專利名稱：用于減少b-輔助性t細(xì)胞以治療自身免疫疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的領(lǐng)域，以及更特別地涉及通過(guò)降低B-輔助性T 細(xì)胞的活性來(lái)診斷、預(yù)防和治療自身免疫疾病的組合物和方法。
背景技術(shù)：
在不限制本發(fā)明的范圍的前提下，將其背景與自身免疫應(yīng)答相聯(lián)系地進(jìn)行描述。為了治療自身免疫障礙，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種的化學(xué)和生物學(xué)的免疫治療方法。一般來(lái)說(shuō)，免疫治療方法已經(jīng)通過(guò)利用例如化學(xué)劑如類固醇或者抗免疫的細(xì)胞抗體減緩整個(gè)免疫應(yīng)答來(lái)起始之后，嘗試治療自身免疫性障礙，所述的減緩中使用。例如，一種這樣的方法嘗試通過(guò)給藥結(jié)合于B-細(xì)胞抗原(如⑶22、⑶20、⑶19和⑶74或者HLA-DR抗原)的抗體來(lái)治療自身免疫障礙。然而，所述抗體靶向全部的B細(xì)胞，而不管其正常的功能，并且降低全部的免疫應(yīng)答，而非僅僅所靶向的自身免疫應(yīng)答。一個(gè)這樣的專利是授權(quán)給Goldenberg等人的第7，074，403號(hào)美國(guó)專利，其涉及使用靶向B-細(xì)胞的抗體的自身免疫障礙的免疫治療。該專利教導(dǎo)了使用結(jié)合B-細(xì)胞抗原的抗體來(lái)提供治療自身免疫障礙的有效方式。被結(jié)合的或者裸露的抗體和片段被單獨(dú)使用， 或者用于多樣的治療中。所述抗體可以是雙特異性的抗體，并且可以作為融合蛋白或者雜交體、多特異性抗體來(lái)重組制備。授權(quán)給Ways等人的第6，103，713號(hào)美國(guó)專利教導(dǎo)了通過(guò)抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化/增殖的自身免疫疾病的治療，以及使用同工酶選擇性PKC抑制劑來(lái)治療自身免疫疾病和/或疾病的表現(xiàn)形式，所述的抑制劑是(S)-3，4-[N，N’ _1，1’ -((2”-乙氧基)-3’ “ (0)-4' ‘‘-(N，N-二甲基氨基)-丁烷]-雙 _(3，3’ -吲哚基 1)]-1(H)_ 吡咯-2， 5- 二酮及其藥學(xué)上可接受的鹽。另一個(gè)例子是由Dingivan遞交的第20070025990號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)，其關(guān)于給藥/ 給服CD2拮抗劑，用于預(yù)防和治療自身免疫性障礙或者炎癥異常的方法。該申請(qǐng)教導(dǎo)了在受試者中使用一種或者多種CD2拮抗劑用來(lái)預(yù)防或者治療自身免疫障礙或者炎癥異常的組合物，以及在受試者中使用一種或者多種CD2拮抗劑來(lái)預(yù)防或者治療自身免疫障礙或者炎癥異常的方法。本發(fā)明提供了 CD2結(jié)合分子的劑量和給藥的方法，這些都導(dǎo)致改進(jìn)的功效，并且避免或者降低與藥劑的給藥相關(guān)的不利的或者不想要的副作用，所述藥劑引起外周血液淋巴細(xì)胞的減少。再另一個(gè)申請(qǐng)是由Cohen等人遞交的第20040022787號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)，其涉及使用可溶的CTLA4分子以及DMARD或者NSAID治療自身免疫疾病的方法。簡(jiǎn)言之，教導(dǎo)了用于治療免疫系統(tǒng)疾病如風(fēng)濕病的組合物和方法，其通過(guò)向受試者給藥可溶的CTLA4分子， 所述CTLA4分子單獨(dú)地或者與其它的藥劑一起阻斷內(nèi)源的B7分子結(jié)合其配體，所述其它藥劑包括緩解疾病的抗風(fēng)濕性藥物(DMARD)。發(fā)明概述本發(fā)明包括用于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的組合物和方法，以及更特別地包括調(diào)節(jié)B-輔助性τ細(xì)胞的活性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)IL-12是將B細(xì)胞增殖、成熟和活化成免疫球蛋白分泌細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。本文證明了 IL-12通過(guò)控制該T細(xì)胞亞集的發(fā)育和活化及其對(duì)IL-21的分泌來(lái)調(diào)節(jié)大部分的T細(xì)胞，B-輔助性T細(xì)胞。生理上發(fā)現(xiàn)并在本文證明在包括自身免疫抗體的自身免疫障礙中，在這些自身免疫疾病患者的血液中B-輔助性T細(xì)胞的存在增加了，所述自身免疫抗體如青少年型皮肌炎(JDM)、系統(tǒng)性關(guān)節(jié)炎(SYS)以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡關(guān)節(jié)炎(SLE)。進(jìn)一步地證明了在通過(guò)患有自身免疫疾病患者的T細(xì)胞分泌IL-21中，IL-12是關(guān)鍵的分子。本發(fā)明包括減少B-輔助性T細(xì)胞的數(shù)量或者活性，從而治療自身免疫疾病的組合物和方法。一個(gè)這種方法包括阻斷IL-12活性從而抑制B-輔助性T細(xì)胞的發(fā)育及其對(duì) IL-21的分泌。另一方法包括通過(guò)阻斷ICOS來(lái)降低B-輔助性T細(xì)胞對(duì)IL-21的分泌。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用于治療自身免疫障礙的組合物和方法，其通過(guò)向患有自身免疫障礙的受試者給藥有效量的治療組合物，所述治療組合物包含足夠量的 IL-12抑制劑來(lái)減少B-輔助性T細(xì)胞從而減少例如借助B細(xì)胞的自發(fā)免疫抗體的分泌。在一方面，所述IL-12抑制劑包含至少一種阻斷抗-IL-12抗體或者其片段。在另一方面，所述方法還包括藥學(xué)上可接受的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述IL-12抑制劑包含IL-12的抑制性抗體，其以每劑1至1，OOOmg的劑量來(lái)給藥。在一方面，所述IL-12抑制劑包含IL-12 的抑制抗體，并且受試者接受以重復(fù)給藥的抗體。在再一方面，所述IL-12抑制劑包括選自類人靈長(zhǎng)類抗體、鼠單克隆抗體、嵌合抗體、人化抗體和人類抗體的抗-IL-12抗體。在又一方面，所述IL-12抑制劑包括IL-12的RNAi、siRNA或者其它的核酸抑制劑?？梢杂帽景l(fā)明治療的自身免疫疾病的非限制性實(shí)例包括例如自身免疫抗體引發(fā)自身免疫應(yīng)答的那些，所述自身免疫應(yīng)答例如急性先天血小板減少性紫癜、慢性先天血小板減少性紫癜、皮肌炎、西德哈姆舞蹈病、重癥肌無(wú)力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡腎炎、風(fēng)濕熱、多腺性綜合征、大皰性類天皰瘡、糖尿病癥、亨-舍紫癜、鏈球菌感染后腎炎(post streptococcal nephritis)、結(jié)節(jié)性紅斑、高安氏動(dòng)脈炎、阿狄森氏病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 多發(fā)性硬化、肉狀瘤病、潰瘍性結(jié)腸炎、多形性紅斑、IgA腎病、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、強(qiáng)直性脊椎炎、肺出血腎炎綜合征、閉塞性血栓血管炎、舍格倫綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬化、橋本甲狀腺炎、甲狀腺功能亢進(jìn)、硬皮病、慢性活動(dòng)型肝炎、多肌炎/皮肌炎、多軟骨炎、慢性天皰瘡、韋氏肉芽腫病、膜性腎病、肌萎縮(amyotrophic lateral sclerosis)、脊髓癆(tabes dorsalis)、巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎/多肌痛、惡性貧血、急進(jìn)性腎小球腎炎和纖維性肺泡炎。在本發(fā)明的再一方面，所述IL-12抑制劑可以與第二治療劑一起提供，所述第二治療劑針對(duì) T-細(xì)胞、B-細(xì)胞、血漿細(xì)胞或者巨噬細(xì)胞或者炎性細(xì)胞因子。本發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案是增強(qiáng)針對(duì)抗原的抗原特異性B細(xì)胞應(yīng)答的方法，所述方法包括分離原初CD4+ T細(xì)胞；并且在加載了抗原的樹(shù)突細(xì)胞以及有效量的IL-12的存在下使原初CD4+T細(xì)胞成熟，所述有效量的IL-12足以使B-輔助性T細(xì)胞發(fā)育并活化，其中經(jīng)IL-12處理的B-輔助性T細(xì)胞分泌納摩爾量的IL-21。在一方面，將原初⑶4+ T細(xì)胞從外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞中通過(guò)負(fù)選擇進(jìn)行分離。在另一方面，所述原初CD4+ T細(xì)胞通過(guò)使用負(fù)選擇得自外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞，所述負(fù)選擇使用抗CD8的抗體以及一種或者多種對(duì)抗CDllb、 CDllc、⑶14、⑶15、⑶16、⑶19、CD45R0、CD56以及HLA-DR的抗體。