Wnt組合物及其使用方法
【專利摘要】提供了Wnt組合物和它們的使用方法。本發(fā)明的組合物包含具有期望的生物活性的wnt多肽片段，此類片段在本文中被稱為“小型wnt”。這些組合物和方法在下述方面特別有用：確定與Wnt受體的結(jié)合；抑制表達Wnt受體的細胞內(nèi)的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；將功能部分遞送至表達Wnt受體的細胞；和用作制備Wnt-特異性抗體的免疫原。
【專利說明】WNT組合物及其使用方法
[0001]發(fā)明背景
[0002]Wnt蛋白構(gòu)成了高度保守的分泌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子家族，其調(diào)控胚胎發(fā)生期間的細胞與細胞相互作用。fct基因和Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)還與癌癥相關(guān)。Wnt糖蛋白被認為在多種原初細胞類型中作為有活性的旁分泌或自分泌信號起作用。
[0003]Wnt生長因子家族包括小鼠和人中鑒定的多于19種基因。Wnt-I原癌基因（int_l)最初從乳腺腫瘤中鑒定到，該乳腺瘤由小鼠乳瘤病毒（MMTV)誘發(fā)，由于病毒DNA序列的插入引起（Nusse and Varmus (1982) Cell31:99-109)。Wnt蛋白的表達存在差異,但經(jīng)常與發(fā)育過程相關(guān)，例如在胚胎和胎兒組織中。fct可能在局部細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起作用。生化研究表明，可以發(fā)現(xiàn)許多分泌fct蛋白與細胞表面或細胞外基質(zhì)相關(guān)，而非在媒介中自由擴散。
[0004]對Wnt活動機制的深入了解來自多個系統(tǒng)：果蠅（Drosophila)和秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)遺傳學(xué)；非洲爪蟾（Xenopus)胚胎的細胞培養(yǎng)和異位基因表達生物化學(xué)。已經(jīng)突變了小鼠的許多fct基因，導(dǎo)致非常特定的發(fā)育缺陷。根據(jù)當前所了解，Wnt蛋白在細胞表面上結(jié)合到卷曲蛋白（Frizzled)家族受體、ROR家族受體和LRP5受體、LRP6受體和FRLl受體上。在典型Wnt/β連環(huán)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，Wnt結(jié)合到卷曲蛋白受體上導(dǎo)致β連環(huán)蛋白的細胞核定位，其接著與TCF絡(luò)合以激活Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄。
[0005]Wnt基因的突變研究表明了 Wnt在生長調(diào)控和組織模式形成中的作用。在果蠅中，無翅基因（wg)編碼Wnt基因，且wg突變改變了胚胎外胚層、神經(jīng)發(fā)生和成蟲盤增生的模式。在秀麗隱桿線蟲中，lin-44編碼Wnt，其為不對稱細胞分化所必需。小鼠內(nèi)的敲除突變顯示fct為腦發(fā)育所必需，以及腎臟、尾芽和肢芽的胚胎原基增生所必需。乳腺內(nèi)Wnt的過度表達可能導(dǎo)致乳腺增生癥 和過早的齒槽發(fā)育。因此，fct信號轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及眾多動物發(fā)育事件，包括干細胞增殖和神經(jīng)嵴的特化。因此fct蛋白為用于擴展特定的細胞類型及治療體內(nèi)病癥的潛在重要藥劑。
[0006]數(shù)據(jù)表明在天然形式下，具有生物活性的Wnt需要在蛋白的保守半胱氨酸上進行棕櫚?；瑓⒁?，尤其是，Willert et al. (2003)Nature423:448-452 和 Nusse (2005)cell Research 15:28-32。此類脂質(zhì)基團降低了 Wnt蛋白的水溶性。因此，迄今為止，用于分離生物有效濃度的有活性的天然和重組fct的方法，需要使用洗滌劑或脂質(zhì)體（參見Willert et al.,同前，Zhao et al. (2009) Methods Enzymol. 465:331-347 和 Morrell etal. (2008) PLoS One 3(8) :e2930)o由于注射此類化學(xué)物到動物體內(nèi)的問題，為了溶解Wnt而對此類化學(xué)試劑的需要限制了其藥學(xué)應(yīng)用。因此研制具有藥學(xué)活性的水溶性wnt組合物引起人們很大的興趣。
[0007]出版物
[0008]可溶性無翅基因蛋白的生物活性描述在van Leeuwen et al. (1994)Nature24:368(6469) :342-4中。采用可溶的、具有生物活性的脊椎動物Wnt蛋白的Wnt-卷曲蛋白相互作用的生物化學(xué)特征由Hsieh et al. (1999)Proc Natl Acad Sci USA96(7) :3546-51 描述。Bradley et al. (1995)Mol Cell Biol 15(8) :4616-22 描述了具有致有絲分裂活性的wnt蛋白的可溶性形式。Hoppler et al. (1996)Genes andDev. 10:2805-2817描述了顯性失活的Wnt多肽，其為截短的Wnt (截短的Xwnt_8和截短的小鼠 Wnt-I)。Couso 和 Martinez-Arias (1994) Cell 79(2) :259-72 描述了 Dwnt-I 的突變等位基因，其編碼具有大量羧基末端缺失的具有反效等位基因效應(yīng)的分泌蛋白。其它顯性失活的fct多肽和其使用方法描述在W02010/078458中。
[0009]Willert et al. (2003)Nature 423:448-452 描述了借助洗漆劑純化 Wnt 蛋白的方法。Morrell et al. (2008)PLoS 0ne3 (8) : e2930描述了將Wnt蛋白構(gòu)建到脂質(zhì)體內(nèi)，以及包裹在脂質(zhì)體內(nèi)的Wnt如何保持體內(nèi)生物活性。專利公開包括美國專利號7，335，643和7，153，832和已公開的美國專利申請20080226707。
[0010]發(fā)明概述
[0011]提供了 Wnt組合物以及它們的使用方法。本發(fā)明的組合物包括具有期望的生物活性的wnt多肽片段,該片段在本文稱為“小型wnt”。感興趣的小型wnt多肽包括天然wnt蛋白和其衍生物的片段，例如，包括能提高目標性質(zhì)的相對于天然序列的一個或多個氨基酸改變的類似物，所述性質(zhì)例如溶解性、對目標受體的親和力或特異性。所述片段，尤其是WntC末端的片段，可能是水溶性的。感興趣的組合物包括，但不限于，配制于藥學(xué)上可接受的賦形劑中的有效劑量的小型wnt多肽。組合物可以包括其它試劑，例如，佐劑等。小型wnt多肽可以通過合成方式產(chǎn)生，通過本領(lǐng)域已知的各種合適的重組方法等。
[0012]這些組合物和方法在抑制表達Wnt受體的細胞內(nèi)的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如，用于抑制異常的細胞增殖；將功能部分（functional moiety),如治療或成像部分,遞送至表達Wnt受體的細胞；以及用作制備fct特異性抗體的免疫原中特別有用。通常小型wnt能結(jié)合Wnt共受體對的一個而非兩個。
