專利名稱：以 Wnt為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型及其構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種以Wnt為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型，尤其涉及一種以具有組成型fct活性細(xì)胞為基礎(chǔ)的藥物篩選細(xì)胞模型；本發(fā)明同時(shí)還涉及該藥物篩選細(xì)胞模型的構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Wnt是一條進(jìn)化上高度保守的信號(hào)通路，從線蟲(chóng)到人類，均有Wnt家族成員存在。果蠅含有7種Wnt基因，而在脊椎動(dòng)物中含有19種。通過(guò)小鼠體內(nèi)β-catenin(CTNNBl)功能缺陷和功能獲得性的試驗(yàn)證實(shí)，在胚胎發(fā)育早期的各個(gè)階段，Wnt家族成員直接決定著細(xì)胞的分化方向，同時(shí)也調(diào)節(jié)了諸如心血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟和肺等組織器官的分化發(fā)展。在成人體內(nèi)，fct信號(hào)通過(guò)調(diào)節(jié)干細(xì)胞的分化來(lái)維持組織自我更新。然而，Wnt信號(hào)通路的異?；罨３?dǎo)致人類的發(fā)育缺陷、癌癥及各種疾病?！?993年，Vogelstein報(bào)道了腫瘤抑制因子APC可以與Wnt通路核心成員β -catenin相互作用，腫瘤與Wnt信號(hào)通路之間的關(guān)聯(lián)才逐漸為人們所知。在過(guò)去19年的研究中，人們發(fā)現(xiàn)fct信號(hào)通路是多種惡性腫瘤發(fā)生的共同途徑。在諸如結(jié)腸癌、黑色素瘤、毛母質(zhì)瘤、肝癌、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、肝母細(xì)胞瘤、胃腸癌、韋氏腫瘤等超過(guò)3500多種不同癌癥中，病變組織中均能檢測(cè)到CTNNBl的突變或 Wnt信號(hào)通路的異常活化。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，超過(guò)有超過(guò)700個(gè)病例的CTNNBl突變發(fā)生在β -catenin的N端，這些突變或者改變了 β-catenin磷酸化的位點(diǎn)Ser45、Thr41、Ser37和Ser33,或者改變了與這些位點(diǎn)相鄰的其他氨基酸。Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因APC，AXINl，AXIN2和CTNNBl的突變直接導(dǎo)致了細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β -catenin的積累，過(guò)剩的β -catenin入核轉(zhuǎn)錄Wnt下游基因，導(dǎo)致組織細(xì)胞惡性增殖，引發(fā)癌癥。在絕大部分結(jié)腸癌和消化系統(tǒng)癌癥中，都能檢測(cè)到APC、AXIN或者CTNNBl基因的突變。在結(jié)腸癌Wnt信號(hào)通路異常活化的病例中，將近80%是由APC基因的突變或缺失造成的。在肝癌的病例中，良性肝細(xì)胞腺瘤中若出現(xiàn) fct信號(hào)通路的異常，將大大增加其轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒愿伟┑娘L(fēng)險(xiǎn)。不同于結(jié)腸癌的是，惡性肝癌中APC突變發(fā)生的概率很低，而CTNNBl和AXINl基因的突變更為常見(jiàn)。這些突變阻斷了 β-catenin被磷酸化及泛素化修飾的途徑，打破了體內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡，使β-catenin得以積累并入核，最終導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖或分化?；谏鲜鲈?