專(zhuān)利名稱(chēng)：：日本血吸蟲(chóng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Sjwnt-4基因的克隆、表達(dá)及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：-本發(fā)明屬于基因
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種日本血吸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Sjwnt-4基因的克隆、表達(dá)及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：-Wnts是一類(lèi)從水螅、昆蟲(chóng)到脊椎動(dòng)物中都能發(fā)現(xiàn)的分泌型糖蛋白，由細(xì)胞分泌出來(lái)后，與自身或鄰近細(xì)胞的膜受體結(jié)合，激發(fā)下游的信號(hào)通路，調(diào)節(jié)核內(nèi)靶基因的表達(dá)，決定細(xì)胞的分化命運(yùn)，在動(dòng)物發(fā)育中起著廣泛的調(diào)節(jié)作用。Wnt蛋白異常的時(shí)空表達(dá)或異常的激活往往與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。有研究表明，Wnt信號(hào)通路對(duì)哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)的正常發(fā)育起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，它主要參與了繆勒氏管及其派生器官的形成，調(diào)控卵泡的發(fā)育、排卵及黃體化，另外與正常妊娠的建立以及妊娠過(guò)程中乳腺的變化也有關(guān)。Wnt4是Wnt家族蛋白成員之一，在小鼠中，Wnt4對(duì)繆勒氏管的形成有關(guān)鍵意義，缺失Wnt4的雌、雄小鼠都沒(méi)有繆勒氏管；Wnt4突變的雌鼠沒(méi)有繆勒氏管的派生器官(即輸卵管、子宮、子宮頸和陰道上部)；而沃爾夫管則繼續(xù)存在。Wnt4缺失的雄性動(dòng)物其睪丸的發(fā)育不受影響，但當(dāng)發(fā)育著的雌性性腺中一旦缺失Wnt4信號(hào)，其結(jié)構(gòu)和功能上都呈現(xiàn)一定的雄性化特征，性腺雖然定位在它們正確的部位，但其外形比正常的卵巢更圓，且像睪丸一樣沒(méi)有包被。此外，突變的性腺可以分化MIS(繆勒氏管抑制物質(zhì))及睪酮。在人類(lèi)中，男性的染色體lp31p35片斷的二倍體導(dǎo)致了Wnt4增多，Wnt4的過(guò)量表達(dá)致使XY的男性具有了女性的表型。因此，Wnt4可能是一種性別表型的決定基因。對(duì)血吸蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究是解和認(rèn)識(shí)血吸蟲(chóng)生活特征的有效途徑。但是到目前為止，對(duì)血吸蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的研究甚少，以致在開(kāi)發(fā)高效候選疫苗分子和篩選新型藥物的方面進(jìn)展緩慢。而對(duì)血吸蟲(chóng)Wnt基因的研究國(guó)內(nèi)外尚未有研究報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于設(shè)計(jì)血吸蟲(chóng)Wnt基因的有關(guān)表達(dá)。本發(fā)明利用RACE技術(shù)首次克隆到編碼日本血吸蟲(chóng)Wnt4蛋白的含ORF的cDNA序列，分析了該基因在日本血吸蟲(chóng)不同發(fā)育階段中的表達(dá)情況，應(yīng)用大腸桿菌進(jìn)行了表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了抗原性測(cè)定。本發(fā)明提供了一種日本血吸蟲(chóng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Sjwnt-4基因的克隆和表達(dá)。該方法包括下列步驟(1)材料Trizol、GeneRacerKit購(gòu)自Invitrogen公司；ExTaqHotStartDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶5aw/H、Wol、T4DNA連接酶、熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒和隨機(jī)引物購(gòu)自TaKaRa生物工程(大連)有限公司；羊抗鼠IgG-HRP購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；抗GST單抗購(gòu)自SIGMA公司；羊抗兔IgG-HRP購(gòu)自華美生物工程公司；逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Stratagen公司；RNA酶抑制劑購(gòu)自Promega公司；SYBRGreenI和Calibration購(gòu)自BIO-RAD公司；(2)菌種、質(zhì)粒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)粒pGEX-4T-2、大腸桿菌DH5a、BL21(DE3)由本所(上海獸醫(yī)研究所)提供，pUCm-T載體購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。新西蘭白兔(雄性，2.53.0kg)購(gòu)自上海羅涇飛達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)。日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株尾呦由本所(上海獸醫(yī)研究所)釘螺室提供。新西蘭白兔分別以腹部貼片法感染20000，5000,2000條血吸蟲(chóng)尾蚴，在14天、19天、31天和44天后剖殺，以肝門(mén)靜脈灌注法收集蟲(chóng)體，液氮凍存?zhèn)溆茫?3)方法①總RNA的提取取液氮中凍存的日本血吸蟲(chóng)19天童蟲(chóng)200mg，按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA的提??