專利名稱：植物油體表達(dá)載體和利用植物油體表達(dá)人表皮生長因子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體的說，涉及利用植物油體表達(dá)載體和利用植物油體表達(dá)人表皮生長因子的方法。
背景技術(shù)：
利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥用蛋白，近年來越來越受到人們的關(guān)注，在植物油體中表達(dá)藥用蛋白，使目的基因插到油體蛋白基因的N端或C末端，構(gòu)建成融合蛋白基因。由于油體蛋白鑲嵌在油體表面，構(gòu)建的融合蛋白基因便可在受體植物種子的油體中特異表達(dá)，這樣可以大大提高外源蛋白在植物組織中的表達(dá)量，并可利用油體親脂疏水的特性，將種子粉碎后，再經(jīng)液體抽提離心等步驟，回收油相，便可將融合蛋白或目的蛋白與細(xì)胞內(nèi)的其它組份分開，這樣可以明顯簡化目的蛋白的分離純化過程，這種植物油體表達(dá)體系有利于外源基因的表達(dá)及產(chǎn)業(yè)化研究，因此本發(fā)明采用油體表達(dá)技術(shù)在植物種子中表達(dá)hEGF，為hEGF的產(chǎn)業(yè)化研究打下了基礎(chǔ)。
人表皮生長因子(human Epidermal growth factor，hEGF)最早由Cohen等于1962年發(fā)現(xiàn)的，由于EGF的發(fā)現(xiàn)和研究成果，Cohen和Montalcini兩位科學(xué)家分享了1986年的諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎。通過研究發(fā)現(xiàn)EGF具有很多生物學(xué)活性。EGF具有促進(jìn)上皮再生的功能，可以用于促進(jìn)外科手術(shù)傷口及其它創(chuàng)面的愈合，如皮膚移植、皮膚的擦傷、燒傷、糜爛等促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞的增殖，用來治療角膜損傷、潰瘍、酸堿燒傷以及促進(jìn)移植角膜的存活。EGF在人類胃腸道、十二指腸粘膜潰瘍愈合過程中起著十分重要作用，對多種刺激引起的胃、十二指腸粘膜損傷均具有一定的保護(hù)和治療作用。目前EGF主要是在大腸桿菌中表達(dá)，基本上為注射用藥，生產(chǎn)成本高。
綜合所述，本發(fā)明的優(yōu)點如下由于hEGF分子中二硫鍵及其他多種官能團(tuán)的存在，因而化學(xué)合成的產(chǎn)物純度及產(chǎn)率無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)。目前hEGF的生產(chǎn)主要通過基因工程技術(shù)在大腸桿菌和酵母中獲得，但表達(dá)產(chǎn)物往往形成包涵體，分離純化時涉及到蛋白質(zhì)變性和復(fù)性問題，以及給后處理和純化工藝帶來繁衍的多步操作。為了解決這些難題，人們試圖采用植物來表達(dá)藥用蛋白，使蛋白質(zhì)正確折疊和糖基化，以此維持蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供在植物種子油體中表達(dá)EGF的重組表達(dá)載體，其中所說的表達(dá)載體包含與油體蛋白啟動子可操作地連接的hEGF的全長核苷酸序列，且hEGF全長核苷酸序列是按照植物偏好的密碼子設(shè)計合成的。
本發(fā)明的表達(dá)載體所用的啟動子是油菜啟動子，將大豆油體蛋白基因與EGF基因融合后克隆進(jìn)表達(dá)載體中，經(jīng)農(nóng)桿菌浸染轉(zhuǎn)化進(jìn)植物中進(jìn)行表達(dá)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種在植物中表達(dá)人表皮生長因子的方法。該方法包括以下步驟(1)構(gòu)建植物油體表達(dá)載體p1390ONE；(2)按植物偏好的密碼子合成hEGF的核苷酸序列；(3)將hEGF的核苷酸序列連接到油體蛋白核苷酸序列的3`端，克隆進(jìn)表達(dá)載體中；(4)將步驟(3)的重組表達(dá)載體用農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)恼婧怂拗饔鷤M織；(5)篩選轉(zhuǎn)基因抗性愈傷組織；(6)篩選抗性植物轉(zhuǎn)化苗；(7)將得到的植物種子經(jīng)粉碎、用提取液萃取，離心可除去90％以上的雜質(zhì)，經(jīng)洗滌純化回收所需的表皮生長因子活性多肽。
本發(fā)明涉及以重組DNA技術(shù)生產(chǎn)EGF的方法，特別是涉及以植物作為宿主生產(chǎn)EGF的方法。更具體的說，本發(fā)明涉及用于在植物種子油體蛋白中融合表達(dá)EGF蛋白。本發(fā)明進(jìn)一步涉及按本發(fā)明的方法制備的EGF用于組織修復(fù)、傷口愈合中及其在個人護(hù)理品中的應(yīng)用。
一般的來說，為了提高基因的表達(dá)效率和產(chǎn)物的產(chǎn)率，本發(fā)明選擇用油體蛋白與EGF融合表達(dá)，從而使融合蛋白表達(dá)量大大提高，并且更加穩(wěn)定。