，一直以來(lái)研究者們?cè)噲D尋找特異性好，副作用低的Wnt抑制劑，以最終用于臨床，緩解和治療數(shù)目龐大的相關(guān)患者；然而時(shí)至今日理想的產(chǎn)品少之又少，很大程度緣于沒(méi)有一套高效而簡(jiǎn)易的篩選方法；基于報(bào)告系統(tǒng)的高通量篩選方法雖已經(jīng)出現(xiàn)并用于實(shí)踐，取得了一定成效，但仍然有一些不可克服的缺點(diǎn)，比如需要外源刺激(先用激活劑激活fct，再去篩選抑制劑)，這樣不僅步驟多，而且篩選成本也較高，尤其是像細(xì)胞因子Wnt3 等激活劑的使用將大大增高成本；即使像Licl類激活劑使用成本較低，但由于其本身毒性較大，限制了其使用；同時(shí)篩選體系每增加一步，會(huì)使報(bào)告系統(tǒng)的不穩(wěn)定性增加(額外的操作必然會(huì)帶來(lái)額外的不確定因素)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，提供一種以fct為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型。本發(fā)明的另一目的是提供一種以fct為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型的構(gòu)建方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的，就是提供以Wnt為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型在藥物篩選中的應(yīng)用。(一)以Wnt為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型藥物篩選細(xì)胞模型
本發(fā)明以fct為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型，是利用含有β -catenin特異性結(jié)合序列的 報(bào)告系統(tǒng)載體，以具有組成型fct的活性細(xì)胞為基礎(chǔ)，構(gòu)建成穩(wěn)定的以Wnt信號(hào)為靶點(diǎn)的高通量藥物篩選細(xì)胞模型。所述β-catenin的特異性結(jié)合序列為5’ -AGATCAAAGGG-3’。所述報(bào)告系統(tǒng)載體是在含有突光素酶報(bào)告基因的報(bào)告載體多克隆位點(diǎn)中插入包含有β-catenin特異性結(jié)合序列作為報(bào)告系統(tǒng)載體的響應(yīng)序列，構(gòu)建成的報(bào)告系統(tǒng)載體。所述具有組成型Wnt活性細(xì)胞為一類具有持續(xù)活化Wnt活性的細(xì)胞,主要有DLDl前列腺癌細(xì)胞、Hep3B人肝癌細(xì)胞、HCTl 16人結(jié)腸癌細(xì)胞等。(二)以Wnt為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型藥物篩選細(xì)胞模型的構(gòu)建方法 本發(fā)明以fct為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型的構(gòu)建方法，包括以下工藝步驟
(1)報(bào)告系統(tǒng)載體構(gòu)建利用分子生物學(xué)方法在含有熒光素酶報(bào)告基因的報(bào)告載體多克隆位點(diǎn)中插入包含有β-catenin特異性結(jié)合序列以及3’端含有TATA盒序列的DNA片段，作為報(bào)告系統(tǒng)載體的響應(yīng)序列，構(gòu)建成報(bào)告系統(tǒng)載體。這樣插入序列位于熒光素酶報(bào)告基因的上游，當(dāng)β -catenin活化時(shí)，便可增強(qiáng)熒光素酶報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄和熒光素酶翻譯，從而增強(qiáng)了熒光素酶的活性，加入熒光素酶底物時(shí)即可檢測(cè)到更強(qiáng)的熒光；抑制β-catenin活性時(shí)，熒光素酶報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄和熒光素酶翻譯的水平都降低，也就抑制細(xì)胞內(nèi)熒光素酶的活性，加入熒光素酶底物時(shí)熒光強(qiáng)度也就減弱。(2)細(xì)胞模型的構(gòu)建將所述報(bào)告系統(tǒng)載體轉(zhuǎn)染具有組成型Wnt的活性細(xì)胞后，用嘌呤霉素進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，選取對(duì)已知fct信號(hào)抑制劑(如XAV939，LDW643等已知Wnt上游信號(hào)抑制劑)有響應(yīng)的克隆，即為以fct為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型。在具有組成型Wnt活性的細(xì)胞中，報(bào)告系統(tǒng)載體能很好地被活化。當(dāng)使用Wnt信號(hào)通路抑制劑時(shí)即可使熒光被顯著抑制，構(gòu)建的細(xì)胞模型也就無(wú)需在外源刺激下靈敏地用于高通量藥物篩選。(三)以Wnt為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型的應(yīng)用
