專利名稱：：植物響應低磷和高鹽脅迫的蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種植物響應低磷和高鹽脅迫的蛋白及其編碼基因與應用，特別涉及來源于擬南芥的一種調(diào)控植物響應低磷和高鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應用。
背景技術(shù)：
：糧食問題是當今世界所面臨的幾大難題之一。土壤缺磷和鹽漬化是限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的兩個重要限制因素。磷礦是不可再生的資源，大量施用磷肥會造成環(huán)境污染；鹽漬土是一種世界性的低產(chǎn)土壤，甚至是不毛之地。因此，認識植物對低磷和高鹽脅迫的反應機制，提高植物自身對低磷和高鹽脅迫的耐受能力，已成為如何進一步提高作物產(chǎn)量的重要研究工作，倍受世界各國政府和植物及農(nóng)業(yè)科學家的關(guān)注。擬南芥C^a&'^^w's"3h'a/7a)是一種典型的模式植物(其作用與實驗鼠、果蠅等模式生物相當)，已被廣泛應用于植物遺傳學、發(fā)育生物學和分子生物學的研究。擬南芥共有約1.3億個堿基對，約2.7萬個基因?，F(xiàn)在已知擬南芥基因組中含有超過1500個編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因，其中WRKY基因有74個，這些WRKY基因在植物響應低磷和高鹽脅迫中的作用還不清楚。擬南芥的大多數(shù)基因在其他植物中都能找到與之同源的基因，有關(guān)擬南芥的絕大多數(shù)發(fā)現(xiàn)都能應用于其他植物的研究。以往的研究已經(jīng)證明，對擬南芥的研究將幫助科學家找到提高農(nóng)作物產(chǎn)量的方法。面對農(nóng)作物生產(chǎn)中日益嚴重的土壤低磷和高鹽問題，克隆調(diào)控植物響應低磷和高鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄因子基因并對其功能進行研究，對盡快培育耐低磷和耐高鹽作物品種有重要的實踐意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種植物響應低磷和高鹽脅迫的蛋白及其編碼基因與應用。本發(fā)明所提供的植物響應低磷和高鹽脅迫的蛋白，名稱為AtLPSTC^s&VopsAz^ah'朋a尸力os;3力atea/c/5"a7t7b7era/7ce)，來源于哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Ar3Z^'c/o/7s/s^a力'a^)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐逆性功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。其中，序列表中的序列2所示的蛋白序列由553個氨基酸殘基組成。為了使(a)中的AtLPST分泌到細胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中或使其功能穩(wěn)定，可在由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的N端連接上信號肽序列，為了(a)中的AtLPST便于純化，可在由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的N端或C端連接上如表1所示的標簽。表l.標簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述(b)中的AtLPST可人工合成，也可先合成其編碼基因，再按照下述方法進行生物表達得到。上述(b)中的AtLPST的編碼基因可通過將序列表中序列l(wèi)的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端連上信號肽的編碼序列，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。上述植物響應低磷和高鹽脅迫的蛋白植物響應低磷和高鹽脅迫的蛋白的編碼基因""尸5D也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述植物響應低磷和高鹽脅迫的蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之1)序列表中SEQIDW2:1的核苷酸序列；2)在高嚴謹條件下可與1)所述的DNA序列雜交的核苷酸序列。其中，序列表中序列l(wèi)是由1662個脫氧核苷酸組成，自序列表中序列1的5'端第1-1659位核苷酸序列為編碼序列(0RF)，編碼具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。