可按照本領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行基因的分離和合成、克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建、DNA序列分析及鑒定、宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)，以及表達(dá)產(chǎn)物的分離和純化等操作(參見Sambrook ct al.，Molecular CloningALaboratory Mannual，Cold Spring Harbor laboratory Press，Cola SpringHarbor，NY，1989)。
可以將按本發(fā)明方法制備的EGF與選自人血清白蛋白、多聚甘氨酸、金屬陽離子(如Zn2+、Mn+和Mg2+)及低分子量肽的活性蛋白質(zhì)保護(hù)劑，選自聚乙二醇、谷胱甘肽的穩(wěn)定劑混合，并加入本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的藥物載體或賦形劑，制成適于經(jīng)胃腸道途徑，特別是經(jīng)胃腸道外途徑給藥的藥物組合物?？梢园凑罩扑庮I(lǐng)域的常規(guī)方法，將這樣的藥物組合物制成適于經(jīng)血管內(nèi)、肌肉內(nèi)、或腹腔內(nèi)給藥的溶液劑、經(jīng)口服給藥的片劑或粉末劑，或制成適合于外用的栓劑、軟膏、霜劑、乳化劑等劑型。
本發(fā)明的藥物組合物可用于促進(jìn)因燒傷或其他機(jī)械床上造成的軟組織、肌腱、人帶、軟骨或骨組織傷口的修復(fù)或愈合。所說的軟骨組織包括皮膚、肌肉、血管、內(nèi)臟器官及角膜組織等處古和軟骨組織外的所有組織。本發(fā)明的藥物組合物亦可用于治療血管組織損傷，如促進(jìn)血管生長(血管生成)和血管修復(fù)(促進(jìn)受損部位的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖)。本發(fā)明的藥物組合物還可用于促進(jìn)中樞和外周神經(jīng)組織修復(fù)，包括刺激阿爾海默氏病(早老性癡呆)病理過程中受損的海馬神經(jīng)元的生長。作為本發(fā)明藥物組合物的活性成分，EGF可刺激因各種原因受到損傷的神經(jīng)組織，使之通過成神經(jīng)細(xì)胞的有絲分裂再生新的神經(jīng)元，恢復(fù)受損部位的神經(jīng)細(xì)胞群體，并促進(jìn)軸突的延伸。


圖1表達(dá)載體p1390R的圖譜。
圖2hEGF目的蛋白的Western檢測圖。
其中，圖2中1為人標(biāo)準(zhǔn)品對照；2，3為重組人EGF樣品。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例1EGF基因的制備及序列測定以hEGF基因為藍(lán)圖，首先按照植物偏愛的密碼子將hEGF堿基序列重新改造，并按照密碼子的簡并性消除在本實驗中所用到的酶切位點，利用在線軟件Primer Finder及DNA STAR設(shè)計引物，EGF基因通過橋式PCR合成。
EGF全長基因合成PCR體系一10×pfu buffer 10μldNTP(2.5mM) 8μl引物F1(10μmol/L)2μl引物R1(10μmol/L)2μlpfu DNA聚合酶0.5μlddH2O77.5μl
Total100μlPCR體系二10×pfu buffer 10μl
dNTP(2.5mM)8μl引物F2(10μmol/L) 2μl引物R2(10μmol/L) 2μlpfu DNA聚合酶 0.5μlddH2O 77.5μl
Total 100μl反應(yīng)參數(shù)94℃ 5min55℃ 5min72℃ 5min經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測無非特異性條帶后，用DNA膠回收試劑盒純化回收，回收產(chǎn)物分別命名為E1和E2。
PCR體系三10×pfu buffer10μldNTP(2.5mM) 8μlE1(10μmol/L) 2μlE2(10μmol/L) 2μlpfu DNA聚合酶 0.5μlddH2O 77.5μl
Total 100μl反應(yīng)條件同上。得到全長的EGF基因。
將PCR產(chǎn)物EGF經(jīng)KpnI及SpeI雙酶切后連接到pUC19上，得到pUCEGF。重組質(zhì)粒pUCEGF的DNA序列測序結(jié)果表明，本發(fā)明設(shè)計合成的EGF核苷酸序列正確。
實施例2重組油體表達(dá)載體的構(gòu)建以白菜型油菜的總DNA為模板，以oleosin基因的啟動子的序列設(shè)計引物，引物1含有HindIII酶切位點，引物2引入XbaI和EcoRI酶切位點，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了約900bp的20KD oleosin基因的啟動子(PCR反應(yīng)條件為94℃，5分鐘；94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分鐘；25個循環(huán)結(jié)束后72℃延伸5分鐘)，PCR產(chǎn)物用HindIII和EcoRI雙酶切后，將其連接到pUC19上，得到pUCON，其測序結(jié)果表明克隆產(chǎn)物為油菜油體蛋白基因的啟動子。