本發(fā)明以fct為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型用于篩選由Wnt組成型活化造成的腫瘤抑制藥物。具體藥物篩選方法如下
(O將所述藥物篩選細(xì)胞模型用100 I培養(yǎng)基接種于96孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度為 50% 60% ；
(2)培養(yǎng)基中加入待篩選化合物O.I μ Γ2Ρ I，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；(3)在96孔板中加入50P I穩(wěn)定型熒光素酶底物，使用熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀測(cè)定熒光強(qiáng)度并分析熒光抑制率，當(dāng)熒光抑制率達(dá)到40%以上得到初篩產(chǎn)物；
(4)以化合物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)消除初篩產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞模型的直接損傷，熒光抑制率仍在40%以上得到復(fù)篩產(chǎn)物，即為以Wnt為靶點(diǎn)的抑制劑。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)以Wnt信號(hào)通路為靶點(diǎn)，采用基于具有組成型Wnt活性(即持續(xù)Wnt活性)的細(xì)胞系為策略，使報(bào)告系統(tǒng)本身在細(xì)胞中處于高度活化狀態(tài)，無(wú)需使用外加刺激，得到的穩(wěn)定細(xì)胞模型可直接用于化合物的篩選；不僅大大降低了篩選的成本，同時(shí)也使整個(gè)篩選流程從細(xì)胞培養(yǎng)一激活fct —加化合物一檢測(cè)簡(jiǎn)化為細(xì)胞培養(yǎng)一加化合物一檢測(cè)，縮短了篩選的周期，減少了操作步驟，提升系統(tǒng)穩(wěn)定性、高效性及易用性，更適用于高通量藥物篩選。


圖I為所用報(bào)告載體基本骨架；
圖2為所構(gòu)建的報(bào)告系統(tǒng)載體Wnt -Iuc插入序列的測(cè)序結(jié)果 圖3為利用293T細(xì)胞檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng)載體Wnt - Iuc響應(yīng)能力；
圖4為使用Western-Blot方法檢測(cè)本發(fā)明所涉及的細(xì)胞中β-catenin活性結(jié)果； 圖5為利用！fep3B細(xì)胞檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng)載體Wnt - Iuc響應(yīng)能力；
圖6為利用DLDl細(xì)胞檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng)載體Wnt - Iuc響應(yīng)能力；
圖7為利用DLDl-W篩選得到產(chǎn)物對(duì)β -catenin信號(hào)的抑制。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明以Wnt為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型的結(jié)構(gòu)、構(gòu)建方法和應(yīng)用做進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)驗(yàn)中所采用的儀器和試劑如下
儀器PerkinElmer Victor3突光/化學(xué)發(fā)光分析儀。試劑螢火蟲(chóng)熒光素酶測(cè)定試劑盒購(gòu)自Promega公司；XAV939以及嘌呤霉素購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；用于篩藥的96孔板購(gòu)自Corning公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自Fermentas公司；序列合成及測(cè)序,上海生工提供；DMEM (高糖)及胎牛血清購(gòu)自Hyclone (Thermo公司),轉(zhuǎn)染試劑GenEscort II購(gòu)自南京慧基生物；篩選的化合物由國(guó)家小分子化合物資源中心提供；各種抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。I、報(bào)告系統(tǒng)載體構(gòu)建
