專利名稱：用于檢測(cè)母系遺傳線粒體耳聾基因a1555g突變的探針及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體用于珍斷母系線粒體遺傳耳聾疾病的探針及其用途，更具體的是涉及用于檢測(cè)母系遺傳線粒體耳聾基因A1555G突變的實(shí)時(shí)熒光定量探針及其用途。本發(fā)明還涉及所述探針及其相關(guān)產(chǎn)品在制備用于診斷母系遺傳線粒體耳聾疾病的試劑盒或類似產(chǎn)品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
氨基糖甙類抗生素(鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素及小諾霉素等)因其廣譜高效的抗菌作用以及低廉的價(jià)格在臨床上被廣泛用于控制革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌感染，但此類抗生素具有嚴(yán)重的耳毒性副作用，可使患者發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的聽(tīng)力損失。近十年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，部分氨基糖甙類抗生素致聾患者有母系遺傳家族史，并與線粒體DNA 12S rRNA基因(以下簡(jiǎn)稱為線粒體基因，或mtDNA)第1555位A→G(以下簡(jiǎn)稱A1555G突變)均質(zhì)性點(diǎn)突變有關(guān)(Prezant TR等，Nat Genet，1993，4289-294；袁慧軍等，中華耳鼻咽喉科雜志，1998，3367-70)。單次劑量的氨基糖甙類藥物應(yīng)用即可導(dǎo)致攜帶此突變個(gè)體的重度聽(tīng)力損失。根據(jù)目前已有的研究結(jié)果可知，幾乎攜帶此突變的個(gè)體在應(yīng)用不同劑量的氨基糖甙類抗生素后均發(fā)生嚴(yán)重或較嚴(yán)重的聽(tīng)力損失，是后天性獲得性耳聾發(fā)生的重要原因。鑒于這一耳聾有明確的基因變化和誘發(fā)因素，使得該種耳聾成為一種可以預(yù)防的疾病。
在中國(guó)已報(bào)道的線粒體基因mtDNA的A1555G突變的母系遺傳耳聾家系已超過(guò)100個(gè)，各家系發(fā)病人數(shù)從2-50人不等，考慮到尚有很多同類家系尚未被發(fā)現(xiàn)、報(bào)道，以及此突變?cè)谏l(fā)性耳聾的致病機(jī)制中占有一定的比例，對(duì)這種耳聾的預(yù)防變得更為重要。其預(yù)防的關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于通過(guò)篩查，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)攜帶mtDNA的A1555G突變的個(gè)體，絕對(duì)禁止此類個(gè)體接觸氨基糖甙類抗生素，從而避免嚴(yán)重的耳毒性反應(yīng)發(fā)生。
自1993年以來(lái)，對(duì)此突變的檢測(cè)除了直接測(cè)序外，最常用的篩選方法為BsmAI(Alw26I)酶切法(Fischel-Ghodsian等，Am J Otolaryngol，1993，14399-403；Fischel-Ghodsian等，AmJ Otolaryngol，1997b，18173-178；袁慧軍等，中華耳鼻咽喉科雜志，1998，3367-70)。在國(guó)外，普遍應(yīng)用限制性酶BsmAI(Alw26I)酶切配合序列分析鑒定有無(wú)mtDNA的A1555G突變，酶切鑒定方便快捷，結(jié)果可靠，但不足的是BsmAI(Alw26I)價(jià)格較貴，與常用的限制性酶相比，價(jià)格差異達(dá)50-100倍；國(guó)內(nèi)目前主要應(yīng)用線粒體基因A1555G突變檢測(cè)試劑盒(專利號(hào)ZL03156762.2)，該技術(shù)在線粒體基因的1555位鄰近引入一個(gè)包括1555位在內(nèi)的新的限制性酶切位點(diǎn)，然后用Hae III限制性內(nèi)切酶消化(戴樸等，中國(guó)聽(tīng)力語(yǔ)言康復(fù)科學(xué)，2004，621-23)，雖然較BsmAI(Alw26I)相比具有成本低的明顯優(yōu)勢(shì)，但仍需聚合酶鏈反應(yīng)后的繁瑣處理，耗時(shí)較長(zhǎng)，為克服這一缺點(diǎn)我們?cè)O(shè)計(jì)了一種更為簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、減少污染而且成本低廉的檢測(cè)方法，以滿足對(duì)mtDNA的A1555G突變進(jìn)行廣泛篩查的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的通過(guò)下述原理實(shí)現(xiàn)為了檢測(cè)在母系遺傳線粒體基因序列(SEQ ID NO5)中的A1555G突變，設(shè)計(jì)覆蓋所述基因序列的1555bp位點(diǎn)在內(nèi)的探針(探針序列跨度為1543bp-1574bp)，并且在該探針片段的5’末端標(biāo)記了熒光報(bào)告基團(tuán)、3’末端標(biāo)記了熒光淬滅基團(tuán)，其中如果探針在1555bp相應(yīng)的堿基A被替換為G，則稱為突變型實(shí)時(shí)熒光定量探針(或突變型探針、突變型Taqman探針)；如果探針在1555bp相應(yīng)的堿基仍舊是A，則稱為野生型實(shí)時(shí)熒光定量探針(或野生型探針、野生型Taqman探針)；由于突變型和野生型兩種探針的5’端熒光報(bào)告基團(tuán)不同，即二者發(fā)射波長(zhǎng)不同的熒光(不同波長(zhǎng)的熒光在在實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀器上能被分別記錄下來(lái)，在分析軟件中以不同的顏色或不同的標(biāo)記反映出來(lái))，因此，突變型探針能與發(fā)生A1555G突變的模板完全匹配而不能與野生型模板完全匹配；而野生型探針不能與發(fā)生A1555G突變的模板完全匹配、而只能與野生型模板完全匹配；并且熒光報(bào)告基團(tuán)不同的探針結(jié)合模板可發(fā)射不同波長(zhǎng)的熒光。
在實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系中，加入用于擴(kuò)增母系遺傳線粒體耳聾基因序列SEQ IDNO5的正向引物和反向引物(可以根據(jù)任何生物引物軟件進(jìn)行設(shè)計(jì))，并加入突變型實(shí)時(shí)熒光定量探針，如果需要，還可加入野生型實(shí)時(shí)熒光定量探針。
由于熒光探針很短(13-30bp左右)，5′端熒光報(bào)告基團(tuán)吸收能量后可將能量轉(zhuǎn)移給鄰近的3′端熒光淬滅基團(tuán)，而3′端熒光淬滅基團(tuán)則可抑制5’端熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光發(fā)射。因此，探針完整時(shí)，即5’端熒光報(bào)告基團(tuán)未脫離3’熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽時(shí)，檢測(cè)不到探針5′端熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將引物和突變型探針和野生型探針同時(shí)加入實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系中。當(dāng)體系中的模板變性后低溫退火時(shí)，引物與探針均與模板結(jié)合。在引物的介導(dǎo)下，沿模板向前延伸至探針結(jié)合處，Taq酶的5′-3′外切酶活性(此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響)將探針5′端連接的熒光報(bào)告基團(tuán)從探針上切割下來(lái)，游離于反應(yīng)體系中，從而脫離3′端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，接受光刺激發(fā)出熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，也就是熒光信號(hào)的強(qiáng)度與相應(yīng)PCR產(chǎn)物量成線性函數(shù)關(guān)系。當(dāng)模板為A1555G突變型時(shí)，則突變型探針會(huì)與之全匹配結(jié)合，PCR反應(yīng)中5’端熒光報(bào)告基團(tuán)不斷被Taq酶切下，脫離3′端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，其熒光強(qiáng)度隨PCR產(chǎn)物量的增多而不斷增加。