上述植物響應低磷和高鹽脅迫的蛋白的基因組基因，可具有下述核苷酸序列之1)序列表中SEQIDJ^:3的核苷酸序列；2)在高嚴謹條件下可與l)所述的DNA序列雜交的核苷酸序列。序列表中序列3由2597個核苷酸組成，自序列3的5'端第125-490位核苷酸為第一個外顯子，自序列3的5'端第696-797位核苷酸為第二個外顯子，自序列3的5'端第890-1042位核苷酸為第三個外顯子，自序列3的5'端第1126-1447位核苷酸為第四個外顯子，自序列3的5'端第1540-1656位核苷酸為第五個外顯子，自序列3的5'端第1776-2393位核苷酸為第六個外顯子。自序列3的5'端第491-695位核苷酸為第一個內(nèi)含子，自序列3的5'端第798-889位核苷酸為第二個內(nèi)含子，自序列3的5'端第1043-1125位核苷酸為第三個內(nèi)含子，自序列3的5'端第1448-1539位核苷酸為第四個內(nèi)含子，自序列3的5'端第1657-1775位核苷酸為第五個內(nèi)含子。自序列3的5'端第1-124位核苷酸為5'UTR，第2394-2597位為3'UTR。上述高嚴謹條件可為在O.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液中，在65。C下雜交并洗膜。含有上述植物響應低磷和高鹽脅迫的蛋白的編碼基因的表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，將本發(fā)明所提供的力"尸6T基因敲除掉或使力"尸5T基因表達量降低，植物就表現(xiàn)耐低磷和耐高鹽性狀；或者將力"尸5T基因在植株中過量表達，植物就表現(xiàn)低磷敏感和高鹽敏感性狀。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記或具有抗性的抗生素標記物。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物。本發(fā)明的基因?qū)ε嘤偷土缀湍透啕}新品種，以及植物對低磷和高鹽耐受的研究具有重要意義，如利用本發(fā)明的基因可設(shè)計小干擾RNA對該基因的表達進行干擾、插入突變該基因或者缺失突變該基因，從而提高植物對低磷和高鹽的耐受能力。本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)入植物中過表達，可作為土壤磷指標和鹽指標的指示植物，預警土壤的低磷和/或高鹽。下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。圖1為野生型、^"尸5T過量表達植株(35S::力7Z尸5T-刃和J"尸6T敲除突變體("&"-7)在低磷條件下的表型觀察結(jié)果。圖2為野生型、Jz^尸5T過量表達植株(35S:M7Z尸5T-9)和^Z尸67敲除突變體(s"pst-7)的幼苗在高鹽條件下的表型觀察結(jié)果。圖3為野生型、JM尸5T過量表達植株(35S::^7Z尸6T-^)和JM尸5T敲除突變體("7p"-7)的成苗在高鹽條件下的表型觀察結(jié)果。圖4為低磷條件下^"/^T基因的表達變化結(jié)果。圖5為高鹽條件下^"尸5T基因的表達變化結(jié)果。量表達植株(35S::J7Z尸5T-50和Z"尸5T敲除突變體("7p^-7)的磷含量測定結(jié)果。圖7為野生型、X"尸5T過量表達植株(35S::力7Z尸5T-9)和^"尸5T敲除突變體(s^pW-"的鉀、鈉含量測定結(jié)果。具體實施例方式下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法實施例l、植物響應低磷和高鹽脅迫的蛋白及其編碼基因的獲得提取10天擬南芥(Col咖bia型)幼苗總RNA、反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以此cDNA為模板、利用分別設(shè)有Kpnl和Sacl酶切位點的一對引物進行PCR擴增，得到耐旱相關(guān)基因的cDNA全長。引物序列如下Primer1:5'-ggtaccATGGACAGAGGATGGTCTGGTCTC-3，(輛I);Primer2:5'-gagctcCTATTGATTTTTGTTGTTTCCTTCGCCGTCGT-3，(Sacl)。采用Takara公司的高保真的PyrobestDNA聚合酶進行擴增，擴增體系為50nL，含10XPyrobestPCR緩沖液5.O)iL，10raMdNTPmix1.OfiL，引物各1.0|iL，Pyrobest酶0.5pL，模板3.0|iL(0.lug)，補充滅菌超純水至50pL，反應體系在冰上進行操作。在PE9700儀器上進行擴增，預變性5min，95。C變性30s，56°C30s，72°C2min，循環(huán)數(shù)30個，72。C延伸10min。