專利名稱：：與衰老相關(guān)退行性疾病的線粒體nd3基因snpg10320a分子標(biāo)記、檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測(cè)線粒體ND3基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的方法，具體地說(shuō)是一種檢測(cè)線粒體ND3基因mtDNA10320位點(diǎn)的SNP的方法以及檢測(cè)該位點(diǎn)SNP的試劑盒和該試劑盒的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：健康長(zhǎng)壽一直是各國(guó)研究的熱點(diǎn)，這是由于長(zhǎng)壽老人在衰老的過(guò)程中并不患衰老相關(guān)的退行性疾病如中風(fēng)，心血管疾病，2型糖尿病，帕金森病，老年性癡呆，癌癥等，而健康的生活。這些衰老相關(guān)的退行性疾病不僅給患者帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)、影響生活質(zhì)量，同時(shí)由于我國(guó)自1998年進(jìn)入老齡化社會(huì)以來(lái)，老齡人口占全人口構(gòu)成比(10%)在逐年增高，預(yù)計(jì)到2020年，我國(guó)大于60歲的人口將占全人口的27%，所以也會(huì)給社會(huì)造成巨大的壓力，將會(huì)成為影響我國(guó)社會(huì)福利和衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)的重大醫(yī)學(xué)問(wèn)題。長(zhǎng)壽的機(jī)制研究可以為衰老相關(guān)疾病的病理機(jī)制提供線索并可以預(yù)測(cè)衰老相關(guān)疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。與患衰老相關(guān)的退行性疾病是受多個(gè)遺傳和環(huán)境因素影響的一種復(fù)雜遺傳性狀，包括基因之間及基因和環(huán)境之間的相互作用。基因和(或)環(huán)境通過(guò)減少衰老相關(guān)的退行性疾病或減緩衰老來(lái)促進(jìn)長(zhǎng)壽。但是影響長(zhǎng)壽的確切因素迄今為止尚未闡明。雙生子研究表明長(zhǎng)壽表型25。/。是由遺傳因素決定的(ChristensenK，JohnsonTE，VaupelJW.Thequestforgeneticdeterminantsofhumanlongevity:challengesandinsights.Nature,2006;7:436-448)。同時(shí)，家系分析中也表明百歲老人的兄弟姐妹的壽命要比一般人群高約4倍(ChristensenK，JohnsonTE，VaupelJW.Thequestforgeneticdeterminantsofhumanlongevity:challengesandinsights.Nature,2006;7:436-448)。這些研究證明了遺傳因素在長(zhǎng)壽的機(jī)制中起到重要作用。并且，在病例對(duì)照的關(guān)聯(lián)研究中發(fā)現(xiàn)了與長(zhǎng)壽相關(guān)的一些遺傳標(biāo)記，如4號(hào)染色體和一些基因如，AP0E，HLA，mtDNA等。由于線粒體在細(xì)胞中的重要作用及線粒體的突變可以引起衰老相關(guān)的疾病(AudeshBhat，AnilKoul，SwarkarSharma，etal.Thepossibleroleof10398Aand16189CmtDNAvariantsinprovidingsusceptibilitytoT2DMintwoNorthIndianpopulations:areplicativestudy.HumGenet,2007，120:821—826.)，因此線粒體DNA可能在長(zhǎng)壽的機(jī)制中起到重要的作用。更重要的是衰老相關(guān)的疾病多表現(xiàn)為母系遺傳，這與線粒體DNA的遺傳方式非常相似。這樣，我們推測(cè)長(zhǎng)壽人群是遺傳了母親的線粒體DNA，而這些線粒體DNA的表達(dá)在功能上可以保護(hù)長(zhǎng)壽人群不得衰老相關(guān)疾病，從而延長(zhǎng)了其壽命。這樣，線粒體DNA變異與衰老相關(guān)的退行性疾病關(guān)系正在越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。線粒體是細(xì)胞漿中的小細(xì)胞器，含有自己的雙鏈環(huán)狀DNA編碼氧化磷酸化過(guò)程所需的蛋白及合成這些蛋白所需的tRNA和rRNA。每一細(xì)胞含有數(shù)千個(gè)線粒體，每個(gè)線粒體中含有2-10個(gè)DNA，因此，每個(gè)細(xì)胞中含有數(shù)萬(wàn)個(gè)DNA拷貝。目前進(jìn)行的與衰老相關(guān)的退行性疾病因研究多釆用關(guān)聯(lián)分析方法，已證明，以SNPs作為基因組標(biāo)志是有效的。如在日本長(zhǎng)壽群體中發(fā)現(xiàn)線粒體DNA編碼區(qū)的SNP5178A與長(zhǎng)壽相關(guān)(Tanaka，M.，Gong，J.S.，Zhang,J.,Yoneda，M.