在另一方面，所述抗原選自病毒、細(xì)菌、真菌、癌或者毒素。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括調(diào)節(jié)自身免疫疾病的組合物和方法，其包括辨別出懷疑需要治療自身免疫障礙的患者，所述自身免疫障礙由B細(xì)胞分泌自身免疫抗體而引起；以及使用足以抑制CD4+ B-輔助性T細(xì)胞的一定量的抗-IL-12抑制劑來(lái)治療患者。在一方面，所述抗-IL-12抑制劑包括抗-IL-12p40mAb或者抗-IL_12p70 mAb、抗-IL_12p70 mAb、抗IL-12受體、可溶的非活性IL-12及它們的組合。在另一方面，所述抗-IL-12抑制劑包括IL-12受體拮抗劑。在再一方面，所述CD4+ B-輔助性T細(xì)胞通過(guò)負(fù)選擇來(lái)進(jìn)行選擇。 在一方面，所述CD4+ B-輔助性T細(xì)胞通過(guò)負(fù)選擇得自外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞，其使用對(duì)CD8的抗體，以及一種或者多種對(duì) CDllb、CDllc、CD14、CD15、CD16、CD19、CD45R0、CD56 和 HLA-DR 的抗體。在另一方面，所述CD4+ B-輔助性T細(xì)胞在經(jīng)活化的樹(shù)突細(xì)胞存在下進(jìn)行活化。在一方面，所述自身免疫疾病選自系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮肌炎、青少年型皮肌炎、關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性關(guān)節(jié)炎和銀屑病關(guān)節(jié)炎。在一方面，將所述IL-12抑制劑在自身免疫抗體產(chǎn)生之前，提供給懷疑易患自身免疫疾病的患者。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案是根據(jù)下述方法制備的B細(xì)胞輔助性T細(xì)胞，所述方法包括分離原初CD4+ T細(xì)胞；以及在經(jīng)活化的樹(shù)突細(xì)胞的存在下使原初CD4+ T細(xì)胞成熟，所述經(jīng)活化的樹(shù)突細(xì)胞在IL-12的存在下表達(dá)靶抗原，其中成熟的CD4+ B-輔助性T細(xì)胞在應(yīng)答抗原中釋放納摩爾量的IL-21。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括通過(guò)將分泌IL-21的B-輔助性T細(xì)胞暴露于包含 IL-12抑制劑的組合物，調(diào)節(jié)B細(xì)胞的增殖、成熟和活化使之成為免疫球蛋白分泌細(xì)胞的組合物和方法。在一方面，所述IL-12抑制劑借助⑶4+ B-輔助性T細(xì)胞來(lái)減少IL-21和 IFN-Y的分泌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供富集B-輔助性T細(xì)胞的方法，所述方法包括將原初⑶4+ T細(xì)胞與足以引發(fā)納摩爾量的IL-21的釋放的量IL-12進(jìn)行培育。附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明為了更完整地理解本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在將本發(fā)明的詳述結(jié)合附圖作為參考，其中

圖1顯示了 IL-12誘導(dǎo)原初⑶4+ T細(xì)胞來(lái)分泌IL-21。圖2顯示了用IL-12引發(fā)的原初⑶4+ T細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生免疫球蛋白。圖3顯示了用IL-12引發(fā)的原初⑶4+ T細(xì)胞通過(guò)IL-21和ICOS來(lái)輔助B細(xì)胞。圖4顯示了經(jīng)活化的DC通過(guò)IL-12來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-21的⑶4+ T細(xì)胞。圖5顯示了阻斷的IL-12抑制能夠輔助B細(xì)胞的T細(xì)胞的生長(zhǎng)。圖6顯示了 IL-12通過(guò)記憶⑶4+ T細(xì)胞來(lái)控制IL-21的分泌。圖7顯示了⑶4+T細(xì)胞和B細(xì)胞主要集中在DM的炎癥部位。圖8顯示了在自身免疫疾病患者的血液中，功能性B輔助性T細(xì)胞的頻率的增加。圖9顯示了得自活性JDM患者的外周血液?jiǎn)渭?xì)胞應(yīng)答SEB的增加的IL-21分泌。圖10顯示了來(lái)自JDM患者的PBMC的IL-21分泌依賴于IL-12。發(fā)明詳述盡管以下詳細(xì)地討論了本發(fā)明各種實(shí)施方案的制備和應(yīng)用，應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明提供了許多適用的發(fā)明構(gòu)思，這些發(fā)明構(gòu)思可以體現(xiàn)在各種各樣的具體上下文中。本文所討論的具體實(shí)施方案僅僅舉例說(shuō)明了制備和使用本發(fā)明的具體方式，并不限制本發(fā)明的范圍。為了有助于理解本發(fā)明，在下文定義了多個(gè)術(shù)語(yǔ)。本文所定義的術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的含義。術(shù)語(yǔ)如“一個(gè)”、“一種”和“該”不意在僅指一個(gè)單數(shù)的實(shí)體，而是包括可以用于舉例說(shuō)明的具體例子的一般類型。本文的術(shù)語(yǔ)用于描述本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但它們的用法并不限制本發(fā)明，除了如在權(quán)利要求中所概括的。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明中有辨別需要治療B細(xì)胞調(diào)節(jié)自身免疫障礙的受試者的步驟。該辨別可以是判斷受試者或健康專業(yè)人員，其可以是主觀的(例如，觀念上的) 或者客觀的(例如，可以通過(guò)測(cè)試或者診斷方法進(jìn)行測(cè)定的)。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“治療(treat) ”、“治療(treatment) ”和“治療(treating) ”是指B-細(xì)胞調(diào)節(jié)的自身免疫障礙的發(fā)展、嚴(yán)重性和/或持續(xù)性上的減少或者改善，或者B細(xì)胞調(diào)節(jié)的自身免疫障礙的多種癥狀(優(yōu)選的一種或多種可識(shí)別的癥狀)的改善，所述癥狀由給予本發(fā)明的一種或多種療法而引起，所述療法靶向由B-輔助性T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫應(yīng)答，所述B-輔助性T細(xì)胞應(yīng)答T細(xì)胞的活化而分泌大量的IL-21，所述T細(xì)胞的活化通過(guò)加載了抗原的呈遞細(xì)胞(例如，樹(shù)突細(xì)胞)在IL-12的存在下進(jìn)行。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“預(yù)防(prevent)”、“預(yù)防(prevention)”和“預(yù)防 (preventing)，，是指減少獲得或者發(fā)生給定的B-細(xì)胞調(diào)節(jié)的自身免疫障礙的風(fēng)險(xiǎn)，或者減少或抑制給定的B-細(xì)胞調(diào)節(jié)的自身免疫障礙的一種或者多種癥狀的復(fù)發(fā)、開(kāi)始或者發(fā)展。 在一個(gè)實(shí)施方案中，將IL-12抑制劑作為預(yù)防性的措施給藥患者(例如，人)，所述患者被懷疑具有本文所描述的任意障礙的遺傳學(xué)上的傾向。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“有效量”指一定量的IL-12抑制劑，所述量足以降低或者改善 B-細(xì)胞調(diào)節(jié)的自身免疫障礙的嚴(yán)重性、持續(xù)性、發(fā)展或者開(kāi)始，預(yù)防B-細(xì)胞調(diào)節(jié)的自身免疫障礙的增進(jìn)，導(dǎo)致B-細(xì)胞調(diào)節(jié)的自身免疫障礙的退化，預(yù)防與B-細(xì)胞調(diào)節(jié)的自身免疫障礙相關(guān)的癥狀的復(fù)發(fā)、開(kāi)始或者發(fā)展，或者增強(qiáng)或者改進(jìn)其它療法在預(yù)防或者治療上的效果。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的治療提供了 B-細(xì)胞調(diào)節(jié)的自身免疫障礙至少一種癥狀或者表現(xiàn)的減少或者預(yù)防，按照在體內(nèi)或者在體外所測(cè)定的，減少或預(yù)防了至少約10%、 或者甚至 20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%,98%^； 99%。本發(fā)明確認(rèn)了在Freireich 等人(1966)Cancer Chemother Rep 50 :219 中所述的，對(duì)于動(dòng)物和人類而言劑量的相互關(guān)系(基于每平方米身體表面的毫克數(shù))。