)射的不同顏色的熒光，即可分辨出熒光所對應(yīng)的模板，也就檢測出樣品中是否含有母系遺傳線粒體耳聾基因。
在另一個實施方案中，在實時定量PCR反應(yīng)體系中也可僅加入突變型MGB探針，當(dāng)模板是突變型時，則最終可檢測到突變型MGB探針發(fā)射所對應(yīng)的熒光信號，因而確定樣本含有母系遺傳線粒體耳聾基因C1494T突變，從而確定患者患有母系線粒體遺傳耳聾疾?。划?dāng)模板是野生型時，則最終不能檢測到突變型MGB探針發(fā)射所對應(yīng)的熒光信號，因而確定樣本不含有母系遺傳線粒體耳聾基因C1494T突變，從而確定患者未患有母系線粒體遺傳耳聾疾病。
也就是說，理論上，一個體系中僅加入針對C1494T突變型模板的突變型MGB探針即可進行檢測。但是當(dāng)同時加入的針對C1494C野生型模板的野生型MGB探針時，可以起到反向校正的雙保險作用，從而使結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。
因此，基于以上發(fā)明原理，本發(fā)明第一個發(fā)明目的是提供一種用于檢測母系遺傳線粒體耳聾基因C1494T突變的實時定量MGB探針，其中MGB探針的5’端位于如母系遺傳線粒體耳聾基因序列SEQ ID NO5所示的1482-1487bp區(qū)域中，3’端位于如線粒體基因序列SEQID NO5所示的1503-1508bp區(qū)域中，并且在該MGB探針片段的5’末端標(biāo)記了熒光報告基團、3’末端標(biāo)記了非熒光淬滅基團MGB，以及1494bp的堿基C被替換為T，稱為突變型實時定量MGB探針。
另外，在本領(lǐng)域中，TaqMan探針根據(jù)其3′端標(biāo)記的淬滅基團的不同分為兩種普通的TaqMan探針和TaqMan MGB探針。普通的TaqMan探針的淬滅基團為熒光淬滅基團，而MGB探針的淬滅基團采用非熒光淬滅基團，本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號的強度。同時探針上還連接有MGB(Minor Groove Binder)修飾基團，可以將探針的Tm值提高10℃左右。為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通TaqMan探針設(shè)計得更短，既降低了合成成本，也使得探針設(shè)計的成功率大為提高。因為在模板的DNA堿基組成不理想的情況下，短的探針比長的更容易設(shè)計。鑒于mtDNA 1494位點及其周圍堿基組合的特點，經(jīng)過大量的摸索試驗，本發(fā)明選用的TaqMan MGB探針，優(yōu)選5’端位于SEQ ID NO5的1485-1488bp區(qū)域，3’端則位于1503-1505bp；更優(yōu)選地，TaqMan MGB的5’端位于1487-1488bp，3’端位于1503bp。
在一個具體實施方案中，突變型MGB探針的核苷酸序列位于如母系遺傳線粒體耳聾基因序列SEQ ID NO5所示的1487-1503bp區(qū)域中(如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列)，并且 5’端熒光報告基團是FAM熒光報告基團，3’端基團是非熒光淬滅基團MGB。
本發(fā)明第二個發(fā)明目的是提供與突變型MGB探針協(xié)同使用的野生型MGB探針。與突變型實時MGB探針相比，野生型實時MGB探針除了在1494bp的堿基仍是C、且5’端熒光報告基團不同于突變型MGB探針的5’端熒光報告基團、探針起始點位于1488bp而不是1487bp之外，其余結(jié)構(gòu)都相同。
在一個具體實施方案中，野生型MGB探針的核苷酸序列位于如母系遺傳線粒體耳聾基因序列SEQ ID NO5所示的1488-1503bp區(qū)域中(如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列)，并且5’端熒光報告基團是HEX熒光報告基團，3’端是非熒光淬滅基團MGB。