而野生型探針因與之存在一個(gè)堿基的差別不能結(jié)合，故只檢測(cè)到突變型探針發(fā)射所對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)；當(dāng)模板為A1555A野生型時(shí)，野生型探針會(huì)與模板全匹配結(jié)合，突變型探針因與之存在一個(gè)堿基的差別不能結(jié)合，故只檢測(cè)到野生型探針發(fā)射所對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)。由于突變型和野生型探針的5’端分別連接不同的熒光報(bào)告基團(tuán)，因此根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器分析軟件記錄到的由不同顏色或標(biāo)記區(qū)別的波長(zhǎng)不同的熒光即可分辨出熒光所對(duì)應(yīng)的模板，也就檢測(cè)出樣品中是否含有母系遺傳線粒體耳聾基因。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，在實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系中也可僅加入突變型探針，當(dāng)模板是突變型時(shí)，則最終可檢測(cè)到突變型探針發(fā)射所對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)，因而確定樣本含有母系遺傳線粒體耳聾基因A1555G突變，從而確定患者患有母系線粒體遺傳耳聾疾?。划?dāng)模板是野生型時(shí)，則最終不能檢測(cè)到突變型探針發(fā)射所對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)，因而確定樣本不含有母系遺傳線粒體耳聾基因A1555G突變，從而確定患者未患有母系線粒體遺傳耳聾疾病。
也就是說(shuō)，理論上，一個(gè)體系中僅加入針對(duì)A1555G突變型模板的突變型探針即可進(jìn)行檢測(cè)。但是當(dāng)同時(shí)加入的針對(duì)A1555A野生型模板的野生型探針時(shí)，可以起到反向校正的雙保險(xiǎn)作用，從而使結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。
因此，基于以上發(fā)明原理，本發(fā)明第一個(gè)發(fā)明目的是提供一種用于檢測(cè)母系遺傳線粒體耳聾基因A1555G突變的實(shí)時(shí)熒光定量探針，其中探針的5’端位于如母系遺傳線粒體耳聾基因序列SEQ ID NO5所示的1543-1553bp區(qū)域中(優(yōu)選位于1546-1550bp區(qū)域，更優(yōu)選位于1548bp)，3’端位于如線粒體基因序列SEQ ID NO5所示的1564-1574bp區(qū)域中(優(yōu)選位于1567bp-1571bp，更優(yōu)選位于1569bp)，并且在該探針片段的5’末端標(biāo)記了熒光報(bào)告基團(tuán)、3’末端標(biāo)記了熒光淬滅基團(tuán)，以及1555bp的堿基A被替換為G，稱為突變型實(shí)時(shí)熒光定量探針。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，突變型熒光探針的核苷酸序列位于如母系遺傳線粒體耳聾基因序列SEQ ID NO5所示的1548-1569bp區(qū)域中(如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列)，并且5’端熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端熒光淬滅基團(tuán)是TAMRA熒光淬滅基團(tuán)。
本發(fā)明第二個(gè)發(fā)明目的是提供與突變型探針協(xié)同使用的野生型探針。與突變型實(shí)時(shí)熒光探針相比，野生型實(shí)時(shí)熒光探針除了在1555bp的堿基仍是A、且5’端熒光報(bào)告基團(tuán)不同于突變型探針的5’端熒光報(bào)告基團(tuán)之外，其余結(jié)構(gòu)都相同。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，野生型熒光探針的核苷酸序列位于如母系遺傳線粒體耳聾基因序列SEQ ID NO5所示的1548-1569bp區(qū)域中(如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列)，并且5’端熒光報(bào)告基團(tuán)是HEX熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端熒光淬滅基團(tuán)是TAMRA熒光淬滅基團(tuán)。
應(yīng)當(dāng)指出，5’端熒光報(bào)告基團(tuán)及其相應(yīng)的3’端熒光淬滅基團(tuán)可以是本領(lǐng)域中任何可用的熒光基團(tuán)，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，選擇這些熒光報(bào)告基團(tuán)及其相應(yīng)的熒光淬滅基團(tuán)也是眾所周知的常規(guī)技術(shù)。例如，熒光染料FAM和HEX可以由其他熒光基團(tuán)或染料代替，如VIC、JOE等。
本發(fā)明第三個(gè)目的是提供與實(shí)時(shí)熒光定量探針共同使用的PCR正向引物和反向引物。正向引物和反向引物用于擴(kuò)增包含了A1555G突變的母系遺傳線粒體耳聾基因序列SEQ IDNO5。其中正向引物(長(zhǎng)約15-24bp)5’端位于SEQ ID NO5(A1555G上游)的1-1467bp區(qū)域，反向引物(長(zhǎng)約15-24bp)的3’端位于SEQ ID NO5(A1555G下游)的1668bp-16568bp區(qū)域；優(yōu)選地，正向引物(長(zhǎng)約15-24bp)的5’端位于SEQ ID NO5(A1555G上游)的1000-1467bp區(qū)域，反向引物(長(zhǎng)約15-24bp)的3’端位于SEQ ID NO5(A1555G下游)的1668bp-2000bp區(qū)域；更優(yōu)選地，正向引物(長(zhǎng)約15-24bp)的5’端位于SEQ ID NO5(A1555G上游)的1400-1467bp區(qū)域，反向引物(長(zhǎng)約15-24bp)的3’端位于SEQ ID NO5(A1555G下游)的1668bp-1700bp區(qū)域；最優(yōu)選地，正向引物(長(zhǎng)約15-24bp)的5’端位于SEQ ID NO5(A1555G上游)的1467bp位點(diǎn)，反向引物(長(zhǎng)約15-24bp)的3’端位于SEQ ID NO5(A1555G下游)的1668bp位點(diǎn)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，正向引物是母系遺傳線粒體耳聾基因序列SEQ ID NO5所示的1467-1483bp核苷酸序列，其序列為序列表中的SEQIDNO3；反向引物是則是其所示的1650-1668bp的核苷酸序列，其序列為序列表中的SEQ ID NO4。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，可以使用各種生物軟件程序設(shè)計(jì)上述引物。優(yōu)選使用GenetoolLite程序(美國(guó)Biotools公司提供的軟件)來(lái)設(shè)計(jì)引物。