；②RACE的引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增本實(shí)驗(yàn)室程國(guó)鋒等利用雙向電泳結(jié)合肽質(zhì)量指紋圖譜技術(shù)獲得一個(gè)Wnt家族蛋白的一段肽序列，以此肽序列為詢問(wèn)序列在日本血吸蟲(chóng)EST庫(kù)中(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)搜索到一個(gè)日本血吸蟲(chóng)的相應(yīng)EST片斷(GenBankaccessionnumberAAM89872)，長(zhǎng)727bp，不含有完整的ORF。以該EST序列為模板設(shè)計(jì)合成RACE引物(由上海申能博采生物技術(shù)有限公司合成)。3'RACE的兩個(gè)巢式引物3GSP1:5'-TATGCTGTGGTCGAGGATTTAAACG-3'，3GSP2:5'-GGTGTTGCAAAGTTGTCTGTAAAACA-3';5'RACE的兩個(gè)巢式引物5GSP1:5'-GGTGTTGCAAAGTTGTCTGTAAAACA-3'，5GSP2:5'-TTGTCGTTTAAATCCTCGACCACAG-3';具體步驟按GeneRacer試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行。將RACE產(chǎn)物克隆到試劑盒提供的pCR4-T0P0載體中，挑選陽(yáng)性克隆，由英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序。利用DNAStar軟件査找3'、5'RACE產(chǎn)物序列與原EST序列的重疊部分，將三段序列拼接；③含ORFcDNA片斷的擴(kuò)增根據(jù)拼接的cDNA序列設(shè)計(jì)引物(Fl和F2)進(jìn)行含ORFcDNA片斷的擴(kuò)增。Fl:5'-CCGGGATCCATGAATCTAACTCAGCTAGAA-3'引入酶切位點(diǎn)5a/z^I(加下劃線)；F2:5'-CGGCTCGAGTTAATTACATGTAGATATAAC-3'弓I入酶切位點(diǎn)(J力oIX由上海申能博采生物技術(shù)有限公司合成)。取3yl在3'RACE中反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件分別為94'C預(yù)變性5min，然后94°C、30s,55°C、30s，72°C、lmin30s，共30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72。C延伸10min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收，純化后連pUCm-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，選單個(gè)菌落酶切鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pUCm-T-》ww"并送英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序；生物信息學(xué)分析將測(cè)序得到的cDNA在NCBI上進(jìn)行相似性比對(duì)(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST);利用NCBI上的ORFfinder找出新基因的讀碼框；利用DNAstar軟件對(duì)氨基酸殘基數(shù)、組成、蛋白質(zhì)相對(duì)分子量等參數(shù)進(jìn)行分析；利用clustalW軟件對(duì)不同物種Wnt蛋白進(jìn)行多重比對(duì)；利用Ne仏cet軟件(http:〃www.cbs.dtu.dk/services/NetAcet/)進(jìn)行糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。利用SYFPEITHI的MHCII表型在線預(yù)測(cè)工具(http:〃www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/)進(jìn)行T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)。◎熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR試驗(yàn)中選擇血吸蟲(chóng)的持家基因a-微管蛋白(a-tubulin)為內(nèi)參；分別提取14d和19d童蟲(chóng)、31d蟲(chóng)體、44d雄蟲(chóng)和44d雌蟲(chóng)總RNA，去除基因組DNA后利用隨機(jī)引物合成cDNA第一鏈；熒光定量PCR引物:擴(kuò)增Sjwnt4的引物Sl:5'-ACATACAAAATCGTCTGGTCTC-3'，S2:5'陽(yáng)GATGGTAAAGGCGATGTAGTC-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度214bp;擴(kuò)增a-tubulin引物Tl:5'-CTGATTTTCCATTCGTTTG-3'，T2:5'-GTTGTCTACCATGAAGGCA-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度213bp;引物由上海生工合成，采用熒光染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，反應(yīng)體系包括5XR-PCRBuffer5pl，250mMMg2+0.3|jl，10mMdNTP0.75|jl，10|JM弓l物1.0|jl，25XSYBRGreenI1.0|jl，10-3XCalibrationl.O(jl，5U/|j|ExTaqHs0.25[Jl，ddh2014.7pl，模板cDNAl.Opl，共25yl;反應(yīng)參數(shù)95'C變性3min，95°C5s，58°C30s，40個(gè)循環(huán)，其中58'C30s結(jié)束時(shí)間點(diǎn)為熒光信號(hào)檢測(cè)點(diǎn)，每個(gè)反應(yīng)均做3孔重復(fù)；采用BIO-RAD公司iCyclerIQversion3.0軟件進(jìn)行計(jì)算分析，以a-tubulin為內(nèi)參標(biāo)化反應(yīng)結(jié)果，得出相對(duì)于每百萬(wàn)持家基因的目的基因含量；重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建從測(cè)序后確定的重組質(zhì)粒pUCm-T-》ww"中用限制性內(nèi)切酶、^ToI切出S/w""含ORF的cDNA片斷，將該完整序列定向克隆于原核表達(dá)載體pGEX-4T-2的多克隆位點(diǎn)區(qū)，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-》'w7",并轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3);⑦在大腸桿菌中的表達(dá)將鑒定好的pGEX-4T-2-》w""/BL21(DE3)接種于液體LB培養(yǎng)基，37。