[0013]在一些實施方案中，小型wnt為C末端（C-terminal)或“C末端（Cterm) ”小型wnt,其中C末端小型wnt為包含wnt多肽的羧基末端結(jié)構(gòu)域或由wnt多肽的羧基末端結(jié)構(gòu)域組成，且不包括氨基末端結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基的多肽。本文中以多個人fct蛋白為示例描述羧基末端結(jié)構(gòu)域，例如，如圖6中所示。還可以通過與本文中提供的序列比對而通過經(jīng)驗鑒定fct羧基末端結(jié)構(gòu)域。在一個實例中，C末端小型wnt氨基酸序列通過保守殘基與人Wntl的298-370位對齊，且缺少與人Wntl的1-257位殘基對齊的氨基酸序列。C末端小型wnt通常為水溶性的。
[0014]在其它實施方案中，小型wnt為N末端（N-terminal)或“N末端（Nterm) ”小型wnt,其中N末端小型wnt為包含wnt多肽的氨基末端結(jié)構(gòu)域或由wnt多肽的氨基末端結(jié)構(gòu)域組成，且不包括羧基末端結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基的多肽。本文中以多個人fct蛋白為示例描述氨基末端結(jié)構(gòu)域，例如，如圖8中所示。還可以通過與本文中提供的序列比對而通過經(jīng)驗鑒定fct氨基末端結(jié)構(gòu)域。在一個實例中，N末端小型wnt氨基酸序列通過保守的殘基與人Wntl的34-247位對齊，且缺少與對應(yīng)于人Wntl的288-370位殘基的殘基對齊的氨基酸序列。N末端小型wnt可以為水溶性的或者可以為脂溶性的。
[0015]在一些實施方案中，小型wnt多肽與功能部分融合或綴合，功能部分可以為治療性部分，例如細胞毒性部分，或?qū)⒓毎ㄏ驗锳DCC或CDC指導(dǎo)的細胞死亡的部分。感興趣的治療性部分包括能改變細胞活性的部分。在一些實施方案中，功能部分為成像部分，例如，熒光團、發(fā)光體、放射性同位素等。在一些實施方案中，功能部分為低聚化部分，其能通過例如使用拉鏈或Fe多肽，或其它增強親和力的化學(xué)或蛋白試劑而誘導(dǎo)小型wnt低聚化為同二聚物、同三聚物、同四聚物或更大的同聚物，或異二聚物，異三聚物、異四聚物或更大的異聚物。在一些實施方案中，功能部分為能延長小型wnt多肽的半衰期和/或增加小型wnt多肽的尺寸的蛋白或化學(xué)部分。
[0016]在本發(fā)明的一些方面，提供了將功能部分遞送至細胞的方法，包括使包含感興趣的功能部分的小型wnt與表達Wnt受體的目標細胞接觸。在其它實施方案中，提供了抑制細胞內(nèi)Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法。在此類方法中，使一定濃度的小型wnt多肽與表達Wnt的受體細胞接觸，其中所述濃度的多肽可以有效抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如，相比不存在小型wnt時的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)減少25%、50%、75%、90%、95%或者更多。此類信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制可以抑制靶細胞的增殖，或者可以干擾靶細胞內(nèi)有活性的fct信號通路。
[0017]在本發(fā)明的方法中，如果Wnt受體為Fz蛋白、ROR蛋白或Ryk蛋白，小型wnt多肽通常為C末端小型wnt。如果Wnt受體為LRP5、LRP6或FRLl/crypto，小型wnt多肽通常為N末端小型wnt。在一些方法中，表達受體的細胞在體外接觸。在其它實施方案中，表達受體的細胞在體內(nèi)接觸。如本領(lǐng)域所了解，目標細胞包括多種表達Wnt受體的細胞。
[0018]提供了制備Wnt特異性抗體的方法，該方法包括使用有效劑量的C末端或N末端小型wnt多肽免疫動物，任選地，使用佐劑配制所述小型wnt多肽。可以從血清獲得多克隆抗體，或者可以將來源于動物的細胞用于制備單克隆抗體，作為用于產(chǎn)生重組制備的抗體等的多核苷酸來源。
[0019]提供了確定Wnt蛋白的同源受體的方法，該方法包括使對應(yīng)于目標fct蛋白的小型wnt多肽與候選Wnt受體或其片段接觸；以及確定所述小型wnt與所述候選受體的結(jié)合，其中特異性結(jié)合的存在表明所述Wnt蛋白為所述候選受體的配體。目標受體包括Fz蛋白、ROR蛋白或Ryk蛋白，其可以與C末端小型wnt接觸；和LRP5、LRP6或FRLl/crypto，其可以與N末端小型wnt接觸?？?使用多種結(jié)合測定,例如利用表達候選受體的細胞，但特別感興趣的是能在溶液中進行的測定，例如，利用所述受體的可溶片段用于結(jié)合，包括但不限于Fz-CRD多肽和水溶性C末端小型wnt多肽之間的相互作用。
[0020]本發(fā)明的組合物和方法的優(yōu)點是靶向特異性，其中小型wnt與其源自的天然wnt蛋白革巴向相同的細胞。例如，小型wnt選擇性抑制能響應(yīng)于Wnt母體蛋白的細胞內(nèi)的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。本領(lǐng)域已知的fct信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑，例如，能結(jié)合特定Wnt受體的抗體，不會結(jié)合Wnt母體靶向的所有Wnt受體，而僅能結(jié)合它們對之具有特異性的Wnt受體。此外，水溶性形式的小型wnt的優(yōu)點是不需要可能限制它們的治療應(yīng)用的配制添加劑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]結(jié)合附圖可從下述詳細描述最好地理解本發(fā)明。本專利或申請文件包含至少一張以彩色制作的繪圖。本專利或?qū)＠暾埞_的彩圖復(fù)印件經(jīng)要求將由官方提供并需要支付必要的費用。需要強調(diào)，根據(jù)慣例所述繪圖的各種特征不按比例。相反，為清楚起見，所述各種特征的維度被隨意放大或減小。說明書附圖中包括以下附圖。
[0022]圖I.可溶性非洲爪蟾WntS ( "XwntS")的演化。圖A (左側(cè)）顯示了在酵母表面表達的Wnt分子的示意圖（cartoon)。Wnt分子攜帶引起該分子的水溶性的多個突變（星形）。連接到fct的C末端的為“Myc”標簽，其在本該實驗中用于使用Myc的抗體檢測表達的Wnt。圖A(右側(cè)）中還顯示了 Wnt受體卷曲蛋白（此種情況下為Fz5)的Wnt結(jié)合結(jié)構(gòu)域的示意圖。該結(jié)構(gòu)域被稱為“CRD”。所述CRD的示意圖顯示4個CRD分子，其排列結(jié)合到四價的鏈霉親和素分子上(中央的十字形示意圖)，其中所述鏈霉親和分子連接到用于可視化的熒光染料。在圖B中，顯示了包含生物素的Fz5CRD，生物素被添加到其C末端，以便其能結(jié)合鏈霉親和素。這顯示在SDS-PAGE凝膠中，其中Fz5CRD向上“轉(zhuǎn)移”結(jié)合到凝膠中的鏈霉親和素上。這一 “轉(zhuǎn)移”顯示生物素存在于Fz5和Fz8CRD上。圖C顯示了細分為N末端(紫色底紋)小型fct、連接子(綠色底紋)和C末端小型Wnt (紅色底紋)的全長非洲爪蟾fct8的序列。指示B7、A12、B2和A3的塊狀紅色箭頭表明小型wnt的不同序列邊界。每個小型fct的實際邊界是可變的(見圖6)，且可以延伸多個殘基到連接子中。
[0023]圖2.各個A克隆的驗證。對于每一個克隆,與Wnt C末端抗原表位結(jié)合的抗myc抗體顯示在圖1中，與酵母展示的XWnt8結(jié)合的Fz5和Fz8CRD顯示在頂部FACS圖中。在棕色塊狀箭頭連接的下方伴隨圖中，顯示當使用3C蛋白酶將Wnt從酵母上切掉時，喪失了抗Myc和Fz5/Fz8-CRD的結(jié)合。由于酵母展示的Wnt在Wnt和酵母間含有3C蛋白酶切割位點，因此與Myc和Fz-CRD結(jié)合的喪失表明與所展示的Wnt存在特異性相互作用，而不是以非特異性方式與酵母的相互作用。以這種方式，通過切割而喪失結(jié)合為非常嚴謹?shù)慕Y(jié)合特異性測試。㈧克隆wntA3的驗證。使用了 AGA2-連接子-3C位點-GS-AWSAPDYCLKNISLGLQGTEGRECLQSGKNLSQWERRSCKRLCTDCGLRVEEKKTEIISSCNCKFHWCCTVKCEQCKQVVIEHFCAGSSGGEQKLISEEDLLEf*構(gòu)建體。(B)克隆wntA12的驗證。使用了 AGA2-連接子-3C位點-GS-AWSVNNFLEDSPDHCLKNISLGLQGTEGRECLQSGKNLSQWERRSCKRLCTDCGLRVEEKKTEIISSCNCKFHWCCTVKCEQCKQVVIKYFCAGSSGGEQKLISEEDLLEI** 構(gòu)建體。