本發(fā)明第四個(gè)發(fā)明目的提供上述探針在制備用于診斷母系線粒體耳聾遺傳疾病的試劑盒中的應(yīng)用。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明人利用發(fā)明原理和設(shè)計(jì)的引物以及Taqman探針提供用于體外檢測(cè)母系遺傳耳聾線粒體基因A1555G突變的試劑盒，用于診斷母系線粒體遺傳耳聾疾病，該試劑盒含有1.提取血樣DNA的試劑；2.PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑混合液，優(yōu)選Hotstar Mastermix混和液；3.用于擴(kuò)增包含了A1555A位點(diǎn)或A1555G突變位點(diǎn)的母系遺傳線粒體耳聾基因序列SEQ ID NO5的正向引物和反向引物(優(yōu)選等比例混合)；4.前述的實(shí)時(shí)熒光定量Taqman突變型探針；5.如果需要，還包括使用說(shuō)明書(shū)。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，上述試劑盒還可包含前述的野生型實(shí)時(shí)熒光定量探針。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，上述試劑盒中的正向引物和反向引物結(jié)構(gòu)如前文所述。優(yōu)選選自SEQ ID NO3所示的核苷酸序列，反向引物優(yōu)選選自SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，突變型探針核苷酸序列優(yōu)選選自如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，其5’末端的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM熒光報(bào)告基團(tuán)，3’末端的熒光淬滅基團(tuán)是TAMRA熒光淬滅基團(tuán)。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，野生型探針核苷酸序列優(yōu)選選自如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列，其5’末端的熒光報(bào)告基團(tuán)是HEX熒光報(bào)告基團(tuán)，3’末端的熒光淬滅基團(tuán)是TAMRA熒光淬滅基團(tuán)。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，上述試劑盒中所述的提取血樣DNA的試劑為提取足根血DNA的溶液I，其主要成分為Chelex(ABI公司產(chǎn)品)；或者提取血樣DNA的試劑為外周血DNA提取試劑，選用市售產(chǎn)品配套使用。
應(yīng)當(dāng)指出，術(shù)語(yǔ)“試劑盒”是還應(yīng)當(dāng)包括具有不同于試劑盒的名稱，但與試劑盒具有類似結(jié)構(gòu)或組分以及生物學(xué)功能的生物學(xué)產(chǎn)品。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述探針或試劑盒在體外檢測(cè)母系遺傳線粒體耳聾基因A1555G突變中的用途。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供上述探針或試劑盒在制備用于珍斷母系線粒體耳聾遺傳疾病(即檢測(cè)母系遺傳線粒體耳聾基因A1555G突變)的產(chǎn)品(包括藥物、試劑、試劑盒等產(chǎn)品)中的用途。
檢測(cè)母系遺傳線粒體耳聾基因A1555G突變與現(xiàn)有技術(shù)(如Hae III酶切鑒定方法)相比有以下優(yōu)點(diǎn)
1.本發(fā)明檢測(cè)線粒體耳聾基因A1555G突變操作步驟和反應(yīng)時(shí)間均比現(xiàn)有技術(shù)(如Hae III酶切鑒定方法)有明顯優(yōu)勢(shì)本發(fā)明僅需一次PCR過(guò)程即可檢測(cè)出是否存在A1555G突變，比現(xiàn)有技術(shù)(如Hae III酶切鑒定方法)簡(jiǎn)省了PCR后的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、酶切反應(yīng)和酶切后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)三個(gè)步驟，不僅減少了PCR反應(yīng)后處理帶來(lái)的污染風(fēng)險(xiǎn)，還將反應(yīng)時(shí)間由原來(lái)的將近6小時(shí)縮短到1.5小時(shí)。
2.本發(fā)明兩條探針設(shè)計(jì)分別針對(duì)A1555G突變型和A1555A野生型，當(dāng)共同存在于同一體系時(shí)每種探針只與序列與其完全匹配的模板結(jié)合，故特異性極強(qiáng)。對(duì)一份模板而言，如果檢測(cè)到突變型探針的5’端熒光(如FAM熒光)，未檢測(cè)到野生型探針的5’端熒光(如HEX熒光)可以肯定為A1555G突變型；如果反之則可肯定為A1555A野生型。并且理論上，一個(gè)體系中僅加入針對(duì)A1555G突變型模板的突變型探針即可進(jìn)行診斷。但是當(dāng)同時(shí)加入兩種探針時(shí)，可以起到反向校正的雙保險(xiǎn)作用，從而使結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。此外，探針技術(shù)的高特異性和光譜技術(shù)的敏感性賦予了本發(fā)明重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、敏感性高和易操作等優(yōu)點(diǎn)。
3.本發(fā)明的結(jié)果判讀在實(shí)時(shí)定量PCR儀器的分析軟件支持下進(jìn)行，具有自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，減少了人為的誤差。
4.應(yīng)用本發(fā)明提供的試劑盒或相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行A1555G突變檢測(cè)，成本較其他常規(guī)檢測(cè)方法更低。
由此可見(jiàn)，本發(fā)明的探針及其試劑盒填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)相關(guān)檢測(cè)領(lǐng)域的空白，并且其操作簡(jiǎn)便、判讀直觀、特異性強(qiáng)、敏感性高、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)為在全國(guó)范圍內(nèi)實(shí)行母系遺傳線粒體耳聾基因A1555G突變的篩查和抗生素應(yīng)用前預(yù)防性檢測(cè)提供了更為便利的條件，從而根本上減少對(duì)氨基糖甙類抗生素敏感的個(gè)體發(fā)生藥物性耳聾的機(jī)會(huì)。


圖1所示132例不同基因型的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的部分結(jié)果圖(Allelic data forCycling A.FAM/Sybr，Cycling A.JOE)。
圖2所示132例不同基因型的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的部分結(jié)果圖的圖例。
具體實(shí)施例方式
母系遺傳耳聾線粒體基因A1555G突變的檢測(cè)1.檢測(cè)樣本從中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院聾病分子診斷中心聾病資源庫(kù)選取感音神經(jīng)性耳聾患者132人，從被檢個(gè)體提取外周全血DNA(袁慧軍等，中華耳鼻咽喉科雜志，1998，33(2)67-70；李為民等，臨床耳鼻咽喉科雜志，2001，15(增刊)53-58)，作為檢測(cè)樣本。
2.探針和引物設(shè)計(jì)根據(jù)已公開(kāi)的線粒體基因序列(Cambridge Sequence或NCBI人線粒體基因組序列NC-001807.4或NT-006713.14等，或序列號(hào)SEQ ID NO5)，使用Genetool Lite程序協(xié)助設(shè)計(jì)引物和Taqman探針序列，其中突變型熒光探針(T1)的核苷酸序列位于如母系遺傳線粒體耳聾基因序列SEQ ID NO5所示的1548-1569bp區(qū)域中(如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列)，并且熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM熒光報(bào)告基團(tuán)，熒光淬滅基團(tuán)是TAMRA熒光淬滅基團(tuán)，探針結(jié)構(gòu)如下5′FAM-AGAGGAGGCAAGTCGTAACATG-TAMRA3′野生型熒光探針(T2)的核苷酸序列位于如母系遺傳線粒體耳聾基因序列SEQ ID NO5所示的1548-1569bp區(qū)域中(如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列)，并且熒光報(bào)告基團(tuán)是HEX熒光報(bào)告基團(tuán)，熒光淬滅基團(tuán)是TAMRA熒光淬滅基團(tuán)，探針結(jié)構(gòu)如下5′HEX-AGAGGAGACAAGTCGTAACATG-TAMRA3′正向引物(F1)是母系遺傳線粒體耳聾基因序列SEQ ID NO5所示的1467-1483bp核苷酸序列，其序列為序列表中的SEQIDNO3；反向引物(R1)是則是其所示的1650-1668bp的核苷酸序列，其序列為序列表中的SEQ ID NO4。