C震蕩培養(yǎng)，朋值為0.6時(shí)加終濃度為lmM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。在IPTG誘導(dǎo)后0h，0.5h，lh，2h，4h，6h分別收集菌體，應(yīng)用SDS-PAGE分析菌體蛋白，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間；⑧Westernblotting檢測(cè)將高表達(dá)時(shí)相菌體蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，分別用抗GST單抗或經(jīng)pGEX-4T-2/BL21大腸桿菌裂解液吸附處理過(guò)的日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原免疫兔血清作一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠、羊抗兔IgG為二抗，DAB作為底物進(jìn)行顯色。本發(fā)明的另一目的是提供了Sjwnt-4編碼基因在制備防治血吸蟲(chóng)疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的SjWnt-4編碼基因的克隆及生物信息學(xué)分析本研究利用RACE技術(shù)對(duì)EST片斷(GenBankTM登陸號(hào)為AAM89872)進(jìn)行3'端和5'端延伸，分別經(jīng)2輪PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物測(cè)序后拼接得到2044bp的DNA片斷，進(jìn)一步利用PCR技術(shù)克隆獲得含完整閱讀框的編碼基因，其開(kāi)放閱讀框?yàn)?311bp，編碼436個(gè)氨基酸，利用NCBI的Blast軟件對(duì)該序列進(jìn)行同源性搜索，結(jié)果與血吸蟲(chóng)其它已知基因無(wú)顯著同源性，為血吸蟲(chóng)新基因。氨基酸序列的相似性比較結(jié)果顯示與Wnt家族蛋白具有高度同源性，其中與Wnt4蛋白的同源性最高，并且對(duì)氨基酸序列進(jìn)行分析也發(fā)現(xiàn)其具有十分典型的Wnt家族蛋白特征整個(gè)蛋白序列中散在著100多個(gè)Wnt家族蛋白的保守位點(diǎn);富含可交連形成二硫鍵的半胱氨酸殘基，約2324個(gè)保守的半胱氨酸，其中50%位于蛋白的羧基端；具有三個(gè)或四個(gè)糖基化位點(diǎn)，又選擇了分別來(lái)自日本三角渦蟲(chóng)(登陸號(hào)BAD93239.1)、人(GeneBank登陸號(hào)NP—110388.2)、小鼠(GeneBank登陸號(hào)NP—033549.1)、尤金袋鼠(GeneBank登陸號(hào)AAY18780.1)、雞(GeneBank登陸號(hào)JC2451)、線蟲(chóng)(GeneBank登陸號(hào)NP—493668.1)、果蠅(GeneBank登陸號(hào)NP—476810.1)的7個(gè)物種的Wnt4蛋白進(jìn)行氮基酸序列的多重比對(duì)。結(jié)果顯示，該基因所編碼氨基酸序列與同屬扁形動(dòng)物門(mén)的日本三角渦蟲(chóng)的Wnt4相似性最高達(dá)43%(E=le-100)，與人Wnt4的相似性為37%(E=9e-72)，其余皆在36%38%之間。據(jù)此，推測(cè)該基因編碼的蛋白為日本血吸蟲(chóng)Wnt4蛋白，將該基因命名為日本血吸蟲(chóng)wnt4(Sjwnt4)(GeneBank登陸號(hào)DQ643829)。對(duì)該基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行T細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該序列中含有多個(gè)可與特定HLA分子具較高結(jié)合效價(jià)的抗原肽段(表1)。表1Sjwnt4與HLA有較高結(jié)合效率的潛在的抗原肽<table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>306SALLSSVVSGVSSSD28HLA-DRB1*030125ETFVGADGKLQMSIC28206RNRLKRNPKLGLTNL27198RQFLDVRERNRLKRN26HLA-DRB1*0401330RNAFDTLTRSTSLTT28125QTYLDKLLSKGTRES26139SAYVLAVTSAGVSHA26151SHAVTKACSSGLHDN26HLA-DRB1"101330RNAFDTLTRSTSLTT30250RTCWRSLPKFRHLGA26HLA-DRB1"501253WRSLPKFRHLGAQLQ30HLA-DRB1*0701151SHAVTKACSSGLHDN30189NIHFGAAFSRQFLDV30298GNALLLSHSALLSSV30273AIQVTYIQNRLVSMK28本發(fā)明57粉"基因的期別、性別表達(dá)分析為了了解SjWnt4基因在日本血吸蟲(chóng)不同發(fā)育階段蟲(chóng)體的表達(dá)情況，提取14天童蟲(chóng)、19天童蟲(chóng)、31天成蟲(chóng)、44天雄蟲(chóng)和44天雌蟲(chóng)等階段蟲(chóng)體總RNA，選擇持家基因a-tubulin作為內(nèi)參，利用熒光定量PCR法檢測(cè)該基因在日本血吸蟲(chóng)幾個(gè)不同發(fā)育階段蟲(chóng)體的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，57粉"在日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)、成蟲(chóng)及雌雄蟲(chóng)中均有表達(dá)(圖l),其中在19天童蟲(chóng)中表達(dá)量最高，44天雌蟲(chóng)表達(dá)量明顯比雄蟲(chóng)高。