專利名稱：一種硨磲科貝類線粒體coi基因擴(kuò)增引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種硨磲科貝類線粒體COI [the cytochrome c oxidase I]基因擴(kuò)增引物。
背景技術(shù)：
硨磲科(Corbiculacea)隸屬于雙殼綱(Bivalvia),異齒亞綱(Heterodonta),簾蛤目(Veneroida)，它是世界上最大的雙殼貝類，多分布于印度洋和太平洋海域，特別是在印度尼西亞、馬來西亞和澳大利亞等熱帶海域低潮區(qū)附近的珊瑚礁間較多，我國的海南省以及南海諸島也有分布。全世界共有2屬6種，其中大硨磲、庫氏硨磲和鱗硨磲被列為世界珍稀保護(hù)動物。硨磲科物種自古以來受到人們的青睞，位于“佛教七寶”之首。而且硨磲肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，是名貴的海產(chǎn)品，并具有一定的藥用價值和觀賞價值。由于其生活環(huán)境的特殊性，還可以成為評價珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)是否健康的重要指標(biāo)。硨磲將是一種非常有 養(yǎng)殖前景的海洋經(jīng)濟(jì)貝類。然而由于硨磲科的貝殼外部形態(tài)可塑性強(qiáng)、受環(huán)境影響大，有時還覆蓋有大量附著物，利用形態(tài)特征對硨磲科進(jìn)行物種分類和系統(tǒng)發(fā)育的分析變得異常困難，特別對于一些近緣物種，單利用形態(tài)特征很難區(qū)分開來。近年來，利用分子技術(shù)對物種進(jìn)行分類和系統(tǒng)發(fā)育分析已成為一種有效的方法，其中線粒體COI基因已成為區(qū)分物種和研究物種進(jìn)化關(guān)系的理想標(biāo)記，并在許多物種中得到了成功應(yīng)用。因此，利用mtCOI基因?qū)Τ岉峥七M(jìn)行物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析具有很好的前景。然而貝類mtCOI序列的變異速率明顯高于動物的其他類群，軟體動物不同物種，即使是近緣種甚至種內(nèi)不同群體之間的mtCOI序列變異都很大，這就導(dǎo)致了 Folmer等人于1994年設(shè)計的COI通用引物L(fēng)CO1490和HC02198在這一動物類群中的擴(kuò)增效率極低。缺少擴(kuò)增效率高的引物已經(jīng)嚴(yán)重阻礙了這種分子標(biāo)記應(yīng)用于雙殼貝類的分子鑒定研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種硨磲科貝類線粒體COI基因適用性好的擴(kuò)增引物，它能滿足現(xiàn)有技術(shù)的上述需求。本發(fā)明根據(jù)硨磲科物種COI基因序列變異度較高和非特異性擴(kuò)增引物擴(kuò)增效率低的特性，對比分析美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI, http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)上已有的硨磲科貝類序列，結(jié)合自己利用通用引物擴(kuò)增的序列，通過重復(fù)試驗，最終篩選出硨磲科貝類COI基因最適擴(kuò)增引物。采用本發(fā)明的硨磲科貝類COI基因擴(kuò)增引物，可以高效的擴(kuò)增出硨磲科不同物種的COI序列，更有利于硨磲科的物種遺傳多樣性的研究。
具體實施例方式本發(fā)明的硨磲科貝類線粒體COI基因擴(kuò)增引物的篩選方法采用四個步驟a、在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih. gov/)上下載已有的硨磲科序列；b、利用COI通用擴(kuò)增引物(LC01490F和HC02198R，F(xiàn)olmer 1994)擴(kuò)增出部分硨磲科物種的COI序列；c、從上述得到的硨磲科mtCOI序列中，通過比對找出保守的序列片段，合成多套擴(kuò)增引物序列；d、從合成的多套擴(kuò)增引物序列中篩選出擴(kuò)增硨磲科線粒體COI基因效果最好的一對引物。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明I.在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI, http ://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上下載已有的5種硨磲科貝類52條COI序列番紅硨磲(Genbank Number JN392040-JN392066);大硨碟(Genbank Number EU003616);無鱗硨碟(Genbank Number GQ166591);鱗硨磲(Genbank Number JN392020-JN392037);長硨磲(Genbank Number EU003610-EU003614)。