身體表面面積可以從患者的身高和體重來(lái)近似地確定。參見(jiàn)，例如kientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, N. Y.，1970，537。本發(fā)明的化合物的有效量可以為約0. OOlmg/ kg至約1000mg/kg，更優(yōu)選地為0. 01mg/kg至約100mg/kg，更優(yōu)選地0. lmg/kg至約IOmg/ kg;或者為任意范圍，其中所述任意范圍的下限為0. 001mg/kg至900mg/kg之間的任意的量，并且所述任意范圍的上限為0. lmg/kg至1000mg/kg之間的任意的量(例如0. 005mg/kg 至200mg/kg，0. 5mg/kg至20mg/kg)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)同的，有效量也可能變化，這取決于所治療的疾病，給藥途徑，賦形劑的使用以及可能與其它治療如與其它藥劑共同使用。在操作中，本發(fā)明的組合物和方法可以包括抗-IL-12抑制劑，所述抗-IL-12抑制劑單獨(dú)地或者作為藥物組合物的組分經(jīng)靜脈內(nèi)、經(jīng)肌肉內(nèi)、經(jīng)口服、經(jīng)腸道外、通過(guò)吸入噴霧、經(jīng)局部、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、經(jīng)面頰、經(jīng)陰道或者通過(guò)植入的儲(chǔ)液囊來(lái)給藥。IL-12抑制劑的遞送和本發(fā)明的方法的其它非限制性的實(shí)例包括經(jīng)皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、滑液內(nèi)、intrastemal、鞘內(nèi)、病灶內(nèi)和顱內(nèi)注射或灌注技術(shù)。在特定的實(shí)施方案中，可以將所述B-輔助性T細(xì)胞在體外進(jìn)行分離和處理，并隨后返回到受試者中用于治療。
例如，本發(fā)明可以按照無(wú)菌的可注射組合物進(jìn)行制備和給藥。例如，無(wú)菌的可注射含水的或者油質(zhì)的懸浮液可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中已知的技術(shù)，使用適合的分散劑或潤(rùn)濕劑 (例如，Tween 80)和懸浮劑來(lái)配制。所述無(wú)菌可注射制劑也可以是無(wú)菌的可注射溶液或者在無(wú)毒的腸道外可接受的稀釋劑或者溶劑中的懸浮液，例如為1，3_ 丁二醇的溶液。在可以采用的可接受的載體和溶劑中包括甘露醇、水、Ringer溶液和等滲透壓的氯化鈉溶液。除此之外，傳統(tǒng)上將無(wú)菌的、不揮發(fā)的油用作溶劑或者懸浮介質(zhì)(例如，合成的單甘油酯或者二甘油酯)。在血管注射劑的制備中，脂肪酸如油酸和其甘油酯衍生物是有用的，例如天然的藥學(xué)上可接受的油，如橄欖油或蓖麻油，尤其是以其聚乙氧基化形式的。這些油溶液或者懸浮液也可以含有長(zhǎng)鏈的醇稀釋劑或者分散劑，或者羧甲基纖維素或者類似的分散劑。其它常用的表面活性劑如Tween或者Span或者其它類似的乳化劑或者生物利用的增強(qiáng)劑常被用在也可用于制劑目的的藥學(xué)上可接受的固體、液體或者其它劑型制備中。本發(fā)明的另一實(shí)例是用于經(jīng)口服給藥的組合物，并且可以為任何口服可接受劑型，其包括但不限于，膠囊、片劑、乳劑和水性懸浮液、分散液和溶液。在用于口服的片劑的情況下，通常使用的載體包括乳糖和玉米淀粉。還通常加入潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂。對(duì)于以膠囊形式的口服給藥而言，有用的稀釋劑包括乳糖和干燥的玉米淀粉。當(dāng)經(jīng)口服給藥水性分散液或者乳劑時(shí)，可以將活性成分在組合了乳化劑或分散劑的油相中懸浮或者溶解。如果期待的話，可以加入特定的甜味劑、調(diào)味劑或者著色劑?？梢愿鶕?jù)在醫(yī)藥制劑領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)中已知的技術(shù)來(lái)制備鼻氣霧劑或吸入組合物，并且可以被制備成鹽水溶液，其采用苯甲醇或者其它合適的防腐劑、吸收促進(jìn)劑從而提高生物利用度，也可以采用碳氟化合物，和/ 或其它的現(xiàn)有技術(shù)中已知的增溶劑或者分散劑。本發(fā)明化合物也可以以直腸給藥的栓劑形式來(lái)給藥。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”指那些試劑(活性的或者惰性的)， 其中可以包括IL-12抑制劑，對(duì)于所治療的受試者通常是無(wú)害的。例如，與本發(fā)明的化合物形成特定的溶解性更好的復(fù)合物的增溶劑如環(huán)糊精，或者一種或多種增溶劑可以用作運(yùn)送本發(fā)明化合物的藥學(xué)上的賦形劑。其它載體的實(shí)例包括膠體二氧化硅、硬脂酸鎂、纖維素、 十二烷基硫酸鈉和染料。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”、“受試者”、“哺乳動(dòng)物”和“患者”，包括但不限于，人類或者動(dòng)物如牛、猴、馬、豬、雞、火雞、鵪鶉、貓、狗、小鼠、大鼠、兔和倉(cāng)鼠。在對(duì)其有需要的患者中用來(lái)治療或者預(yù)防B細(xì)胞調(diào)節(jié)的自身免疫障礙的方法還包括向要被給藥的患者給藥有效量的IL-12抑制劑。所述IL-12抑制劑也可以與其它治療劑一起遞送，所述治療劑如傳統(tǒng)上用于預(yù)防或者治療B細(xì)胞調(diào)節(jié)的自身免疫障礙或者其癥狀的那些。在這樣的組合療法中，IL-12抑制劑及其它的藥劑可以通過(guò)傳統(tǒng)方法給藥哺乳動(dòng)物(例如人類男性或者女性)。所述劑可以以單劑型或者以分開(kāi)的劑型來(lái)給藥。其它治療劑的有效量對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。從在本發(fā)明的角度，技術(shù)人員可以確定其它治療劑最優(yōu)的有效量范圍。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的IL-12抑制劑的有效量可以在第二治療劑增強(qiáng)或者提高IL-12抑制劑的效果的情況下減少。用于組合療法的藥劑的實(shí)例可以包括TNF拮抗劑(例如但不限于TNF抗體或片段，可溶的TNF受體或其片段、融合蛋白，或者小分子的TNF拮抗劑)，抗風(fēng)濕劑(如甲氨蝶呤，金諾芬，硫金代葡萄糖，硫唑嘌呤，依那西普，硫代蘋果酸金鈉，硫酸羥氯喹，來(lái)氟米特，二柳氮磺胺吡啶)，肌肉松弛劑，麻醉劑，非類固醇消炎藥(NSAID)，止痛藥，麻醉劑，鎮(zhèn)靜劑，局部麻醉劑，神經(jīng)肌肉阻斷劑，抗微生物劑(如氨基糖苷類、抗真菌劑、抗寄生蟲(chóng)劑、抗病毒劑、碳青霉烯劑、頭孢菌素、氟喹啉酮?jiǎng)⒋蟓h(huán)內(nèi)酯劑、青霉素、磺胺劑，四環(huán)素，另一抗微生物劑)，抗牛皮癬劑，皮質(zhì)類固醇激素，合成代謝類固醇，糖尿病相關(guān)的藥劑，礦物質(zhì)， 營(yíng)養(yǎng)劑，甲狀腺劑，維生素，鈣相關(guān)激素，止瀉劑，鎮(zhèn)咳劑，止吐劑，抗?jié)儎?，瀉藥，抗凝血?jiǎng)?，紅細(xì)胞生成素(例如，紅細(xì)胞生成素α)，非格司亭(例如，G-CSF、Neupogen)，沙莫司亭(GM-CSF、Leukine)，免疫接種劑，免疫球蛋白，免疫抑制劑(例如，巴利昔單抗、環(huán)孢素、 賽尼哌)，成長(zhǎng)激素，激素替代藥物，雌激素受體調(diào)節(jié)劑，散瞳劑，睫狀肌麻痹劑，烷基化劑， 抗代謝物，有絲分裂抑制劑，放射性藥物，抗抑郁藥，抗躁狂劑，抗精神病藥物，抗焦慮劑， 催眠劑，擬交感神經(jīng)劑，興奮劑，多奈哌齊，他克林，哮喘藥，β受體激動(dòng)劑，吸入類固醇，白三烯抑制劑，甲基黃嘌呤，色甘酸鈉，腎上腺素或類似物，α "domase (阿法鏈道酶)，細(xì)胞因子或細(xì)胞因子拮抗劑。適用的劑量在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。參見(jiàn)例如Wells等人，eds., Pharmacotherapy Handbook,2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford,Conn. (2000)； PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif. (2000)，相關(guān)的部分引入本文作為參考。