重組原核表達(dá)載體pGEX-4T-2-5"J柳"的構(gòu)建鑒定經(jīng)PCR、萬(wàn)a/a^1和雙酶切鑒定(圖2)和測(cè)序證實(shí)pGEX-4T-2-5yra"重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖3)。本發(fā)明Sjwnt4基因在大腸桿菌中表達(dá)重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-5^77^在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得表達(dá)，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，lmMIPTG誘導(dǎo)4h即達(dá)到最大表達(dá)量；重組蛋白分子量約為76kD，與預(yù)期結(jié)果相符(Sjwnt4蛋白推測(cè)分子量約為49.6kD，載體表達(dá)蛋白GST約26kD,故重組蛋白分子量約為75.6kD)(圖4)。重組蛋白以包涵體形式存在，可溶于含8M尿素的PBS。上述表達(dá)產(chǎn)物抗原性分析以重組表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)電轉(zhuǎn)移至NC膜上，分別用抗GST單抗和經(jīng)pGEX-4T-2/BL21大腸桿菌蛋白吸附的日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原免疫血清作一抗進(jìn)行Westernblot，結(jié)果均在75kD處有一明顯的識(shí)別條帶(圖5箭頭處)，表明重組表達(dá)產(chǎn)物為GST融合蛋白且具有良好的抗原性。上述結(jié)果表明Sjwnt4基因在日本血吸蟲(chóng)感染宿主后第14天童蟲(chóng)、19天童蟲(chóng)、31天蟲(chóng)體、44天雌蟲(chóng)和44天雄蟲(chóng)體內(nèi)均有表達(dá)，但19d童蟲(chóng)的表達(dá)量顯著的高于其它各個(gè)階段；與此同時(shí)，該基因在44d雌蟲(chóng)中的表達(dá)量高于44d雄蟲(chóng)。從過(guò)去的研究已知日本血吸蟲(chóng)感染宿主后，在第15-16天雌雄蟲(chóng)合抱配對(duì)，雌雄蟲(chóng)合抱后卵黃腺開(kāi)始發(fā)育，卵黃細(xì)胞分化，合成卵黃小滴；第22天雌蟲(chóng)體內(nèi)表達(dá)卵殼蛋白；到第24天后長(zhǎng)期保持排卵狀態(tài)。上述5"^77Z^基因的表達(dá)狀況分析結(jié)果顯示，該基因的表達(dá)變化與血吸蟲(chóng)性別表型的發(fā)育變化密切相關(guān)，從一個(gè)側(cè)面揭示了Wnt4基因在血吸蟲(chóng)生殖系統(tǒng)發(fā)育中的重要作用。這個(gè)結(jié)果與該基因在小鼠和小袋鼠中表達(dá)的生物學(xué)意義有一定的相似性。在小鼠中，Wnt4最初在腎管間充質(zhì)及未分化的性腺中表達(dá)，它在兩性未分化的性腺中都表達(dá)，但經(jīng)過(guò)性別特異的分化后，在雄性性腺中Wnt4表達(dá)下降，而在雌性性腺中一直維持。在有袋動(dòng)物如塔馬爾沙袋鼠中，Wnt4mRNA在未分化的兩性性腺中都有表達(dá)；雌性小袋鼠Wnt4mRNA在卵巢分化過(guò)程中表達(dá)水平顯著上升，約在小鼠出生后913天后到達(dá)頂峰，然后當(dāng)所有的雌性生殖細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂后開(kāi)始下降；雄性小袋鼠的Wnt4mRNA表達(dá)水平在輸精管形成后立即下降。因此，如果能通過(guò)人為干預(yù)，如使用RNAi干擾技術(shù)抑制血吸蟲(chóng)Wnt4的表達(dá)或者以Wnt4蛋白為藥耙抑制它的活性，從而控制血吸蟲(chóng)性別發(fā)育、產(chǎn)卵，對(duì)減輕血吸蟲(chóng)病的病理?yè)p害，及阻斷傳播將有重要意義。本發(fā)明首次克隆獲得血吸蟲(chóng)Wnt4基因，為Wnt信號(hào)通路在血吸蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育特別是生殖器官發(fā)育中的作用以及開(kāi)發(fā)高效的抗血吸蟲(chóng)病的疫苗和篩選新型的抗血吸蟲(chóng)藥物有較大的應(yīng)用價(jià)值。SjWnt-4的核苷酸和推測(cè)氨基酸序列。181CAAATAATTATAATCATGAACGA2040AATCTMCTCAGCTAGMCAAACGATTCAAGACATGAATAATAATGATAGTMCMTATMTGACATCAGAAACATTTGTTGGTGCCNDSNNIMTSETFVGAMNLTQLEQTIQDMNN294GATGGAAAATTACAAATGAGTATATGCGATCATCCMATGGATTTTTACGGAGACAAMGAAATTATGCCGTCAGTATTTACATTTGATG474564DGKLQMSICDHPNGFLRRQKKLCRQYLHLMESVIRGYFMGLKECEYQFSAHRWNCQGHNLTIQAPTSRKQKRLRYRESELKNDMDNSRRKSVRIQTYLDKLLSKGTRESAYVLAVTSAGVSHAVTKACSSGHDNCGCDRTIYDHPREPNFEWSGCSDNHFGAAFSRQFLDVRERNRLK92410141104RNPKLGLTNLHNNHVGRHMVINKMEVQCKCHGVSGSCEMRTCWRSLPKFRHLGAQLQERFHEAIQVTYIQNRLVSMKALEQLSKESNGNALLLSHSALLSSVVSGVSSSDELPASPRINR1194薩1374NAFDTLTRSTSLTTSPLPSPTENDLIYSESPTFCHHDPRYGSIGTYGRQCDENSQGLNSCNYLCCGRGFKRQTFVQQERCDCKFQWCCK1464GTTGTCTGTAAAACATGTCGTAAAACAGTAGTTATATCTACATGTMT^TATATATATATATAAGGTATCTTTTTATCGTTCGCAATCVVCKTCRKTVVISTCN★1734AGAAGATTTGAAAACATAAAATTTACTAAGTTGATGACMTTTACTCCAAAAAGGAAATAAGGMACGATAMGMTAACCGAAAGACM182419142004TMATCAGTCAGTMCCAAAAAAAAAMAAAAAAAAAAAA圖1:實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)SjWnt4基因在日本血吸蟲(chóng)不同期別和性別蟲(chóng)體中的表達(dá)；14d:14天童蟲(chóng);19d:19天童蟲(chóng);31d:31天蟲(chóng)體;44d(M):44天雄蟲(chóng);44d(F):44天雌蟲(chóng)。