以大豆24kD油體蛋白基因序列設(shè)計引物引物1序列為5′-GAA TCT AGA GAT GAT GAT GAT AAG ATG ACC ACA CAAGTA CC，引物2序列為5′-GCC GGT ACC ATC ATC ATC ATC CTTGGT TGT TGC TGT CAC TG。引物1含有XbaI酶切位點，引物2引入KpnI酶切位點，以含完整大豆24KDa油體蛋白基因的pTO質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得完整的大豆24kDa油體蛋白基因編碼區(qū)序列678bp(PCR反應(yīng)條件為94℃，5分鐘；94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分鐘；25個循環(huán)結(jié)束后72℃延伸2分鐘)，PCR產(chǎn)物用KpnI和XbaI雙酶切后，將其連接到pUC19上，得到pUCOE，其測序結(jié)果表明克隆產(chǎn)物為大豆油體蛋白基因。
將pUCON質(zhì)粒用HindIII和XbaI雙酶切后，將酶切片段油菜油體蛋白啟動子連接到p1390R中，(見《貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報》2006年第04期，“含aFGF基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建及其對根瘤農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化”)重組質(zhì)粒命名為p1390ON，經(jīng)酶切鑒定正確后進(jìn)行后續(xù)工作。將pUCOE質(zhì)粒經(jīng)XbaI和KpnI雙酶切后，將酶切片段大豆油體蛋白基因與p1390ON連接，重組質(zhì)粒命名為p1390ONE，此即油體表達(dá)載體。
實施例3含hEGF基因的重組油體表達(dá)載體的構(gòu)建將pUCEGF質(zhì)粒用KpnI和SpeI雙酶切后，將得到的hEGF酶切片段與重組油體表達(dá)載體p1390ONE連接，得到重組植物油體表達(dá)載體p1390ONE-EGF。
實施例4農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜、紅花等遺傳轉(zhuǎn)化p1390ONE-EGF質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌取1μg p1390ONE-EGF質(zhì)粒DNA加入到100μl LBA4404感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴放置5分鐘；然后置液氮中冷凍5分鐘后迅速轉(zhuǎn)至37℃水浴中溫育5分鐘。加入1毫升LB液體培養(yǎng)基，在28℃搖床上180rpm振蕩培養(yǎng)4小時。取適量菌液涂布到含鏈霉素50mg/L和卡那霉素50mg/L的LB固體培養(yǎng)基上，置28℃培養(yǎng)24～48小時，經(jīng)抗性篩選、PCR及酶切鑒定獲得帶有p1390ONE-EGF質(zhì)粒DNA的農(nóng)桿菌單菌落。
含p1390ONE-EGF質(zhì)粒的農(nóng)桿菌的活化從平板上挑取含p1390ONE-EGF質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落，接種到5毫升LB液體培養(yǎng)基中(含卡那霉素50mg/L，鏈霉素50mg/L)，振蕩培養(yǎng)過夜，取100微升菌液接種到50毫升LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素50mg/L，鏈霉素50mg/L)中，28℃，180rpm振蕩培養(yǎng)至OD600為1500rpm離心10分鐘，菌體用浸染培養(yǎng)基重懸，使OD600為0.5。
油菜或紅花等植物的遺傳轉(zhuǎn)化將油菜或紅花等子葉或下胚軸在重懸的農(nóng)桿菌菌液中浸泡15分鐘，放到含適當(dāng)激素配比的MS固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3天，之后轉(zhuǎn)到含有潮霉素15mg/L+頭孢霉素250mg/L的MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性愈傷組織的篩選及進(jìn)行芽分化選擇培養(yǎng)，約8周左右有抗性芽出現(xiàn)，待抗性芽伸長至2～5厘米時轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基上，一般15～30天左右即可生根。
