專利名稱：Tnik抑制劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用Traf2_和Nck-相互作用激酶(TNIK)抑制劑治療癌癥患者的組合物和方法。更具體地，本發(fā)明涉及包含TNIK抑制劑和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，和用于向癌癥患者施用TNIK抑制劑而進(jìn)行治療的方法，尤其是向諸如結(jié)直腸癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌或乳腺癌的實(shí)體癌患者施用。本發(fā)明還涉及新的氨基噻唑衍生物。
背景技術(shù)：
Wnt蛋白是一個(gè)分泌性糖蛋白的大家族，其活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以控制廣泛多樣的細(xì)胞過程，諸如決定細(xì)胞命運(yùn)、增殖、遷移、和極性。Wnt蛋白能夠通過幾個(gè)途徑進(jìn)行信號傳導(dǎo)，表征最好的是通過β-聯(lián)蛋白(catenin)的規(guī)范途徑(Wnt/β -聯(lián)蛋白信號傳導(dǎo))。Wnt/ β-聯(lián)蛋白信號傳導(dǎo)的反常經(jīng)常見于許多人類癌癥中，如結(jié)直腸癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌、 前列腺癌、乳腺癌，等等。已知TNIK是STE20家族激酶之一，其活化c-Jun N-末端激酶途徑并調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架。最近，在兩種結(jié)直腸癌細(xì)胞系DLDl和HCT-116中TNIK被鑒定為用抗-TCF4共同免疫沉淀的 70 種蛋白之一 (Shitashige M 等，Gastroenterology (胃腸病學(xué))2008，134 1961-71)。下面是關(guān)于本發(fā)明的效用的評價(jià)方法的參考性描述，其涉及使用TNIK抑制劑治療癌癥患者的組合物和方法。盡管這些參考性描述記載在臨時(shí)申請?zhí)峤恢?，這些還記載在由本發(fā)明人在臨時(shí)申請?zhí)峤恢疤峤徊⑶以谂R時(shí)申請?zhí)峤恢蠊_的WO 2009/104413 中。下面用于本發(fā)明的效用的評價(jià)方法的細(xì)節(jié)記載在本發(fā)明的“實(shí)施例”之后的“參考方法”中。關(guān)于本發(fā)明的效用的評價(jià)方法的參考性描述超過80%的結(jié)直腸癌顯示腺瘤性結(jié)腸息肉(APC)基因的突變，并且其余的一半在 CTNNBl基因中也有突變，導(dǎo)致聯(lián)蛋白的累積和Wnt信號傳導(dǎo)的組成型激活。β -聯(lián)蛋白通過與T細(xì)胞因子(TCF)/淋巴樣細(xì)胞增強(qiáng)因子(LEF)家族DNA結(jié)合蛋白形成復(fù)合物并且通過反式激活它們的靶基因來發(fā)揮其致癌活性。TCF4是TCF/LEF家族成員，通常在結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)并且參與結(jié)直腸的致癌作用。我們以前在兩種結(jié)直腸癌細(xì)胞系(DLD1和 HCT-116)中將TNIK鑒定為用抗-TCF4和抗β-聯(lián)蛋白抗體共同免疫沉淀的70種蛋白之一 (Shitashige M，等，Gastroenterology (胃腸病學(xué))2008，134 :1961-71)。DLDl 具有 APC 基因中的截?cái)嗤蛔儾⑶襾G失了另一個(gè)等位基因，HCT-116具有CTNNBl基因中的錯(cuò)義突變。在用抗-TCF4或抗β-聯(lián)蛋白抗體的免疫沉淀中檢測到TNIK，但用對照IgG則檢測不到。相反，β -聯(lián)蛋白和TCF4蛋白被抗TNIK抗體免疫沉淀，表明TCF4，β -聯(lián)蛋白和TNIK蛋白在結(jié)直腸癌細(xì)胞中形成復(fù)合物。