應(yīng)當(dāng)指出，5’端熒光報告基團及其相應(yīng)的3’端非熒光淬滅基團可以是本領(lǐng)域中任何可用的熒光報告基團或非熒光淬滅基團，并且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，選擇這些熒光報告基團及其相應(yīng)的非熒光淬滅基團也是眾所周知的常規(guī)技術(shù)。例如，熒光染料FAM和HEX可以由其他熒光基團或染料代替，如VIC、JOE等。
本發(fā)明第三個目的是提供與實時定量MGB探針共同使用的PCR正向引物和反向引物。正向引物和反向引物用于擴增包含了C1494T突變的母系遺傳線粒體耳聾基因序列SEQ IDNO5。其中正向引物(長約15-24bp)5’端位于SEQ ID NO5(C1494T上游)的1-1464bp區(qū)域，反向引物(長約15-24bp)的3’端位于SEQ ID NO5(C1494T下游)的1615bp-16568bp區(qū)域；優(yōu)選地，正向引物(長約15-24bp)的5’端位于SEQ ID NO5(C1494T上游)的1000-1464bp區(qū)域，反向引物(長約15-24bp)的3’端位于SEQ ID NO5(C1494T下游)的1615bp-2000bp區(qū)域；更優(yōu)選地，正向引物(長約15-24bp)的5’端位于SEQ ID NO5(C1494T上游)的1400-1464bp區(qū)域，反向引物(長約15-24bp)的3’端位于SEQ ID NO5(C1494T下游)的1615bp-1700bp區(qū)域；最優(yōu)選地，正向引物(長約15-24bp)的5’端位于SEQ ID NO5(C1494T上游)的1464bp位點，反向引物(長約15-24bp)的3’端位于SEQ ID NO5(C1494T下游)的1615bp位點。
在一個具體實施方案中，正向引物是母系遺傳線粒體耳聾基因序列SEQ ID NO5所示的1464-1481bp核苷酸序列，其序列為序列表中的SEQIDNO3；反向引物是則是其所示的1592-1615bp的核苷酸序列，其序列為序列表中的SEQ ID NO4。
在一個具體實施方案中，可以使用各種生物軟件程序設(shè)計上述引物。優(yōu)選使用GenetoolLite程序(美國Biotools公司提供的軟件)來設(shè)計引物。
本發(fā)明第四個發(fā)明目的提供上述MGB探針在制備用于診斷母系線粒體耳聾遺傳疾病的試劑盒中的應(yīng)用。
在一個具體實施方案中，本發(fā)明人利用發(fā)明原理和設(shè)計的引物以及Taqman MGB探針提供用于體外檢測母系遺傳耳聾線粒體基因C1494T突變的試劑盒，用于診斷母系線粒體遺傳耳聾疾病，該試劑盒含有1.提取血樣DNA的試劑；2.PCR擴增反應(yīng)試劑混合液，優(yōu)選Hotstar Mastermix混和液；3.用于擴增包含了C1494C位點或C1494T突變位點的母系遺傳線粒體耳聾基因序列SEQ ID NO5的正向引物和反向引物(優(yōu)選等比例混合)；4.前述的實時定量突變型Taqman MGB探針；5.如果需要，還包括使用說明書。
在一個具體實施方案中，上述試劑盒還可包含前述的野生型實時定量Taqman MGB探針。
在另一個具體實施方案中，上述試劑盒中的正向引物和反向引物結(jié)構(gòu)如前文所述。正向引物優(yōu)選選自SEQ ID NO3所示的核苷酸序列，反向引物優(yōu)選選自SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
在另一個具體實施方案中，突變型MGB探針核苷酸序列優(yōu)選選自如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，其5’末端的熒光報告基團是FAM熒光報告基團，3’末端標(biāo)記了非熒光淬滅基團MGB。
在另一個具體實施方案中，野生型MGB探針核苷酸序列優(yōu)選選自如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列，其5’末端的熒光報告基團是HEX熒光報告基團，3’末端標(biāo)記了非熒光淬火基團是非熒光淬滅基團MGB。