[0024]圖3.各個B克隆的驗證。對于每個克隆,與Wnt C末端抗原表位結(jié)合的抗myc抗體顯示在圖1中，與酵母展示的XWnt8結(jié)合的Fz5和Fz8CRD顯示在頂部FACS圖中。在棕色塊狀箭頭連接的下方伴隨圖中，顯示當使用3C蛋白酶將Wnt從酵母切掉時，喪失了抗-Myc和Fz5/Fz8-CRD的結(jié)合。由于酵母展示的Wnt在Wnt和酵母間含有3C蛋白酶切割位點，因此與Myc和Fz-CRD結(jié)合的喪失表明與所展示的Wnt存在特異性相互作用，而不是以非特異性方式與酵母的相互作用。以這種方式，通過切割喪失結(jié)合為非常嚴謹?shù)慕Y(jié)合特異性測試。(A)克隆 wnt B2 的驗證。使用了 AGA2 -連接子-3C 位點-GS-NGKAMQGVFEYYKSVTFVSNCGSHPSTTSKGSPINTQYVFKDNSSTIEGRYPYDVPDYALQASGGGGSVLEDLPDYCLKNISLGLQGTEGRECLQSGKNLSQWERRSCKRLCTDCGLHVEEKKIEIISSCNCKFHWCCTVKCEQCKQVVVKHFCAGSSGGEQKLISEEDLLEI** 構(gòu)建體。(B)克隆wnt B7的驗證。使用了 AGA2-連接子-3C位點-GS-AWSVNNELIFLEDSPDYCLKNISLGLQGTEGRECLQSGKNLSQWERRSCKRLCTDCGLRVEERKTEIISSCNCKFHWCCTVKCEQCKQVVIKHFCAGSSGGEQKLISEEDLLEI** 構(gòu)建體。
[0025]圖4.重組體的生產(chǎn)，來自桿狀病毒感染的昆蟲細胞的水溶性C末端小型Wnt8結(jié)構(gòu)域，以及與Fz5CRD的相互作用的演示。在步驟I中，由昆蟲細胞表達小型Xwnt8的B7邊界形式，帶有C末端六聚組氨酸標簽(tag)(上方，最左邊示意圖)。在步驟2中，接著通過superdex-75凝膠過濾層析(以及伴隨使用考馬斯亮藍染色的SDS-凝膠)純化該蛋白，其中顯示其從柱子中洗脫，在表示具有正確麗的適當折疊蛋白的位置為小型fct。在步驟3中，接著將該小型Wnt8添加到Fz5-CRD-Fc融合物中，在步驟4中，通過凝膠過濾再分析。通過SuperdeX75柱對所述混合物分級分離，然后進行非還原性聚丙烯酰胺凝膠電泳，證明了 C末端小型wnt8和Fz5CRD-Fc融合物存在于相同的級分(fraction)中，其中在缺少Fz5CRD-Fc時，C末端小型wnt8在更早的級分中洗脫。在步驟5中，F(xiàn)z5CRD_Fc融合物與蛋白A的Fz免疫沉淀反應(yīng)也使C末端小型wnt8蛋白沉淀。因此以兩種方式證實了小型XWntS和Fz5-CRD間的特異性結(jié)合相互作用的形成:步驟4 -使用凝膠過濾共洗脫，和步驟
5-免疫共沉淀。
[0026]圖5.通過表面等離子體共振(Biacore)測量mFZ8/5_CRD的小型XWnt8 (氨基酸殘基248 - 338)的結(jié)合親和力。Fz8-CRD或mFz5CRD通過C末端生物素連到包被了鏈霉親和素的CM4Biacore芯片上。數(shù)據(jù)證明了純化的昆蟲表達的小型XWnt8C末端片段與Fz5 CRD和Fz8 CRD的直接相互作用。在圖的底部，顯示了原始的擬合曲線數(shù)據(jù)和結(jié)果。
[0027]圖6.人Wnt的C末端結(jié)構(gòu)域與來自非洲爪蟾(Xenopus Iaevis)的Wnt8 (ΝΜ_001088168)和來自黑腹果妮(Drosophila melanogaster)的 Wnt5 ( “Drome”)的C末端結(jié)構(gòu)域的比對。
[0028]圖7.LRP6細胞外結(jié)構(gòu)域和XWnt8的N末端小型Wnt及其突變體之間的相互作用。(a)XWnt8的野生型N末端小型wnt和LRP6之間的相互作用。(b)來源于易錯酵母文庫的XWnt8的N末端小型wnt的克隆和LRP6之間的相互作用。通過使用抗c_myc (直方圖；c-myc抗體:1:250 一抗,1:100 二抗)的FACS分析克隆，以驗證表面展示，并使用LRP6(E1E2)-Fc (點陣圖；LRP6 (E1E2)-Fe:2μΜ, 1:25 二抗)以證明所述結(jié)構(gòu)域結(jié)合 LRP6。直方圖中設(shè)門的結(jié)構(gòu)域(gated domain)中的峰值表明了 c_myc的陽性信號，因此表明N末端小型wnt-8的存在。點陣圖的右下象限中的群體表明了 LRP6的陽性信號。注意所有(b)中的克隆與產(chǎn)生于野生型N末端小型wnt的(a)中的克隆都具有相當?shù)腇ACS點。在一些克隆中，Cys55Ala或Serl87Ala突變在制備文庫前合并到母體XWnt8 cDNA中，以確保所述多肽不會因棕櫚酸脂質(zhì)基團的添加而改變。此類突變位點是基于已發(fā)表的文獻選擇的，所述文獻將Wnt3A中55和187的類似位置指定為棕櫚?；稽c(見，例如，Willert etal.(2003)同上)。還提供了 XWntS N末端結(jié)構(gòu)域的非突變野生型染色，其也證明了 Lrp6的大量結(jié)合。因此，這些數(shù)據(jù)證明了水溶性N末端小型Wnt結(jié)合LRP6。
[0029]圖8.人Wnt的N末端結(jié)構(gòu)域與非洲爪蟾Wnt8和黑腹果蠅Wnt5 ( “Drome” )的N末端結(jié)構(gòu)域的比對。
[0030]發(fā)明詳述
[0031]在描述本發(fā)明方法和組合物之前，應(yīng)當理解本發(fā)明不限于所描述的具體方法或組合物，因為其當然可以發(fā)生變化。同樣也應(yīng)當理解本文中使用的術(shù)語目的僅僅是為了描述具體實施方案，且并非旨在限制，因為本發(fā)明的范圍僅由所附權(quán)利要求所定義。
[0032]如果提供了數(shù)值范圍，除非上下文另有明確說明，應(yīng)當理解，該范圍的上限和下限之間，精確到下限的單位的十分之一的每個中間值也被具體地公開。在表述的值范圍內(nèi)任何表述的值或中間值間與該表述的范圍內(nèi)的任何其它表述的值或中間值之間的每個更小范圍都包括在本發(fā)明中。此類更小范圍的上限和下限可能獨立地包括于或排除于該范圍，且如果端值的兩者之一、兩者都不或兩者包括在所述更小范圍內(nèi)，其每一個范圍也包括在本發(fā)明中，這受到所表述的范圍中的任何特定排除的閾值的限制。如果所表述的范圍包括所述端值的一個或兩個，排除那些包括在內(nèi)的端值的兩者之一或兩者的范圍也包括在本發(fā)明中。
[0033]除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。盡管可以將與本文中描述的方法和材料類似或等同的任何方法和材料用于本發(fā)明的實踐或測試，現(xiàn)在描述一些可能和優(yōu)選的方法和材料。將本文中提及的所有出版物通過引用并入本文中，以公開和描述與所述出版物引用的方法和/或材料有關(guān)的方法和/或材料。應(yīng)當理解，本公開取代所并入的出版物的任何公開，出現(xiàn)矛盾除外。
[0034]必須注意，如本文和所附權(quán)利要求中所用，除非上下文另有明確說明，單數(shù)形式"a/an"和"the〃包括復(fù)數(shù)對象。因此，例如，提及〃細胞〃包括多個這樣的細胞，提及"所述肽"包括提及一個或多個肽及其等同物，例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的多肽等。