可以使用本發(fā)明進(jìn)行診斷、預(yù)防或者治療的自身免疫疾病的非限制性的實(shí)例包括這些自身免疫疾病，其部分或者主要地包括針對(duì)自身抗原的免疫球蛋白應(yīng)答，所述的自身免疫疾病例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、舍格倫綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、青少年發(fā)病型糖尿病、韋格納肉芽腫、炎癥性腸道疾病、多發(fā)性肌炎、皮肌炎、多發(fā)性內(nèi)分泌功能衰竭、施密特綜合征、 自身免疫葡萄膜炎、阿狄森氏病、腎上腺炎、格雷夫斯病、甲狀腺炎、橋本甲狀腺炎、自身免疫甲狀腺疾病、惡性貧血、胃萎縮、慢性肝炎、狼瘡樣肝炎、動(dòng)脈粥樣硬化、早老性癡呆、脫髓鞘疾病、多發(fā)性硬化、亞急性皮膚紅斑性狼瘡、甲狀旁腺功能低下癥、德雷斯勒綜合征、重癥肌無(wú)力、自身免疫血小板減少癥、特發(fā)性血小板減少性紫癜、溶血性貧血、尋常型天皰瘡、天皰瘡、皰疹性皮炎、脫發(fā)阿克塔、類天皰瘡、硬皮病、漸進(jìn)系統(tǒng)性硬化癥、CREST綜合征(鈣化、雷諾氏現(xiàn)象、食管蠕動(dòng)、硬皮病和毛細(xì)血管擴(kuò)張)、成人發(fā)病型糖尿病(II型糖尿病)、男性和女性免疫性不孕、強(qiáng)直性脊椎炎、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、混合性結(jié)締組織病、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、全身壞死性血管炎、青少年發(fā)病類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腎炎、過(guò)敏性皮炎、過(guò)敏性鼻炎、 古德帕斯蒂爾綜合征、南美錐蟲(chóng)病、結(jié)節(jié)病、風(fēng)濕性熱、哮喘、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、抗磷脂綜合征、農(nóng)民肺、多形性紅斑、心臟術(shù)后綜合征、皮質(zhì)醇增多癥、自身免疫慢性活動(dòng)性肝炎、飼?shū)B(niǎo)者肺、 過(guò)敏性疾病、過(guò)敏性腦脊髓炎、中毒性表皮壞死、脫發(fā)、奧爾波特綜合征、肺泡炎、過(guò)敏性肺泡炎、纖維化性肺泡炎、間質(zhì)性肺疾病、結(jié)節(jié)性紅斑、膿皮病壞疽、輸血反應(yīng)、麻風(fēng)病、瘧疾、 利什曼病、錐蟲(chóng)病、高安氏動(dòng)脈炎、多肌痛風(fēng)濕性、顳動(dòng)脈炎、血吸蟲(chóng)病、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、蛔蟲(chóng)病、曲霉菌病、Sampter綜合征、濕疹、淋巴瘤樣肉芽腫、白塞氏病、卡普蘭綜合征、川崎氏病、 登革熱、腦脊髓炎、心內(nèi)膜炎、心內(nèi)膜心肌纖維化、眼內(nèi)炎、持久隆起性紅斑、牛皮癬、新生兒成紅血細(xì)胞增多癥、嗜酸性筋膜炎、舒爾曼綜合征、費(fèi)爾蒂綜合征、絲蟲(chóng)病、睫狀體炎、慢性睫狀體炎、異色性睫狀體炎、Fuch睫狀體炎、IgA腎病、過(guò)敏性紫癜、腎炎、移植物抗宿主病、 移植排斥反應(yīng)、人類免疫缺陷病毒感染、埃可病毒感染、心肌病、阿爾茨海默氏病、細(xì)小病毒感染、風(fēng)疹病毒感染、免疫后綜合征、先天性風(fēng)疹感染、霍奇金及非霍奇金淋巴瘤、腎細(xì)胞癌、多發(fā)性骨髓瘤、伊頓-蘭伯特綜合征、復(fù)發(fā)性多軟骨炎、惡性黑色素瘤、冷球蛋白血癥、巨球蛋白血癥、EB病毒感染、流行性腮腺炎、埃文綜合癥和自身免疫性腺衰竭。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了 IL-12是調(diào)節(jié)人體中抗體應(yīng)答的關(guān)鍵分子。還發(fā)現(xiàn)了功能性B-輔助性T細(xì)胞在自身免疫疾病中頻率增加，所述自身免疫疾病包括JDM、SYS和SLE。靶向B-輔助性T細(xì)胞從未作為自身免疫疾病的治療途徑而被要求權(quán)利。使用本發(fā)明，現(xiàn)在可能1)阻斷IL-12從而抑制B-輔助性T細(xì)胞的發(fā)育，2)阻斷IL-12從而借助B-輔助性T細(xì)胞來(lái)抑制IL-21的分泌，以及3)靶向B-輔助性T細(xì)胞從而減少其在體內(nèi)的數(shù)目，例如通過(guò)使用對(duì) CXCR5或者ICOS的單克隆抗體。例如，發(fā)現(xiàn)了將得自自身免疫疾病，如皮肌炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患者的外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞(PBMC)與超抗原腸毒素(SEB)在IL-12中和抗體(抗-IL_12p70 mAb)的存在下或者不存在下進(jìn)行培養(yǎng)，并在培養(yǎng)的第2天分析IL-21的分泌。加入IL-12阻斷抗體顯著地抑制了從SEB-反應(yīng)性的⑶4+ T細(xì)胞中的IL-21分泌。因此，阻斷IL-12減少了從⑶4+ T細(xì)胞中的IL-21分泌，其在抗體應(yīng)答的發(fā)展中起到關(guān)鍵的作用。原初CD4+ T細(xì)胞的分離。從來(lái)自成年健康的志愿者的單采血液成分法血液樣品中通過(guò)Ficoll梯度離心純化PBMC并將其冷凍并存放在液氮中的10% DMSO中。首先通過(guò)負(fù)選擇富集原初 CD4+ T 細(xì)胞將 PBMC 與經(jīng)純化的 CD8 (HIT8a, eBiosciences)、CDllb (LM1/2， ATCC)、CDllc(B-ly6，BD Biosciences)、CD14(M5E2，ATCC)、CD15 (W6D3，BD Biosciences)、 CD16(3G8, Beckman Coulter)、CD19(J4. 119，Beckman Coulter)、CD45R0 (UCHL1，BD Biosciences)、CD56(C218, Beckman Coulter)禾口 HLA_DR(B8.12.2, Beckman Coulter)mAb 在4°C下培育30分鐘，并隨后與Dynabeads Pan Mouse IgG(Dynal)在4°C下培育30分鐘。使用磁力(Dynal)將結(jié)合了抗體的細(xì)胞去除。原初⑶4+ T細(xì)胞通過(guò)與FACSAria(BD Biosciences)，其為經(jīng) CD8 PE (RPA-T8，eBiosciences)染色的 CD8- CD56" HLA-DR- CD45RA+ CD4+細(xì)胞、CD56 PE (B159, BD Biosciences), HLA-DR PE (G46-6, BD Biosciences)、CD45RA 三色(MEM-56，Caltag)和⑶4+太平洋藍(lán)(S3. 5，Caltag)mAbs進(jìn)行分類而進(jìn)一步純化。細(xì)胞純度> 99%。B細(xì)胞的分離。B細(xì)胞首先從單采血液成分法的PBMC通過(guò)陽(yáng)性篩選進(jìn)行富集， 所述篩選使用⑶19微珠和LS柱(Miltenyi Biotec)。隨后，將原初和記憶B細(xì)胞使用 FACSAria 進(jìn)行分類，其分別地為 IgD+ CD27" CD3" CDllcT CDlf 細(xì)胞以及 IgD- CD27+ CD3" CDllcT CD14-細(xì)胞，其分別地經(jīng) IgD FITC (IA6-2，BD)、CD27 PE(L128, BD Biosciences)、 CD3 APC(SK7，BD Biosciences),CDllc APC(S-HCL-3，BD Biosciences)和CD14 APC(TuK4, Caltag)mAb染色。細(xì)胞純度>98%。DC和原初CD4+ T細(xì)胞的共培養(yǎng)。通過(guò)負(fù)選擇，使用單核細(xì)胞分離試劑盒 II (Miltenyi Biotec)從PBMC中分離單核細(xì)胞。通過(guò)將單核細(xì)胞與50ng/ml IL-4 (R&D)和 100ng/ml GM-CSF(Leukine)在含有1 % L-谷氨酸、1 %盤尼西林/鏈霉素、50 μ M 2-巰基乙醇、丙酮酸鈉、非必要氨基酸(全部得自sigma)、25mM HEPES p7. 2以及10%熱滅活的FBS(Hyclone)的RPMI 1640完全培養(yǎng)基(GIBCO)中，在6孔板QxlO6個(gè)細(xì)胞/3ml/孔) 上培養(yǎng)來(lái)產(chǎn)生。每?jī)商焯砑蛹?xì)胞活素。在第6天時(shí)，將樹(shù)突細(xì)胞用經(jīng)輻射的轉(zhuǎn)染了 CD40L 的 L 細(xì)胞、PGN (5 μ g/ml, InvivoGen)、LPS(50ng/ml, Sigma-Aldrich)、鞭毛蛋白(20ng/ml， InvivoGen), CL097 (咪唑喹啉化合物5 μ g/ml，InvivoGen)、加熱殺滅的大腸桿菌(ΙΟ8/ ml, hvitrogen)、加熱殺滅的金黃色葡萄球菌(lOVml-hvivoGen)或者加熱殺滅的牙齦卟啉菌(lOVml-hvivoGen)進(jìn)行激發(fā)。在6小時(shí)的激發(fā)之后，收獲暴露于TLR配體或者加熱殺滅的細(xì)菌的DC，并仔細(xì)地洗滌在由CDllc APC(S-HCL-3，BD Biosciences)和CD40L PE(TR0P1, BD Biosciences)mAbs染色后，使用轉(zhuǎn)染了 CD40L的L細(xì)胞進(jìn)行激發(fā)的DC作為 FACS所謂的⑶llc+CD40L_DC被回收。將經(jīng)活化的DC(1. 3x10s細(xì)胞/孔)與自體同源的原初⑶4+ TGxlO4細(xì)胞/孔)細(xì)胞在96孔圓底板中，在RPMI完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天。在一些實(shí)驗(yàn)中，將 10 μ g/ml 抗-IL-12p40 (C8. 6，eBiosciences)或者抗 _IL_12p70 (M122, Pierce) 阻斷mAb加入到培養(yǎng)物中。為了評(píng)估IL-12的分泌，將激發(fā)6小時(shí)收獲的DC在平底96孔板中再培養(yǎng)M小時(shí)OxlO5個(gè)細(xì)胞/孔)，并且使用IL-12p70 ELISA試劑盒(eBiosciences) 來(lái)測(cè)定所分泌的IL-12。