將擴增片段用0.8%的瓊脂糖凝膠進行電泳，回收擴增片段，連接到pMD18-T載體，酶切、擴增、測序鑒定，測序結(jié)果表明，上述PCR擴增得到的片段具有序列表中序列l(wèi)的核苷酸序列，為本發(fā)明的調(diào)控植物響應低磷和高鹽脅迫cDNA基因命名為力M/^7;序列表中序列1的核苷酸序列由1662個堿基組成，其編碼序列為自序列表中序列1的第1一1659位核苷酸，編碼具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列。將上述獲得的正確的含有力"尸67的重組載體命名為pMD18-力tZ尸5T。提取10天擬南芥(Columbia型)幼苗總DNA，以此DNA為模板、利用一對引物進行PCR擴增，得到耐旱相關(guān)基因的基因組DNA全長。引物序列如下Primer3:5'-ACAGACTCTTTCTTAATCTCTCTCTCTTTC-3';Primer4:5，-AAAGCTTTAAAGGCAATGCTAATTAAG-3，。采用Takara公司的高保真的PyrobestDNA聚合酶進行擴增，擴增體系為5(VL，含10XPyrobestPCR緩沖液5.0jiL，10mMdNTPmix1.0pL，引物各1.0pL，Pyrobest酶0.5pL，模板3.0nL(0.lug)，補充滅菌超純水至50|iL，反應體系在冰上進行操作。在PE9700儀器上進行擴增，預變性5min，95。C變性30s，56°C30s，72°C3.5min，循環(huán)數(shù)30個，72。C延伸10min。對PCR產(chǎn)物進行測序，得到2597bp的核苷酸片段，是具有序列表中序列3的核苷酸序列，為本發(fā)明的調(diào)控植物響應低磷和高鹽脅迫基因組基因，將其命名為g」"/^71。將g^z^R5T連接到pMD18-T載體得到的重組載體命名為pMD18-g^Z尸6T。序列表中序列3的5'端第125-490位核苷酸為第一個外顯子，自序列3的5'端第696-797位核苷酸為第二個外顯子，自序列3的5'端第890-1042位核苷酸為第三個外顯子，自序列3的5'端第1126-1447位核苷酸為第四個外顯子，自序列3的5'端第1540-1656位核苷酸為第五個外顯子，自序列3的5'端第1776-2393位核苷酸為第六個外顯子。自序列3的5'端第491-695位核苷酸為第一個內(nèi)含子，自序列3的5'端第798-889位核苷酸為第二個內(nèi)含子，自序列3的5'端第1043-1125位核苷酸為第三個內(nèi)含子，自序列3的5'端第1448-1539位核苷酸為第四個內(nèi)含子，自序列3的5'端第1657-1775位核苷酸為第五個內(nèi)含子。自序列3的5'端第1-124位核苷酸為5'UTR，第2394-2597位為3'UTR。實施例2、植物響應低磷和高鹽脅迫的蛋白及其編碼基因的功能驗證一、^Z尸67過量表達植株(35S::J7Z尸6T-力的獲得采用實施例l所獲得的含有^Z尸57基因的重組載體pMD18-AZ尸57S]pBIB-Super載體(pBIB-Super載體的構(gòu)建方法利用引物aagcttGTGGGCCTGTGGTCTCAAGAT禾口tctagaCTAGAGTCGATTTGGT從質(zhì)粒pMSP-1(NiM，CuiD,EinsteinJ,NarasimhuluS，VergaraC，GelvinSB.Strenghtandtissuespecificityofchimaericpromotersderivedfromtheoctopineandmannopinesysthasegenes.19957:661-676.)中擴增出長l.lkb的super啟動子序列；將擴增得到的super啟動子用HindIII和XbaI雙酶切，回收s叩er啟動子片段，插入到質(zhì)粒pBIB(BecherD.Binaryvectorswhichallowtheexchangeofplantselectablemarkersandreportergenes.NucleicAcidsRes.199018:203.)的HindIII和XbaI酶切位點之間中，得到pBIB-Super質(zhì)粒)，同時用內(nèi)切酶XbaI和KpnI進行大體系酶切。將所切得的J^堪因片段和線性化的pBIB-Super質(zhì)粒片段進行回收，連接，并測序驗證，即獲得驗證正確的含有^M尸57^因的重組載體并將其命名為S叩er::^"尸5T。將S叩er::力"/^符lj用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化侵染Columbia野生型擬南芥植株。從而獲得^A尸57過量表達Tl代轉(zhuǎn)S叩er:Mz^尸67擬南芥植株。經(jīng)過在含50mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)S叩er:MM尸57擬南芥陽性植株并進行分離比統(tǒng)計，在T3代即得到轉(zhuǎn)Super::刀"尸57擬南芥單拷貝純合株系，即JM尸67過量表達株系。