，andYagi，K.Mitochondrialgenotypeassociatedwithlongevity.Lancet,1998:351，185-186)。此后國(guó)內(nèi)外的許多研究進(jìn)一步證實(shí)了5178A這一突變位點(diǎn)與長(zhǎng)壽相關(guān)。隨后也發(fā)現(xiàn)了另一些與長(zhǎng)壽相關(guān)的SNPs如9055A(Ross0A，McCormackR，CurranMDetal:MitochondrialDNApolymorphism:itsroleinlongevityoftheIrishpopulation.ExpGerontol2001;36:1161—1178.)。SNP是指基因組水平上單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，在人群中的頻率需>1%。SNPs這種單堿基變化中有70.1%為同型堿基之間的轉(zhuǎn)換如G/A或T/C，29.1%為發(fā)生在嘌呤和嘧啶之間的顛換。C(胞嘧啶)是人類基因組中最易發(fā)生變化的位點(diǎn)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)是甲基化胞嘧啶，能夠自發(fā)脫氨基轉(zhuǎn)換為T(胸腺嘧啶)，SNPs包含了己知多態(tài)性的80-90%，是最常見(jiàn)的遺傳變異。由于生存的選擇壓力導(dǎo)致SNP在單一基因和整個(gè)基因組中的分布呈不均勻性。SNPs在基因非編碼區(qū)的數(shù)量是編碼區(qū)的4倍，總數(shù)可達(dá)3百萬(wàn)個(gè)(BrookesAJ.TheessenceofSNPs.Gene,1999;234:177-186.)。SNPs以其密度高，平均每lkb就有l(wèi)個(gè)；代表性強(qiáng)，位于基因內(nèi)部的SNPs可能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平；遺傳穩(wěn)定性好，同微衛(wèi)星多態(tài)性比較而言；易于自動(dòng)化分析，因SNPs在人群中為等位基因標(biāo)記，可簡(jiǎn)單以"+/-或l/0"直接分型，成為很好的遺傳標(biāo)志(CollinsFS,BrooksLD，ChakravartiA.A腿polymorphismdiscoveryresourceforresearchonhumangeneticvariation.GenomeRes，1998;8:1229-1231)。服MA技術(shù)是基因分型的一種新方法，樣品在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)擴(kuò)增后直接進(jìn)行HRMA，實(shí)現(xiàn)了閉管操作。由于HRMA完全是基于核酸的物理性質(zhì)進(jìn)行分析，無(wú)需序列特異性探針，因而服MA檢測(cè)不受突變堿基位點(diǎn)和種類的局限，所需要的只是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上增加一個(gè)飽和染料。所以，相比定量探針?lè)?，?jiǎn)化了操作時(shí)間和步驟，大大降低了使用成本。因而HRMA越來(lái)越受到關(guān)注，同時(shí)飽和熒光染料的使用也大大減少了非飽和熒光染料對(duì)PCR反應(yīng)的抑制作用。服MA與以往分型方法中變性高壓液相色譜(denaturinghighpressureliquidchromatography，dHP!X)禾口溫度梯度毛細(xì)管電泳(temperature-gradientcapillaryelectrophoresis,TGCE)相同。但是后兩者方法對(duì)于一些野生型和純合突變的很難分型。盡管可以通過(guò)一個(gè)已知的純合樣本與未知樣本混合，從而形成異源鏈進(jìn)行分型，但是這樣會(huì)使實(shí)驗(yàn)過(guò)程重復(fù)兩次，第一次區(qū)分雜和與純合變異，第二次將已知的純合樣本與未知樣本混合，從而使工作更加繁瑣。同時(shí)，兩次操作也不能實(shí)現(xiàn)閉管操作，增加PCR產(chǎn)物污染問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種與衰老相關(guān)的退行性疾病的線粒體ND3基因分子標(biāo)記及檢測(cè)該分子標(biāo)記的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供檢測(cè)線粒體ND3位點(diǎn)為mtDNA10320的單核苷酸多態(tài)性的方法及特異性擴(kuò)增引物。本發(fā)明的再一目的在于提供檢測(cè)線粒體ND3基因SNPG10320A分子標(biāo)記的試劑盒及該試劑盒的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下具體技術(shù)方案一種檢測(cè)與衰老相關(guān)的退行性疾病的線粒體ND3基因SNPG10320A分子標(biāo)記，其DNA序列如SEQIDNo.l所示。上述檢測(cè)與衰老相關(guān)的退行性疾病線粒體ND3基因SNPG10320A分子標(biāo)記，其中，所述SEQIDNo.10320位點(diǎn)存在一個(gè)分子標(biāo)記SNPG10320A。