在另一個具體實施方案中，上述試劑盒中所述的提取血樣DNA的試劑為提取足根血DNA的溶液I，其主要成分為Chelex(ABI公司產(chǎn)品)；或者提取血樣DNA的試劑為外周血DNA提取試劑，選用市售產(chǎn)品配套使用。應(yīng)當(dāng)指出，術(shù)語“試劑盒”是還應(yīng)當(dāng)包括具有不同于試劑盒的名稱，但與試劑盒具有類似結(jié)構(gòu)或組分以及生物學(xué)功能的生物學(xué)產(chǎn)品。
在另一個具體實施方案中，本發(fā)明提供上述MGB探針或試劑盒在體外檢測母系遺傳線粒體耳聾基因C1494T突變中的用途。在另一個具體實施方案中，本發(fā)明還提供上述MGB探針或試劑盒在制備用于診斷母系線粒體耳聾遺傳疾病(即檢測母系遺傳線粒體耳聾基因C1494T突變)的產(chǎn)品(包括藥物、試劑、試劑盒等產(chǎn)品)中的用途。
檢測母系遺傳線粒體耳聾基因C1494T突變與現(xiàn)有技術(shù)(如Hae III酶切鑒定方法)相比有以下優(yōu)點1.本發(fā)明檢測線粒體基因C1494T突變操作步驟和反應(yīng)時間均較為直接測序法有明顯優(yōu)勢本發(fā)明僅需一次PCR過程即可檢測出是否存在mtDNAC1494T突變，較測序方法相比簡省了PCR后的瓊脂糖凝膠電泳檢測、PCR產(chǎn)物純化、測序反應(yīng)、測序反應(yīng)產(chǎn)物純化四個步驟，不僅減少了PCR反應(yīng)后處理帶來的污染風(fēng)險，還將操作及反應(yīng)時間由原來的最短12個小時縮短到1.5小時。
2.本發(fā)明兩條MGB探針設(shè)計分別針對C1494T突變型和C1494C野生型，當(dāng)共同存在于同一體系時每種MGB探針只與序列與其完全匹配的模板結(jié)合，故特異性極強。對一份模板而言，如果檢測到突變型MGB探針的5’端熒光(如FAM熒光)，未檢測到野生型MGB探針的5’端熒光(如HEX熒光)可以肯定為C1494T突變型；如果反之則可肯定為C1494C野生型。并且理論上，一個體系中僅加入針對C1494T突變型模板的突變型MGB探針即可進行診斷。但是當(dāng)同時加入兩種MGB探針時，可以起到反向校正的雙保險作用，從而使結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。此外，MGB探針技術(shù)的高特異性和光譜技術(shù)的敏感性賦予了本發(fā)明重復(fù)性好、特異性強、敏感性高和易操作等優(yōu)點。
3.本發(fā)明的結(jié)果判讀在實時定量PCR儀器的分析軟件支持下進行，具有自動化的優(yōu)點，減少了人為的誤差。
4.應(yīng)用本發(fā)明提供的試劑盒或相關(guān)產(chǎn)品進行C1494T突變檢測，成本較其他常規(guī)檢測方法更低。
由此可見，本發(fā)明的MGB探針及其試劑盒填補了國內(nèi)相關(guān)檢測領(lǐng)域的空白，并且其操作簡便、判讀直觀、特異性強、敏感性高、價格低廉等優(yōu)點為在全國范圍內(nèi)實行母系遺傳線粒體耳聾基因C1494T突變的篩查和抗生素應(yīng)用前預(yù)防性檢測提供了更為便利的條件，從而根本上減少對氨基糖甙類抗生素敏感的個體發(fā)生藥物性耳聾的機會。


圖1所示72例不同基因型的實時定量PCR檢測的部分結(jié)果圖(Allelic data for CyclingA.FAM/Sybr，Cycling A.JOE)。
圖2所示72例不同基因型的實時定量PCR檢測的部分結(jié)果圖的圖例。
具體實施例方式
母系遺傳耳聾線粒體基因C1494T突變的檢測1.檢測樣本從中國人民解放軍總醫(yī)院聾病分子診斷中心聾病資源庫選取感音神經(jīng)性耳聾患者72人，從被檢個體提取外周全血DNA(袁慧軍等，中華耳鼻咽喉科雜志，1998，33(2)67-70；李為民等，臨床耳鼻咽喉科雜志，2001，15(增刊)53-58)，作為檢測樣本。