通過(guò)⑶3/^擬8激發(fā)原初⑶4+ T細(xì)胞。將原初⑶4+ T細(xì)胞(IxlO5個(gè)細(xì)胞/孔) 使用固定在板上的 CD3 mAb (5 μ g/ml, 0KT3, ATCC)和可溶的 CD^mAb (1 μ g/ml. C擬8. 2， BD Biosciences)在平底96孔板中，在RPMI完全培養(yǎng)基中，在人類重組細(xì)胞活素的存在下進(jìn)行激發(fā)，所述人類重組活素為 IL-I Y (R&D)、IL-6 (R&D)、IL-10 (R&D)、IL_12(R&D)、 IL-18 (R&D), IL-23 (eBiosciences)、IL_27(R&D)、TNF (R&D),(各個(gè)為 10ng/ml 或者以所表示的濃度)，或者IFN-α (IFN-α 2b 500IU/ml, Schering)。在第7天時(shí)分析經(jīng)活化的 ⑶4+ T細(xì)胞。在一些實(shí)驗(yàn)中，將原初⑶4+ T細(xì)胞使用1 μ M羧基熒光素琥珀酰亞胺二乙酸脂(Molecular Probes)標(biāo)記，從而示蹤T細(xì)胞的增殖。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞活素染色。將激發(fā)了 7天的原初CD4+ T細(xì)胞使用豆蔻酸佛波醇乙酸酯 (25ng/ml, Sigma-Aldrich)和伊屋諾霉素(1 μ g/ml, Sigma-Aldrich)進(jìn)行再激發(fā) 6 小時(shí)，其中最后4小時(shí)在GolgiPlug (BD Biosciences)的存在下。隨后將細(xì)胞固定并使用Cytofix/ Cytoperm Fixation/Permeabilization試劑盒(BD Biosciences)進(jìn)行滲透，并且將在細(xì)胞漿中表達(dá)的細(xì)胞活素使用 IL-21PE 或者 APC (3A3-N2，eBiosciences)、IL-17A PE (64DEC17, eBiosciences)和 IFNyAPC (B27，BD Biosciences)mAb 進(jìn)行分析。在使用多聚甲醛進(jìn)行固定之后，將細(xì)胞從FACS Calibur或者FACS CantoII獲得。使用FlowJo軟件(TreeMar) 分析在經(jīng)活化的CD4+ T細(xì)胞中的細(xì)胞活素表達(dá)。自經(jīng)活化的CD4+ T細(xì)胞中的IL-21分泌。在使用CDllc APC(S_HCL_3，BD Biosciences)染色從而除去殘余的CDllc+ DC之后，將經(jīng)活化的細(xì)胞在第7天分類為FSChigh 細(xì)胞(⑶3/ 激發(fā))或者⑶IlcltwFSChigh細(xì)胞(與DC共培養(yǎng))。將經(jīng)分類的⑶4+ T細(xì)胞使用固定在盤上的CD3 mAb (5 μ g/ml)和可溶的CD28 mAb (1 μ g/ml)在96孔平底板(5xl04 個(gè)細(xì)胞/孔)中，在培養(yǎng)基(Gemini)中，加入10% FBS進(jìn)行在激發(fā)。在對(duì)小時(shí)之后，使用 Luminex分析得到所產(chǎn)生的IL-21的水平。使用Luminex技術(shù)基于人類IL-21珠的分析的開(kāi)發(fā)。使用PCR將序列插入到Hind III-不是哺乳動(dòng)物表達(dá)載體I PCDM8 (Seed, 1987)的間隔中，所述序列結(jié)合了 TGCTGGCTA和 TGA，并編碼小鼠信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)淋巴細(xì)胞激活分子家族成員1的信號(hào)肽(gb|EDL39054. 1|)的殘基 l-24，GL，gb|ABN54273. 1 纖維素體錨定蛋白殘基 1050_1219、LEAD 以及 gb |AAG29348. 1 人類白細(xì)胞介素21殘基30-162。該載體指導(dǎo)粘結(jié)蛋白-IL-21融合蛋白的分泌。指導(dǎo)天然的人類IL-21分泌的載體通過(guò)將前面加有CACC的ref |NM_021803. 11殘基47_5；35插入到 Nhe I-Not I interval of pIRES2_DsRed2 (Clontech)中來(lái)進(jìn)行加工。所分泌的蛋白質(zhì)使用 FreeStyle 293 Expression Systemanvitrogen)，根據(jù)生產(chǎn)商的規(guī)程按照 Img 總質(zhì)粒DNA與1. 3ml 293Fectin試劑/L的轉(zhuǎn)染物進(jìn)行制備。將經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)3天，收集培養(yǎng)物上清液并加入新鮮的具有0. 5%盤尼西林/鏈霉素(Biosource)的^3FreeStyleTM培養(yǎng)基anvitrogen)，繼續(xù)培養(yǎng)2天。將培養(yǎng)物上清液(IL)加載到經(jīng)PBS洗滌的20ml Q瓊脂糖凝膠柱(GE Healthcare)上，并使用PBS+1M NaCl pH 7. 4進(jìn)行洗脫。將洗脫的部分通過(guò)定制的Iml抗粘結(jié)蛋白mAb柱，使用PBS洗脫并且使用pH為2. 7的0. IM甘氨酸洗脫，且然后通過(guò)DPBS進(jìn)行滲析。將蛋白質(zhì)用SDS-PAGE凝膠進(jìn)行分析，并且濃度根據(jù)在280nm處的理論消光系數(shù)來(lái)確定。對(duì)人類IL-21的小鼠mAb通過(guò)快速的、重復(fù)的免疫策略來(lái)產(chǎn)生。簡(jiǎn)言之，在30_40 天的過(guò)程中，通過(guò)足墊注射IOyg粘結(jié)蛋白-IL-21融合蛋白和Ribi或者CpG(1017ISS， Dynavax)佐劑7-9次，對(duì)6周齡的BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。在觀察到升高的血清滴度時(shí)，在收獲腹股溝和腿彎部的排泄淋巴結(jié)用于與P3x63、Ag8. 653 (ATCC CRL-1580)和/或SP2/ O-Ag 14骨髓細(xì)胞瘤細(xì)胞系進(jìn)行PEG誘導(dǎo)的軀體融合之前，注射10 μ g三天到四天，所述細(xì)胞系適用于降低血清耐受力。通過(guò)直接ELISA，在使用0. 5μ g/ml對(duì)照粘結(jié)蛋白融合蛋白或者0.2yg/ml粘結(jié)蛋白-IL-21對(duì)照包覆的板上，篩查了 1 25稀釋的雜種細(xì)胞上清液。 也使用包覆了山羊抗小鼠IgG從而錨定單克隆抗體的板，以捕獲ELISA的形式來(lái)篩查上清液，并且在Neutravidin-HRP之前，使用0. 0625 μ g/ml的生物素化IL-21進(jìn)行檢測(cè)。得到最強(qiáng)的抗體的雜種細(xì)胞為了生產(chǎn)純抗體而克隆和放大的單個(gè)細(xì)胞。在棋盤形式的ELISA 中檢測(cè)mAb，從而建立能夠檢測(cè)IL-21的對(duì)。所述mAb在2μ g/ml下固定到板上，并隨后用2ng/ml和20pg/ml的IL-21進(jìn)行培育，隨后使用lOOng/ml經(jīng)生物素化的mAb并隨后用 Neutravidin-HRP進(jìn)行檢測(cè)。借助100ng/ml至45pg/ml的IL-21滴定來(lái)在所述ELISA中進(jìn)一步篩選成功配對(duì)的mAb，并且用lOOng/ml經(jīng)生物素化的mAb進(jìn)行檢測(cè)。將在ELISA中最靈敏的抗體連接到珠(Luminex Corporation的將蛋白質(zhì)偶合到羧基化的微球上的兩步碳二亞胺偶合方案，2006年1月)上，并使用從4000pg/ml至lpg/ml的滴定系列的重組人 IL-21，以及來(lái)自⑶4+ T細(xì)胞的上清液進(jìn)行培育，所述⑶4+T細(xì)胞由離子霉素和PMA激發(fā)，并與其含有天然的，人類的IL-21。將用于檢測(cè)的mAb生物素化，并在0.5 μ g/ml下使用。所選擇的mAb對(duì)檢測(cè)分泌自細(xì)胞中的IL-21進(jìn)行轉(zhuǎn)染，所述細(xì)胞由IL-21表達(dá)載體。融合蛋白-IL-21用作標(biāo)準(zhǔn)，其顯著地比來(lái)自兩個(gè)商購(gòu)來(lái)源的IL-21更為強(qiáng)有力。最終的Luminex檢測(cè)對(duì)于lpg/ml至至少4000pg/ml的hIL_21敏感。所述IL-21 對(duì)根據(jù)Upstate Beadlyte Human 26plex multiplex standard進(jìn)行檢測(cè)。任意的分析之間沒(méi)有交叉反應(yīng)性。所述IL-21對(duì)也可以使用Upstate human 22plex進(jìn)行倍增。Giavedoni 等人詳述了 Luminex珠結(jié)合和一般的分析條件(Giavedoni，2005)。在IxlO7珠子對(duì)應(yīng)于 500 μ 1 50mM MES pH 5. 0中有5 μ g mAb的最優(yōu)條件下使用kroMAP珠子(區(qū)洸)。檢測(cè)劑mAb的生物素化使用25X NHS-LC生物素(Pierce)完成，并且在分析中以0. 5 μ g/ml來(lái)貞_。 2 μ g/ml 白勺^5自 Prozyme 白勺 Phycolink Strepavidin R-Phycoerythrin PJ31SM 作報(bào)告物。T和B細(xì)胞的共培養(yǎng)。