上述的與衰老相關(guān)的退行性疾病線粒體ND3基因SNPG10320A分子標(biāo)記，其中，所述SEQIDNo.1的第10320位點(diǎn)分子標(biāo)記為G或A。本發(fā)明所述的一種檢測(cè)線粒體ND3基因SNPG10320A分子標(biāo)記的方法，其特征在于，其具體步驟如下(1)提取基因組DNA;(2)線粒體ND3基因單核苷酸多態(tài)性識(shí)別制備混合液步驟(1)制備的基因組DNA溶液、PCR緩沖液、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、PLUS+飽和熒光染料、Cl寡核苷酸探針和純水；PCR條件在95。C5分鐘，95°Cl分鐘，63.5°C30秒，72°C10秒，72°C7分鐘，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；反應(yīng)完成后，將PCR產(chǎn)物再進(jìn)行兩個(gè)變性和復(fù)性的循環(huán)，95。C變性30秒，25i:復(fù)性2分鐘，共2個(gè)循環(huán)；(3)將步驟(2)制備的樣本進(jìn)行高分辨熔解曲線分析。將步驟(2)制備的樣本進(jìn)行測(cè)序，識(shí)別和驗(yàn)證高分辨熔解曲線分型結(jié)果。該測(cè)序?yàn)槌Ｒ?guī)方法，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司提供。該測(cè)序結(jié)果證實(shí)了本發(fā)明高分辨溶解曲線分析方法的準(zhǔn)確性。上述方法中提取基因組DNA的來(lái)源可以為離體的體液也可以為組織細(xì)胞，無(wú)具體限定。上述的一種檢測(cè)線粒體ND3基因SNPG10320A分子標(biāo)記的方法，其中所述的提取基因組DNA的方法為將除去血清的人外周血加入細(xì)胞裂解液37"C孵育過(guò)夜；然后用Tris飽和酚提取DNA2次；收集上層水項(xiàng)，加入氯仿和異丙醇混合液抽提l次；收集水項(xiàng)，加入1/10體積冰醋酸和2.5倍體積的冰無(wú)水乙醇，-20。C過(guò)夜沉淀細(xì)胞DNA;然后離心，加入冷70%乙醇離心1次；使這樣獲得的基因組DNA溶解于TE緩沖液中，然后定量測(cè)定混合物在260nm的吸收率；DNA工作液濃度調(diào)整至30ng/ul，置-2(TC冰箱保存。上述PCR引物為堿基序歹ll如SEQIDNo.2所示的F1..5，-ATTTGATCTAGAAATTGCCCTCC-3，；堿基序列如SEQIDNo.3所示的R1:5，-TTGTAGTCACTCATAGGCCAG-3，。本發(fā)明上述的檢測(cè)方法可用于檢測(cè)ND3基因mtDNA10320位點(diǎn)突變情況。本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)線粒體ND3基因SNPG10320A分子標(biāo)記的特異性引物，其長(zhǎng)度為2123bp，堿基序列如SEQIDNo.2所示的Fl:5，-ATTTGATCTAGAAATTGCCCTCC-3，；堿基序列如SEQIDNo.3所示的Rl:5，-TTGTAGTCACTCATAGGCCAG-3，。上述特異性引物可以準(zhǔn)確擴(kuò)增出含有mtDNA10320位點(diǎn)的ND3基因序列。本發(fā)明所述的一種檢測(cè)線粒體ND3基因SNPG10320A分子標(biāo)記的試劑盒，該試劑盒由以下試劑組成、來(lái)源如下本發(fā)明試劑盒供10人份檢測(cè)應(yīng)用，-2(TC保存(1)130ul純水(自制)；(2)20ul10XPCR緩沖液(Takara);(3)4ul10mMdNTP混合液(Pharmacia);(4)20ullunit/ulTaqDNA聚合酶(Takara);(5)2ullpmol/ulFl引物(自制);(6)2ul10praol/ulRl引物(自制)(6)20ullXLCGreenPLUS+飽和熒光染料(Idaho);(7)探針2ul10pmol/ulCl(自制)；其中引物F1堿基序列如SEQIDNo.2所示，R1如SEQIDNo.3所示；探針C1堿基序列如SEQIDNo.4所示。5，-ACAACTAACCTACCACTAATAGTTATGTCATCC-C3-3，此探針中3'端需要被阻斷，避免其在PCR擴(kuò)增中的延伸。而3'阻斷通常使用3'-磷酸化，2'3'-雙脫氧核核苷酸，3'-脫氧核苷酸，3'-3個(gè)碳烷基。但3'-3個(gè)碳垸基，穩(wěn)定性較好。本發(fā)明試劑盒的使用方法1)通過(guò)PCR擴(kuò)增ND3基因，先制備混合液，加入基因組DNA溶液2ul、2ul10XPCR緩沖液、0.4ul10mMdNTP、2ulTaqDNA聚合酶、分別O.2ul的Fl和Rl為正義引物和反義引物，2ulLCGreenPLUS+飽和熒光染料，0.2ul的Cl探針。接著，加入純水，使總體積為20ul。反應(yīng)在95。C5分鐘，95。Cl分鐘，63.5。C30秒，72。C10秒，72°C7分鐘，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。2)反應(yīng)完成后，將PCR產(chǎn)物再進(jìn)行兩個(gè)變性和復(fù)性的循環(huán)，95t:變性30秒，25°C復(fù)性2分鐘，共2個(gè)循環(huán)。