[0035]提供本文中所討論的出版物僅僅是因為它們的公開早于本申請的申請日。本文中沒有任何可以被理解為承認本發(fā)明不具備作為在先發(fā)明而早于此類出版物的資格。此外，提供的出版物的日期可能與真實出版日期不同，這可能需要進行獨立確證。
[0036]定義
[0037]提供了小型wnt組合物和它們的使用方法。此類組合物和方法在抑制表達fct受體的細胞內(nèi)的fct信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如，用于抑制異常的細胞增殖；將治療性部分遞送至表達Wnt受體的細胞；將成像部分遞送至表達Wnt受體的細胞；和用于制備fct特異性抗體中特別有用。通過閱讀如下更完整描述的組合物和方法的細節(jié)，本發(fā)明的此類和其它目的、優(yōu)勢和特征將對本領(lǐng)域技術(shù)人員變得明顯。
[0038]“Wnt蛋白”為高度保守的分泌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子家族的成員，在胚胎形成和成熟組織中都具有關(guān)鍵作用。術(shù)語"fct"或"Wnt基因產(chǎn)物"或"Wnt多肽"在本文中使用時包括天然序列fct多肽、Wnt多肽變體、Wnt多肽片段和嵌合Wnt多肽。“小型wnt多肽”為這樣的多肽，其為全長fct蛋白的片段，保留了其所源自的全長Wnt蛋白特異性結(jié)合一種或多種Wnt受體的能力。所述小型wnt與Wnt受體的結(jié)合可能具有顯性負效應(yīng),抑制從Wnt受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0039]術(shù)語"天然序列Wnt多肽"指的是包括在天然條件下發(fā)現(xiàn)的序列的Wnt多肽。例如，本申請中的目標人天然序列fct蛋白包括下述:Wnt-l (GenBank登錄號NM_005430)；ffnt-2 (GenBank 登錄號 NM_003391) ；ffnt-2B (ffnt-13) (GenBank 登錄號 NM_004185 (同種型 I)，NM_024494.2 (同種型 2))，ffnt-3 (Ref Seq.:NM_030753)，Wnt3a (GenBank 登錄號NM_033131)，ffnt-4 (GenBank 登錄號 NM_030761)，ffnt-5A (GenBank 登錄號 NM_003392)，ffnt-5B (GenBank 登錄號 NM_032642)，ffnt-6 (GenBank 登錄號 NM_006522)，ffnt-7A (GenBank登錄號 NM_004625)，Wnt_7B (GenBank 登錄號 NM_058238)，Wnt_8A (GenBank 登錄號NM_058244), ffnt-8B (GenBank 登錄號 NM_003393)，ffnt-9A (Wnt-14) (GenBank 登錄號NM_003395), Wnt_9B (Wnt-15) (GenBank 登錄號 NM_003396)，Wnt-1OA (GenBank 登錄號NM_025216)，Wnt-1OB (GenBank 登錄號 NM_003394)，Wnt-1I (GenBank 登錄號 NM_004626)，Wnt-16 (GenBank登錄號NM_016087))。盡管每個成員具有與所述家族具有不同程度的序列一致性，其都編碼小的(即39-46kD)、?；?、棕櫚酰化、分泌的糖蛋白，該糖蛋白包含23-24個保守半胱氨酸殘基，其間隔高度保守(McMahon，A P et al., TrendsGenet.1992;8:236-242;Miller, J R.Genome Biol.2002; 3 (I):3001.1-3001.15)。本發(fā)明中的其它目標天然序列fct多肽包括來源于任何哺乳動物的上述多肽的直系同源物，包括家養(yǎng)的和農(nóng)場的動物，以及動物園、實驗室或?qū)櫸飫游?，例如狗、貓、牛、馬、綿羊、豬、山羊、兔、大鼠、小鼠、蛙、斑馬魚、果蠅、蠕蟲等。[0040]"天然序列"小型wnt多肽為Wnt多肽序列的氨基酸序列片段。此類天然序列多肽可以從產(chǎn)生內(nèi)源性fct蛋白的細胞中分離，或者可以通過重組或合成方式產(chǎn)生。因此，天然序列小型wnt多肽可以具有,例如,天然存在的人Wnt多肽、鼠Wnt多肽或來自任何其它哺乳動物物種的多肽，或者來自非哺乳動物物種(例如，果蠅、秀麗隱桿線蟲等)的多肽所包含的氨基酸序列。
[0041]"變體"小型wnt多肽是指如下所定義的生物活性多肽，其在所述片段長度上與天然fct序列具有小于100%的序列一致性。此類變體包括如下所述的多肽，其中一個或多個氨基酸殘基被添加到所述天然序列N末端或C末端或所述天然序列內(nèi)，缺失了約1-40個氨基酸殘基，且任選地由一個或多個氨基酸殘基取代，此類變體還包括上述多肽的衍生物，其中氨基酸殘基受到共價修飾從而所得產(chǎn)物具有非天然存在的氨基酸。通常，生物學(xué)活性變體具有的氨基酸序列與天然序列多肽具有至少約75%的序列一致性、約80%的序列一致性、約85%的氨基酸序列一致性、約90%的氨基酸序列一致性，優(yōu)選至少約95%，更優(yōu)選至少約99%的序列一致性?？梢岳帽绢I(lǐng)域已知的許多方法開發(fā)此類變體多肽。
[0042]"嵌合"小型wnt多肽為這樣的多肽，其包含與異源多肽融合或綴合的小型wnt多肽。所述嵌合小型wnt多肽通常與初始小型wnt多肽共有至少一種生物學(xué)性質(zhì)。嵌合多肽的實例包括與一個或多個功能部分(如治療性部分、成像部分、表位標簽)融合的小型wnt多肽。通常，當功能部分為多肽部分時，該部分具有足夠的殘基來提供功能，例如，促進多聚化、促進細胞死亡、改變細胞功能、熒光信號、表位序列等，然而該部分應(yīng)足夠短，使得其不干擾小型wnt多肽的生物活性。用作表位的合適標簽多肽通常具有至少六個氨基酸殘基，且通常為約6-250個氨基酸殘基。
[0043]“水溶性的”是指在不存在去垢劑的情況下可溶于水性緩沖液的組合物，通常在提供生物有效劑量的多肽的濃度下是可溶的。水溶性的組合物形成了具有特定活性的大體均一的組合物，該活性為純化其所源自的起始材料活性的至少約5%，通常為所述起始材料活性的至少約10%、20%或30%，更通常為所述起始材料活性的約40%、50%或60%，且可以為約50%、約90%或更高。本發(fā)明的 小型wnt組合物通常形成濃度為至少25 μ M和更高的大體均一的溶液，例如，至少25 μ Μ、40 μ M或50 μ Μ，通常至少60 μ Μ、70 μ Μ,80 μ M或90 μ Μ，有時高達100μΜ、120μΜ或150μΜ。換句話說，本發(fā)明的小型wnt組合物通常形成濃度為約
0.lmg/ml、約0.5mg/ml,約lmg/ml或更高的大體均一的溶液。