3.PCR擴(kuò)增反應(yīng)根據(jù)上述設(shè)計(jì)的探針核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、以及引物序列SEQ IDNO3、SEQ ID NO4，通過(guò)人工合成得到探針T1、T2、正向引物F1和反向引物R1，并以上述提取的被測(cè)樣本的外周血DNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)反應(yīng)體系模板 10ngHotstar Mastermix10μl引物F1，R1(2pmol/ml) 各1μl探針T1(2pmol/ml) 1μl另外，如果需要，加入1μl的T2(2pmol/ml)
加三蒸水至20μl體積。
反應(yīng)條件如表1所示95℃變性10分鐘后，接著95℃變性30秒，59℃退火30秒，，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)退火時(shí)采集熒光。
表1

4.結(jié)果132名受檢對(duì)象中以實(shí)時(shí)熒光定量Taqman探針?lè)ü矙z測(cè)到32人攜帶mtDNA的A1555G突變。
5.實(shí)時(shí)定量Taqman探針?lè)煽啃缘臋z驗(yàn)所有被檢測(cè)個(gè)體的1555bp位點(diǎn)均經(jīng)過(guò)Alw26I酶切和直接測(cè)序兩種方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果證明根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量Taqman探針?lè)z測(cè)到的攜帶A1555G突變的32個(gè)耳聾患者，其含有1555位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物均不能被Alw26I切開(kāi)；而不攜帶A1555G突變的100名個(gè)體，其含有1555位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物均能被Alw26I切開(kāi)。直接測(cè)序法證實(shí)了Taqman探針?lè)ǖ慕Y(jié)果。三種方法的吻合率為100％，說(shuō)明使用本發(fā)明方法檢測(cè)A1555G突變的可靠性和穩(wěn)定性。具體數(shù)據(jù)參見(jiàn)表2。
表2

序列表<110>金政策<120>用于檢測(cè)母系遺傳線粒體耳聾基因A1555G突變的探針及其用途<160>5<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>突變型Taqman探針核苷酸序列<440>1AGAGGAGGCA AGTCGTAACA TG 22<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>野生型Taqman探針核苷酸序列<440>2AGAGGAGACA AGTCGTAACA TG 22<210>3<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物F1<400>3CTGAAGCGCG TACACAC17<210>4<211>19<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>反向引物R1<400>4AGAGCGGTCA AGTTAAGTT 19<210>5<211>16568<212>DNA<213>智人(Homo Sapiens)<220>
<223>人線粒體基因組<400>5GATCACAGGT CTATCACCCT ATTAACCACT CACGGGAGCT CTCCATGCAT TTGGTATTTT60CGTCTGGGGG GTATGCACGC GATAGCATTG CGAGACGCTG GAGCCGGAGC ACCCTATGTC120GCAGTATCTG TCTTTGATTC CTGCCTCATC CTATTATTTA TCGCACCTAC GTTCAATATT180ACAGGCGAAC ATACTTACTA AAGTGTGTTA ATTAATTAAT GCTTGTAGGA CATAATAATA240ACAATTGAAT GTCTGCACAG CCACTTTCCA CACAGACATC ATAACAAAAA ATTTCCACCA300AACCCCCCCT CCCCCGCTTC TGGCCACAGC ACTTAAACAC ATCTCTGCCA AACCCCAAAA360ACAAAGAACC CTAACACCAG CCTAACCAGA TTTCAAATTT TATCTTTTGG CGGTATGCAC420TTTTAACAGT CACCCCCCAA CTAACACATT ATTTTCCCCT CCCACTCCCA TACTACTAAT480CTCATCAATA CAACCCCCGC CCATCCTACC CAGCACACAC ACACCGCTGC TAACCCCATA540CCCCGAACCA ACCAAACCCC AAAGACACCC CCCACAGTTT ATGTAGCTTA CCTCCTCAAA600GCAATACACT GAAAATGTTT AGACGGGCTC ACATCACCCC ATAAACAAAT AGGTTTGGTC660CTAGCCTTTC TATTAGCTCT TAGTAAGATT ACACATGCAA GCATCCCCGT TCCAGTGAGT720TCACCCTCTA AATCACCACG ATCAAAAGGA ACAAGCATCA AGCACGCAGC AATGCAGCTC780AAAACGCTTA GCCTAGCCAC ACCCCCACGG GAAACAGCAG TGATTAACCT TTAGCAATAA840ACGAAAGTTT AACTAAGCTA TACTAACCCC AGGGTTGGTC AATTTCGTGC CAGCCACCGC900GGTCACACGA TTAACCCAAG TCAATAGAAG CCGGCGTAAA GAGTGTTTTA GATCACCCCC960TCCCCAATAA AGCTAAAACT CACCTGAGTT GTAAAAAACT CCAGTTGACA CAAAATAGAC1020TACGAAAGTG GCTTTAACAT ATCTGAACAC ACAATAGCTA AGACCCAAAC TGGGATTAGA1080TACCCCACTA TGCTTAGCCC TAAACCTCAA CAGTTAAATC AACAAAACTG CTCGCCAGAA1140CACTACGAGC CACAGCTTAA AACTCAAAGG ACCTGGCGGT GCTTCATATC CCTCTAGAGG1200AGCCTGTTCT GTAATCGATA AACCCCGATC AACCTCACCA CCTCTTGCTC AGCCTATATA1260CCGCCATCTT CAGCAAACCC TGATGAAGGC TACAAAGTAA GCGCAAGTAC CCACGTAAAG1320ACGTTAGGTC AAGGTGTAGC CCATGAGGTG GCAAGAAATG GGCTACATTT TCTACCCCAG1380AAAACTACGA TAGCCCTTAT GAAACTTAAG GGTCGAAGGT GGATTTAGCA GTAAACTAAG1440AGTAGAGTGC TTAGTTGAAC AGGGCCCTGA AGCGCGTACA CACCGCCCGT CACCCTCCTC1500AAGTATACTT CAAAGGACAT TTAACTAAAA CCCCTACGCA TTTATATAGA GGAGACAAGT1560CGTAACATGG TAAGTGTACT GGAAAGTGCA CTTGGACGAA CCAGAGTGTA GCTTAACACA1620
AAGCACCCAA CTTACACTTA GGAGATTTCA ACTTAACTTG ACCGCTCTGA GCTAAACCTA1680GCCCCAAACC CACTCCACCT TACTACCAGA CAACCTTAGC CAAACCATTT ACCCAAATAA1740AGTATAGGCG ATAGAAATTG AAACCTGGCG CAATAGATAT AGTACCGCAA GGGAAAGATG1800AAAAATTATA ACCAAGCATA ATATAGCAAG GACTAACCCC TATACCTTCT GCATAATGAA1860TTAACTAGAA ATAACTTTGC AAGGAGAGCC AAAGCTAAGA CCCCCGAAAC CAGACGAGCT1920ACCTAAGAAC AGCTAAAAGA GCACACCCGT CTATGTAGCA AAATAGTGGG AAGATTTATA1980GGTAGAGGCG ACAAACCTAC CGAGCCTGGT GATAGCTGGT TGTCCAAGAT AGAATCTTAG2040TTCAACTTTA AATTTGCCCA CAGAACCCTC TAAATCCCCT TGTAAATTTA ACTGTTAGTC2100CAAAGAGGAA CAGCTCTTTG GACACTAGGA AAAAACCTTG TAGAGAGAGT AAAAAATTTA2160ACACCCATAG