實施例4轉(zhuǎn)基因油菜、紅化等植物的PCR檢測提取轉(zhuǎn)基因油菜或紅花等植物基因組DNA，以基因組DNA為模板，分別以EGF基因的一對引物擴(kuò)增目的基因EGF、以大豆油體蛋白基因的一對引物擴(kuò)增大豆油體蛋白基因、以大豆油體蛋白基因5`端引物和EGF基因的3`端引物擴(kuò)增融合蛋白基因。擴(kuò)增EGF基因的PCR反應(yīng)條件為94℃ 5分鐘；94℃ 35秒，58℃ 35秒，72℃ 35秒，25個循環(huán)；72℃延伸2分鐘。擴(kuò)增大豆油體蛋白基因的PCR反應(yīng)條件為94℃ 5分鐘，94℃ 35秒，58℃ 35秒，72℃ 1分鐘；25個循環(huán)；72延伸5分鐘。擴(kuò)增融合蛋白基因的PCR反應(yīng)條件為94℃5分鐘，94℃ 35秒，58℃ 35秒，72℃ 1分鐘；25個循環(huán)；72延伸5分鐘。分別擴(kuò)增出預(yù)期的440bp的EGF基因(含酶切位點和凝血酶切位點)、690bp的大豆油體蛋白基因及1130bp的融合蛋白基因。
實施例5油菜籽和紅花籽中EGF目的蛋白的Western檢測提取油菜籽中和紅花籽中的油體蛋白，經(jīng)凝血酶切割后過肝素親和層析柱，分離純化得到EGF純品，經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，經(jīng)轉(zhuǎn)膜后用山羊抗兔EGF的多克隆抗體進(jìn)行Western分析，結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因油菜和紅花的種子中有EGF蛋白的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物大小約為15kD，與預(yù)期的大小一致，Western結(jié)果見附圖2。
實施例6油體蛋白與EGF融合蛋白的分離純化及生物活性測定1.油菜和紅花籽中油體蛋白-EGF融合蛋白的提取(1)分別取油菜種子和紅花種子10粒去掉外殼，加2.5倍體積的緩沖液A(0.15M Tricine-KOH pH7.5，10mM KCI，1mM MgCl2，1mM EDTA，0.6M蔗糖)研磨，5000g、4℃離心15分鐘。
(2)上清用含0.65M蔗糖的緩沖液A重懸。
(3)液面上覆以等體積的含0.12M蔗糖的緩沖液A。
(4)15000g、4℃離心25分鐘，重復(fù)兩次，取上清。
至此將油體與種子中的其它成份分開。
(5)上清中加2倍體積的乙醚，15000g離心8分鐘，上部的乙醚層中多為中性脂類，磷脂留在下面的水相中，取中間的蛋白層。
(6)以適量含0.1M蔗糖的緩沖液A重懸蛋白，加三倍體積的氯仿/甲醇(2∶1)混合物，抽提3次。
(7)取中間蛋白層，用乙醚抽提一次，-70℃超低溫冰箱中凍干保存。
2、油體蛋白與EGF蛋白的分離(1)將油體蛋白-EGF融合蛋白溶于無菌水中，加入0.2U凝血酶，37℃酶切過夜。
(4)將酶切反應(yīng)液上Harpin-Sepharose CL-6B親和層析柱，用平衡緩沖液(10mmol/L PBS，PH7.0，0.2mol/L NaCl)洗至基線，用含0.6mol/L NaCl洗除雜蛋白，再用含1.2mol/L NaCl的PBS緩沖液進(jìn)行洗脫，收集活性峰，經(jīng)SDS-PAGE、考馬氏亮藍(lán)染色，BandScan軟件分析，得到的EGF純品純度達(dá)98％。
用MTT法測定純化后EGF蛋白和野生型EGF對Balb/c 3T3細(xì)胞的促分裂活性。結(jié)果表明，油體表達(dá)EGF純品的ED50為4.5ng/ml，野生型EGF的ED50為4.32ng/ml；油體表達(dá)得到的EGF蛋白純品與野生型活性相當(dāng)。
權(quán)利要求
1.油體蛋白和人表皮生長因子融合基因的植物油體表達(dá)載體p1390ONE-EGF。
2.一種制備人表皮生長因子的方法，包括步驟a)、用權(quán)利要求1所述的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體植物，經(jīng)篩選鑒定獲得轉(zhuǎn)基因受體植物并獲得目的植物種子；b)、由目的植物種子提取表皮生長因子活性多肽。
全文摘要
本發(fā)明采用體外基因重組方法，將人表皮生長因子(human Epidermal growth factor，hEGF)與油體蛋白基因融合，構(gòu)建成一種植物油體表達(dá)載體，用根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化了擬南芥、紅花、大豆、黑豆、油菜，建立了一種油體蛋白基因與目的基因融合表達(dá)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，并獲得了轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因紅花、油菜的分子生物學(xué)檢測證明外源基因的整合和表達(dá)，經(jīng)活性檢測，獲得的重組蛋白具有生物活性，其生物活性與人hEGF標(biāo)準(zhǔn)品活性相當(dāng)。本發(fā)明還提供一種在植物種子中表達(dá)人表皮生長因子的方法，這種方法可以提供一種經(jīng)濟(jì)的方法生產(chǎn)人表皮生長因子，可開發(fā)出一種新藥。
文檔編號C12N15/62GK1986818SQ20061016960
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月25日
發(fā)明者李校堃, 肖業(yè)臣, 龐實鋒, 柯實, 張馳 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)