[0044]在本文中使用“Wnt蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”或“Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”來指生物活性Wnt在細胞上發(fā)揮其作用以調(diào)節(jié)細胞活性的機制。fct蛋白通過結(jié)合Wnt受體調(diào)節(jié)細胞活性，Wnt受體包括來自卷曲蛋白(Fz)蛋白家族的蛋白、來自ROR蛋白家族的蛋白、來自LRP蛋白家族的蛋白LRP5、LRP6、FRLl/crypto蛋白和Derailed/Ryk蛋白。一旦受到Wnt結(jié)合而激活，Wnt受體將激活一個或多個細胞內(nèi)的信號級聯(lián)。信號級聯(lián)包括:經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；Wnt/平面細胞極性(Wnt/PCP)通路；Wnt-鈣(ffnt/Ca2+)通路(Giles, RH et al.(2003)BiochimBiophys Actal653, 1-24;Peifer, M.et al.(1994)Developmentl20:369-380;Papkoff, J.etal(1996)Mol.Cell Biol.16:2128-2134;Veeman, M.T.et al.(2003)Dev.Cell5:367-377)；和其它本領(lǐng)域所熟知的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。例如，經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活導(dǎo)致細胞內(nèi)蛋白連環(huán)蛋白的磷酸化作用的抑制，導(dǎo)致胞液內(nèi)連環(huán)蛋白的積累以及其隨后向細胞核的遷移，在核內(nèi)其與轉(zhuǎn)錄因子(例如，TCF/LEF)相互作用來激活目標基因。激活Wnt/PCP通路會激活RhoA、C-Jun N末端激酶(JNK)和nemo樣激酶(NLK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)，以控制此類生物學(xué)過程，如組織極性和細胞運動。通過例如結(jié)合Wnt-4、ffnt-5A或Wnt-1l而活化Wnt/Ca2+引起鈣離子的細胞內(nèi)釋放，從而激活鈣敏感性酶，如蛋白激酶C(PKC)、鈣-鈣調(diào)蛋白依賴性激酶II (CamKII)或鈣調(diào)磷酸酶(CaCN)。通過分析上述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性，可以容易地確定Wnt組合物的生物活性?！吧锘钚孕⌒蛍nt”為能特異性結(jié)合Wnt受體且在體外或體內(nèi)(也就是給予動物，例如哺乳動物)提供給細胞時能調(diào)節(jié)fct信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的小型wnt組合物。小型wnt多肽常常為顯性負性的或競爭性的wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。
[0045]術(shù)語"特異性結(jié)合"指的是發(fā)生在成對物質(zhì)之間的結(jié)合，如酶/底物、受體/配體、抗體/抗原和凝集素/碳水化合物，其可能受到共價或非共價相互作用或者共價和非共價相互作用的組合的介導(dǎo)。當所述兩種物質(zhì)的相互作用產(chǎn)生非共價結(jié)合的復(fù)合物時，發(fā)生的結(jié)合通常為靜電式、氫鍵式或親脂性相互作用的結(jié)果。因此，"特異性結(jié)合"發(fā)生在成對物質(zhì)之間，其中所述兩者間存在能產(chǎn)生具有抗體/抗原或配體/受體相互作用特征的結(jié)合復(fù)合物的相互作用。通過在體內(nèi)施用后在功能分析中確定活性水平(例如，減速骨增生、下調(diào)干細胞增殖等)，在非功能分析(例如免疫染色、ELISA、考馬斯或銀染色凝膠上的定量等)中定量小型wnt蛋白的量,和確定在體內(nèi)生物活性小型wnt與總體小型wnt的比率,可以確定組合物內(nèi)的小型wnt蛋白的生物活性。生物活性小型wnt組合物為能將Wnt蛋白活性調(diào)節(jié)至少約40%、約60%，更通常情況下約70%、75%或80%，經(jīng)常約85%、90%或95%，有時多達100%(即完全終止Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo))的組合物。
[0046]本文中可互換使用術(shù)語“Wnt拮抗劑”、“Wnt抑制劑”和“Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑”來指拮抗、抑制或負面調(diào)節(jié)細胞活性的fct調(diào)節(jié)作用的試劑。同樣地，本文中可互換使用短語“拮抗fct信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”和“抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”來指拮抗、抑制或負面調(diào)節(jié)細胞活性的Wnt
調(diào)節(jié)作用。
[0047]本文中使用“Fz ” 、“Fz蛋白”和“Fz受體”來指所述卷曲蛋白受體家族的蛋白。此類蛋白為包含CRD結(jié)構(gòu)域的七次跨膜蛋白(Ingham，P.W.(1996) TrendsGenet.12:382-384;Yang-Snyder, J.et al.(1996)Curr.Biol.6:1302-1306;Bhanot, P.etal.(1996)Nature382:225-230)。存在十個已知的Fz家族成員(Fzl到FzlO)，其每一個都可以作為Wnt的受體。Fz受體介導(dǎo)許多Wnt生物活性，包括但不限于突觸形成的調(diào)節(jié)。
[0048]本文中使用“LRP”、“LRP蛋白”和“LRP受體”來指低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白家族的蛋白。此類受體為單次跨膜蛋白，在受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用過程中結(jié)合并內(nèi)化配體。LRP蛋白 LRP5 (GenBank 登錄號 ΝΜ_002335.2)和 LRP6 (GenBank 登錄號 ΝΜ_002336.2)包括在 Wnt受體復(fù)合物中。
[0049]Ryk(其果蠅同系物為Derailed)為生長因子受體蛋白酪氨酸激酶家族的非典型成員，其在激活和核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的許多保守殘基上與其它成員存在差異。Ryk的蛋白序列可以在GenBank登錄號NM_001005861(同種型I)和NM_002958.3 (同種型2)找到。Ryk作為Wnt蛋白的受體起作用，通常作為Fzs的共受體，且介導(dǎo)Wnt生物學(xué)活性，如調(diào)節(jié)成骨細胞分化、細胞遷移、細胞命運決定、軸突導(dǎo)向和神經(jīng)突增生，包括運動神經(jīng)元目標選擇和肌肉神經(jīng)節(jié)點處的突出發(fā)生。通過損傷激活所述Wnt/Ryk通路抑制軸突再生。
[0050]本文中使用“ ROR”、“ ROR蛋白”和“ ROR”受體”來指受體酪氨酸激酶樣孤」L受體家族的RORl和R0R2蛋白。RORl的蛋白序列可以在GenBank登錄號NM_005012.2 (同種型I)和ΝΜ_001083592.1(同種型2)找到。ROR2的蛋白序列可以在GenBank登錄號NM_004560.3找到。RORl和R0R2作為Wnt蛋白的受體起作用，通常作為Fzs的共受體。
[0051]本文中使用“EGF-CFC蛋白”和“EGF-CFC受體”來指由表皮生長因子(EGF)-crypto、FRL-U cryptic家族編碼的蛋白。此類蛋白包括Cripto (也稱為“CR-1 ”和“Tdgf I (畸形癌衍生的生長因子I) ”，GenBank登錄號ΝΜ_003212.3 (同種型I)和ΝΜ_001174136.1(同種型 2))和 Cryptic (也稱為 “CFC1 ”，GenBank 登錄號 ΝΜ_032545.2)。EGF-CFC蛋白共享變體EGF樣基序(motif)、保守的半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域和C末端疏水區(qū)。此類蛋白為fct受體，且在脊椎動物胚胎發(fā)生和腫瘤生長期間的細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起關(guān)鍵作用。