雙雜交測定揭示TNIK與TCF4通過包含激酶結(jié)構(gòu)域的氨基酸 1-289相互作用。TCF4的氨基酸100-216是與TNIK相互作用所必不可少的。TCF4蛋白被TNIK (WT,野生型)磷酸化，但不被TNIK的無催化活性的突變體磷酸化，所述突變體具有在激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合袋中的保守賴氨酸M位殘基的置換(KMR)。串聯(lián)質(zhì)譜法(MS/MQ揭示TCF4的絲氨酸巧4位殘基被TNIK(WT)磷酸化。一貫地，絲氨酸巧4位殘基被丙氨酸置換(S154A)消除了 TNIK對TCF4的磷酸化。在用TNIK(WT)轉(zhuǎn)染DLDl 細(xì)胞后TCF4被磷酸化，但用TNIK(KMR)轉(zhuǎn)染后不發(fā)生磷酸化。TNIK的自磷酸化似乎對于其核易位和與TCF4的相互作用是必不可少的。用 TNIK(WT)或無催化活性的TNIK(KMR)轉(zhuǎn)染DLDl和HCT-116細(xì)胞，并通過免疫印跡和免疫熒光顯微鏡檢查法來分析。我們發(fā)現(xiàn)TNIK(WT)誘導(dǎo)其自身的絲氨酸764位殘基 (TNIKpS764)的磷酸化(通過抗TNIKpS764)。磷酸化TNIK結(jié)合至核中，而K54R置換顯著地抑制了 TNIK的磷酸化和核易位，并且減少與TCF4相互作用的TNIK的量。內(nèi)源性TNIK蛋白沿絲狀細(xì)胞骨架分布，而磷酸化TNIK(TNIKpS764)主要在核中被檢測到，并且與TCF4共定位。 iKpS764在結(jié)直腸癌細(xì)胞中檢測到，但在未轉(zhuǎn)化的HEK293細(xì)胞中檢測不到。在結(jié)直腸癌的臨床標(biāo)本中檢查到TNIK的表達(dá)和定位。盡管TNIK蛋白的總體表達(dá)水平在癌癥和正常粘膜之間的差別不顯著，但與鄰近的正常腸上皮細(xì)胞相比，癌細(xì)胞中磷酸化TNIK(pS764)的表達(dá)增加。核TNIKpS764最主要地在結(jié)直腸癌的浸潤前沿(invasive front)中檢測到，而β-聯(lián)蛋白累積在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。然后我們研究了 TNIK對β-聯(lián)蛋白和TCF4復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄活性的影響。ΗΕΚ293和 HeLa細(xì)胞具有野生型APC和CTNNBl基因。與假(mock)轉(zhuǎn)染相比，用通過使N-末端糖原合酶激酶3 β (GSK3 磷酸化位點(diǎn)缺失而穩(wěn)定化的β-聯(lián)蛋白(β-聯(lián)蛋白Δ^34)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞增加了規(guī)范的TCF/LEF報(bào)告分子(TOP-FLASH)的熒光素酶活性，但不增加突變報(bào)告分子(F0P-FLASH)的熒光素酶活性。用血凝素(HA)-標(biāo)記的野生型TNIK (WT)，而不用TNIK(KMR)共轉(zhuǎn)染進(jìn)一步增強(qiáng)了 β -聯(lián)蛋白-引起的轉(zhuǎn)錄活性和ΗΕΚ293和HeLa細(xì)胞的集落形成。在不存在聯(lián)蛋白Δ W34時(shí)，TNIK不顯著地影響轉(zhuǎn)錄活性或集落形成，表明TNIK的作用依賴于Wnt信號傳導(dǎo)的激活。用TNIK而不用TNIK(KMR)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染DLDl和 HCT-116細(xì)胞也增強(qiáng)了它們的TCF/LEF轉(zhuǎn)錄活性和集落形成。與此相反，通過針對TNIK的短干擾RNA(siRNA)(構(gòu)建體12和13)對TNIK的敲減 (knockdown)消除了 β-聯(lián)蛋白Δ m 34-引起的ΗΕΚ293和HeLa細(xì)胞的TCF/LEF轉(zhuǎn)錄活性。 