TAGGCCTAAA AGCAGCCACC AATTAAGAAA GCGTTCAAGC TCAACACCCA2220CTACCTAAAA AATCCCAAAC ATATAACTGA ACTCCTCACA CCCAATTGGA CCAATCTATC2280ACCCTATAGA AGAACTAATG TTAGTATAAG TAACATGAAA ACATTCTCCT CCGCATAAGC2340CTGCGTCAGA TTAAAACACT GAACTGACAA TTAACAGCCC AATATCTACA ATCAACCAAC2400AAGTCATTAT TACCCTCACT GTCAACCCAA CACAGGCATG CTCATAAGGA AAGGTTAAAA2460AAAGTAAAAG GAACTCGGCA AATCTTACCC CGCCTGTTTA CCAAAAACAT CACCTCTAGC2520ATCACCAGTA TTAGAGGCAC CGCCTGCCCA GTGACACATG TTTAACGGCC GCGGTACCCT2580AACCGTGCAA AGGTAGCATA ATCACTTGTT CCTTAAATAG GGACCTGTAT GAATGGCTCC2640ACGAGGGTTC AGCTGTCTCT TACTTTTAAC CAGTGAAATT GACCTGCCCG TGAAGAGGCG2700GGCATAACAC AGCAAGACGA GAAGACCCTA TGGAGCTTTA ATTTATTAAT GCAAACAGTA2760CCTAACAAAC CCACAGGTCC TAAACTACCA AACCTGCATT AAAAATTTCG GTTGGGGCGA2820CCTCGGAGCA GAACCCAACC TCCGAGCAGT ACATGCTAAG ACTTCACCAG TCAAAGCGAA2880CTACTATACT CAATTGATCC AATAACTTGA CCAACGGAAC AAGTTACCCT AGGGATAACA2940GCGCAATCCT ATTCTAGAGT CCATATCAAC AATAGGGTTT ACGACCTCGA TGTTGGATCA3000GGACATCCCG ATGGTGCAGC CGCTATTAAA GGTTCGTTTG TTCAACGATT AAAGTCCTAC3060GTGATCTGAG TTCAGACCGG AGTAATCCAG GTCGGTTTCT ATCTACTTCA AATTCCTCCC3120TGTACGAAAG GACAAGAGAA ATAAGGCCTA CTTCACAAAG CGCCTTCCCC CGTAAATGAT3180ATCATCTCAA CTTAGTATTA TACCCACACC CACCCAAGAA CAGGGTTTGT TAAGATGGCA3240GAGCCCGGTA ATCGCATAAA ACTTAAAACT TTACAGTCAG AGGTTCAATT CCTCTTCTTA3300ACAACATACC CATGGCCAAC CTCCTACTCC TCATTGTACC CATTCTAATC GCAATGGCAT3360TCCTAATGCT TACCGAACGA AAAATTCTAG GCTATATACA ACTACGCAAA GGCCCCAACG3420TTGTAGGCCC CTACGGGCTA CTACAACCCT TCGCTGACGC CATAAAACTC TTCACCAAAG3480AGCCCCTAAA ACCCGCCACA TCTACCATCA CCCTCTACAT CACCGCCCCG ACCTTAGCTC3540TCACCATCGC TCTTCTACTA TGAACCCCCC TCCCCATACC CAACCCCCTG GTCAACCTCA3600ACCTAGGCCT CCTATTTATT CTAGCCACCT CTAGCCTAGC CGTTTACTCA ATCCTCTGAT3660CAGGGTGAGC ATCAAACTCA AACTACGCCC TGATCGGCGC ACTGCGAGCA GTAGCCCAAA3720CAATCTCATA TGAAGTCACC CTAGCCATCA TTCTACTATC AACATTACTA ATAAGTGGCT3780CCTTTAACCT CTCCACCCTT ATCACAACAC AAGAACACCT CTGATTACTC CTGCCATCAT3840GACCCTTGGC CATAATATGA TTTATCTCCA CACTAGCAGA GACCAACCGA ACCCCCTTCG3900ACCTTGCCGA AGGGGAGTCC GAACTAGTCT CAGGCTTCAA CATCGAATAC GCCGCAGGCC3960CCTTCGCCCT ATTCTTCATA GCCGAATACA CAAACATTAT TATAATAAAC ACCCTCACCA4020CTACAATCTT CCTAGGAACA ACATATGACG CACTCTCCCC TGAACTCTAC ACAACATATT4080TTGTCACCAA GACCCTACTT CTAACCTCCC TGTTCTTATG AATTCGAACA GCATACCCCC4140GATTCCGCTA CGACCAACTC ATACACCTCC TATGAAAAAA CTTCCTACCA CTCACCCTAG4200CATTACTTAT ATGATATGTC TCCATACCCA TTACAATCTC CAGCATTCCC CCTCAAACCT4260AAGAAATATG TCTGATAAAA GAGTTACTTT GATAGAGTAA ATAATAGGAG CTTAAACCCC4320
CTTATTTCTA GGACTATGAG AATCGAACCC ATCCCTGAGA ATCCAAAATT CTCCGTGCCA4380CCTATCACAC CCCATCCTAA AGTAAGGTCA GCTAAATAAG CTATCGGGCC CATACCCCGA4440AAATGTTGGT TATACCCTTC CCGTACTAAT TAATCCCCTG GCCCAACCCG TCATCTACTC4500TACCATCTTT GCAGGCACAC TCATCACAGC GCTAAGCTCG CACTGATTTT TTACCTGAGT4560AGGCCTAGAA ATAAACATGC TAGCTTTTAT TCCAGTTCTA ACCAAAAAAA TAAACCCTCG4620TTCCACAGAA GCTGCCATCA AGTATTTCCT CACGCAAGCA ACCGCATCCA TAATCCTTCT4680AATAGCTATC CTCTTCAACA ATATACTCTC CGGACAATGA ACCATAACCA ATACTACCAA4740TCAATACTCA TCATTAATAA TCATAATAGC TATAGCAATA AAACTAGGAA TAGCCCCCTT4800TCACTTCTGA GTCCCAGAGG TTACCCAAGG CACCCCTCTG ACATCCGGCC TGCTTCTTCT4860CACATGACAA AAACTAGCCC CCATCTCAAT CATATACCAA ATCTCTCCCT CACTAAACGT4920AAGCCTTCTC CTCACTCTCT CAATCTTATC CATCATAGCA GGCAGTTGAG GTGGATTAAA4980CCAAACCCAG CTACGCAAAA TCTTAGCATA CTCCTCAATT ACCCACATAG GATGAATAAT5040AGCAGTTCTA CCGTACAACC CTAACATAAC CATTCTTAAT TTAACTATTT ATATTATCCT5100AACTACTACC GCATTCCTAC TACTCAACTT AAACTCCAGC ACCACGACCC TACTACTATC5160TCGCACCTGA AACAAGCTAA CATGACTAAC ACCCTTAATT CCATCCACCC TCCTCTCCCT5220AGGAGGCCTG CCCCCGCTAA CCGGCTTTTT GCCCAAATGG GCCATTATCG AAGAATTCAC5280AAAAAACAAT AGCCTCATCA TCCCCACCAT CATAGCCACC ATCACCCTCC TTAACCTCTA5340CTTCTACCTA CGCCTAATCT ACTCCACCTC AATCACACTA CTCCCCATAT CTAACAACGT5400AAAAATAAAA TGACAGTTTG AACATACAAA ACCCACCCCA TTCCTCCCCA CACTCATCGC5460CCTTACCACG CTACTCCTAC CTATCTCCCC TTTTATACTA ATAATCTTAT AGAAATTTAG5520GTTAAATACA GACCAAGAGC CTTCAAAGCC CTCAGTAAGT TGCAATACTT AATTTCTGTA5580ACAGCTAAGG ACTGCAAAAC CCCACTCTGC ATCAACTGAA CGCAAATCAG CCACTTTAAT5640TAAGCTAAGC CCTTACTAGA CCAATGGGAC