圖2:重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-57柳"雙酶切鑒定及PCR鑒定；Ml:DNAMarkerDL15000;1:pGEX-4T-2-5>77〃重組質(zhì)粒經(jīng)5滅1、J力ol雙酶切；2:pGEX-4T-2空載體經(jīng)fe/z^I、J力ol雙酶切；M2:DNAmarkerDL2000;3:pGEX-4T-2-5>""重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物。圖3:pGEX-4T-2-Sjwnt4重組質(zhì)粒示意Fig5TherecombinantplasmidpGEX-4T-2-Sjwnt4。圖4:SDS-PAGE分析pGEX-4T-2-^'柳W/BL21(DE3)不同時(shí)相的表達(dá)蛋白；M:蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；1、2、3、4、5、6:重組質(zhì)粒pGEX_4T-2-5>77^在IPTG誘導(dǎo)后Oh，0.5h，lh，2h,4h,6h的表達(dá)產(chǎn)物;7:pGEX-4T-2-5>"^不加IPTG培養(yǎng)6h的產(chǎn)物圖5:pGEX-4T-2-57(raz^重組蛋白的Westernblot分析；M:預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量；l:pGEX-4T-2-57柳W未誘導(dǎo)產(chǎn)物；2:pGEX-4T-2-5>77"誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物；a.:以鼠抗GST單抗為一抗進(jìn)行的Westernblot;b:以抗日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原兔血清作一抗進(jìn)行的Westernblot。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1日本血吸蟲(chóng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Sjwnt-4基因的克隆1.實(shí)驗(yàn)材料U材料Trizol、GeneRacerKit購(gòu)自Invitrogen公司；ExTaqHotStartDNA聚合酶、T4DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa生物工程(大連)有限公司。1.2菌種、質(zhì)粒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大腸桿菌DH5a由本所提供，pUCm-T載體購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。新西蘭白兔(雄性，2.53.0kg)購(gòu)自上海羅涇飛達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)。日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株尾蚴由本所釘螺室提供。新西蘭白兔分別以腹部貼片法感染20000，5000,2000條血吸蟲(chóng)尾蚴，在14天、19天、31天和44天后剖殺，以肝門(mén)靜脈灌注法收集蟲(chóng)體，液氮凍存?zhèn)溆茫?.方法2.1總RNA的提取取液氮中凍存的日本血吸蟲(chóng)19天童蟲(chóng)200mg，按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA的提?。?.2RACE的引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增本實(shí)驗(yàn)室程國(guó)鋒等利用雙向電泳結(jié)合肽質(zhì)量指紋圖譜技術(shù)獲得一個(gè)Wnt家族蛋白的一段肽序列，以此肽序列為詢問(wèn)序列在日本血吸蟲(chóng)EST庫(kù)中(http:〃www,ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)搜索到一個(gè)日本血吸蟲(chóng)的相應(yīng)EST片斷(GenBankTMaccessionnumberAAM89872)，長(zhǎng)727bp，不含有完整的ORF。以該EST序列為模板設(shè)計(jì)合成RACE引物(由上海申能博采生物技術(shù)有限公司合成)。3'RACE的兩個(gè)巢式引物:3GSP1:5'-TATGCTGTGGTCGAGGATTTAAACG-3',3GSP2:5'-GGTGTTGCAAAGTTGTCTGTAAAACA-3';5'RACE的兩個(gè)巢式引物5GSP1:5'-GGTGTTGCAAAGTTGTCTGTAAAACA-3'，5GSP2:5'-TTGTCGTTTAAATCCTCGACCACAG-3';具體步驟按GeneRacer試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行。將RACE產(chǎn)物克隆到試劑盒提供的pCR4-T0P0載體中，挑選陽(yáng)性克隆，由英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序。利用DNAStar軟件査找3'、5'RACE產(chǎn)物序列與原EST序列的重疊部分，將三段序列拼接；2.3含ORFcDNA片斷的擴(kuò)增根據(jù)拼接的cDNA序列設(shè)計(jì)引物(Fl和F2)進(jìn)行含ORFcDNA片斷的擴(kuò)增。