二、野生型、^Z尸5T過量表達植株(Super::^Z尸5T)禾口力"尸57^除突變體("7p"-7)在低磷或高鹽條件下的表型觀察結(jié)果1、野生型、^Z/^r過量表達植株(Super::JM尸5T-9)和^Z尸57敲除突變體(sOo"-7)在低磷條件下的表型觀察結(jié)果在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)后生長一周的野生型擬南芥(Col咖bia型)、力M尸57過量表達植株(一個步驟一獲得的轉(zhuǎn)S叩er::^"尸57擬南芥單拷貝純合株系，名稱為Super::AZ尸5T-9)和J"尸57敲除突變體(aWp^-7)(購自ABRC)擬南芥幼苗移入含有IOpMPi的低磷MS培養(yǎng)基(以正常MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，將Pi濃度由1.25mM調(diào)整為10|xM，其它成分與正常MS培養(yǎng)基一致。正常MS培養(yǎng)基組成為每升溶液含1650mgNH4N03，1900mgKNO3，370mgMgSO4'7H20，170mgKH2PO4，440mgCaCl22H20，22.3mgMnS04*4H20，0.83mgKI，0.025mgCuS04*5H20，6.25mgH3B05，0.025mgCoCl*6H20，8.65mgZnS04*7H20，0.25mgNa2Mo04*2H20，27.8mgFeS04*7H20，37.3mgNa2EDTA)上繼續(xù)生長10天，觀察其性狀。以繼續(xù)在MS培養(yǎng)基培養(yǎng)的各株系做為對照。結(jié)果如圖l所示，在低磷MS培養(yǎng)基上生長IO天后，力"P57過量表達植株(Super::JtZ尸5T-刃表現(xiàn)出明顯低磷脅迫癥狀，葉色變?yōu)辄S褐色或紫色，幼苗生長受到明顯抑制；野生型擬南芥(Columbia型)植株和^tZ尸57敲除突變("7pW-"體仍然生長正常，沒有出現(xiàn)明顯的低磷脅迫癥狀。圖l中l(wèi)為野生型植株，2為」^尸5T過量表達植株(Super::^M尸5T-50，3為」"/^微除突變體(a^o"-7)。2、野生型、AZ尸5T過量表達植株(Super::^z^R5T-50和^Z尸^57敲除突變體(a"p^-7)在高鹽條件下的表型觀察結(jié)果在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)后生長一周的野生型擬南芥(Columbia型)、^"P57過量表達植株(Super::AZ尸5T-刃和AZ尸57敲除突變體(s"a^-_/)擬南芥幼苗移入含有170mMNaCl的高鹽MS培養(yǎng)基(在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上再添加170mMNaCl)上繼續(xù)生長10天后，觀察其性狀。結(jié)果如圖2所示，在高鹽MS培養(yǎng)基上，^"/^7過量表達植株(Super::J"/^7-力表現(xiàn)出明顯高鹽脅迫癥狀，葉色變?yōu)榘咨酌缟L受到明顯抑制；野生型植株表現(xiàn)輕微的高鹽脅迫癥狀，葉色變?yōu)辄S色，生長受到一定抑制；而^tZv^7敲除突變體"Od^-"仍然生長正常，沒有出現(xiàn)高鹽脅迫癥狀。圖2中1為^Z/^r敲除突變體(aW/^f-7)，2為^M尸6T過量表達植株(Super::J"尸5T-9)，3為野生型植株。在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)并生長一周的野生型、/l"尸5T過量表達植株(S叩er::j"尸57-"禾IW"/^職除突變體的幼苗移栽到土壤中，繼續(xù)生長，每3天澆水一次，每天光照16小時，光強為100too1/(m2*s)，溫度為22攝氏度，濕度為50%。擬南芥幼苗在土壤中繼續(xù)生長3周后，停止?jié)菜?，改用相同體積的170mMNaCl溶液替換水進行澆灌，三天澆一次，20天后觀察性狀(圖3中澆鹽(170mMNaCl))。以繼續(xù)正常澆水為對照(圖3中正常澆水)。結(jié)果如圖3所示，改澆NaCl溶液20天后，^"尸5T過量表達植株(Super::j^/^r-"表現(xiàn)出明顯高鹽脅迫癥狀，葉色變?yōu)辄S色或白色，生長受到明顯抑制；野生型植株表現(xiàn)輕微的高鹽脅迫癥狀，老葉的葉色變?yōu)辄S色或白色，生長受到一定抑制；而^"尸57敲除突變體("&W-7)仍然生長正常，沒有出現(xiàn)高鹽脅迫癥狀。圖3中1為野生型擬南芥，2為J7Z尸6T過量表達植株(Super:M7Z尸5T-^)，3為力7Z尸57敲除突變體(aW/7"-7)。3、低磷和高鹽條件下J"尸57基因的表達變化結(jié)果在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)生長一周的野生型擬南芥(Columbia型)幼苗分別轉(zhuǎn)移到低磷MS培養(yǎng)基(含10!iMPi，即以正常MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，將Pi濃度由1.25mM調(diào)整為10nM，其它成分與正常MS培養(yǎng)基一致。