2.MGB探針和引物設(shè)計根據(jù)已公開的線粒體基因序列(Cambridge Sequence或NCBI人線粒體基因組序列NC-001807.4或NT-006713.14等，或序列號SEQ ID NO5)，使用Genetool Lite程序協(xié)助設(shè)計引物和Taqman MGB探針序列，其中突變型MGB探針(T1)的核苷酸序列位于如母系遺傳線粒體耳聾基因序列SEQ ID NO5所示的1487-1503bp區(qū)域中(如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列)，并且熒光報告基團是FAM熒光報告基團，熒光淬滅基團是TAMRA熒光淬滅基團，MGB探針結(jié)構(gòu)如下5′FAM-CCGTCACTCTCCTCAAG-MGB3′野生型MGB探針(T2)的核苷酸序列位于如母系遺傳線粒體耳聾基因序列SEQ ID NO5所示的1488-1503bp區(qū)域中(如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列)，并且熒光報告基團是HEX熒光報告基團，熒光淬滅基團是TAMRA熒光淬滅基團，MGB探針結(jié)構(gòu)如下5′HEX-CGTCACCCTCCTCAAG-MGB3′正向引物(F1)是母系遺傳線粒體耳聾基因序列SEQ ID NO5所示的1464-1481bp核苷酸序列，其序列為序列表中的SEQIDNO3；反向引物(R1)是則是其所示的1592-1615bp的核苷酸序列，其序列為序列表中的SEQ ID NO4。
3.PCR擴增反應(yīng)根據(jù)上述設(shè)計的MGB探針核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、以及引物序列SEQID NO3、SEQ ID NO4，通過人工合成得到MGB探針T1、T2、正向引物F1和反向引物R1，并以上述提取的被測樣本的外周血DNA為模板，進行實時定量PCR擴增反應(yīng)反應(yīng)體系模板 10ngHotstar Mastermix10μl引物F1，R1(2pmol/l) 各1μlMGB探針T1(2pmol/l) 1μl另外，如果需要，加入1μl的T2(2pmol/l)加三蒸水至20μl體積。
反應(yīng)條件如表1所示95℃變性10分鐘后，接著95℃變性30秒，60℃退火30秒，，共進行40個循環(huán)，在每個循環(huán)退火時采集熒光。
表1

4.結(jié)果72名受檢對象中以實時定量Taqman MGB探針法共檢測到10人攜帶mtDNA的C1494T突變。
附圖中不帶圓圈標(biāo)記的線為記錄到的FAM熒光，帶圓圈標(biāo)記的線為記錄到的HEX熒光。軟件分析結(jié)果見表2。
5.實時定量Taqman MGB探針法可靠性的檢驗所有被檢測個體的1494bp位點均經(jīng)過直接測序法進行驗證，結(jié)果證明根據(jù)實時定量Taqman MGB探針法檢測到的攜帶C1494T突變的10名耳聾患者和不攜帶C1494T突變的62名個體，與直接測序法結(jié)果一致，兩種方法的吻合率為100％，說明使用本發(fā)明方法檢測C1494T突變的可靠性和穩(wěn)定性。具體數(shù)據(jù)參見表2。
表2

序列表<110>金政策<120>用于檢測母系遺傳線粒體耳聾基因C1494T突變的TaqMan MGB探針及其用途<160>5<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>突變型Taqman MGB探針核苷酸序列<440>1CCGTCACTCT CCTCAAG17<210>2<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>野生型Taqman MGB探針核苷酸序列<440>2CGTCACCCTC CTCAAG 16<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物F1<400>3GCCCTGAAGC GCGTACAC 18<210>4<211>24<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>反向引物R1<400>4TAAGCTACAC TCTGGTTCGT CCAA 24<210>5<211>16568<212>DNA<213>智人(Homo Sapiens)<220>