TTAAACCCAC AAACACTTAG TTAACAGCTA5700AGCACCCTAA TCAACTGGCT TCAATCTACT TCTCCCGCCG CCGGGAAAAA AGGCGGGAGA5760AGCCCCGGCA GGTTTGAAGC TGCTTCTTCG AATTTGCAAT TCAATATGAA AATCACCTCG5820GAGCTGGTAA AAAGAGGCCT AACCCCTGTC TTTAGATTTA CAGTCCAATG CTTCACTCAG5880CCATTTTACC TCACCCCCAC TGATGTTCGC CGACCGTTGA CTATTCTCTA CAAACCACAA5940AGACATTGGA ACACTATACC TATTATTCGG CGCATGAGCT GGAGTCCTAG GCACAGCTCT6000AAGCCTCCTT ATTCGAGCCG AGCTGGGCCA GCCAGGCAAC CTTCTAGGTA ACGACCACAT6060CTACAACGTT ATCGTCACAG CCCATGCATT TGTAATAATC TTCTTCATAG TAATACCCAT6120CATAATCGGA GGCTTTGGCA ACTGACTAGT TCCCCTAATA ATCGGTGCCC CCGATATGGC6180GTTTCCCCGC ATAAACAACA TAAGCTTCTG ACTCTTACCT CCCTCTCTCC TACTCCTGCT6240CGCATCTGCT ATAGTGGAGG CCGGAGCAGG AACAGGTTGA ACAGTCTACC CTCCCTTAGC6300AGGGAACTAC TCCCACCCTG GAGCCTCCGT AGACCTAACC ATCTTCTCCT TACACCTAGC6360AGGTGTCTCC TCTATCTTAG GGGCCATCAA TTTCATCACA ACAATTATCA ATATAAAACC6420CCCTGCCATA ACCCAATACC AAACGCCCCT CTTCGTCTGA TCCGTCCTAA TCACAGCAGT6480CCTACTTCTC CTATCTCTCC CAGTCCTAGC TGCTGGCATC ACTATACTAC TAACAGACCG6540CAACCTCAAC ACCACCTTCT TCGACCCCGC CGGAGGAGGA GACCCCATTC TATACCAACA6600CCTATTCTGA TTTTTCGGTC ACCCTGAAGT TTATATTCTT ATCCTACCAG GCTTCGGAAT6660AATCTCCCAT ATTGTAACTT ACTACTCCGG AAAAAAAGAA CCATTTGGAT ACATAGGTAT6720GGTCTGAGCT ATGATATCAA TTGGCTTCCT AGGGTTTATC GTGTGAGCAC ACCATATATT6780TACAGTAGGA ATAGACGTAG ACACACGAGC ATATTTCACC TCCGCTACCA TAATCATCGC6840TATCCCCACC GGCGTCAAAG TATTTAGCTG ACTCGCCACA CTCCACGGAA GCAATATGAA6900ATGATCTGCT GCAGTGCTCT GAGCCCTAGG ATTCATCTTT CTTTTCACCG TAGGTGGCCT6960GACTGGCATT GTATTAGCAA ACTCATCACT AGACATCGTA CTACACGACA CGTACTACGT7020
TGTAGCCCAC TTCCACTATG TCCTATCAAT AGGAGCTGTA TTTGCCATCA TAGGAGGCTT7080CATTCACTGA TTTCCCCTAT TCTCAGGCTA CACCCTAGAC CAAACCTACG CCAAAATCCA7140TTTCACTATC ATATTCATCG GCGTAAATCT AACTTTCTTC CCACAACACT TTCTCGGCCT7200ATCCGGAATG CCCCGACGTT ACTCGGACTA CCCCGATGCA TACACCACAT GAAACATCCT7260ATCATCTGTA GGCTCATTCA TTTCTCTAAC AGCAGTAATA TTAATAATTT TCATGATTTG7320AGAAGCCTTC GCTTCGAAGC GAAAAGTCCT AATAGTAGAA GAACCCTCCA TAAACCTGGA7380GTGACTATAT GGATGCCCCC CACCCTACCA CACATTCGAA GAACCCGTAT ACATAAAATC7440TAGACAAAAA AGGAAGGAAT CGAACCCCCC AAAGCTGGTT TCAAGCCAAC CCCATGGCCT7500CCATGACTTT TTCAAAAAGG TATTAGAAAA ACCATTTCAT AACTTTGTCA AAGTTAAATT7560ATAGGCTAAA TCCTATATAT CTTAATGGCA CATGCAGCGC AAGTAGGTCT ACAAGACGCT7620ACTTCCCCTA TCATAGAAGA GCTTATCACC TTTCATGATC ACGCCCTCAT AATCATTTTC7680CTTATCTGCT TCCTAGTCCT GTATGCCCTT TTCCTAACAC TCACAACAAA ACTAACTAAT7740ACTAACATCT CAGACGCTCA GGAAATAGAA ACCGTCTGAA CTATCCTGCC CGCCATCATC7800CTAGTCCTCA TCGCCCTCCC ATCCCTACGC ATCCTTTACA TAACAGACGA GGTCAACGAT7860CCCTCCCTTA CCATCAAATC AATTGGCCAC CAATGGTACT GAACCTACGA GTACACCGAC7920TACGGCGGAC TAATCTTCAA CTCCTACATA CTTCCCCCAT TATTCCTAGA ACCAGGCGAC7980CTGCGACTCC TTGACGTTGA CAATCGAGTA GTACTCCCGA TTGAAGCCCC CATTCGTATA8040ATAATTACAT CACAAGACGT CTTGCACTCA TGAGCTGTCC CCACATTAGG CTTAAAAACA8100GATGCAATTC CCGGACGTCT AAACCAAACC ACTTTCACCG CTACACGACC GGGGGTATAC8160TACGGTCAAT GCTCTGAAAT CTGTGGAGCA AACCACAGTT TCATGCCCAT CGTCCTAGAA8220TTAATTCCCC TAAAAATCTT TGAAATAGGG CCCGTATTTA CCCTATAGCA CCCCCTCTAC8280CCCCTCTAGA GCCCACTGTA AAGCTAACTT AGCATTAACC TTTTAAGTTA AAGATTAAGA8340GAACCAACAC CTCTTTACAG TGAAATGCCC CAACTAAATA CTACCGTATG GCCCACCATA8400ATTACCCCCA TACTCCTTAC ACTATTCCTC ATCACCCAAC TAAAAATATT AAACACAAAC8460TACCACCTAC CTCCCTCACC AAAGCCCATA AAAATAAAAA ATTATAACAA ACCCTGAGAA8520CCAAAATGAA CGAAAATCTG TTCGCTTCAT TCATTGCCCC CACAATCCTA GGCCTACCCG8580CCGCAGTACT GATCATTCTA TTTCCCCCTC TATTGATCCC CACCTCCAAA TATCTCATCA8640ACAACCGACT AATCACCACC CAACAATGAC TAATCAAACT AACCTCAAAA CAAATGATAA8700CCATACACAA CACTAAAGGA CGAACCTGAT CTCTTATACT AGTATCCTTA ATCATTTTTA8760TTGCCACAAC TAACCTCCTC GGACTCCTGC CTCACTCATT TACACCAACC ACCCAACTAT8820CTATAAACCT AGCCATGGCC ATCCCCTTAT GAGCGGGCAC AGTGATTATA GGCTTTCGCT8880CTAAGATTAA AAATGCCCTA GCCCACTTCT TACCACAAGG CACACCTACA CCCCTTATCC8940CCATACTAGT TATTATCGAA ACCATCAGCC TACTCATTCA ACCAATAGCC CTGGCCGTAC9000GCCTAACCGC TAACATTACT GCAGGCCACC TACTCATGCA CCTAATTGGA AGCGCCACCC9060TAGCAATATC AACCATTAAC CTTCCCTCTA CACTTATCAT CTTCACAATT CTAATTCTAC9120TGACTATCCT AGAAATCGCT GTCGCCTTAA TCCAAGCCTA CGTTTTCACA CTTCTAGTAA9180GCCTCTACCT