將經(jīng)活化的⑶4+ T細(xì)胞按照前述地進(jìn)行分類，并且與同源記憶B細(xì)胞GxlO4個(gè)細(xì)胞/各個(gè)孔)在96孔的圓底板中，在ksel培養(yǎng)基/10% FBS 中，在降低腸毒素的SEB(0. 25ng/ml ;Toxin technology, Inc.)的存在下進(jìn)行共培養(yǎng)。在一些實(shí)驗(yàn)中，將抗-IL-2 mAb(PAB956，BIIR)、抗-IL-4 mAb (MP4-25D2，BD)、抗-IL-10mAb (PAB548,BIIR)、抗-IFN-γ mAb (B27，BD Biosciences)、ICOS-L-mlgFc (Ancell)、IgGlFc 或者IL-21R/Fc (兩者都來(lái)自R&D systems)加入到培養(yǎng)物中。在第6或者第14天分析在培養(yǎng)物中產(chǎn)生的IgdgM, IgG和IgA)。Ig ELISA.為了測(cè)量Ig，將培養(yǎng)物上清液在室溫下于96孔滴定板(Nunc) 中培育2小時(shí)，所述滴定板包覆了 5 μ g/ml的山羊抗人IgM，IgG, IgA Ab (全部來(lái)自SouthernBiotech，Inc.) 0洗滌之后，將板在室溫下與堿性磷酸酶鏈接的山羊抗人IgM、IgG或者IgA Ab(最終的稀釋比分別為1/2000、1/2500或者1/2500，全部來(lái)自 SouthernBiotech, Inc.)培育1小時(shí)。隨后，將這些板粗略洗滌之后，使用磷酸對(duì)硝基苯酯(Sigma)進(jìn)行培育。使用3N的NaOH終止反應(yīng)，并使用SpectraMax讀板儀(Molecular Devices)讀取光密度。帶有SEB的PBMC培養(yǎng)基。將經(jīng)純化的新鮮PBMC (2. 5x10s個(gè)細(xì)胞/孔)與 SEB (0. 1 μ g/ml)在96孔板中培養(yǎng)48小時(shí)，其在抗-IL_12p40或IL-12p70mAbs存在或者不存在下進(jìn)行，并且所分泌的細(xì)胞活素通過(guò)Luminex進(jìn)行測(cè)量。⑶4+ T細(xì)胞顯型的分析。為了分析CXCR5+ T細(xì)胞亞種群，將得自自身免疫疾病患者和年齡匹配的健康受試者的新鮮全血樣品使用抗-CXCR5-AleXa 488、CCR6-PE、 CD45RA-ECD、CXCR3-PC5、CCR4-PC7、ICOS-APC、CD3-AF700、CD8-APC H7、CD45RA 太平洋藍(lán)、以及⑶45太平洋橙mAb進(jìn)行染色。細(xì)胞得自FACSAria，并使用FlowJo軟件分析(Tre必tar)。IL-12是B-輔助性T細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵因子。IL-21是T細(xì)胞和NKT細(xì)胞的細(xì)胞活素，其作用于免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞。具體地，IL-21促進(jìn)B細(xì)胞向抗體分泌的血漿細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。圖1顯示了在IL-12存在下引發(fā)的原初的⑶4+T產(chǎn)生大量的IL-21。簡(jiǎn)言之，將原初的⑶4+T細(xì)胞與連接在盤上上抗-⑶Ab，在細(xì)胞活素(lOng/ml，除了 IFN-α 為 500IU/ml)的存在下激發(fā) 7 天。IL-I β，IL-6，IL-10，IL-18，IL-27，TNF-α，并且IFN-α不將⑶4+T細(xì)胞引發(fā)為能分泌IL-21。然而，IL-12促進(jìn)能產(chǎn)生IL-21的CD4+ T 細(xì)胞的發(fā)育。在通過(guò)⑶再次活化時(shí)，使用IL-12引發(fā)的⑶4+ T細(xì)胞能夠分泌納克量的IL-21 (3. 3 士0. 4ng/ml在5xl04個(gè)細(xì)胞/200 μ 1的培養(yǎng)基中，平均值士 s. e. m. η = 5)， 而使用IL-23引發(fā)的僅僅分泌皮克量(40士4pg/ml.平均值士 s. e. m. η = 5)。因此，IL-12 潛在地誘導(dǎo)原初⑶4+ T細(xì)胞產(chǎn)生IL-21。圖2顯示了在IL-12的存在下所引發(fā)的原初⑶4+ T細(xì)胞能夠誘導(dǎo)自體B細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生免疫球蛋白。簡(jiǎn)言之，在第7天時(shí)，對(duì)由抗-⑶mAb在IL-12或者其它的細(xì)胞活素存在下活化的原初CD4+ T細(xì)胞進(jìn)行分類，并且與自體血液IgD+CD27-原初B細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，所述B細(xì)胞使用抗-IgM mAb和CpG(TLR-9配體)進(jìn)行預(yù)活化。將超抗原葡萄球菌腸毒素B(SEB)加入從而誘導(dǎo)T-B相互作用，并且在第14天測(cè)定所分泌的Ig(A，無(wú))。相反地， 使用IL-12引發(fā)的CD4+ T細(xì)胞誘導(dǎo)B細(xì)胞分泌Ig，所述Ig包括IgM、IgG和IgA。與IL-23 引發(fā)的⑶4+ T細(xì)胞共培養(yǎng)的原初B細(xì)胞產(chǎn)生顯著地更低量的Ig。類似地，與使用IL-12引發(fā)的原初⑶4+ T細(xì)胞相比，使用IL-12引發(fā)的原初⑶4+ T細(xì)胞誘導(dǎo)IgD-⑶27+記憶B細(xì)胞顯著更大的量地產(chǎn)生Ig (B)。因此，IL-12誘導(dǎo)⑶4+ T細(xì)胞成為能夠輔助B細(xì)胞的細(xì)胞。圖3顯示了在IL-12的存在下所引發(fā)的⑶4+ T細(xì)胞以依賴于IL-21的方式，將B 細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫球蛋白。簡(jiǎn)言之，將抑制IL-21的功能的可溶的IL-21受體/Fe嵌合蛋白加入到B細(xì)胞和由IL-12引發(fā)的⑶4+ T細(xì)胞的共培養(yǎng)物中。阻斷IL-21顯著地抑制B 細(xì)胞分泌Ig。因此，分泌自IL-12引發(fā)的⑶4+ T細(xì)胞的IL-21在B細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體中起到關(guān)鍵的作用。圖4顯示了經(jīng)活化的DC通過(guò)IL-12誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-21的⑶4+ T細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，將 DC與熱殺死的細(xì)菌培育6小時(shí)，所述細(xì)菌包括大腸桿菌(革蘭氏陰性)、金黃色葡萄球菌 (革蘭氏陽(yáng)性)和牙齦卟啉單胞菌(革蘭氏陰性)，并隨后用異源的CD4+ T細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。 將在第7天分類的經(jīng)活化的⑶4+ T細(xì)胞使用抗-⑶mAb再次激發(fā)對(duì)小時(shí)，從而測(cè)定 IL-21的分泌。與使用未激發(fā)的DC引發(fā)的那些相比，使用細(xì)菌活化的DC引發(fā)的⑶4+ T細(xì)胞分泌更多的IL-21。在DC-T細(xì)胞共培養(yǎng)期間加入的抑制IL-12和IL-23的抗-IL_12p40 阻斷mAb顯著地抑制使用細(xì)菌活化的DC發(fā)展產(chǎn)生IL-21的⑶4+ T細(xì)胞。明顯地，加入單獨(dú)抑制IL-12的抗-IL-12p40阻斷mAb足以顯著地抑制CD4+ T細(xì)胞分泌IL-21 (85士5%抑制， 平均值士 s. e.m.n = 5)。因此，使用感受到細(xì)菌的DC誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-12的⑶4+ T由IL-12 所介導(dǎo)。圖5顯示了阻斷IL-12抑制了能夠輔助B細(xì)胞的T細(xì)胞的發(fā)育。簡(jiǎn)言之，通過(guò)與細(xì)菌所活化的DC培養(yǎng)進(jìn)行活化的CD4+ T細(xì)胞在第7天進(jìn)行分類并與自體記憶B細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。使用細(xì)菌活化的DC引發(fā)的CD4+ T細(xì)胞誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生Ig。當(dāng)在DC-T細(xì)胞共培養(yǎng)期間加入抗_12p40 mAb時(shí)，B細(xì)胞分泌Ig的誘導(dǎo)顯著地受到影響。然而，使用抗-IL-12p70 mAb阻斷IL-12足以抑制B-輔助性⑶4+ T細(xì)胞的發(fā)育。因此，由經(jīng)活化的DC所分泌的 IL-12對(duì)于原初CD4+ T細(xì)胞分化成為B-輔助性T細(xì)胞而言是關(guān)鍵的。IL-12控制IL-21的分泌。圖6顯示了 IL-12通過(guò)記憶⑶4+T細(xì)胞來(lái)控制 IL-21分泌。簡(jiǎn)言之，單核細(xì)胞(PBMC)分離自健康成人的血液樣品中，并使用葡萄球菌腸毒素B(SEB)來(lái)激發(fā)。在培養(yǎng)48小時(shí)后，分析所產(chǎn)生的IL-21的水平。當(dāng)與SEB培養(yǎng) 48 小時(shí)時(shí)，PBMC 產(chǎn)生大量的 IL-21(A. 740士250pg/ml.