然后將樣本在LightscannerTMHR-196儀中進(jìn)行熔解曲線分析。通過(guò)儀器以0.3C/秒的速度從5(TC升溫到98'C，獲得樣品的熔解曲線。3)多態(tài)性分型根據(jù)樣品的熔解曲線，如果為A，熒光信號(hào)隨溫度升高首先開(kāi)始下降，如果為G，熒光信號(hào)隨溫度升高而后開(kāi)始下降。上述的一種檢測(cè)線粒體ND3基因單核苷酸多態(tài)性的試劑盒可用于預(yù)測(cè)衰老相關(guān)的退行性疾病的應(yīng)用。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果SNPG10320A分子標(biāo)記基因型為A時(shí)，受試者與衰老相關(guān)的退行性疾病關(guān)系不大；如果基因型為G時(shí)，受試者與衰老相關(guān)的退行性疾病可能有一定的遺傳關(guān)系，可做進(jìn)一步檢測(cè)或者適當(dāng)注意改變不良的生活習(xí)慣。上述與衰老相關(guān)的退行性疾病為中風(fēng)、心血管疾病、2型糖尿病、帕金森病、老年性癡呆和/或癌癥。本發(fā)明引物設(shè)計(jì)是根據(jù)劍橋參考序列提供的人類線粒體基因組全序列(輕鏈)Genbank:REFSEQAC—000021.2gi:115315570(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgidb=nucleotide&val=115315570)，在第10320位為G，其反義鏈為A的突變。本發(fā)明的測(cè)定方法測(cè)定了來(lái)源于人的基因組DNA，樣品沒(méi)有限制如，體液(如血液、腹水和尿液)、組織細(xì)胞(如肝組織)等，通過(guò)提取和純化這些樣品可制備基因組DNA。從基因組DNA中，可擴(kuò)增含ND3基因突變點(diǎn)的DNA片段，以獲得用于測(cè)定的大量樣本。這種通過(guò)擴(kuò)增含ND3基因突變點(diǎn)的DNA片段獲得的樣品，特別適于用作測(cè)定材料。例如，可按PCR方法，使用引物進(jìn)行擴(kuò)增，此引物經(jīng)合理設(shè)計(jì)以便僅擴(kuò)增含ND3基因多態(tài)性的部分。本發(fā)明特異性引物為本發(fā)明的發(fā)明點(diǎn)之一，該引物本領(lǐng)域技術(shù)人員可經(jīng)常規(guī)制備引物的方法制備。待擴(kuò)增區(qū)的堿基長(zhǎng)度不受限制。當(dāng)按本發(fā)明所述制備引物時(shí)，可獲得適宜的測(cè)定樣品，其作為擴(kuò)增的DNA片段，并具有特異性長(zhǎng)度。HRMA技術(shù)的主要的原理主要是依據(jù)雜合異源雙鏈的形成。在PCR反應(yīng)前加入飽和熒光染料，在一定的溫度范圍內(nèi)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性，使DNA雙鏈逐漸解鏈，此時(shí)熒光染料分子逐漸從DNA雙鏈上脫落，熒光信號(hào)會(huì)下降。如果某個(gè)體是雜合突變，該個(gè)體的PCR產(chǎn)物中會(huì)形成雜合異源雙鏈及不配對(duì)的堿基對(duì)，那么該樣品在溫度逐漸升高的時(shí)候會(huì)首先發(fā)生解鏈，其熒光信號(hào)首先開(kāi)始下降，而此時(shí)的純合個(gè)體的樣品由于解鏈溫度較高，熒光信號(hào)沒(méi)有下降或者下降的較慢，lightscanner儀器通過(guò)光學(xué)檢測(cè)熒光信號(hào)變化并繪制溫度熔解曲線，根據(jù)曲線準(zhǔn)確區(qū)分野生型、雜合突變、純和突變。進(jìn)行高分辨熔解曲線分析時(shí)，采用未標(biāo)記探針?lè)蠢貌坏攘康囊镞M(jìn)行非對(duì)稱PCR反應(yīng)，在PCR產(chǎn)物中除了雙鏈DNA外，還存在一條與探針雜交的過(guò)量單鏈DNA，通過(guò)在一定的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行變性，使得與單鏈DNA不完全配對(duì)(形成異源雙鏈)的探針先解鏈，完全配對(duì)的探針后解鏈的原理，進(jìn)行探針區(qū)域的SNPs分型。這種方法可以克服以往小擴(kuò)增子法的局限性，將兩種純合子準(zhǔn)確分型。此探針序列的3'端需要加3個(gè)碳烷基修飾，以避免其在PCR反應(yīng)中的延伸。因此，本發(fā)明根據(jù)PCR方法擴(kuò)增的所需DNA片段，通過(guò)上述合理引物，探針得以設(shè)計(jì)。光學(xué)檢測(cè)熒光信號(hào)變化產(chǎn)生溫度熔解曲線證實(shí)，它們顯示不同的熔解曲線。根據(jù)在上述方法中獲得的熔解曲線，可測(cè)定mtDNAG10320A單核苷酸多態(tài)性。在進(jìn)行本發(fā)明的基因檢測(cè)時(shí)，優(yōu)選使用用于測(cè)定根據(jù)mtDNAG10320A單核苷酸多態(tài)性的突變類型存在的試劑，檢測(cè)試劑包括作為必要成分的特定試劑，其對(duì)應(yīng)于用于測(cè)定mtDNAG10320A單核苷酸多態(tài)性突變類型的方法。特定的試劑按采用的測(cè)定方法來(lái)適當(dāng)?shù)剡x擇。