正常MS培養(yǎng)基溶液每升組成為1650mgNH4N03，1900mgKNO3，370mgMgSO4'7H20，170mgKH2PO4，440mgCaCl22H20，22.3mgMnS04*4H20，0.83mgKI，0.025mgCuS04'5H20，6.25mgH3B05，0.025mgCoCl'6H20，8.65mgZnS04*7H20，0.25mgNa2Mo04*2H20，27.8mgFeS04'7H20，37.3mgNa2EDTA)或高鹽MS培養(yǎng)基(在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上再添加170mMNaCl得到的固體培養(yǎng)基)上培養(yǎng)。培養(yǎng)條件采用全日照光照培養(yǎng)，溫度22攝氏度，光強100Wno1/(m2*s)。每隔一段時間的時間點對相關(guān)材料分根冠取樣，提取總RNA，總RNA的提取按InvitrogenTrizolReagent的產(chǎn)品說明書進行。將上述提取的總RNA經(jīng)l.0%瓊脂糖凝膠電泳檢查完整性后，用紫外分光光度計和電泳方法相結(jié)合作精確定量。然后分別取相同量的RNA進行電泳然后Northern雜交。Northern雜交的探針片段的獲得方法如下以力M尸57基因的cDNA全長產(chǎn)物為模板，用下述引物對進行擴增Prmier5:CTTTGGCGATGTCTAGAATTGA;Primer6:CCTCACCTACTGCTCTCGTAGG。PC財廣增出長度為600bp的JM/^堪因特異cDNA片段作為探針。低磷MS培養(yǎng)基生長時^M尸67基因表達結(jié)果如圖4所示，圖4結(jié)果表明，^"尸6T基因受低磷脅迫誘導表達；高鹽MS培養(yǎng)基生長時^Z尸57基因表達結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明，」"/^堪因明顯受高鹽脅迫誘導表達。4、野生型、^M尸5T過量表達植株(Super::^Z尸5T-50和AA尸67^除突變體(s"psf-7)的磷含量測定結(jié)果野生型(WT)、^Z尸5T過量表達植株(Super::^a尸6T-50禾M"/^織除突變體(sf^W-"在MS培養(yǎng)基上生長，7天后分別移至MS培養(yǎng)基(圖6中正常處理)或低磷MS培養(yǎng)基(圖6中低磷處理)(含IO|oMPi，即以正常MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，將Pi濃度由1.25mM調(diào)整為10pM，其它成分與正常MS培養(yǎng)基一致。正常MS培養(yǎng)基溶液組成為1650mgNH4N03，1900mgKN03，370mgMgS04'7H20，170mgKH2P04，440mgCaCl2'2H20，22.3mgMnSCV4H20，0.83mgKI，0.025mgCuS04'5H20，6.25mgH3B05，0.025mgCoCl'6H20，8.65mgZnS04*7H20，0.25mgNa2Mo042H20，27.8mgFeS04'7H20，37.3mgNa2EDTA)上繼續(xù)生長10天，分根部和冠部取樣。樣品在8(TC烘干過夜，然后在馬福爐中進行灰化處理(300°Cl小時，575°C6小時)。灰化后的樣品用5mL0.1NHC1浸提，浸提液用釩鉬黃法進行磷含量測定。釩鉬黃法方法具體如下所述吸取定容后的提取液2.00mL放入lOmL容量瓶中，力Q2滴二硝基酚指示劑，滴加6mol/LNaOH中和至溶液剛呈黃色，加入2.00mL釩鉬酸銨試劑，用水定容10mL。15分鐘后在波長450nm處進行測定，以空白溶液(空白試驗的浸提液按上述步驟進行顯色)調(diào)節(jié)儀器零點。標準曲線準確吸取50g/LPi標準液(利用KH2P04和雙蒸水配制標準液)0、0.2、0.5、1、1.5、2、3mL分別放入10mL容量瓶中，按上述步驟顯色，即得O、1.0、2.5、5.0、7.5、10、15g/mLPi(利用101204和雙蒸水配制標準液)的標準系列溶液，與待測液一起測定，讀取吸光度，然后繪制標準曲線和求直線回歸方程。結(jié)果如圖6所示，結(jié)果表明，在正常生長條件下(MS培養(yǎng)基中，圖6中正常處理)，^M尸57過量表達植株(Super::AZ尸6T-力的根部和冠部磷含量都明顯低于野生型(WT)的根部和冠部磷含量，J"/^7敲除突變體7)的磷含量和野生型的磷含量沒有明顯區(qū)別；在低磷條件下(低磷MS培養(yǎng)基中，圖6中低磷處理)，j"尸57過量表達植株(S叩er::刃的冠部磷含量明顯低于野生型的冠部磷含量，JtZ,67敲除突變體("7pW-"的冠部磷含量明顯高于野生型的冠部磷含量，三種植株的根部磷含量沒有明顯區(qū)別。