2.樣品采集于2002年 2011年，從中國南北沿海共采集硨磲科2個屬4個種類的43個個體。3.DNA提取用苯酚-氯仿法對所采集樣品進(jìn)行DNA提取。4. COI通用擴(kuò)增引物擴(kuò)增利用Folmer于1994年設(shè)計的COI通用擴(kuò)增引物L(fēng)C01490F:5， -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’HC02198R 5，-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3 ’對上述采集的硨磲科43個個體進(jìn)行PCR擴(kuò)增。不同物種的PCR熱循環(huán)退火溫度不同，退火溫度范圍為48°C 52°C。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)I. 5倍的瓊脂糖電泳檢測后，送往測序公司進(jìn)行雙向測序。用Lasergene軟件將測得的序列進(jìn)行人工矯正。最終獲得番紅硨磲2個個體的COI序列，其長度約為700bp，其余個體均未擴(kuò)增出。5.序列比對利用CLUSTALW軟件將上述測得的2個COI序列和下載的52條序列進(jìn)行比對，找出比較保守、堿基變異度最小的序列片段。6.引物合成根據(jù)上述的比對結(jié)果，利用引物設(shè)計軟件PrimerPrimer5在堿基變異度最小的序列片段設(shè)計出4對擴(kuò)增引物。7.引物擴(kuò)增將上述設(shè)計的4對擴(kuò)增引物分別應(yīng)用于PCR擴(kuò)增所采集的硨磲科4個種類的43個個體。不同物種的PCR熱循環(huán)退火溫度不同，PCR熱循環(huán)退火溫度范圍為48°C 52°C。擴(kuò)增產(chǎn)物用I. 5倍的瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測。8.引物擴(kuò)增結(jié)果上述4對擴(kuò)增引物中，I對引物能擴(kuò)增出2個個體，I對引物能擴(kuò)增出5個個體，I對引物能擴(kuò)增出21個個體，I對引物能擴(kuò)增出硨磲科全部的43個個體，擴(kuò)增效果非常好。特異性擴(kuò)增引物序列經(jīng)過大量的重復(fù)試驗，最終篩選出上述擴(kuò)增硨磲科COI基因效果最好的一對引物序列為CQF :5’ -GATATTGGAACCCTTTACTT-3’ ；CQR 5’ -TTCAGGATTGTCCGAAGAATCA-3’。利用此對引物擴(kuò)增出的DNA片段長度約為650bp。9.特異性擴(kuò)增引物擴(kuò)增條件上述CQF與CQR擴(kuò)增引物的10 μ L PCR反應(yīng)體系為
Iμ LlOXbuffer Mg2+，I μ L DNTP (2mM), O. 6 μ L Mgcl2 (25mM)，I μ L 引物 CQF (10 μ Μ)，I μ L引物 CQR(10 μ Μ)，O. 08 μ L r-Taq (5u/μ L), I μ L DNA 模板，4. 32 μ L 雙蒸水。PCR 熱循環(huán)的退火溫度為48°C 52°C。
權(quán)利要求
1. 一種硨磲科貝類線粒體COI基因擴(kuò)增引物，其特征是CQF :5’ -GATATTGGAACCCTTTACTT-3’ 和 CQR :5’ -TTCAGGATTGTCCGAAGAATCA-3’。
全文摘要
本發(fā)明利用NCBI中已有的52條硨磲科序列，結(jié)合筆者用通用引物擴(kuò)增得到的2條硨磲科序列，利用CLUSTALW軟件比對分析，在確定的保守區(qū)域用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5設(shè)計多對引物，用43個硨磲硨磲科個體在10μl體系下重復(fù)進(jìn)行PCR反應(yīng)試驗，最后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出一種硨磲科貝類線粒體COI基因序列高效擴(kuò)增引物，其特征是CQF5’-GATATTGGAACCCTTTACTT-3’CQR5’-TTCAGGATTGTCCGAAGAATCA-3’采用本發(fā)明的硨磲科貝類線粒體COI引物，可以高效地擴(kuò)增出硨磲科貝類不同物種的目的片段，對利用分子方法鑒定硨磲科物種和進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析具有重要的意義，同時也能為利用分子手段開發(fā)、保護(hù)硨磲科種質(zhì)資源提供可靠的技術(shù)指導(dǎo)。
文檔編號C12N15/11GK102816762SQ201210324790
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月1日
發(fā)明者于貞貞, 李琪, 孔令鋒 申請人:中國海洋大學(xué)