試劑的特征是，組成測(cè)定由mtDNAG10320A單核苷酸多態(tài)性定義的突變類型的手段是必要的，如，DNA片段或高分辨熔解曲線分析。試劑，例如特定制備的用于PCR擴(kuò)增步驟的引物，該步驟用于包含高分辨熔解曲線分析單核苷酸多態(tài)性的突變點(diǎn)的特定擴(kuò)增片段，不被認(rèn)為是本發(fā)明診斷試劑的必要成分，它們也包含于本發(fā)明的診斷試劑之中。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果是本發(fā)明提出了一種新的線粒體ND3基因SNPG10320A分子標(biāo)記可以作為檢測(cè)與衰老相關(guān)的退行性疾病應(yīng)用。本發(fā)明所提供的檢測(cè)ND3的SNP方法，為一種生物學(xué)的檢測(cè)方法，與現(xiàn)有檢測(cè)方法相比較，具有顯著的進(jìn)步，如本發(fā)明方法對(duì)于樣本沒(méi)有特殊的限制，無(wú)論是體液和組織細(xì)胞均可作為本發(fā)明檢測(cè)樣本，使得檢測(cè)方便簡(jiǎn)捷；本發(fā)明所設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)待擴(kuò)增區(qū)的堿基長(zhǎng)度無(wú)嚴(yán)格要求，通過(guò)本發(fā)明特異性引物可獲得本發(fā)明所述的PCR產(chǎn)物并進(jìn)行高分辨熔解曲線的分析；本發(fā)明在PCR反應(yīng)前加入飽和熒光染料，lightscanner儀器通過(guò)光學(xué)檢測(cè)熒光信號(hào)變化并繪制溫度熔解曲線，根據(jù)曲線可以準(zhǔn)確區(qū)分野生型、雜合突變、純和突變。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)成本低廉，且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，具有很好的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值。本發(fā)明為一種生物學(xué)的基因位點(diǎn)檢測(cè)方法，與現(xiàn)有檢測(cè)方法比較有顯著的效果，本發(fā)明檢測(cè)目的為得知mtDNAG10320A單核苷酸多態(tài)性，其檢測(cè)結(jié)果可以為與衰老相關(guān)的退行性疾病預(yù)測(cè)提供中間信息，該檢測(cè)信息可以輔助受檢者注意日常飲食和建立正常健康的生活習(xí)慣，但并不能作為最終確定或者預(yù)測(cè)與衰老相關(guān)的退行性疾病患病依據(jù)，因此本發(fā)明并不是疾病的診斷和治療方法。上述內(nèi)容已經(jīng)充分的說(shuō)明了本發(fā)明的技術(shù)方案和有益效果，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步敘述，以使公眾對(duì)
發(fā)明內(nèi)容有更深入的了解，具體實(shí)施方式的實(shí)施例均為最佳的技術(shù)方案，而并非對(duì)本發(fā)明的限制。圖l為mtDNAG10320A的基因分型數(shù)據(jù)圖；圖中顯示不同的基因型隨溫度改變形成不同熔解曲線，黑色曲線為基因型A，灰色的曲線為基因型G。圖2為PCR-直接測(cè)序法所得的多核苷酸序列結(jié)果經(jīng)生物信息學(xué)比對(duì)后識(shí)別線粒體NDl基因mtDNAG10320ASNP標(biāo)記。圖3-l和3-2為本發(fā)明方法檢測(cè)結(jié)果由PCR-直接測(cè)序法驗(yàn)證圖；線粒體ND3基因mtDNAG10320A基因位點(diǎn)使用本專利試劑盒基因型分型結(jié)果與DNA測(cè)序結(jié)果一致。具體實(shí)施例方式用于下列實(shí)施例中表示試劑的英文縮寫(xiě)如下。需要時(shí)，用高壓鍋(12(TC，20分鐘)滅菌EDTA:乙二胺四乙酸二鈉市售SDS:十二垸基硫酸鈉市售TE緩沖液30ug/mlRNaseA，lOmmol/LTris-HC1pH8.0，lmmol/LEDTA10PCR緩沖液lOOmMTris—HC1(pH8.3)，500mMKC1，15mM氯化鎂(MgC12)0.01%(W/V)白明膠自制dNTP:脫氧核苷三磷酸市售實(shí)施例l:血液樣本收集和基因組DNA的提取一、樣本選擇入戶調(diào)查廣西巴馬地區(qū)的長(zhǎng)壽老人，年齡^90歲。意識(shí)清楚，生活自立，能配合檢查，無(wú)心腦血管疾病，老年癡呆，帕金森氏癥，癌癥等衰老相關(guān)的退行性性疾病，共372例。記錄所有受試者的基本信息并由本人或親屬簽署知情同意。這一研究也得到了本單位倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。二、制備基因組DNA在抗凝劑EDTA存在下，將收集的5ml受試者外周血在2500rpm，離心分離30分鐘除去血清。接著加入5ml細(xì)胞裂解液(含10mmol/LTris-HC1p朋.0，10ramol/LEDTApH8.0，15mmo1/LNacl，0.4%SDS，0.lmg/ml蛋白酶K)37。C孵育過(guò)夜。然后用Tris飽和酚(pH8.0)5ml提取DNA2次(12000r/min，10min)。收集上層水項(xiàng)，加入5ml氯仿和異丙醇(24:1)混合液抽提l次(離心12000r/min,10min)。