通過針對TNIK的短發(fā)夾RNA(shRNA)(構(gòu)建體Tl，T2和T3)對TNIK的敲減消除了 β -聯(lián)蛋白Δ^34-引起的集落形成，但不顯著地影響未用β-聯(lián)蛋白Δ^34共轉(zhuǎn)染的ΗΕΚ293 和HeLa細(xì)胞的增殖。TNIK的敲減抑制了 DLDl和HCT-116細(xì)胞的TCF/LEF轉(zhuǎn)錄活性和增殖。通過針對TNIK的siRNA的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，顯著減少了 β -聯(lián)蛋白和TCF/LEF復(fù)合物的已知靶基因的表達(dá)，所述靶基因諸如體軸抑制因子(axis inhibitor)-2 (AXIN2), c-myc (MYC), c-jun(JUN)和基質(zhì)溶解素(matrilysin) (MMP7)，除細(xì)胞周期蛋白Dl (CCNDl)以外。我們下一步檢查了 TNIK在體內(nèi)對人結(jié)腸癌細(xì)胞的生長的影響(圖2)。將HCT-116 細(xì)胞植入至免疫缺陷小鼠的脅腹中。接種后一周，與去端肽膠原蛋白(atelocollagen) 混合的針對 TNIK 的 siRNA(12 或 13) (Takeshita, F.等 Efficient delivery of small interfering RNA to bone-metastatic tumors by using atelocollagen in vivo ( 過使用去端肽膠原蛋白在體內(nèi)將小干擾RNA有效地遞送至骨轉(zhuǎn)移瘤)Jroc Natl Acad Sci USA(美國科學(xué)院院報(bào))102，12177 Q005))直接注射至腫瘤(尺寸為224. 5 士 8. 9mm3)內(nèi)。 在siRNA注射后3天，切除一些腫瘤，并且通過實(shí)時(shí)PCR確認(rèn)TNIK mRNA的沉默(圖2b)。 在注射siRNA后監(jiān)測異種移植物的體積18天(圖加)。我們發(fā)現(xiàn)在單次注射針對TNIK的siRNA(12或1 后腫瘤幾乎完全消退。圖2c和2d顯示代表性的小鼠和切除的腫瘤的外觀。用針對TNIK的siRNA(12或13)處理的腫瘤顯著比未被處理(無處理)、僅用去端肽膠原蛋白處理(僅Atelo)或用對照RNA處理(X或IX)的那些小鼠(圖2d)。在兩種其它結(jié)直腸癌細(xì)胞系DLDl和WiDr中在單次注射針對TNIK的siRNA后，我們觀察到已建立的腫瘤的類似消退(圖3和圖4)。最后，在爪蟾(Xenopus)胚胎中檢查了 TNIK在Wnt信號傳導(dǎo)中的功能參與。在 Unigene非洲爪蟾(Xenopus laevis)數(shù)據(jù)庫中存在有與人TNIK同源的記錄(命名為假想蛋白L0C443633)。激酶結(jié)構(gòu)域(氨基酸25-289)在人和爪蟾之間是高度保守的(98. 9% )。 爪蟾TNIK(XTNIK)在母體中表達(dá)，并且在整個(gè)蝌蚪階段中維持該表達(dá)。已知Wnt信號傳導(dǎo)在腹側(cè)邊緣區(qū)中的異位激活能誘導(dǎo)體軸復(fù)制。與XraiK(WT)HiRNA共同注射增強(qiáng)了 Χβ-聯(lián)蛋白誘導(dǎo)的副軸(secondary axis)形成，而無催化活性的XTNIK(K54R)則將其完全抑制。僅用 XTNIK(WT)或XTNIK(K54R)(無Χβ-聯(lián)蛋白)注射的胚胎正常地發(fā)育。在動物冠(animal cap)測定中，注射Χβ-聯(lián)蛋白誘導(dǎo)Wnt信號傳導(dǎo)的已知靶基因=Siamois和的表達(dá)。 與XTNIK(WT)共同注射增強(qiáng)了這些基因的表達(dá)，而XTNIK(K54R)關(guān)閉它們的表達(dá)。將XTNIK(KMR)mRNA注射至8細(xì)胞期胚胎的背側(cè)卵裂球中抑制第10期時(shí)原腸胚形成的啟動。用XTNIK(WT)背側(cè)注射的胚胎顯示Siamois和的表達(dá)明顯增加，而 XTNIK(K54R)減少它們的表達(dá)。