平均值士s. e. m. η = 7)。在使用抗-IL-12p70mAb的48小時(shí)活化期間，阻斷IL-12導(dǎo)致IL-21分泌的顯著減少 (A&B. 110 士 30pg/ml. η = 7. ρ < 0. 05)。使用抗-IL_12p40mAb 阻斷 IL-12 及 IL-23 將 IL-21 分泌(120士40pg/ml. η = 6)降低到與單獨(dú)阻斷IL-12可比的水平。阻斷IL-12不改變其它的細(xì)胞活素的分泌，所述細(xì)胞活素包括IL-2、IL-5和IL-17(B)。因此，阻礙IL-12特異性地抑制IL-21 and IFN-γ兩者的分泌。因此，IL-12直接地作用于產(chǎn)生IL-21的記憶⑶4+ T細(xì)胞并促進(jìn)IL-21的分泌。在自身免疫疾病的血液中功能性B-輔助性T細(xì)胞的頻率增加。自身抗體關(guān)聯(lián)的自身免疫疾病的實(shí)例皮肌炎(DM)。DM是自身免疫的炎性肌病?；加蠨M的患者顯示出近軸肌肉虛弱以及包括標(biāo)志性的皮膚疹的系統(tǒng)性的炎癥特征。在美國(guó)，JDM的發(fā)病率為每年每百萬(wàn)兒童3. 2人。發(fā)生的平均年齡為7歲，但是25%的患者在發(fā)生時(shí)低于4歲。在美國(guó)，女孩和男孩的比例是2.3 1。 成年人的DM在40到60歲的年齡范圍內(nèi)最為常見(jiàn)，并且在美國(guó)據(jù)觀察100，000人中約有 2人患有此病。⑶4+ T細(xì)胞和B細(xì)胞在DM的炎癥部位顯著地積累(圖7)。許多DM患者顯示出廣譜的自身抗體，因此提出了 B細(xì)胞在DM的病理學(xué)中是關(guān)鍵的。實(shí)際上，最近使用 Rituximab (抗-⑶20 mAb)的兩次實(shí)驗(yàn)顯示B細(xì)胞的除去對(duì)于DM患者是有益的。圖8證明了自身免疫疾病患者，包括青少年型皮肌炎(JDM)患者在與健康的對(duì)照相比時(shí)顯示出偏態(tài)的CXCR5+ T亞集。表達(dá)趨化因子受體CXCR5的血液⑶4+ T細(xì)胞代表了分化用于抗體應(yīng)答的⑶4+ T 細(xì)胞亞集。CXCR5+⑶4+ T細(xì)胞當(dāng)由抗-⑶3 mAb和ICOS激發(fā)時(shí)，分泌大量的IL-21。在 CXCR5+ CD4+ T 細(xì)胞中，鑒定了三種主要的亞群體Thl(C)(CR3+)，Th2(CXCR3-CCR6_)和 Thl7 (CCR6+)細(xì)胞。盡管Th2和Thl7細(xì)胞是有效的B細(xì)胞輔助細(xì)胞，但是Thl細(xì)胞完全不能輔助B細(xì)胞㈧。PBMC的表型分析顯示，系統(tǒng)性關(guān)節(jié)炎(SYS)和JDM患者與年齡相配的健康對(duì)照相比，顯示有較少的CXCR5+Thl (CXCR3+)和更多的CXCR5+Th2 (CXCR3-CCR6-)細(xì)胞(顯示于B 中)。在JDM和SLE (系統(tǒng)性紅斑狼瘡)中，與健康的對(duì)照相比，CXCR5+Thl7 (CXCR3-CCR6+) 細(xì)胞的頻率更高。此外，在JDM中，與其它的自身免疫疾病相比，CXCR5+Th2和Thl7細(xì)胞種群的頻率更高。CXCR5+Th2細(xì)胞種群比SLE中的顯著地更高，并且CXCR5+Thl7細(xì)胞種群比 PSOA (銀屑病關(guān)節(jié)炎)中的更高。明顯的是，顯示出最高的CXCR5+Thl7細(xì)胞的四名JDM患者中的三名是研究的群體當(dāng)中最為病重并且最難治療的(肌肉酶類不斷地升高，CMAS < 40， 并且持續(xù)的皮膚疹)。在JDM中CXCR5+Thl細(xì)胞的頻率顯著地比其它兩種自身免疫疾病中的低。因此，CXCR5+⑶4+T細(xì)胞的亞集在SYS，SLE和JDM中偏向Th2和/或Thl7細(xì)胞，其代表了最有效的B細(xì)胞輔助細(xì)胞。該免疫調(diào)節(jié)失?？梢詫?duì)致病性的自體反應(yīng)B細(xì)胞的產(chǎn)生有貢獻(xiàn)。得自活動(dòng)性的JDM患者的記憶⑶4+T細(xì)胞增加的IL-21的分泌。圖9證明了得自活動(dòng)性的JDM患者的外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞分泌大量的IL-21。簡(jiǎn)言之，從銀屑病關(guān)節(jié)炎(PS0A)、 JDM、SYS和SLE的小兒患者中得到新鮮的PBMC，并使用SEB激發(fā)。在48小時(shí)測(cè)定產(chǎn)生的 IL-21的水平。明顯地，五名患者中有三名顯示出最高的IL-21分泌(在圈中標(biāo)出)是需要給藥于波尼松龍活動(dòng)性的患者當(dāng)中的。因此，當(dāng)活化時(shí)，活動(dòng)性的JDM患者的血細(xì)胞分泌更大量的IL-21。圖10顯示了 IL-12在得自自身免疫疾病患者的PBMC引起IL-21的分泌中也是關(guān)鍵的細(xì)胞活素。簡(jiǎn)言之，將來(lái)自JDM、SYS和SLE患者的PBMC在IL-12中和mAb的存在下使用SEB進(jìn)行激發(fā)，并分析所分泌的IL-21的水平。在來(lái)自所有測(cè)試的自身免疫疾病的PBMC 培養(yǎng)基中，IL-21顯著地被IL-12的阻斷所抑制(JDM :n = 20，ρ = 0. 0027 ；SYS :n = 7，ρ =0. 015 ；SLE :n = 15,ρ = 0. 002.成對(duì)的t_檢驗(yàn))，這與健康成人的樣品中所得到的發(fā)現(xiàn)一致。因此，在自身免疫疾病包括JDM、SYS和SLE中，IL-12在⑶4+ T細(xì)胞分泌IL-21的引發(fā)中起到重要的作用。預(yù)期的是，本說(shuō)明書(shū)中所討論的任何實(shí)施方案可以由關(guān)于本發(fā)明的任何方法、試劑盒、試劑或組合物來(lái)實(shí)施，反之亦然。此外，本發(fā)明的組合物可以用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。要理解的是，本文所述的具體實(shí)施方案是通過(guò)闡釋而不是限制本發(fā)明的方法來(lái)展示的。本發(fā)明的主要特征可以在不脫離本發(fā)明范圍的情況下用于各種實(shí)施方案中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，或者僅僅利用例行的實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虼_定，本文所述具體步驟的許多等同物。 這樣的等同物被認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍內(nèi)，且被權(quán)利要求所涵蓋。本說(shuō)明書(shū)中提到的所有出版物和專利申請(qǐng)指示了本發(fā)明所涉及領(lǐng)域的技術(shù)人員的水平。所有的出版物和專利申請(qǐng)均引入本文作為參考，其引入的程度如同各個(gè)獨(dú)立的出版物或?qū)＠暾?qǐng)具體并獨(dú)立地被指明引入作為參考。
詞語(yǔ)“一個(gè)”或“一種”當(dāng)與權(quán)利要求和/或說(shuō)明書(shū)中的術(shù)語(yǔ)“包含”結(jié)合使用時(shí)， 可以指“一種”，但其也與“一種或多種”、“至少一種”和“一種或多于一種”的意思相一致。 在權(quán)利要求中所使用的術(shù)語(yǔ)“或者”是指“和/或”，除非明確指明僅僅是指供選擇物，或供選擇物為相互排斥的，盡管公開(kāi)內(nèi)容支持僅僅指供選擇物及“和/或”的定義。在整個(gè)本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)“大約”用來(lái)說(shuō)明這樣的值，其包括裝置和用來(lái)測(cè)定所述值的方法的誤差的固有變化，或者研究受試者之間存在的變化。如在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中所使用的，詞語(yǔ)“包含”(以及任何形式的“包含”)， “具有”(以及任何形式的“具有”)，“包括”(以及任何形式的“包括”)或“含有”(以及任何形式的“含有”)是包括的或開(kāi)放式的，且不排除額外的，未述及的元素或方法步驟。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“或其組合”是指在該術(shù)語(yǔ)之前所列舉項(xiàng)目的全部排列和組合。 例如，“A、B、C或其組合”意在包括A、B、C、AB、AC、BC或ABC中的至少一種，并且如果在特定的上下文中順序是重要的，那么還包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。繼續(xù)這個(gè)例子，明顯包括的是包含一種或多種項(xiàng)目或術(shù)語(yǔ)重復(fù)的組合，如BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、 CBBAAA、CABABB等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，通常對(duì)任何組合中的項(xiàng)目或術(shù)語(yǔ)的數(shù)目沒(méi)有限制，除非從上下文中另外是明顯的。 根據(jù)本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容，在沒(méi)有不適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)下可以制備和實(shí)施本文所公開(kāi)和要求保護(hù)的全部組合物和/或方法。盡管已就優(yōu)選的實(shí)施方案描述了本發(fā)明的組合物和方法，但是對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)明顯的是，在不脫離本發(fā)明的概念、精神和范圍的情況下，可以改變本文所述的組合物和/或方法以及方法的步驟或方法的步驟的順序。所有這樣相似的對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言明顯的取代和修飾被認(rèn)為是在附加的權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神、范圍和概念內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于治療自身免疫障礙的方法，所述方法包括向患有自身免疫障礙的受試者給藥有效量的治療組合物，所述治療組合物包括足以阻斷B-輔助性T細(xì)胞活性的量的IL-12 抑制劑。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述IL-12抑制劑包含至少一種抗-IL-12阻斷抗體或者其片段。