收集水項(xiàng)，加入1/10體積3M冰醋酸和2.5倍體積的冰無(wú)水乙醇，一2(TC過(guò)夜沉淀細(xì)胞DNA。然后離心12000r/min，30min，加入冷70%乙醇lml洗l次(離心12000r/min，10min)。使這樣獲得的基因組DNA溶解于TE緩沖液中，然后定量測(cè)定混合物在260咖的吸收率。DNA工作液濃度調(diào)整至30ng/ul，置-2(TC冰箱保存。實(shí)施例2:SNP的識(shí)別確定本發(fā)明采用HRMA和PCR測(cè)序技術(shù)同時(shí)對(duì)G10320A位點(diǎn)(其等位位點(diǎn)對(duì)為C/T)進(jìn)行檢測(cè)。一.特異性引物如下F1:5，-ATTTGATCTAGAAATTGCCCTCC-3，；(SEQIDNO.2)Rl:5，-TTGTAGTCACTCATAGGCCAG-3，(SEQIDNO.3)二.通過(guò)PC財(cái)廣增G10320A附近部分片段；制備混合液加入上述實(shí)施例l制備基因組DNA溶液2ul、2ul10XPCR緩沖液、0.4ul10mMdNTP、2ulTaqDNA聚合酶、分別0.2ul的Fl和Rl為正義引物和反義引物，2ulLCGreenPLUS+飽和熒光染料，0.2ul的Cl探針。接著，加入純水，使總體積為20ul。反應(yīng)在95。C5分鐘，95。Cl分鐘，63.5°C30秒，72"C10秒，72"C7分鐘，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，將PCR產(chǎn)物再進(jìn)行兩個(gè)變性和復(fù)性的循環(huán)，95t變性30秒，25。C復(fù)性2分鐘，共2個(gè)循環(huán)。三.通過(guò)將樣本在LightscannerTMHR-196儀中進(jìn)行熔解曲線分析。儀器以O(shè).3C/秒的速度從5(TC升溫到98。C,獲得樣品的熔解曲線。如圖1所示，圖l為mtDNAG10320A的基因分型數(shù)據(jù)圖；根據(jù)樣品的熔解曲線，如果為A，熒光信號(hào)隨溫度升高首先開(kāi)始下降，如果為G，熒光信號(hào)隨溫度升高而后開(kāi)始下降。圖譜中黑色曲線代表mtDNA10320A;灰色曲線代表為mtDNA10320G。上述實(shí)施例結(jié)果驗(yàn)證利用PCR-直接測(cè)序法將實(shí)施例1制備的樣本進(jìn)行DNA測(cè)序，識(shí)別和驗(yàn)證實(shí)施例2高分辨熔解曲線分型結(jié)果。該測(cè)序?yàn)槌Ｒ?guī)方法在此不贅述，該測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司提供。該測(cè)序結(jié)果證實(shí)了本發(fā)明高分辨溶解曲線分析方法的準(zhǔn)確性。如圖2所示，為PCR-直接測(cè)序法所得的多核苷酸序列結(jié)果經(jīng)生物信息學(xué)比對(duì)后識(shí)別線粒體ND3基因mtDNAG10320ASNP標(biāo)記；如圖3-l和3-2所示，圖3-1和3-2為本發(fā)明方法檢測(cè)結(jié)果由PCR-直接測(cè)序法驗(yàn)證圖；線粒體ND3基因mtDNA10320基因位點(diǎn)使用本專利試劑盒基因型分型結(jié)果與DNA測(cè)序結(jié)果一致。實(shí)施例3:mtDNA10320單核苷酸多態(tài)性與與衰老相關(guān)的退行性疾病的相關(guān)一.統(tǒng)計(jì)方法利用STATA8.0和SPSS11.0軟件中Pearson卡方檢驗(yàn)計(jì)算mtDNA10320單核苷酸多態(tài)性的攜帶者頻率，進(jìn)行連續(xù)校正和單側(cè)漸近概率分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性水平設(shè)定為P〈0.05。采用單因素Logistic回歸分析計(jì)算長(zhǎng)壽的風(fēng)險(xiǎn)0R值及其95n/0可信區(qū)間(CI)。二.結(jié)果1.健康人mtDNA10320單核苷酸多態(tài)性分布按實(shí)施例1和2的方法測(cè)定了384個(gè)健康人(年齡《60歲)的基因多態(tài)性。379人在第10320位堿基有G多態(tài)性(98.7%)，5人有A的多態(tài)性(1.3%)。2.健康老人(無(wú)與衰老相關(guān)的退行性疾病者，年齡》90歲)mtDNA10320單核苷酸多態(tài)性分布按實(shí)施例1和2的方法測(cè)定個(gè)上述老人的基因多態(tài)性。359人在第10320位有G堿基多態(tài)性(96.5%)，發(fā)現(xiàn)13人有A堿基多態(tài)性(3.5%)。3.健康老人組和健康對(duì)照組比較比較健康老人組和健康對(duì)照組mtDNA10320單核苷酸多態(tài)性的頻率分布，詳見(jiàn)表l。表lmtDNA10320單核苷酸多態(tài)性(SNP)頻率風(fēng)險(xiǎn)性在健康老人組和健康正常人群中的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由表1可見(jiàn)，mtDNA第10320位的常見(jiàn)SNP位點(diǎn)的G等位位點(diǎn)，即在其DNA互補(bǔ)鏈上為C等位位點(diǎn)，當(dāng)突變?yōu)锳時(shí)，在健康老人群體中的分布頻率大大高于對(duì)照群體中的頻率，相差約2.2%，有顯著性差別(P=0.048)。