結(jié)果表明，X"尸57被敲除后，導致植物在低磷條件下磷含量較野生型增加；^"尸67過量表達后，導致植物無論正常條件還是低磷條件下植物的磷含量都降低。5、野生型、J"/^r過量表達植株(Super::Ai:尸5T-刃和ALP67lt除突變體10的鉀、鈉含量測定結(jié)果野生型(WT)、^M尸5T過量表達植株(Super::^"尸5T-^0和^Z尸6T敲除突變體(aW/7W-7)在MS培養(yǎng)基上生長，7天后分別移至MS或高鹽(170mMNaCl)培養(yǎng)基上繼續(xù)生長10天，取樣。樣品在8(TC烘干過夜，然后在馬福爐中灰化(300°Cl小時，575°C6小時)?；一瘶悠酚?0mL0.INHC1浸提，浸提液用原子吸收法(Aproteinkinase,interactingwithtwocalcineurinB-likeproteinsregulatesK+transporterAKT1inAraWops/s.XuJ，LiHD，ChenLQ，WangY，LiuLL，HeL，WuWH.Cell,2006，125:1347-1360)進行鉀、鈉含量的測定。結(jié)果如圖7所示，在正常MS條件下，AZ尸67過量表達植株(Super::JM尸5T-刃中的鉀含量明顯低于野生型的鉀含量，^!"/^織除突變體(W^W-7)中的鉀含量與野生型(WT)的鉀含量相比沒有明顯區(qū)別；在高鹽條件下，J"尸57過量表達植株(Super::^Z尸5T-刃中的鉀含量明顯低于野生型(WT)的鉀含量，^"尸57敲除突變體(af7/W-7)中的鉀含量略高于野生型的鉀含量，同時^"尸5T過量表達植株(Super::^Z尸5T^)的鈉含量明顯高于野生型的鈉含量，J"尸5"微除突變體(3"p^-7)的鈉含量明顯低于野生型的鈉含量。表明力"尸67在植物中過量表達后會導致植物的鉀含量降低，進而導致植物在高鹽條件下鈉含量增加，使植物表現(xiàn)對鹽敏感；^"尸67在植物中被敲除后，導致植物在高鹽脅迫下鉀含量比野生型高而鈉含量比野生型低，使植物表現(xiàn)耐高鹽脅迫的表型。序列表〈160〉3<210>1〈211〉1662<212>DNA〈213〉擬南芥屬擬南芥(Ara力油p^z^a"扁)<400>1gatggtctggtctcactcttgattcatcttctcttgatcttttaaaccct60aatcgtatttctcataagaatcaccgacgtttctcaa^tcctttggcgatgtctagaatt120g3cgagaa1:atxaaccaacggtagtg犯tttaggtttccg180gtgagtctctcagg"tattcgtg3tcgtgaagatg^gatttttcatctggcgttgctgga240gataatgaccgtgaagttcccggcg鄉(xiāng)tggatttcttctccg3ca^ga^atctagggtt300tgtcgtg鯽acgacgaaggatttxgtgtgaag呵g犯gaacaagatgatcga^cggsc360gtaaataccggtttgaatcttcgaaca3ctggtaatacaa卿gtgatgagtc犯tg3tc420gatgstggagaatcttccgaaatggaagat鄉(xiāng)CgtgCg3Etaaatgagttggtgaaatta■c肌gatgagttgaagaaaatgacaatggata^txa^aagcttagagaattgctt3cac肌540gttagcaacagttacacttca^cttc3ga1:gcatcttgtttcactaatgcagca^cagcsa600ataaggtaatagaagctgctgsgaagcctg3ggagacgat3gtax:caagg660caatttattgatttaggccct3cga^gcagt鄉(xiāng)tgeiggccgagg3tgtgtcaaattct720tcatccgaagat3g犯ctcgttcggggggttcttctgcagccgagaggcgtagtaacggg780aagagacttgggcgtga卿aagccccgaaactgagtcca840tctactaccccgacgacatttgatca犯ccgctgaagctacgatgaggaaagcccgtgtc900tccgttcgtgcccgatcggaagctccgatg3ta^gcg3tggatgtcaatg恥0ggccagaagatggccaaagggaatccttgtccgcgggcatattaccgctgcacgatggcc1020acgggctgtcccgttcgcaacattgcgcggaagacagatcaattctgatt1080acaacctacgtaaccatccgttgccgccagccgcggtagccatggcttct1140accaccacggcggcggctaacatgttgctatccgggtcaatgtctagtcacgacgggatg1200caaatttactagctagggctgttcttccttgctccaca3gcatggcaaca1260atctcagcctccgcgccgtttccaaccgtcacattag