在8細(xì)胞期時(shí)接受將XTNIK(K54R)mRNA注射至背側(cè)卵裂球中的胚胎發(fā)生明顯的體軸缺陷完全喪失了頭和體軸結(jié)構(gòu)，由Wnt信號傳導(dǎo)的背側(cè)抑制引起的典型表型。針對XTNIK的反義嗎啉代寡核苷酸(MOs) (M01和M03)阻斷當(dāng)被共同注射至8細(xì)胞期胚胎的腹側(cè)邊緣區(qū)中時(shí)由Χβ-聯(lián)蛋白誘導(dǎo)的副軸形成。通過共同注射HA-標(biāo)記的 XTNIKoef( JfmmmORm [缺少被MOl和M03靶向的5，UTR (5 ‘-非翻譯區(qū))]，此阻斷被消除。 用任一種xraiK-ΜΟ背側(cè)注射的胚胎在第10期時(shí)不能啟動原腸胚形成，并且發(fā)育成異常的蝌蚪，其頭和體軸結(jié)構(gòu)明顯減小。通過共同注射XTNIKqkf可以挽救由XTNIK-MOs導(dǎo)致的缺陷。用含有核苷酸錯(cuò)配(5mis-對照-1和-3)的對照MO注射的胚胎不顯示在TNIK-M01 和-M03中觀察到的效應(yīng)。通過共注射XTNIKqkf逆轉(zhuǎn)了 XTNIK-MOs對Siamois和)(nr3表達(dá)的抑制。已經(jīng)將蛋白激酶的合成ATP競爭劑成功地結(jié)合至腫瘤學(xué)實(shí)踐中。例如，伊馬替尼 (imatinib)阻斷慢性髓樣白血病(CML)的Bcr-Abl融合激酶，其目前是CML的一線治療藥物。表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑，吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼 (erlotinib)已經(jīng)用于治療非小細(xì)胞肺癌。Wnt信號傳導(dǎo)是驅(qū)動結(jié)直腸癌發(fā)生的主要力量。 TNIK在結(jié)直腸癌中被激活，并且結(jié)直腸癌細(xì)胞高度依賴TNIK的表達(dá)和激酶活性以進(jìn)行增殖。我們的結(jié)果表明了開發(fā)靶向TNIK的藥物的可行性。盡管我們?nèi)缦陆忉屃烁綀D，但圖2-4是關(guān)于本發(fā)明的效用的評價(jià)方法的參考附圖。附圖簡述

圖1圖1顯示了化合物1對β-聯(lián)蛋白/TCF4-介導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄的抑制。圖2 (參考附圖)針對TNIK的siRNA對結(jié)直腸癌生長的抑制。
a,將HCT-116細(xì)胞皮下接種至BALB/c nu/nu裸鼠中。將形成的腫瘤不處理，或僅用去端肽膠原蛋白、對照RNA(X或IX)或針對TNIK的siRNA(12或13)處理。如所示的那樣監(jiān)視腫瘤的體積(每組η = 8)。#, P < 0. 001 (Mann-Whitney U-檢驗(yàn))；條形(Bars)， SE ；N. S.，不顯著。b，在用siRNA注射的腫瘤中TNIK的mRNA表達(dá)(每組η = 3)。c，d，在注射siRNA后18天，小鼠和切除的腫瘤的代表性外觀。各柱表示切除的腫瘤的平均重量(每組 η = 8) · $，P < 0. OO5 (Mann-Whitney U-檢驗(yàn))；Bars, SE.圖3和4(參考附圖)針對TNIK的siRNA引起的結(jié)直腸腫瘤的生長抑制和消退。在第0天，將DLDl (圖3)或WiDr (圖4)細(xì)胞接種在BALB/c nu/nu裸鼠的脅腹中。 在第7天將形成的腫瘤(DLD1，64. 0 士 1. 9mm3 ；WiDr，95. 9 士 1. 6mm3)不處理，或僅用去端肽膠原蛋白、對照RNA (X或IX)或針對TNIK的siRNA (12或13)處理。a,在第7，9，13，16，19，22和25天時(shí)測量腫瘤的體積(每組η = 8)。*, P < 0. 0001 (Mann-Whitney U-檢驗(yàn))；條形(Bars)，SE ；N. S.，不顯著。b，在注射siRNA后3天通過實(shí)時(shí)PCR測定TNIK在腫瘤中的mRNA表達(dá)(每組η = 3)。