利用同尾酶技術(shù)得以快速準(zhǔn)確獲得任意倍數(shù)的TCF結(jié)合序列，從而選取能夠有效響應(yīng)fct信號(hào)的最佳拷貝次數(shù)構(gòu)建報(bào)告系統(tǒng)。將人工合成包含9個(gè)TCF的結(jié)合序列(5，-AGATCAAAGGG-3，)以及通用的TATA盒輔助序5’-TATATAA-3’的DNA片段，以KpnI和HINDIII的酶切位點(diǎn)插入到通用的熒光素酶報(bào)告載體pBR322-luc-puro,得到的報(bào)告系統(tǒng)載體命名為Wnt_luc。突光素酶報(bào)告載體 81 322-111^111'0由？81 322載體出11(1111和3&1 I之間插入北美螢火蟲(chóng)熒光素酶(FireflyLuciferase，參見(jiàn)J R de Wet等人Mol. Cell. Biol. 1987)報(bào)告基因和嘌呤霉素基因(Puromycin,參見(jiàn) Lacalle RA 等人Gene. 1989，GenBank: M25346. I)所得，并且突光素酶報(bào)告基因和嘌呤霉素篩選基因通過(guò)內(nèi)部核糖體進(jìn)入序列(IRES)相連，pBR322-luc-puro多克隆位點(diǎn)位于原EcoR I和Hind III之間(參見(jiàn)圖I)。至此，在pGL4. 20-luc-puro熒光素酶報(bào)告載體上的完整插入序列如下(測(cè)序結(jié)果參見(jiàn)圖2)
5'^KfTACC AC ATf^\AA^ CM；；GTCGΛC,%GAT(^AΛ ACiCIGCRlTA AG ATC* AA ACiCiCiC
TCOACA<；AlTA%,L4GC iGC3TAAC^\TC；A\AGCiG(1X'GAC^%CiATt,A,,L%CJ iiGGTAAii
AU'ΛΛΜMiHiCJCGAlM^XlVAAAt； ；1}ΙΠ Λ Α 'XXMMiQClCGAQ -5'.

2、報(bào)告系統(tǒng)載體性能測(cè)試ΗΕΚ293Τ細(xì)胞于12孔板生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度為50% 60%時(shí)，轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt_luc(2 Hg/孔)，載體與轉(zhuǎn)染試劑的使用比例為1:2(即2 Il g質(zhì)粒，4 μ I轉(zhuǎn)染試劑，各溶于50 P I DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基，混合成100 P I預(yù)混液，室溫靜置20 min，再加入150 P I無(wú)血清DMEM，混勻后加入12孔板各孔內(nèi))4小時(shí)后換成完全培養(yǎng)基(即含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)，12小時(shí)以后，用LiCl (25mM)處理8小時(shí)，吸去培養(yǎng)基，加入200 Ul裂解液裂解細(xì)胞，輕搖 lOmin，取150 μ I于96孔板中，加入20 μ I普通螢火蟲(chóng)熒光素酶底物,使用熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀立即測(cè)定(Imin以內(nèi))熒光素酶的活性，對(duì)照及處理各3個(gè)重復(fù)。由于ΗΕΚ293Τ細(xì)胞對(duì)各種外源細(xì)胞因子的刺激比較敏感，便于在外加細(xì)胞因子刺激時(shí)檢測(cè)相應(yīng)信號(hào)通路的活化情況。所以使用該細(xì)胞作為代表檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng)載體是否響應(yīng)正常。ΗΕΚ293Τ細(xì)胞中Wnt信號(hào)使用LiCl刺激激活，結(jié)果表明在信號(hào)通路活化時(shí)所使用報(bào)告系統(tǒng)載體9Χ Wnt-Iuc以及對(duì)照的4X、7X Wnt-Iuc響應(yīng)正常，刺激后與刺激前熒光素酶活性的比例分別為811: I、135: I、170: 1，可見(jiàn)9Χ Wnt-Iuc響應(yīng)能力最好(見(jiàn)圖3，其中control為對(duì)照)。3、藥物篩選模型構(gòu)建及性能測(cè)試