而且OR值反映位點(diǎn)A的頻率在健康老人人群中高出正常人2.745倍，均表明這是與健康衰老相關(guān)的一個(gè)等位基因。G10320A位于ND3基因，其表達(dá)產(chǎn)物為NADH脫氫酶(復(fù)合體I)亞單位3，該突變?yōu)殄e(cuò)義突變，使得編碼的纈氨酸變?yōu)楫惲涟彼?，可能在功能上通過(guò)影響編碼蛋白的功能，從而影響線粒體功能。實(shí)施例4:檢測(cè)試劑盒本發(fā)明試劑盒供io人份檢測(cè)應(yīng)用，保存溫度為-2crc，包括130ul純水；20ul10XPCR緩沖液;4ul10mMdNTP混合液；20ullunit/ulTaqDNA聚合酶;2ullpmol/ulFl引物(SEQIDNo.1);2ul10pmol/ulRl引物(SEQIDNo.2);20ullXLCGreenPLUS+飽和熒光染料；探針2ul10pmol/ulCl(SEQIDNo.3)。引物序列為Fl:5'-ATTTGATCTAGAAATTGCCCTCC-3，；(SEQIDNo.2)Rl:5，-TTGTAGTCACTCATAGGCCAG-3，(SEQIDNo.3)探針序列為Cl:(SEQIDNo.4)5'-ACAACTAACCTACCACTAATAGTTATGTCATCC-C3-3，本試劑盒經(jīng)PCR-HRMA檢測(cè)后，可輕易檢測(cè)出第10320位的G—A的SNP。本發(fā)明具有實(shí)用性的例證1.本發(fā)明的mtDNA10320單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，可用于分析人線粒體的ND3基因上的常見(jiàn)SNP的A等位位點(diǎn)，應(yīng)用對(duì)個(gè)體是否與衰老相關(guān)的退行性疾病有關(guān)系進(jìn)行考察，以利于開(kāi)展早期干預(yù)和生活習(xí)慣的改進(jìn)。2.利用本發(fā)明闡述mtDNA10320堿基變異，作為生物標(biāo)志物之一，可用作藥物設(shè)計(jì)的分子靶標(biāo)的篩選，促進(jìn)老年相關(guān)疾病新藥開(kāi)發(fā)。3.本發(fā)明建立的檢測(cè)ratDNA10320單核苷酸多態(tài)性的核酸序列和相關(guān)位點(diǎn)，可高靈敏度，特異性地應(yīng)用于長(zhǎng)壽基因檢測(cè)用的試劑盒。如上所述，得出結(jié)論，mtDNA單核苷酸多態(tài)性在第10320位堿基的多態(tài)性與衰老相關(guān)的退行性疾病具顯著相關(guān)性。本發(fā)明敘述了與衰老相關(guān)的退行性疾病相關(guān)的新突變點(diǎn)，并提供了一種測(cè)定mtDNA10320單核苷酸多態(tài)性的方法。而且，根據(jù)本發(fā)明，只需要少量DNA樣品就足以測(cè)定mtDNA10320單核苷酸多態(tài)性的多態(tài)性。按照1990年前后死亡水平的估算表明，80歲老人活到100歲以上高壽的平均概率分別為0.65%。如此稀少的人有可能活到100歲高壽，充分說(shuō)明，與一般人群相比，長(zhǎng)壽老人比較有可能攜帶有利于老齡健康的基因，根據(jù)概率計(jì)算可知本實(shí)驗(yàn)所抽樣結(jié)果代表約6萬(wàn)群體的抽樣結(jié)果，具有可行性和準(zhǔn)確性，符合統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，可用于其他地區(qū)其他人群的檢測(cè)。序歹lJ表〈110〉衛(wèi)生部北京醫(yī)院<120〉與衰老相關(guān)退行性疾病的線粒體ND3基因SNPG10320A分子標(biāo)記、檢測(cè)方法及試劑盒〈130〉〈160〉4<170〉Patentlnversion3.5〈210〉1〈211>133<212〉醒〈213〉人類線粒體基因〈400〉1atttgatctagaaattgccctccttttacccctaccatgagccctacaaacaactaacct60gccactaatarttatgtcatccctcttattaatcatcatcctagccctaagtctggccta120tgagtgactacaa133<210〉2<211〉23〈212〉副A<213>人工序列〈400〉2atttgatctagaaattgccctcc23<210>3〈211〉21<212〉腿<image>imageseeoriginaldocumentpage17</image>權(quán)利要求1、一種與衰老相關(guān)的退行性疾病線粒體ND3基因SNPG10320A分子標(biāo)記，其特征在于，DNA序列如SEQIDNo.1所示。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的與衰老相關(guān)的退行性疾病線粒體ND3基因SNPG10320A分子標(biāo)記，其特征在于，所述SEQIDNo.1中第10320位點(diǎn)存在一個(gè)分子標(biāo)記SNPG10320A。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的與衰老相關(guān)的退行性疾病線粒體ND3基因SNPG10320A分子標(biāo)記，其特征在于，所述SEQIDNo.1的第10320位點(diǎn)分子標(biāo)記為G或A。