GCACGACAAC ACATAATGAC CCACCAATCA CATGCCTATC ATATAGTAAA9240ACCCAGCCCA TGACCCCTAA CAGGGGCCCT CTCAGCCCTC CTAATGACCT CCGGCCTAGC9300CATGTGATTT CACTTCCACT CCATAACGCT CCTCATACTA GGCCTACTAA CCAACACACT9360AACCATATAC CAATGATGGC GCGATGTAAC ACGAGAAAGC ACATACCAAG GCCACCACAC9420ACCACCTGTC CAAAAAGGCC TTCGATACGG GATAATCCTA TTTATTACCT CAGAAGTTTT9480TTTCTTCGCA GGATTTTTCT GAGCCTTTTA CCACTCCAGC CTAGCCCCTA CCCCCCAATT9540AGGAGGGCAC TGGCCCCCAA CAGGCATCAC CCCGCTAAAT CCCCTAGAAG TCCCACTCCT9600AAACACATCC GTATTACTCG CATCAGGAGT ATCAATCACC TGAGCTCACC ATAGTCTAAT9660AGAAAACAAC CGAAACCAAA TAATTCAAGC ACTGCTTATT ACAATTTTAC TGGGTCTCTA9720
TTTTACCCTC CTACAAGCCT CAGAGTACTT CGAGTCTCCC TTCACCATTT CCGACGGCAT 9780CTACGGCTCA ACATTTTTTG TAGCCACAGG CTTCCACGGA CTTCACGTCA TTATTGGCTC 9840AACTTTCCTC ACTATCTGCT TCATCCGCCA ACTAATATTT CACTTTACAT CCAAACATCA 9900CTTTGGCTTC GAAGCCGCCG CCTGATACTG GCATTTTGTA GATGTGGTTT GACTATTTCT 9960GTATGTCTCC ATCTATTGAT GAGGGTCTTA CTCTTTTAGT ATAAATAGTA CCGTTAACTT 10020CCAATTAACT AGTTTTGACA ACATTCAAAA AAGAGTAATA AACTTCGCCT TAATTTTAAT 10080AATCAACACC CTCCTAGCCT TACTACTAAT AATTATTACA TTTTGACTAC CACAACTCAA 10140CGGCTACATA GAAAAATCCA CCCCTTACGA GTGCGGCTTC GACCCTATAT CCCCCGCCCG 10200CGTCCCTTTC TCCATAAAAT TCTTCTTAGT AGCTATTACC TTCTTATTAT TTGATCTAGA 10260AATTGCCCTC CTTTTACCCC TACCATGAGC CCTACAAACA ACTAACCTGC CACTAATAGT 10320TATGTCATCC CTCTTATTAA TCATCATCCT AGCCCTAAGT CTGGCCTATG AGTGACTACA 10380AAAAGGATTA GACTGAACCG AATTGGTATA TAGTTTAAAC AAAACGAATG ATTTCGACTC 10440ATTAAATTAT GATAATCATA TTTACCAAAT GCCCCTCATT TACATAAATA TTATACTAGC 10500ATTTACCATC TCACTTCTAG GAATACTAGT ATATCGCTCA CACCTCATAT CCTCCCTACT 10560ATGCCTAGAA GGAATAATAC TATCGCTGTT CATTATAGCT ACTCTCATAA CCCTCAACAC 10620CCACTCCCTC TTAGCCAATA TTGTGCCTAT TGCCATACTA GTCTTTGCCG CCTGCGAAGC 10680AGCGGTGGGC CTAGCCCTAC TAGTCTCAAT CTCCAACACA TATGGCCTAG ACTACGTACA 10740TAACCTAAAC CTACTCCAAT GCTAAAACTA ATCGTCCCAA CAATTATATT ACTACCACTG 10800ACATGACTTT CCAAAAAACA CATAATTTGA ATCAACACAA CCACCCACAG CCTAATTATT 10860AGCATCATCC CTCTACTATT TTTTAACCAA ATCAACAACA ACCTATTTAG CTGTTCCCCA 10920ACCTTTTCCT CCGACCCCCT AACAACCCCC CTCCTAATAC TAACTACCTG ACTCCTACCC 10980CTCACAATCA TGGCAAGCCA ACGCCACTTA TCCAGTGAAC CACTATCACG AAAAAAACTC 11040TACCTCTCTA TACTAATCTC CCTACAAATC TCCTTAATTA TAACATTCAC AGCCACAGAA 11100CTAATCATAT TTTATATCTT CTTCGAAACC ACACTTATCC CCACCTTGGC TATCATCACC 11160CGATGAGGCA ACCAGCCAGA ACGCCTGAAC GCAGGCACAT ACTTCCTATT CTACACCCTA 11220GTAGGCTCCC TTCCCCTACT CATCGCACTA ATTTACACTC ACAACACCCT AGGCTCACTA 11280AACATTCTAC TACTCACTCT CACTGCCCAA GAACTATCAA ACTCCTGAGC CAACAACTTA 11340ATATGACTAG CTTACACAAT AGCTTTTATA GTAAAGATAC CTCTTTACGG ACTCCACTTA 11400TGACTCCCTA AAGCCCATGT CGAAGCCCCC ATCGCTGGGT CAATAGTACT TGCCGCAGTA 11460CTCTTAAAAC TAGGCGGCTA TGGTATAATA CGCCTCACAC TCATTCTCAA CCCCCTGACA 11520AAACACATAG CCTACCCCTT CCTTGTACTA TCCCTATGAG GCATAATTAT AACAAGCTCC 11580ATCTGCCTAC GACAAACAGA CCTAAAATCG CTCATTGCAT ACTCTTCAAT CAGCCACATA 11640GCCCTCGTAG TAACAGCCAT TCTCATCCAA ACCCCCTGAA GCTTCACCGG CGCAGTCATT 11700CTCATAATCG CCCACGGGCT TACATCCTCA TTACTATTCT GCCTAGCAAA CTCAAACTAC 11760GAACGCACTC ACAGTCGCAT CATAATCCTC TCTCAAGGAC TTCAAACTCT ACTCCCACTA 11820ATAGCTTTTT GATGACTTCT AGCAAGCCTC GCTAACCTCG CCTTACCCCC CACTATTAAC 11880CTACTGGGAG AACTCTCTGT GCTAGTAACC ACGTTCTCCT GATCAAATAT CACTCTCCTA 11940CTTACAGGAC TCAACATACT AGTCACAGCC CTATACTCCC TCTACATATT TACCACAACA 12000CAATGGGGCT CACTCACCCA CCACATTAAC AACATAAAAC CCTCATTCAC ACGAGAAAAC 12060ACCCTCATGT TCATACACCT ATCCCCCATT CTCCTCCTAT CCCTCAACCC CGACATCATT 12120ACCGGGTTTT CCTCTTGTAA ATATAGTTTA ACCAAAACAT CAGATTGTGA ATCTGACAAC 12180AGAGGCTTAC GACCCCTTAT TTACCGAGAA AGCTCACAAG AACTGCTAAC TCATGCCCCC 12240ATGTCTAACA ACATGGCTTT CTCAACTTTT AAAGGATAAC AGCTATCCAT TGGTCTTAGG 12300CCCCAAAAAT TTTGGTGCAA CTCCAAATAA AAGTAATAAC CATGCACACT ACTATAACCA 12360CCCTAACCCT GACTTCCCTA ATTCCCCCCA TCCTTACCAC CCTCGTTAAC CCTAACAAAA 12420