c，d，在第25天時(shí)(在注射siRNA后18天)小鼠(c)和切除的腫瘤(d)的代表性外觀和切除的腫瘤的重量(每組η = 8) (d)。$，P < 0. 005 (Mann-Whitney U-檢驗(yàn))；條形 (Bars), SE.發(fā)明概述這些發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TNIK在Wnt信號傳導(dǎo)途徑中是必不可少的蛋白激酶，其與癌癥，尤其是實(shí)體瘤的增殖密切相關(guān)，所述實(shí)體瘤例如，胰腺癌，非小細(xì)胞肺癌，前列腺癌或乳腺癌(尤其是結(jié)直腸癌)，并且癌癥、尤其是實(shí)體瘤(尤其是結(jié)直腸癌)的增殖可以通過抑制TNIK的作用來控制。發(fā)明詳述基于有關(guān)的知識，本發(fā)明人已經(jīng)篩選了具有TNIK抑制活性的化合物，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)由下列通式(I)表示的氨基噻唑衍生物
權(quán)利要求
1. 一種TNIK抑制劑，所述TNIK抑制劑包含作為活性成分的由通式(I)表示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽
2.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含有效量的作為活性成分的根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。
3.權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其中治療的靶標(biāo)是癌癥。
4.一種用TNIK抑制劑治療癌癥患者的方法，所述方法包括施用有效量的作為活性成分的根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述癌癥是實(shí)體癌。
6.權(quán)利要求4或5所述的方法，其中所述癌癥是結(jié)直腸癌。
7.權(quán)利要求4或5所述的方法，其中所述癌癥是胰腺癌。
8.權(quán)利要求4或5所述的方法，其中所述癌癥是非小細(xì)胞肺癌。
9.權(quán)利要求4或5所述的方法，其中所述癌癥是前列腺癌。
10.權(quán)利要求4或5所述的方法，其中所述癌癥是乳腺癌。
11.權(quán)利要求4-10所述的方法，其中口服施用所述TNIK抑制劑。
12.權(quán)利要求4-10所述的方法，其中靜脈內(nèi)施用所述TNIK抑制劑。
13.一種由下列通式表示的化合物
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中R1’和R2’獨(dú)立地表示氫原子、鹵素原子、羥基、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的氨基、酰基氨基、硝基、取代的或未取代的烷氧基羰基氨基，R3’和R4’獨(dú)立地表示氫原子、鹵素原子、羥基、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烷氧基、取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的?；被蛉〈幕蛭慈〈耐榛鶃喕酋０被?，并且Y1、Y2和 Υ3獨(dú)立地表示氮原子或碳原子。
全文摘要
本發(fā)明涉及Traf2-和Nck-相互作用激酶(TNIK)抑制劑，藥物組合物，和使用TNIK抑制劑治療癌癥患者的方法。本發(fā)明還涉及新的氨基噻唑衍生物。所述TNIK抑制劑由下式(I)表示，其中R1、R2、R3、R4、R5和R6獨(dú)立地表示氫原子或取代基。
文檔編號A61K31/426GK102227218SQ200980147535
公開日2011年10月26日 申請日期2009年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月1日
發(fā)明者下重美紀(jì), 山田哲司, 森山英樹, 橫田耕一, 澤匡明 申請人:卡爾那生物科學(xué)株式會社, 日本國立癌癥研究中心