<223>人線粒體基因組<400>5GATCACAGGT CTATCACCCT ATTAACCACT CACGGGAGCT CTCCATGCAT TTGGTATTTT60CGTCTGGGGG GTATGCACGC GATAGCATTG CGAGACGCTG GAGCCGGAGC ACCCTATGTC120GCAGTATCTG TCTTTGATTC CTGCCTCATC CTATTATTTA TCGCACCTAC GTTCAATATT180ACAGGCGAAC ATACTTACTA AAGTGTGTTA ATTAATTAAT GCTTGTAGGA CATAATAATA240ACAATTGAAT GTCTGCACAG CCACTTTCCA CACAGACATC ATAACAAAAA ATTTCCACCA300AACCCCCCCT CCCCCGCTTC TGGCCACAGC ACTTAAACAC ATCTCTGCCA AACCCCAAAA360ACAAAGAACC CTAACACCAG CCTAACCAGA TTTCAAATTT TATCTTTTGG CGGTATGCAC420TTTTAACAGT CACCCCCCAA CTAACACATT ATTTTCCCCT CCCACTCCCA TACTACTAAT480CTCATCAATA CAACCCCCGC CCATCCTACC CAGCACACAC ACACCGCTGC TAACCCCATA540CCCCGAACCA ACCAAACCCC AAAGACACCC CCCACAGTTT ATGTAGCTTA CCTCCTCAAA600GCAATACACT GAAAATGTTT AGACGGGCTC ACATCACCCC ATAAACAAAT AGGTTTGGTC660CTAGCCTTTC TATTAGCTCT TAGTAAGATT ACACATGCAA GCATCCCCGT TCCAGTGAGT720TCACCCTCTA AATCACCACG ATCAAAAGGA ACAAGCATCA AGCACGCAGC AATGCAGCTC780AAAACGCTTA GCCTAGCCAC ACCCCCACGG GAAACAGCAG TGATTAACCT TTAGCAATAA840ACGAAAGTTT AACTAAGCTA TACTAACCCC AGGGTTGGTC AATTTCGTGC CAGCCACCGC900GGTCACACGA TTAACCCAAG TCAATAGAAG CCGGCGTAAA GAGTGTTTTA GATCACCCCC960TCCCCAATAA AGCTAAAACT CACCTGAGTT GTAAAAAACT CCAGTTGACA CAAAATAGAC1020TACGAAAGTG GCTTTAACAT ATCTGAACAC ACAATAGCTA AGACCCAAAC TGGGATTAGA1080TACCCCACTA TGCTTAGCCC TAAACCTCAA CAGTTAAATC AACAAAACTG CTCGCCAGAA1140CACTACGAGC CACAGCTTAA AACTCAAAGG ACCTGGCGGT GCTTCATATC CCTCTAGAGG1200AGCCTGTTCT GTAATCGATA AACCCCGATC AACCTCACCA CCTCTTGCTC AGCCTATATA1260CCGCCATCTT CAGCAAACCC TGATGAAGGC TACAAAGTAA GCGCAAGTAC CCACGTAAAG1320ACGTTAGGTC AAGGTGTAGC CCATGAGGTG GCAAGAAATG GGCTACATTT TCTACCCCAG1380AAAACTACGA TAGCCCTTAT GAAACTTAAG GGTCGAAGGT GGATTTAGCA GTAAACTAAG1440AGTAGAGTGC TTAGTTGAAC AGGGCCCTGA AGCGCGTACA CACCGCCCGT CACCCTCCTC1500AAGTATACTT CAAAGGACAT TTAACTAAAA CCCCTACGCA TTTATATAGA GGAGACAAGT1560CGTAACATGG TAAGTGTACT GGAAAGTGCA CTTGGACGAA CCAGAGTGTA GCTTAACACA1620AAGCACCCAA CTTACACTTA GGAGATTTCA ACTTAACTTG ACCGCTCTGA GCTAAACCTA1680
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權(quán)利要求