6LCCtcacccactcacctccgcct1320<image>imageseeoriginaldocumentpage13</image>SerSerGluMetGluAspLysArgAlaLysAsnGluLeu145150GinAspGluLeuLysLysMetThr165ValSerAsnSerLeuLeuThrGin180ValSerLeuMet195GluLysMetAsp170TyrThr185GinGinAsn155AsnGinLysSerLeuGinAsnGinGinGinGin200AlaAlaGluLysProGluGluThrlieValPro210215LeuGlyProThrArgAlaValGlyGluAla225230SerSerGluAspArgThrArg245LysArgLeuValLysLeu160LeuArgGlu175MetHisLeu190VallieGluAsnLys205ArgGinPhelieAsp220AspValSerGlu235SerSerAlaArgSerAsnGly260SerAsnLyslieGinLysVal275AlaGluGinThr290ArgSerGluAla305GlyGinLysMetCysThrAlaGluMetAla340AspArg355HisProLeuPro370AlaAlaAsnMet385AlaThrMet295ProMetlie310AlaLysGly325ThrGlyCysGlyAsn280ArgSerAsnProGlyGly250ArgGluGluSerPro265SerThrSerAsnSer240AlaGluArg255GluThrGlu270ThrPheAspLysAlaAspGlyProCys330ValArg345ThrThrThrProThr285ArgValSerValArgAla300GinTrpSerlieLeulie360ValAlaMetAlaCys315ProArgAlaLysGinValTyrArgLysTyr320TyrTyrArg335GinArgCys350AsnHisAsnProAlaAla375LeuLeuSerGlySerMet390Ser395GluGly365SerThrThrThrAla380SerHisAspGlyMet40014<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>ggtttgtcgtga卿cgacgaaggatttcgtgtg鄉(xiāng)Mggaagaacaagatgatcgaac480ggacgta^tctaagtacgacttttcgataaatC￡Lt￡Ltg8Laatacaat11tcttactaat540ggtttgtattagtgtggacgtgtcataatttggtttacatttgaaatatc600accaaattttgtttcatttttttttttttgata^ggtatcatattttgttttcttacaa660aatgatttctaaatttgaattttaatttgtt3t3g3CCggtttgaatcttcgasca^ctg720gtaatscaaagagtgBtgagtca^tgatcgatgatgg卿atcttccgaaatggaagata780agcgtgcgaaagtttagtttgattttacat840ataatttgaaccggtttgattaatatttcggtttatcacagttggtgaaa■tt3C^g3tgagttgaagaagataatcaaaagcttagagaattgcttaca960ca^gttagcaacagttacacttcacttcagatgcatcttgtttcactaatgcagc肌cag1020acaMaaggtaaataattattagattgatcaaccac^gt1080taccctacatgaataggcaattaattttggtgattaggta3tag^gctg1140ctgagaagcctgagg卿cgggcaatttattgatttaggccctacgagag1200cagtaggtgaggccgaggatgtgtcaaattcttcatccgaagatagaactcgttcggggg1260gttcttctgcagccgagaggcgtagt3acgggaagagacttgggcgtgaagaaagccccg1320a^ctgagtcC卿鄉(xiāng)tg3attctactaccccgacgacatttgatcaaa1380ccgctgaagctacgatgagga^gcccgtgtctccgttcgtgcccgatcggaagctccga1440tggtaagttgtactgiatact:tataaaaaata肌ctdtgtg1500ctttagagattaattatctttgtactttatgtttctatagataagcgatggatgtcaatg]560gagaaa^tatggccagaagatggccaaagggaatccttgtccgcgggcatattaccgctg1