[0052]“包含”是指所敘述的要素為所述組合物/方法/試劑盒所必須的，但可能在所述權(quán)利要求范圍內(nèi)包括其它要素以形成該組合物/方法/試劑盒等。例如，包含小型wnt多肽的組合物為可能包括除小型wnt多肽外其它要素的組合物，例如，功能部分，如與所述小型wnt多肽結(jié)合(如共價結(jié)合)的多肽、小分子或核酸；本領(lǐng)域很容易理解的能提高所述小型wnt組合物的穩(wěn)定性的試劑、能提高所述小型wnt組合物的溶解度的試劑、佐劑等,不包括任何用否定條件涵蓋的要素。作為另外一個實例，包含對應(yīng)于例如人fct的298-370殘基或例如34-247殘基的Wnt氨基酸序列的小型wnt多肽可以包含該序列之外的Wnt氨基酸序列，除了否定條件描述的任何序列。
[0053]“基本上由…組成(consisting essentially of) ”是指將描述的組合物或方法的范圍限制到不實質(zhì)上影響本發(fā)明基本的和新的特征的特定材料或步驟。例如，“基本上由公開序列組成”的小型wnt多肽具有所公開序列的氨基酸序列，并且基于其所源自的全長母體Wnt序列，在所述序列的邊界加上或減去約5個氨基酸殘基，例如，比所述邊界氨基酸殘基少約5個殘基、4個殘基、3個殘基、2個殘基或I個殘基，或比所述邊界氨基酸殘基多約I個殘基、2個殘基、3個殘基、4個殘基或5個殘基。
[0054]“由…組成(consisting of) ”是指排除權(quán)利要求中的組合物、方法或試劑盒中沒有指定的任何要素、步驟或組分。例如，“由公開的序列組成”的小型wnt多肽僅由所述公開的氨基酸序列組成。
[0055]“功能部分”或“FM”是指將功能活性賦予組合物的多肽、小分子或核酸組成部分。功能部分的實例包括，但不限于，治療性部分、結(jié)合部分和成像部分。
[0056]“治療性部分”或“TM”是指將治療活性賦予組合物的多肽、小分子或核酸組成部分。治療性部分的實例包括細胞毒素，例如，小分子化合物、蛋白毒素和放射增敏部分，即放射性核素等，其固有地不利于細胞；改變細胞活性的試劑，例如，小分子、肽模擬物、細胞因子、趨化因子；和將細胞引導(dǎo)向ADCC或CDC依賴性死亡的部分，例如，免疫球蛋白的Fe組分。
[0057]“成像部分”或“IM”是指非細胞毒素類試劑，其可以用于定位細胞和任選地使細胞可視化，例如，由本發(fā)明的組合物靶向的細胞。
[0058]寡聚部分為通過例如使用拉鏈或Fe多肽、生物素和抗生物素蛋白/鏈霉親和素、或其它本領(lǐng)域已知的親和力促進化學(xué)或蛋白試劑來誘導(dǎo)小型wnt低聚化為同二聚物、同三聚物、同四聚物或更大同聚物，或異二聚物、異三聚物、異四聚物或更大異聚物的多肽、小分子或核酸組成部分。[0059]本文中可互換使用短語“Wnt介導(dǎo)的疾病狀態(tài)”和“Wnt介導(dǎo)的病癥”來描述特征為異?；虿涣嫉膄ct信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的疾病、病癥或疾病狀態(tài)。在一個具體方面，所述異常fct信號轉(zhuǎn)導(dǎo)為懷疑患病的細胞或組織內(nèi)的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)水平超過了類似的非患病細胞或組織內(nèi)的fct信號轉(zhuǎn)導(dǎo)水平。Wnt介導(dǎo)的病癥的實例包括與異常的血管生成相關(guān)的病癥，例如視網(wǎng)膜病，和與異常的增殖相關(guān)的病癥，例如癌癥。
[0060]本文中使用術(shù)語"治療(treatment)"、"治療(treating)"等通常指得到期望的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效應(yīng)。所述效應(yīng)在完全或部分預(yù)防疾病或其癥狀方面可為預(yù)防性的，和/或在部分或完全治愈疾病和/或由所述疾病引起的不利影響方面為治療性的。本文中所使用的"治療"包括哺乳動物內(nèi)疾病的任何治療，包括:(a)預(yù)防所述疾病在可能易患該疾病但還沒有診斷為患有該病的個體內(nèi)發(fā)生；(b)抑制所述疾病，即阻止其發(fā)展；或(C)減輕所述疾病，即導(dǎo)致所述疾病的減退。所述治療劑可以在疾病或損傷開始之前、期間或之后施用。發(fā)病中疾病的治療，其中所述治療穩(wěn)定或減少患者的不良臨床癥狀，尤其讓人感興趣。這類治療最好在受累組織的功能完全喪失之前進行。所述治療最好在所述疾病的有癥狀階段期間施用，且在一些情形下在所述疾病的有癥狀階段后施用。
[0061]本文中可互換使用術(shù)語"個體(individual)"、"個體(subject)"、"宿主"和"患者"，且指的是需要診斷、處理或治療的任何哺乳類個體，尤其是人。
[0062]分子和細胞生物化學(xué)中的常規(guī)方法可以在此類標準教材如分子克隆中找至丨J:A Laboratory Manual, 3rd Ed.(Sambrook et al., CSH Laboratory Press2001);Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed.(Ausubel et al.eds., Johnffiley&Sons 1999);Protein Methods(Bollag et al., John ffiley&Sons 1996);NonviralVectors for Gene Therapy(Wagner et al.eds., Academic Press 1999) ;ViralVectors (Kaplift&Loewy eds., Academic Press 1995);Immunology Methods Manual(1.Lefkovits ed.,Academic Press 1997);和 Cell and Tissue Culture:LaboratoryProcedures in Biotechnology (Doyle&Griff iths, John ffiley&Sons 1998),其公開通過引用并入本文中。本公開中涉及到的 用于基因操作的試劑、克隆載體和試劑盒可以從商業(yè)供應(yīng)商例如 BioRacU Stratagene> Invitrogen、Sigma-Aldrich 和 ClonTech 獲得。
[0063]組合物
[0064]提供了小型wnt組合物和它們的使用方法。小型wnt組合物為包含小型wnt多肽的組合物。如上所述，小型wnt多肽是這樣的多肽，其為全長Wnt蛋白的片段，并保留其所源自的全長fct蛋白特異性結(jié)合至少一種Wnt受體的能力。與可同時結(jié)合到兩種不同共受體的全長fct蛋白不同，小型wnt通常僅能結(jié)合共受體中的一個。小型wnt多肽通常長度為至少約40個氨基酸，通常長度為至少約50個氨基酸，且長度不大于約120個氨基酸，通常長度不大于約100個氨基酸，且在一些實施方案中，長度為約80至約100個氨基酸。
[0065]在一些實施方案中，所述小型wnt多肽為C末端小型wnt多肽，本文中也稱為“C末端(C-terminal)小型wnt”或“C末端(Cterm)小型wnt”。C末端小型wnt為這樣的多肽組成部分，其來源于即包括來自能結(jié)合Fz、R0R和/或Ryk Wnt受體的Wnt蛋白C末端結(jié)構(gòu)域的序列。在一些實施方案中，所述C末端小型wnt為水溶性的。
[0066]C末端小型wnt包含wnt多肽的羧基末端結(jié)構(gòu)域或由wnt多肽的羧基末端結(jié)構(gòu)域組成，且不包括氨基末端結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基。在本文中以多個人fct蛋白為示例描述羧基末端結(jié)構(gòu)域，例如，如圖6中所示，且可以基本上由所描述結(jié)構(gòu)域中所示的所有氨基酸殘基組成，或者可以在所描述結(jié)構(gòu)域的氨基或羧基末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個氨基酸殘基。還可能通過與本文中提供的序列比對而通過經(jīng)驗鑒定C末端小型wnt。在一個實例中，C末端小型wnt氨基酸序列通過保守殘基與人Wntl的298-370位對齊，且缺少與人Wntl的殘基1-257對齊的氨基酸序列，或者可能如上所述進行截短。在一些實施方案中，C末端小型wnt為如上所定義的變體或類似物。在一些實施方案中，變異或突變改變對其同源受體的親和力，溶解度，和/或?qū)ζ渫词荏w的特異性。