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ACAGCCTTCA TAGGCTATGT CCTCCCGTGA GGCCAAATAT CATTCTGAGG GGCCACAGTA 15180ATTACAAACT TACTATCCGC CATCCCATAC ATTGGGACAG ACCTAGTTCA ATGAATCTGA 15240GGAGGCTACT CAGTAGACAG TCCCACCCTC ACACGATTCT TTACCTTTCA CTTCATCTTG 15300CCCTTCATTA TTGCAGCCCT AGCAACACTC CACCTCCTAT TCTTGCACGA AACGGGATCA 15360AACAACCCCC TAGGAATCAC CTCCCATTCC GATAAAATCA CCTTCCACCC TTACTACACA 15420ATCAAAGACG CCCTCGGCTT ACTTCTCTTC CTTCTCTCCT TAATGACATT AACACTATTC 15480TCACCAGACC TCCTAGGCGA CCCAGACAAT TATACCCTAG CCAACCCCTT AAACACCCCT 15540CCCCACATCA AGCCCGAATG ATATTTCCTA TTCGCCTACA CAATTCTCCG ATCCGTCCCT 15600AACAAACTAG GAGGCGTCCT TGCCCTATTA CTATCCATCC TCATCCTAGC AATAATCCCC 15660ATCCTCCATA TATCCAAACA ACAAAGCATA ATATTTCGCC CACTAAGCCA ATCACTTTAT 15720TGACTCCTAG CCGCAGACCT CCTCATTCTA ACCTGAATCG GAGGACAACC AGTAAGCTAC 15780CCTTTTACCA TCATTGGACA AGTAGCATCC GTACTATACT TCACAACAAT CCTAATCCTA 15840ATACCAACTA TCTCCCTAAT TGAAAACAAA ATACTCAAAT GGGCCTGTCC TTGTAGTATA 15900AACTAATACA CCAGTCTTGT AAACCGGAGA TGAAAACCTT TTTCCAAGGA CAAATCAGAG 15960AAAAAGTCTT TAACTCCACC ATTAGCACCC AAAGCTAAGA TTCTAATTTA AACTATTCTC 16020TGTTCTTTCA TGGGGAAGCA GATTTGGGTA CCACCCAAGT ATTGACTCAC CCATCAACAA 16080CCGCTATGTA TTTCGTACAT TACTGCCAGC CACCATGAAT ATTGTACGGT ACCATAAATA 16140CTTGACCACC TGTAGTACAT AAAAACCCAA TCCACATCAA AACCCCCTCC CCATGCTTAC 16200AAGCAAGTAC AGCAATCAAC CCTCAACTAT CACACATCAA CTGCAACTCC AAAGCCACCC 16260CTCACCCACT AGGATACCAA CAAACCTACC CACCCTTAAC AGTACATAGT ACATAAAGCC 16320ATTTACCGTA CATAGCACAT TACAGTCAAA TCCCTTCTCG TCCCCATGGA TGACCCCCCT 16380CAGATAGGGG TCCCTTGACC ACCATCCTCC GTGAAATCAA TATCCCGCAC AAGAGTGCTA 16440CTCTCCTCGC TCCGGGCCCA TAACACTTGG GGGTAGCTAA AGTGAACTGT ATCCGACATC 16500TGGTTCCTAC TTCAGGGTCA TAAAGCCTAA ATAGCCCACA CGTTCCCCTT AAATAAGACA 16560TCACGATG 16568
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)母系遺傳線粒體耳聾基因A1555G突變的實(shí)時(shí)熒光定量探針，其特征在于探針的5’端位于如母系遺傳線粒體耳聾基因序列SEQ ID NO5所示的1543-1553bp區(qū)域中，3’端位于如線粒體基因序列SEQ ID NO5所示的1564-1574bp區(qū)域中，并且在該探針片段的5’末端標(biāo)記了熒光報(bào)告基團(tuán)、3’末端標(biāo)記了熒光淬滅基團(tuán)，以及1555bp的堿基A被替換為G，稱之為突變型實(shí)時(shí)熒光定量探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的實(shí)時(shí)熒光定量探針，其中還包含野生型實(shí)時(shí)熒光定量探針。與突變型實(shí)時(shí)熒光探針相比，野生型實(shí)時(shí)熒光探針除了在1555bp的堿基仍是A、且5’端熒光報(bào)告基團(tuán)不同于突變型探針的5’端熒光報(bào)告基團(tuán)之外，其余結(jié)構(gòu)都相同。
3.權(quán)利要求1或2所述的實(shí)時(shí)熒光定量探針，其中突變型探針核苷酸序列選自如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；或野生型探針核苷酸序列選自如SEQ IDNO2所示的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求3所述的實(shí)時(shí)熒光定量探針，其中突變型探針5’末端的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM熒光報(bào)告基團(tuán)，野生型探針5’末端的熒光報(bào)告基團(tuán)是HEX熒光報(bào)告基團(tuán)，兩種探針的3’末端的熒光淬滅基團(tuán)均是TAMRA熒光淬滅基團(tuán)。
5.一種用于診斷母系線粒體遺傳耳聾疾病的試劑盒，該試劑盒通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)母系遺傳線粒體耳聾基因序列SEQ ID NO5中的A1555G突變從而診斷母系線粒體耳聾遺傳病，其包括(1)提取血樣DNA的試劑；(2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑混合液；(3)用于擴(kuò)增包含了A1555A位點(diǎn)或A1555G突變位點(diǎn)的母系遺傳線粒體耳聾基因序列SEQ ID NO5的正向引物和反向引物；(4)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的實(shí)時(shí)熒光定量突變型探針；(5)如果需要，還包括使用說(shuō)明書(shū)。
6.權(quán)利要求5所述的試劑盒，其中還包含權(quán)利要求2至4中任一項(xiàng)所述的野生型實(shí)時(shí)熒光定量探針。
7.權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其中所述的正向引物選自SEQ ID NO3所示的核苷酸序列，反向引物選自SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述的反應(yīng)試劑混和液是HotstarMastermix混和液；所述的正向引物和反向引物是等比例混和的；所述的提取血樣DNA的試劑為提取足根血DNA的溶液I，其主要成分為Chelex。
9.根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述的反應(yīng)試劑混和液是HotstarMastermix混和液；所述的正向引物和反向引物是等比例混和的；所說(shuō)的提取血樣DNA的試劑為外周血DNA提取試劑。
10.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的探針或權(quán)利要求5至9任一項(xiàng)所述的試劑盒在體外檢測(cè)母系遺傳線粒體耳聾基因A1555G突變中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)母系遺傳線粒體耳聾基因A1555G突變的實(shí)時(shí)熒光定量探針及其用途。該發(fā)明設(shè)計(jì)兩條Taqman突變型和野生型探針和一對(duì)引物，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量Taqman探針?lè)ㄟM(jìn)行針對(duì)母系遺傳線粒體耳聾基因A1555G突變的基因型分析，從而診斷母系線粒體遺傳耳聾疾病。該方法簡(jiǎn)單省時(shí)、特異性強(qiáng)、敏感性高，檢測(cè)結(jié)果直觀、準(zhǔn)確可靠，適用于對(duì)母系遺傳耳聾線粒體基因A1555G突變的大規(guī)模的篩查或預(yù)防性檢查。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1987462SQ200610169638
公開(kāi)日2007年6月27日 申請(qǐng)日期2006年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月26日
發(fā)明者戴樸, 袁永一, 韓東一, 金政策 申請(qǐng)人:金政策