4、一種檢測(cè)權(quán)利要求2所述的線粒體ND3基因SNPG10320A分子標(biāo)記的方法，其特征在于，其具體步驟如下(1)提取基因組DNA;(2)線粒體ND3基因單核苷酸多態(tài)性識(shí)別制備混合液步驟(1)制備的基因組DNA溶液、PCR緩沖液、dNTP、TaqDNA聚合酶、PCR引物、PLUS+飽和熒光染料、寡核苷酸探針和純水；PCR條件:在95。C5分鐘，95°Cl分鐘，63.5°C30秒，72°C10秒，72°C7分鐘，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；反應(yīng)完成后，將PCR產(chǎn)物再進(jìn)行兩個(gè)變性和復(fù)性的循環(huán)，95'C變性30秒，25'C復(fù)性2分鐘，共2個(gè)循環(huán)；(3)將步驟(2)制備的樣本進(jìn)行高分辨熔解曲線分析。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)線粒體ND3基因SNPG10320A分子標(biāo)記的方法，其特征在于，所述PCR引物為堿基序列如SEQIDNo.2所示的Fl:5，-ATTTGATCTAGAAATTGCCCTCC-3，；堿基序列如SEQIDNo.3所示的Rl:5，-TTGTAGTCACTCATAGGCCAG-3，。6、一種用于檢測(cè)權(quán)利要求2所述的線粒體ND3基因SNPG10320A分子標(biāo)記的特異性引物，其特征在于，其長(zhǎng)度為2123bp，堿基序列如SEQIDNo.2所示的Fh5，-ATTTGATCTAGAAATTGCCCTCC-3，；堿基序歹U如SEQIDNo.3所示的R1:5，-TTGTAGTCACTCATAGGCCAG-3，。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的特異性引物，其特征在于，所述的特異性引物可以擴(kuò)增出含有mtDNA10320位點(diǎn)的ND3基因序列。8、一種檢測(cè)權(quán)利要求2所述的線粒體ND3基因SNPG10320A分子標(biāo)記的試劑盒，其特征在于，該試劑盒由以下試劑組成(1)130ul純水；(2)20ul10XPCR緩沖液;(3)4ullOmMdNTP混合液;(4)20ullunit/ulTaqDNA聚合酶;(5)2ullpmol/ulFl引物；(6)2ul10pmol/ulRl引物；(7)20ullXLCGreenPLUS+飽和熒光染料，(8)探針2ul10pmol/ulCl;其中引物F1堿基序列如SEQIDNo.2所示，R1如SEQIDNo.3所示;探針C1堿基序列如SEQIDNo.4所示。9、權(quán)利要求8所述的檢測(cè)線粒體ND3基因SNPG10320A分子標(biāo)記的試劑盒用于預(yù)測(cè)衰老相關(guān)的退行性疾病的應(yīng)用。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測(cè)線粒體ND3基因SNPG10320A分子標(biāo)記的試劑盒的應(yīng)用，其特征在于，所述衰老相關(guān)的退行性疾病為中風(fēng)、心血管疾病、2型糖尿病、帕金森病和/或老年性癡呆。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種與衰老相關(guān)退行性疾病的分子標(biāo)記和檢測(cè)該分子標(biāo)記SNP的方法以及檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明方法對(duì)于樣本沒(méi)有特殊的限制，無(wú)論是體液和組織細(xì)胞均可作為本發(fā)明檢測(cè)樣本，使得檢測(cè)方便簡(jiǎn)捷；本發(fā)明所設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)待擴(kuò)增區(qū)的堿基長(zhǎng)度無(wú)嚴(yán)格要求，通過(guò)本發(fā)明特異性引物可獲得本發(fā)明所述的PCR產(chǎn)物并進(jìn)行高分辨熔解曲線的分析；在PCR反應(yīng)前加入飽和熒光染料，lightscanner儀器通過(guò)光學(xué)檢測(cè)熒光信號(hào)變化并繪制溫度熔解曲線，根據(jù)曲線可以準(zhǔn)確區(qū)分野生型、雜合突變、純和突變。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)成本低廉，且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，具有很好的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)價(jià)值。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101525665SQ20091008156公開(kāi)日2009年9月9日申請(qǐng)日期2009年4月13日優(yōu)先權(quán)日2009年4月13日發(fā)明者鋼萬(wàn),潔馮,雷唐,放孔,張建佚,澤楊,靜陳,齊科研申請(qǐng)人:衛(wèi)生部北京醫(yī)院