[0067]在一些實施方案中，所述小型wnt多肽為N末端小型wnt多肽，本文中也稱為“N末端(N-terminal)小型wnt”或“N末端(Nterm)小型wnt”。N末端小型wnt為這樣的多肽組成部分，其來源于即由來自能結(jié)合LRP5、LRP6和/或crypto的Wnt蛋白N末端結(jié)構(gòu)域的序列組成。在一些實施方案中，所述N末端小型wnt為水溶性的；在其它實施方案中，所述N末端小型wnt為脂溶性的。
[0068]在一些實施方案中，N末端小型wnt多肽為這樣的多肽，其包含wnt多肽的氨基末端結(jié)構(gòu)域或由wnt多肽的氨基末端結(jié)構(gòu)域組成，且不包括羧基末端結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基。在本文中以多個人Wnt蛋白為示例描述所述氨基末端結(jié)構(gòu)域，例如，如圖8中所示，且可基本上由所描述結(jié)構(gòu)域中所示的所有氨基酸殘基組成，或者可在所描述結(jié)構(gòu)域的氨基或羧基末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個氨基酸殘基。還可能通過與本文中提供的序列比對而通過經(jīng)驗鑒定N末端小型wnt。在一個實例中,N末端小型wnt氨基酸序列通過保守殘基與人fctl的34-247位對齊，且缺少與對應(yīng)于人Wntl的殘基288-370的殘基對齊的氨基酸序列，或者可如上述進行截短。N末端小型wnt可為水溶性的或者可為脂溶性的。在一些實施方案中，C末端小型wnt為如上述的變體或類似物。在一些實施方案中，變異或突變改變對其同源受體的親和力，溶解度，和/或?qū)ζ渫词荏w的特異性。在一些這類實施方案中，在與人fctl的殘基93和/或224對齊的殘基處進行氨基酸取代，以使對應(yīng)于人fctl的殘基Cys55和/或Ser187的殘 基為丙氨酸。
[0069]對應(yīng)于來自任何生物物種(例如，小鼠、大鼠、貓、雞、果蠅、蛙、斑馬魚、狗、蠕蟲等)的Wnt蛋白的C末端小型wnt多肽和N末端小型wnt多肽可用于本申請的組合物中?？梢酝ㄟ^使用比對軟件(例如NCBI BLAST、ClustalW或本領(lǐng)域所熟知的其它軟件)進行目標同源物或直系同源物與如圖6和8中所提供的Wnt序列的比對，容易地確定此類小型wnt的多肽序列。包含小型wnt多肽的組合物可包括不同的要素，除了本文中特別表述為排除在所描述的小型wnt多肽外的要素，例如所述小型wnt可與外源性多肽融合?？赡苓x擇產(chǎn)生所述融合的位點以優(yōu)化所述多肽的生物活性、分泌或結(jié)合特征。通過常規(guī)實驗確定最佳位點。
[0070]例如，包含小型wnt多肽的組合物任選地包括與所述小型wnt多肽融合的多肽以進一步增加它們的溶解度。所述結(jié)構(gòu)域可以通過限定的蛋白酶切割位點(例如，由TEV蛋白酶切割的TEV序列)連接到所述多肽。所述連接子還可以包括一個或多個柔性序列(flexible sequence),例如，I至10個甘氨酸殘基。在一些實施方案中，所述融合蛋白的切割在維持所述產(chǎn)物溶解度的緩沖液中進行，例如，在0.5至2M尿素存在下進行，在增加溶解度的多肽和/或多核苷酸的存在下進行，以及其他條件。目標結(jié)構(gòu)域包括內(nèi)吞體裂解結(jié)構(gòu)域，例如，流感HA結(jié)構(gòu)域；和其它有助于產(chǎn)生的多肽，例如，IF2結(jié)構(gòu)域、GST結(jié)構(gòu)域、GRPE結(jié)構(gòu)域等。
[0071]作為另一個實例,包含小型wnt多肽的組合物可以任選地包括對所述小型wnt多肽的修飾以增加穩(wěn)定性。例如，所述多肽可以為聚乙二醇化的，其中聚乙烯氧基提供在血流中增長的存在時間。所述多肽可以與另一多肽融合以增加在體內(nèi)的穩(wěn)定性。通常這類融合伴侶為穩(wěn)定的血漿蛋白，其可以例如當存在于融合物時，尤其是穩(wěn)定的血漿蛋白為免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域時，能延長所述多肽的體內(nèi)血漿半衰期。在大部分情形下，當所述穩(wěn)定的血漿蛋白通常發(fā)現(xiàn)為多聚體形式，例如，免疫球蛋白或脂蛋白，其中相同的或不同的多肽鏈通常為二硫化物和/或非共價地結(jié)合以形成組裝的多鏈多肽時，本文中包含所述多肽的融合物也作為具有與所述穩(wěn)定血漿蛋白前體基本上相同的結(jié)構(gòu)的多聚體加以生產(chǎn)和使用。這些多聚體相對于它們包含的多肽藥劑是同質(zhì)的，或者它們可以包括多個多肽藥劑。
[0072]穩(wěn)定的血漿蛋白在它們的天然環(huán)境中通常展現(xiàn)在循環(huán)中延長的半衰期，即大于約20小時。合適的穩(wěn)定血漿蛋白的實例為免疫球蛋白、白蛋白、脂蛋白、載脂蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白。所述多肽藥劑通常融合到所述血漿蛋白，例如，位于所述血漿蛋白或其片段的N末端的IgG，其能賦予所述多肽延長的半衰期。對所述多肽的血漿半衰期大于約100%的增加是令人滿意的。通常，所述多肽以C末端融合到免疫球蛋白恒定區(qū)的N末端末端取代其可變區(qū)，然而N末端融合也可能具有作用。通常，這類融合至少保留免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的功能活性鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，其中的重鏈可以包括IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD，通常為IgG類蛋白中一種或組合。融合也產(chǎn)生于恒定區(qū)Fe部分的C末端，或者直接融合到所述重鏈的CHl的N末端或輕鏈的相應(yīng)區(qū)域。這通常通過構(gòu)建合適的DNA序列并在重組細胞培養(yǎng)內(nèi)表達該DNA序列來完成?；蛘?，可以根據(jù)已知方法合成所述多肽。
[0073]在一些實施方案中，對所述小型wnt進行修飾而不改變其序列。不改變一級序列的感興趣的修飾包括多肽的化學(xué)衍生法,例如,酰化、乙?；Ⅳ然?、酰胺化等。還包括糖基化修飾，例如，通過在多肽合成和加工期間或在進一步加工步驟中修改多肽的糖基化方式產(chǎn)生的修飾；例如，通過將所述多肽暴露于影響糖基化的酶，例如哺乳動物糖基化或去糖基化酶產(chǎn)生的修飾。還包括具有磷酸化氨基酸殘基(例如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸)的序列。
[0074]用于本申請的組合物和方法的小型wnt多肽可以使用普通分子生物學(xué)技術(shù)和合成化學(xué)進行修飾，以增加它們對蛋白水解降解的抗性或者優(yōu)化溶解性能或者使它們更適合作為治療劑。這類多肽的類似物包括含有非天然存在的L-氨基酸的殘基的多肽，例如，D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸。D-氨基酸可以取代部分或所有的氨基酸殘基。