3.權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括藥學(xué)上可接受的載體。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述IL-12抑制劑包含以每劑1至1，OOOmg劑量給藥的IL-12抑制性抗體。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述IL-12抑制劑包含IL-12抑制性抗體，并且所述受試者接受重復(fù)劑量的所述抗體。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述IL-12抑制劑包括選自類人靈長(zhǎng)類抗體、鼠單克隆抗體、嵌合抗體、人化的抗體和人類抗體的抗-IL-12抗體。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述IL-12抑制劑包括IL-12的RNAi、siRNA或者其它核酸抑制劑。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述自身免疫疾病選自急性先天血小板減少性紫癜、 慢性先天血小板減少性紫癜、皮肌炎、西德哈姆舞蹈病、重癥肌無(wú)力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡腎炎、風(fēng)濕熱、多腺性綜合征、大皰性類天皰瘡、糖尿病癥、亨-舍紫癜、鏈球菌感染后腎炎、 結(jié)節(jié)性紅斑、高安氏動(dòng)脈炎、阿狄森氏病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、肉狀瘤病、潰瘍性結(jié)腸炎、多形性紅斑、IgA腎病、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、強(qiáng)直性脊椎炎、肺出血腎炎綜合征、閉塞性血栓血管炎、舍格倫綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬化、橋本甲狀腺炎、甲狀腺功能亢進(jìn)、硬皮病、慢性活動(dòng)型肝炎、多肌炎/皮肌炎、多軟骨炎、慢性天皰瘡、韋氏肉芽腫病、膜性腎病、肌萎縮、脊髓癆、巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎/多肌痛、惡性貧血、急進(jìn)性腎小球腎炎和纖維性肺泡炎。
9.權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括分開(kāi)地給藥第二治療劑，所述第二治療劑針對(duì)T-細(xì)胞、B-細(xì)胞、血漿細(xì)胞或者巨噬細(xì)胞或者炎性細(xì)胞因子。
10.一種增強(qiáng)針對(duì)抗原的抗原特異性B細(xì)胞應(yīng)答的方法，所述方法包括分離原初⑶4+ T細(xì)胞；以及在加載了抗原的樹(shù)突細(xì)胞以及有效量的IL-12的存在下使原初CD4+ T細(xì)胞成熟，所述有效量的IL-12足以使B-輔助性T細(xì)胞發(fā)育和活化，其中經(jīng)IL-12處理的B-輔助性T細(xì)胞分泌納摩爾量的IL-21。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述原初CD4+T細(xì)胞通過(guò)負(fù)選擇來(lái)從外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞中分離。
12.權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述原初CD4+T細(xì)胞通過(guò)使用負(fù)選擇而得自外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞，所述負(fù)選擇使用對(duì)⑶8的抗體以及一種或者多種對(duì)⑶lib、⑶11c、⑶14、 CD15、CD16、CD19、CD45R0、CD56 和 HLA-DR 的抗體。
13.權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述抗原選自病毒、細(xì)菌、真菌、癌或者毒素。
14.一種調(diào)節(jié)自身免疫疾病的方法，所述方法包括辨別出懷疑需要治療自身免疫障礙的患者，所述自身免疫障礙由B細(xì)胞分泌自身免疫抗體而引起；以及使用足以抑制⑶4+ B-輔助性T細(xì)胞的量的抗-IL-12抑制劑來(lái)治療患者。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述抗-IL-12抑制劑包括抗-IL-12p40mAb、 抗-IL-12p70 mAb、抗IL-12受體、可溶的非活性IL-12及其組合。
16.權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述抗-IL-12抑制劑包括IL-12受體拮抗劑。
17.權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述CD4+B-輔助性T細(xì)胞通過(guò)負(fù)選擇來(lái)進(jìn)行選擇。
18.權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述CD4+B-輔助性T細(xì)胞通過(guò)負(fù)選擇得自外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞，所述負(fù)選擇使用對(duì)⑶8的抗體以及一種或者多種對(duì)⑶lib、⑶11c、⑶14、⑶15、 CD16、CD19、CD45R0、CD56 和 HLA-DR 的抗體。
19.權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述CD4+B-輔助性T細(xì)胞在經(jīng)活化的樹(shù)突細(xì)胞存在下進(jìn)行活化。
20.權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述自身免疫疾病選自系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮肌炎、 青少年型皮肌炎、關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性關(guān)節(jié)炎和銀屑病關(guān)節(jié)炎。
21.權(quán)利要求14所述的方法，其中，將所述IL-12抑制劑在自身免疫抗體產(chǎn)生之前，提供給懷疑易患自身免疫疾病的患者。
22.一種通過(guò)以下方法制備的B細(xì)胞輔助性T細(xì)胞，所述方法包括分離原初⑶4+ T細(xì)胞；以及在經(jīng)活化的樹(shù)突細(xì)胞存在下使原初CD4 T細(xì)胞成熟，所述經(jīng)活化的樹(shù)突細(xì)胞在IL-12 的存在下表達(dá)靶抗原，其中成熟CD4+ B-輔助性T細(xì)胞在應(yīng)答抗原中釋放納摩爾的量的 IL-21。
23.—種調(diào)節(jié)B細(xì)胞增殖、成熟和活化使之成為球蛋白分泌細(xì)胞的方法，所述方法通過(guò)將分泌IL-21的B-輔助性T細(xì)胞暴露于包含IL-12抑制劑的組合物中。
24.權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述IL-12抑制劑借助CD4+B-輔助性T細(xì)胞來(lái)減少IL-21和IFL-Y的分泌。
25.一種富集B-輔助性T細(xì)胞的方法，所述方法包括將原初CD4 T細(xì)胞在足以引發(fā)納摩爾量的IL-21釋放的IL-12的量的存在下進(jìn)行培育。
全文摘要
本發(fā)明包括用于治療自身免疫疾病的組合物和方法，所述治療通過(guò)向患有自身免疫性障礙的受試者給藥有效量的治療組合物，所述組合物包括藥學(xué)上可接受的載體和至少一種IL-12抑制劑，所述IL-12抑制劑如阻斷抗-IL-12抗體或者其片段。
文檔編號(hào)A61P37/00GK102245205SQ200980147510
公開(kāi)日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2009年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月30日
發(fā)明者J·F·班徹羅, M·V·帕索, N·史密特, 上野英樹(shù) 申請(qǐng)人:貝勒研究院