1.一種用于檢測母系遺傳線粒體耳聾基因C1494T突變的實時定量TaqManMGB探針，其特征在于探針的5’端位于如母系遺傳線粒體耳聾基因序列SEQ IDNO5所示的1482-1488 bp區(qū)域中，3’端位于如線粒體基因序列SEQ ID NO5所示的1503-1508bp區(qū)域中，并且在該探針片段的5’末端標(biāo)記了熒光報告基團、3’末端標(biāo)記了非熒光淬滅基團MGB，以及1494bp的堿基C被替換為T，稱之為突變型MGB探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的實時定量TaqMan MGB探針，其中還包含野生型MGB探針，與突變型MGB探針相比，野生型MGB探針除了在1494bp的堿基仍是C、且5’端熒光報告基團不同于突變型MGB探針的5’端熒光報告基團、探針起始點位于1488bp而不是1487bp之外，其余結(jié)構(gòu)都相同。
3.權(quán)利要求1或2所述的實時定量TaqMan MGB探針，其中突變型MGB探針核苷酸序列選自如SEQ IDNO1所示的核苷酸序列；或野生型MGB探針核苷酸序列選自如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求3所述的實時定量TaqMan MGB探針，其中突變型MGB探針5’末端的熒光報告基團是FAM熒光報告基團，野生型MGB探針5’末端的熒光報告基團是HEX熒光報告基團。
5.一種用于診斷母系線粒體遺傳耳聾疾病的試劑盒，該試劑盒通過實時定量檢測母系遺傳線粒體耳聾基因序列SEQ ID NO5中的C1494T突變從而診斷母系線粒體耳聾遺傳病，其包括(1)提取血樣DNA的試劑；(2)PCR擴增反應(yīng)試劑混合液；(3)用于擴增包含了C1494C位點或C1494T突變位點的母系遺傳線粒體耳聾基因序列SEQ ID NO5的正向引物和反向引物；(4)權(quán)利要求1至4任一項所述的突變型MGB探針；(5)如果需要，還包括使用說明書。
6.權(quán)利要求5所述的試劑盒，其中還包含權(quán)利要求2至4中任一項所述的野生型實時定量TaqMan MGB探針。
7.權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其中所述的正向引物選自SEQ ID NO3所示的核苷酸序列，反向引物選自SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項所述的試劑盒，其中所述的反應(yīng)試劑混和液是Hotstar Mastermix混和液；所述的正向引物和反向引物是等比例混和的；所述的提取血樣DNA的試劑為提取足根血DNA的溶液I，其主要成分為Chelex。
9.根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項所述的試劑盒，其中所述的反應(yīng)試劑混和液是Hotstar Mastermix混和液；所述的正向引物和反向引物是等比例混和的；所說的提取血樣DNA的試劑為外周血DNA提取試劑。
10.權(quán)利要求1至4任一項所述的TaqMan MGB探針或權(quán)利要求5至9任一項所述的試劑盒在體外檢測母系遺傳線粒體耳聾基因C1494T突變中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測母系遺傳線粒體耳聾基因C1494T突變的實時定量MGB探針及其用途。該發(fā)明設(shè)計兩條Taqman突變型和野生型MGB探針和一對引物，通過實時定量Taqman MGB探針法進行針對母系遺傳線粒體耳聾基因C1494T突變的基因型分析，從而診斷母系線粒體遺傳耳聾疾病。該方法簡單省時、特異性強、敏感性高，檢測結(jié)果直觀、準(zhǔn)確可靠，適用于對母系遺傳耳聾線粒體基因C1494T突變的大規(guī)模的篩查或預(yù)防性檢查。
文檔編號C12Q1/68GK1987463SQ200610169639
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月26日
發(fā)明者戴樸, 袁永一, 韓東一, 金政策 申請人:金政策