選用其中DLDl細(xì)胞將Wnt-Iuc轉(zhuǎn)染DLDl細(xì)胞(IOcm培養(yǎng)皿)48小時(shí)后，I傳3，并加入嘌呤霉素進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，初始濃度為5 P g/ml, 2周后降為2.5 Pg/ml,待形成克隆(共約3周)后，用胰酶消化單克隆于96孔板，長(zhǎng)起后再轉(zhuǎn)入48孔板，6孔板直至IOcm培養(yǎng)皿和凍存，期間用濃度為2.5 H g/ml的嘌呤霉素繼續(xù)維持2周。首先選取熒光素酶陽(yáng)性的克隆，再檢測(cè)這些克隆是否響應(yīng)正常，由于即使組成型活化，信號(hào)通路一般還能對(duì)外加細(xì)胞因子有所反應(yīng)，故所選陽(yáng)性克隆的熒光素酶活性在細(xì)胞因子刺激時(shí)應(yīng)當(dāng)還能有所增加；并且由于是組成型活化，Wnt信號(hào)通路的抑制劑應(yīng)當(dāng)能使熒光素酶的活性減少，經(jīng)篩選最終得到反應(yīng)比較理想的細(xì)胞株，命名為DLDI-W。圖4為使用Western-Blot方法檢測(cè)DLDl及Hep3B中β -catenin表達(dá)情況，以HEK293T為對(duì)照。圖5及圖6為DLD-I和!fep3B細(xì)胞檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng)載體Wnt - Iuc響應(yīng)能力，以無(wú)響應(yīng)元件的空載體作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)DLD-I和Hep3B細(xì)胞中的β -catenin信號(hào)較高，故這里選用DLDl細(xì)胞(圖5、6中control為對(duì)照)。4、模型的應(yīng)用
(1)將所述藥物篩選細(xì)胞模型(DLDl-W)用100μ I培養(yǎng)基接種于96孔板中(10，000個(gè)/孔)，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度為30% 40% ；
(2)培養(yǎng)基中加入待篩選化合物0.I P Γ2Ρ I，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；(3)在96孔板中加入50P I穩(wěn)定型熒光素酶底物，使用熒光或化學(xué)發(fā)光分析儀測(cè)定熒光強(qiáng)度并分析熒光抑制率，當(dāng)熒光抑制率達(dá)到40%以上得到初篩產(chǎn)物；
(4)以化合物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)消除初篩產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞模型的直接損傷，熒光抑制率仍在40%以上得到的復(fù)篩產(chǎn)物，即為以fct為靶點(diǎn)的抑制藥物。所選用的陽(yáng)性對(duì)照抑制劑XAV939為已知Wnt信號(hào)通路的抑制劑，作用于Wnt上游Tankyrase-I和Tankyrase-2,最終減少Wnt活化,選用的XAV939 (100 PM)濃度經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)對(duì)DLDl細(xì)胞無(wú)明顯生長(zhǎng)抑制(24小時(shí))。圖7為利用DLDl-W篩選得到的其中兩種產(chǎn)物ICBDS05和ICBDS10對(duì)β -catenin信號(hào)的抑制，以XAV939 (100, M)作為陽(yáng)性對(duì)照，其中control為對(duì)照。上述實(shí)驗(yàn)證明，通過(guò)以Wnt為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型復(fù)篩得到的化合物確為以Wnt為靶點(diǎn)的抑制藥物，從而證明該藥物篩選細(xì)胞模型的有效性。 大量實(shí)驗(yàn)還表明，在多種具有組成型Wnt活性的細(xì)胞中，本發(fā)明以Wnt為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型都能取得便捷、快速、高效的篩選效果。
權(quán)利要求
1.以fct為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型，其特征在于利用含有β-catenin特異性結(jié)合序列的報(bào)告系統(tǒng)載體，以具有組成型fct的活性細(xì)胞為基礎(chǔ)，構(gòu)建成穩(wěn)定的以Wnt信號(hào)為靶點(diǎn)的高通量藥物篩選細(xì)胞模型。
2.如權(quán)利要求I所述以fct為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型，其特征在于所述β -catenin的特異性結(jié)合序列為5’ -AGATCAAAGGG-3’。