Fl:5'-CCGGGATCCATGAATCTAACTCAGCTAGAA-3'引入酶切位點(diǎn)feWI(加下劃線)；F2:5'-CGGCTCGAGTTAATTACATGTAGATATAAC-3'引入酶切位點(diǎn)(/力o1)(由上海申能博采生物技術(shù)有限公司合成)。取3pl在3'RACE中反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件分別為94'C預(yù)變性5min，然后94°C、30s，55°C、30s，72°C、lmin30s，共30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72。C延伸10min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收，純化后連pUCm-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，選單個(gè)菌落酶切鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pUCm-T-》'w""并送英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序；2.4生物信息學(xué)分析將測(cè)序得到的cDNA在NCBI上進(jìn)行相似性比對(duì)(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST);利用NCBI上的ORFfinder找出新基因的讀碼框；利用DNAstar軟件對(duì)氨基酸殘基數(shù)、組成、蛋白質(zhì)相對(duì)分子量等參數(shù)進(jìn)行分析;利用Genetool軟件對(duì)不同物種Wnt蛋白進(jìn)行多重比對(duì)；利用NetAcet軟件(http:〃www.cbs.dtu.dk/services/NetAcet/)進(jìn)行糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。利用SYFPEITHI的MHCII表型在線預(yù)測(cè)工具(http:〃www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/)進(jìn)行T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)。3.結(jié)果利用RACE技術(shù)對(duì)EST片斷(GenBank登陸號(hào)為AAM89872)進(jìn)行3'端和5'端延伸，分別經(jīng)2輪PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物測(cè)序后拼接得到2044bp的DNA片斷，進(jìn)一步利用PCR技術(shù)克隆獲得含完整閱讀框的編碼基因，其開(kāi)放閱讀框?yàn)?311bp,編碼436個(gè)氨基酸，利用NCBI的Blast軟件對(duì)該序列進(jìn)行同源性搜索，結(jié)果與血吸蟲(chóng)其它己知基因無(wú)顯著同源性，為血吸蟲(chóng)新基因。氨基酸序列的相似性比較結(jié)果顯示與Wnt家族蛋白具有高度同源性，其中與Wnt4蛋白的同源性最高，并且對(duì)氨基酸序列進(jìn)行分析也發(fā)現(xiàn)其具有十分典型的Wnt家族蛋白特征整個(gè)蛋白序列中散在著100多個(gè)Wnt家族蛋白的保守位點(diǎn)；富含可交連形成二硫鍵的半胱氨酸殘基，約2324個(gè)保守的半胱氨酸，其中50%位于蛋白的羧基端；具有三個(gè)或四個(gè)糖基化位點(diǎn)，又選擇了分別來(lái)自日本三角渦蟲(chóng)(登陸號(hào)BAD93239.1)、人(GeneBank登陸號(hào)NP—110388.2)、小鼠(GeneBank登陸號(hào)NP—033549.1)、尤金袋鼠(GeneBank登陸號(hào)AAY18780.1)、雞(GeneBank登陸號(hào)JC2451)、線蟲(chóng)(GeneBank登陸號(hào)NP—493668.1)、果蠅(GeneBank登陸號(hào)NP一476810.1)的7個(gè)物種的Wnt4蛋白進(jìn)行氨基酸序列的多重比對(duì)。結(jié)果顯示，該基因所編碼氨基酸序列與同屬扁形動(dòng)物門(mén)的日本三角渦蟲(chóng)的Wnt4相似性最高達(dá)43%(E=le-100)，與人Wnt4的相似性為37%(E=9e-72)，其余皆在36%38%之間。據(jù)此，推測(cè)該基因編碼的蛋白為日本血吸蟲(chóng)Wnt4蛋白，將該基因命名為日本血吸蟲(chóng)wnt4(Sjwnt4)(GeneBank登陸號(hào)DQ643829)。實(shí)施例2日本血吸蟲(chóng)》V""基因在大腸桿菌中的表達(dá)1.實(shí)驗(yàn)材料1.1材料限制性內(nèi)切酶1、WoI、T4DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa生物工程(大連)有限公司。1.2菌種、質(zhì)粒質(zhì)粒pGEX-4T-2、BL21(DE3)由本所提供。2.方法2.1重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建從測(cè)序后確定的重組質(zhì)粒pUCm-T-》'H7i"中用限制性內(nèi)切酶fe/WI、AwI切出》ww"含ORF的cDNA片斷，將該完整序列定向克隆于原核表達(dá)載體pGEX-4T-2的多克隆位點(diǎn)區(qū)，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-》'w""，并轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3);2.2在大腸桿菌中的表達(dá)將鑒定好的pGEX-4T-2-》w""/BL21(DE3)接種于液體LB培養(yǎng)基，37'C震蕩培養(yǎng)，朋值為0.6時(shí)加終濃度為lmM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。在IPTG誘導(dǎo)后0h，0.5h，lh，2h，4h，6h分別收集菌體，應(yīng)用SDS-PAGE分析菌體蛋白，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。