620cacgatggccacgggctgtcccgttcgcaa3c3agta^gattaaccattg1680gactaaaagattcttgttgtaaaaacattag3gatttc犯tgtatata^tgtttgcgtgat1740tggctaatacgttcggtccgtataggttcaacgttgcgcgga^g3ca^t1800caattctgattac83cctacgaggg犯accataaccatccgttgccgccagccgcggtag1860ccatggcttctaccaccacggcggcggctaacatgttgctatccgggtcaatgtctagtc1920acgacgggatgatgaaccctacaaat11act鄉(xiāng)"Ugggctgttcttccttgctccacaa1980gcatggcaacaatctcagcctccgcgccgtttccaaccgtcacattagacctcacccact2040cacctccgcctcctaatggttccaatccttcctcttccgcggctaccaac2100actcactgatgcagcggccgcaacaacaacgacgaacttacctccgggaa2160tgctacctcatgt3at3ggccaggcattgtataaccaatccaagttctcggggctgcagt2220tctctggtggctctccctcgacggcagcgttttctcagtcacacgcggtggctgatacaa2280taacggcactcacagctgacccgaatttcacggcggctcttgcagccgttatttcttcta2340tgatcaatggtacgaaccaccacgacggcgaaggaaacaacaaaaatcaa2400ttacattttttttttgggtatctacattttttttccaactgggt城鄉(xiāng)a33C3g3gaig2460tttatttcattgattcacatttgttctgtttcgtaccaaaatccc3gt肌atatacaaaa2520gca^ct3t3ctcaagttc3tattcgtaMcactataaatagttacgtaacttaattagc2580attgcctttaaagcttt259權(quán)利要求1、一種植物響應低磷和高鹽脅迫的蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQID№.2的氨基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQID№.2氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有增加植物低磷和高鹽脅迫敏感性的功能的由SEQID№2衍生的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求1所述的植物響應低磷和高鹽脅迫的蛋白的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述植物響應低磷和高鹽脅迫的蛋白的編碼基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDW2:1的核苷酸序列；2)序列表中SEQIDJY2:3的核苷酸序列；3)在高嚴謹條件下可與l)或2)所述的DNA序列雜交的核苷酸序列。4、含有權(quán)利要求2或3所述的調(diào)控植物響應低磷和高鹽脅迫編碼基因的重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或宿主菌。5、擴增權(quán)利要求2或3所述基因中任一片段的引物對。6、權(quán)利要求1所述的植物響應低磷和高鹽脅迫蛋白及其編碼基因在培育對低磷和高鹽脅迫抗性或敏感性提高的植物中的應用。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于所述植物為擬南芥。全文摘要本發(fā)明公開了一種植物響應低磷和高鹽脅迫的蛋白及其編碼基因與應用。該蛋白質(zhì)的氨基酸序列為1)序列表中的SEQID№.2的氨基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQID№.2氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有增加植物低磷和高鹽脅迫敏感性的功能的由SEQID№2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的基因可用于培育耐低磷和抗鹽的植物新品種，以及培育對低磷和高鹽敏感的指示植物。文檔編號C12N15/82GK101508727SQ20091008113公開日2009年8月19日申請日期2009年4月2日優(yōu)先權(quán)日2009年4月2日發(fā)明者孔佑涵,謙徐,李立芹,武維華,陳益芳申請人:中國農(nóng)業(yè)大學