3.如權(quán)利要求I所述以fct為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型，其特征在于所述報(bào)告系統(tǒng)載體是在含有突光素酶報(bào)告基因的報(bào)告載體多克隆位點(diǎn)中插入包含有β-catenin特異性結(jié)合序列作為報(bào)告系統(tǒng)載體的響應(yīng)序列，構(gòu)建成的報(bào)告系統(tǒng)載體。
4.如權(quán)利要求I所述以fct為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型，其特征在于所述具有組成型fct的活性細(xì)胞為DLDl前列腺癌細(xì)胞、Hep3B人肝癌細(xì)胞、HCTl 16人結(jié)腸癌細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求I所述以fct為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型的構(gòu)建方法，包括以下工藝步驟 (1)報(bào)告系統(tǒng)載體構(gòu)建利用分子生物學(xué)方法在含有熒光素酶報(bào)告基因的報(bào)告載體多克隆位點(diǎn)中插入包含有β-catenin特異性結(jié)合序列以及3’端含有TATA盒序列的DNA片段，作為報(bào)告系統(tǒng)載體的響應(yīng)序列，構(gòu)建成報(bào)告系統(tǒng)載體； (2)細(xì)胞模型的構(gòu)建將所述報(bào)告系統(tǒng)載體轉(zhuǎn)染具有組成型Wnt的活性細(xì)胞后，用嘌呤霉素進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，選取對(duì)Wnt信號(hào)抑制劑有響應(yīng)的克隆，即為以Wnt為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型。
6.如權(quán)利要求I所述以Wnt為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型用于篩選由Wnt組成型活化造成的腫瘤治療藥物。
7.如權(quán)利要求6所述以Wnt為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型用于篩選由Wnt組成型活化造成的腫瘤抑制藥物，其特征在于所述藥物篩選的方法如下 (I ) 將所述藥物篩選細(xì)胞模型用I O Oμ I培養(yǎng)基接種于96孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度為50°/Γ60% ； (2)培養(yǎng)基中加入待篩選化合物O.I μ Γ2 μ 1，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)； (3)在上述96孔板中加入50μ I穩(wěn)定型突光素酶底物,使用突光/化學(xué)發(fā)光分析儀測(cè)定熒光強(qiáng)度并分析熒光抑制率，當(dāng)熒光抑制率達(dá)到40%以上得到初篩產(chǎn)物； (4)以化合物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)消除初篩產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞模型的直接損傷，熒光抑制率仍在40%以上得到復(fù)篩產(chǎn)物，即為以Wnt為靶點(diǎn)的腫瘤抑制藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種以Wnt為靶點(diǎn)的藥物篩選細(xì)胞模型，利用含有Wnt特異性結(jié)合序列的報(bào)告系統(tǒng)載體，以具有組成型Wnt的活性細(xì)胞為基礎(chǔ)構(gòu)建而成。該模型用于篩選由Wnt組成型活化造成的腫瘤及免疫疾病的治療藥物，由于采用具有組成型Wnt活性的細(xì)胞，模型細(xì)胞中報(bào)告基因處于高度活化狀態(tài)，無(wú)需使用外加刺激物，得到的穩(wěn)定細(xì)胞模型可直接用于化合物的篩選；不僅大大降低了篩選的成本，同時(shí)也使整個(gè)篩選流程從細(xì)胞培養(yǎng)→激活Wnt→加化合物→檢測(cè)簡(jiǎn)化為細(xì)胞培養(yǎng)→加化合物→檢測(cè)，縮短了篩選的周期，減少了操作步驟，提升系統(tǒng)穩(wěn)定性、高效性及易用性，更適用于高通量藥物篩選。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102965340SQ20121036860
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月28日
發(fā)明者趙晨陽(yáng), 李博, 馬銀杏, 王勤, 楊金波 申請(qǐng)人:白銀博賽寧生物科技有限公司