3.結(jié)果重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-57(w"在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得表達(dá)，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，lmMIPTG誘導(dǎo)4h即達(dá)到最大表達(dá)量；重組蛋白分子量約為76kD，與預(yù)期結(jié)果相符(Sjwnt4蛋白推測(cè)分子量約為49.6kD，載體表達(dá)蛋白GST約26kD，故重組蛋白分子量約為75.6kD)(圖4)。重組蛋白以包涵體形式存在，可溶于含8M尿素的PBS。權(quán)利要求1.一種日本血吸蟲(chóng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Sjwnt-4基因的克隆和表達(dá)，其特征在于該方法包括下列步驟(1)材料Trizol、GeneRacerTMKit；ExTaqHotStartDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI、T4DNA連接酶、熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒和隨機(jī)引物；羊抗鼠IgG-HRP抗GST單抗；羊抗兔IgG-HRP；逆轉(zhuǎn)錄酶；RNA酶抑制劑；SYBRGreenI和Calibration；(2)菌種、質(zhì)粒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)粒pGEX-4T-2、大腸桿菌DH5α、BL21DE3由上海獸醫(yī)研究所提供；pUCm-T載體；新西蘭白兔雄性，2.5～3.0kg；日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株尾蚴由上海獸醫(yī)研究所提供；新西蘭白兔分別以腹部貼片法感染20000，5000，2000條血吸蟲(chóng)尾蚴，在14天、19天、31天和44天后剖殺，以肝門(mén)靜脈灌注法收集蟲(chóng)體，液氮凍存?zhèn)溆茫?3)方法①總RNA的提取取液氮中凍存的日本血吸蟲(chóng)19天童蟲(chóng)200mg，按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA的提?。虎赗ACE的引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增利用雙向電泳結(jié)合肽質(zhì)量指紋圖譜技術(shù)獲得一個(gè)Wnt家族蛋白的一段肽序列，以此肽序列為詢問(wèn)序列在日本血吸蟲(chóng)EST庫(kù)中搜索到一個(gè)日本血吸蟲(chóng)的相應(yīng)EST片斷GenBankTMaccessionnumberAAM89872，長(zhǎng)727bp，不含有完整的ORF，以該EST序列為模板設(shè)計(jì)合成RACE引物，3′RACE的兩個(gè)巢式引物3GSP15′-TATGCTGTGGTCGAGGATTTAAACG-3′，3GSP25′-GGTGTTGCAAAGTTGTCTGTAAAACA-3′；5′RACE的兩個(gè)巢式引物5GSP15′-GGTGTTGCAAAGTTGTCTGTAAAACA-3′，5GSP25′-TTGTCGTTTAAATCCTCGACCACAG-3′；具體步驟按GeneRacerTM試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行，將RACE產(chǎn)物克隆到試劑盒提供的pCR4-TOPO載體中，挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序，利用DNAStar軟件查找3′、5′RACE產(chǎn)物序列與原EST序列的重疊部分，將三段序列拼接；③含ORFcDNA片斷的擴(kuò)增根據(jù)拼接的cDNA序列設(shè)計(jì)引物F1和F2進(jìn)行含ORFcDNA片斷的擴(kuò)增，F(xiàn)15′-CCGGGATCCATGAATCTAACTCAGCTAGAA-3′引入酶切位點(diǎn)BamHI加下劃線；F25′-CGGCTCGAGTTAATTACATGTAGATATAAC-3′引入酶切位點(diǎn)XhoI；取3μl在3′RACE中反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件分別為94℃預(yù)變性5min，然后94℃、30s，55℃、30s，72℃、lmin30s，共30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收，純化后連pUCm-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，選單個(gè)菌落酶切鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pUCm-T-Sjwnt4并測(cè)序；④生物信息學(xué)分析將測(cè)序得到的cDNA在NCBI上進(jìn)行相似性比對(duì)，利用NCBI上的ORFfinder找出新基因的讀碼框；利用DNAstar軟件對(duì)氨基酸殘基數(shù)、組成、蛋白質(zhì)相對(duì)分子量等參數(shù)進(jìn)行分析；利用clustalW軟件對(duì)不同物種Wnt蛋白進(jìn)行多重比對(duì)；利用NetAcet軟件進(jìn)行糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，利用SYFPEITHI的MHCII表型在線預(yù)測(cè)工具進(jìn)行T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)；⑤熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR試驗(yàn)中選擇血吸蟲(chóng)的持家基因α-微管蛋白為內(nèi)參；分別提取14天和19天童蟲(chóng)、31天成蟲(chóng)、44天雄蟲(chóng)和44天雌蟲(chóng)總RNA，去除基因組DNA后利用隨機(jī)引物合成cDNA第一鏈；熒光定量PCR引物擴(kuò)增Sjwnt4的引物S15′-ACATACAAAATCGTCTGGTCTC-3′，S25′-GATGGTAAAGGCGATGTAGTC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度214bp；擴(kuò)增α-tubulin引物T15′-CTGATTTTCCATTCGTTTG-3′，T25′-GTTGTCTACCATGAAGGCA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度213bp；引物由上海生工合成，采用熒光染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，反應(yīng)體系包括5×R-PCRBuffer5μl，250mMMg2+0.3μl，10mMdNTP0.75μl，10μM引物1.0μl，25×SYBRGreenI1.0μl，10-3×Calibration1.0μl，5U/μlExTaqHs0.25μl，ddh2O14.7μl，模板cDNA1.0μl，共25μl；反應(yīng)參數(shù)95℃變性3min，95℃5s，58℃30s，40個(gè)循環(huán)，其中58℃30s結(jié)束時(shí)間點(diǎn)為熒光信號(hào)檢測(cè)點(diǎn)，每個(gè)反應(yīng)均做3孔重復(fù)；采用BIO-RAD公司iCyclerTMIQversion3.0軟件進(jìn)行計(jì)算分析，以α-tubulin為內(nèi)參標(biāo)化反應(yīng)結(jié)果，得出相對(duì)于每百萬(wàn)持家基因的目的基因含量；⑥重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建從測(cè)序后確定的重組質(zhì)粒pUCm-T-Sjwnt4中用限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI切出Sjwnt4含ORF的cDNA片斷，將該完整序列定向克隆于原核表達(dá)載體pGEX-4T-2的多克隆位點(diǎn)區(qū)，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-Sjwnt4，并轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21DE3；⑦在大腸桿菌中的表達(dá)將鑒定好的pGEX-4T-2-Sjwnt4/BL21DE3接種于液體LB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)，OD值為0.6時(shí)加終濃度為1mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。在IPTG誘導(dǎo)后0h，0.5h，1h，2h，4h，6h分別收集菌體，應(yīng)用SDS-PAGE分析菌體蛋白，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間；⑧Westernblotting檢測(cè)將高表達(dá)時(shí)相菌體蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，分別用抗GST單抗或經(jīng)pGEX-4T-2/BL21大腸桿菌裂解液吸附處理過(guò)的日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原免疫兔血清作一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠、羊抗兔IgG為二抗，DAB作為底物進(jìn)行顯色。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種日本血吸蟲(chóng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Sjwnt-4基因的克隆和表達(dá)，其特征在于所述的一種日本血吸蟲(chóng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Sjwnt-4基因的核苷酸和推測(cè)氨基酸序列如下<formula>seeoriginaldocumentpage4</formula><formula>seeoriginaldocumentpage5</formula>3、一種如權(quán)利要求1所述的日本血吸蟲(chóng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Sjwnt-4基因在制備防治血吸蟲(chóng)疾病藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了利用RACE技術(shù)從日本血吸蟲(chóng)19天童蟲(chóng)中首次擴(kuò)增到一個(gè)Wnt家族基因，序列分析表明該基因的完整編碼框含1311bp，編碼436個(gè)氨基酸，理論分子量49.6kD。同源性分析結(jié)果表明，該基因的氨基酸序列具有典型Wnt家族蛋白特征，與日本三角渦蟲(chóng)、人Wnt4的氨基酸序列相似性分別達(dá)43％、37％，推測(cè)為血吸蟲(chóng)的Wnt4基因，命名為Sjwnt4(GenBanK登陸號(hào)DQ643829)。實(shí)時(shí)定量PCR分析顯示該基因在14天童蟲(chóng)、19天童蟲(chóng)、31天成蟲(chóng)、44天雌蟲(chóng)及44天雄蟲(chóng)中均有表達(dá)，本發(fā)明構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)載體pGEX-4T-2-Sjwnt4，應(yīng)用大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)行了表達(dá)，表達(dá)蛋白以包涵體形式存在，Western印跡顯示表達(dá)產(chǎn)物能被日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)粗抗原免疫血清所識(shí)別。文檔編號(hào)C12N15/30GK101205538SQ20061016753公開(kāi)日2008年6月25日申請(qǐng)日期2006年12月29日優(yōu)先權(quán)日2006年12月15日發(fā)明者傅志強(qiáng),馮新港,劉金明,姚利曉,林矯矯,王欣之,石耀軍,苑純秀,賈人初,陶麗紅申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所