[0075]所述小型wnt多肽可以使用本領(lǐng)域所了解的常規(guī)方法通過體外合成制備。有各種商業(yè)合成裝置可供使用，例如，Applied Biosystems, Inc., Beckman等的自動合成儀。通過使用合成儀，可以用非天然的氨基酸取代天然存在的氨基酸。具體序列和制備方法將根據(jù)方便、經(jīng)濟、所需純度等確定。若需要，可以在合成期間或表達期間將不同的基團引入到所述肽中，其允許連接到其它分子或連接到表面。因此可以使用半胱氨酸來制備用于連接到金屬離子復(fù)合物的硫醚、組氨酸，用于形成酰胺或酯類的羧基、用于形成酰胺的氨基等。
[0076]或者，所述小型wnt多肽可以使用本領(lǐng)域已知多種系統(tǒng)的任何一種，在含有細胞或無細胞的多肽合成系統(tǒng)內(nèi)通過重組體DNA技術(shù)來制備。采用標準的連接技術(shù)構(gòu)建包含以上所列組分的一種或多種的合適載體。將分離的質(zhì)?；駾NA片段以期望的方式切割、剪切和重新連接以產(chǎn)生所需的質(zhì)粒。對于用以確定所構(gòu)建質(zhì)粒內(nèi)的正確序列的分析，使用所述連接混合物來轉(zhuǎn)化宿主細胞，如合適通過氨芐青霉素或四環(huán)素抗性來選擇成功的轉(zhuǎn)化株。制備了來自所述轉(zhuǎn)化株的質(zhì)粒，通過限制性內(nèi)切酶消化進行分析和/或進行測序。
[0077]本文中用于在載體內(nèi)克隆或表達DNA的合適宿主細胞為原核生物、酵母或高等真核細胞，包括但不限于植物、哺乳動物、昆蟲等細胞。用于這一目的的合適原核生物包括真細菌,例如，革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物,例如，腸桿菌科(Enterobacteriaceae),如埃希氏桿菌屬(Escherichia),例如，大腸桿菌(E.coli),腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬(Salmonella),例如，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium),沙雷氏菌屬(Serratia),例如,黏質(zhì)沙雷菌(Serratia marcescans)和志賀菌屬(Shigella),以及芽孢桿菌屬(Bacilli),例如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.1icheniformis),假單胞菌屬(Pseudomonas),例如綠膿假單胞菌(P.aeruginosa),和鏈霉菌屬(Streptomyces)。此類實例為說明性的而非限制性的。
[0078]除了原核生物，真核微生物如絲狀真菌或酵母為合適的表達宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是較低等真核宿主微生物中最常用的。然而，許多其它屬、種和株通?？梢垣@得且可用于本文中，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe);克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)宿主如乳酸克魯維酵母(K.1actis)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)等；畢赤酵母(Pichia pastoris);假絲酵母(Candida);粗糖脈抱菌(Neurospora crassa);許旺酵母屬(Schwanniomyces)如施旺酵母(Schwanniomyces occidentalis);和絲狀真菌如青霉菌屬(Penicillium)、彎頸霉屬(Tolypocladium)和曲霉屬(Aspergillus)宿主如構(gòu)巢曲霉(A.nidulan)和黑曲霉(A.niger)。
[0079]合適的宿主細胞也可 能來源于多細胞生物體。此類宿主細胞具有復(fù)雜的加工和糖基化活性。原則上，任何較高等的真核細胞培養(yǎng)物都是可行的，無論來自脊椎動物或無脊椎動物培養(yǎng)物。無脊椎動物細胞的實例包括植物和昆蟲細胞。已經(jīng)鑒定了許多桿狀病毒株和變體及相應(yīng)的來自宿主，例如草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蜆(Drosophilamelanogaster)(果蠅)和家蠶(Bombyx mori)的受納昆蟲宿主細胞。多種用于轉(zhuǎn)染的病毒株可以公開獲得，例如，苜猜銀紋夜蛾(Autographa California)NPV的L-1變體和家蠶(Bombyx mori)NPV的Bm_5株，且在本文中可以將此類病毒用作本發(fā)明的病毒，尤其是用于轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞。
[0080]可以將棉花、玉米、土豆、大豆、矮牽牛、番茄和煙草的植物細胞培養(yǎng)物用作宿主。通常，通過與細菌根癌農(nóng)根菌(Agrobacterium tumefaciens)的某菌株一起培養(yǎng)轉(zhuǎn)染植物細胞。在所述植物細胞培養(yǎng)物的這類培養(yǎng)期間，DNA編碼序列被轉(zhuǎn)移到所述植物細胞宿主中，以致其受到轉(zhuǎn)染，且在適當?shù)臈l件下將表達該DNA。此外，可以使用與植物細胞相匹配的調(diào)節(jié)和信號序列，例如胭脂堿合酶啟動子和多腺苷酸化信號序列。
[0081]通過重組體合成制備的所述小型wnt多肽通常依照重組體合成的常規(guī)方法進行分離和純化。裂解產(chǎn)物可以使用HPLC、排阻色譜法、凝膠電泳、親和色譜法或其它純化技術(shù)來純化表達宿主和裂解產(chǎn)物制備。在極大程度上，相對于所述產(chǎn)物的制備及其純化方法相關(guān)的污染物，使用的組合物將包括期望產(chǎn)品的至少20wt%，更通常至少約75wt%，優(yōu)選至少約95wt%，且對于治療用途通常至少約99.5wt%。通常，該百分比基于總蛋白。
[0082]本發(fā)明的小型wnt多肽在結(jié)合同源的Wnt受體方面通常具有生物活性。在這種情況下，所述小型wnt特異性地結(jié)合Wnt受體,并在接觸到表達所述受體的細胞時抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，通常結(jié)合一個而非兩個或fct共受體對。可以通過以下方式確定組合物內(nèi)小型wnt多肽的生物活性:確定在功能分析(例如β_連環(huán)蛋白的去穩(wěn)定化、干細胞生長的抑制等)中fct活性被所述小型wnt抑制的量，通過非功能分析(例如免疫染色、ELISA、考馬斯或銀染的凝膠定量等)定量存在的小型wnt多肽的量，和確定生物活性小型wnt與總小型wnt的t匕。用于小型wnt多肽特異性活性的示例性分析包括使細胞與包含Wnt的組合物(例如來自表達Wnt蛋白的細胞培養(yǎng)基)接觸，并維持一段足夠穩(wěn)定β_連環(huán)蛋白的時間，通常至少約I小時。然后將小型wnt組合物提供給所述細胞，并孵育該細胞，通常至少約I小時，以允許所述小型wnt多肽完全取代所述Wnt蛋白。然后將所述細胞裂解，通過SDS PAGE解析細胞裂解物，接著將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上并使用β_連環(huán)蛋白的特異性抗體探測。其它的分析包括非洲爪蟾動物cap分析中靶基因的C57MG轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)。相對于不存在小型wnt存在時的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，有效劑量或濃度的小型wnt多肽將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如由細胞核β_連環(huán)蛋白的存在證實)減少25%、50%、75%、90%、95%或更多。
[0083]小型wnt的結(jié)合活性的一個方面為確定小型wnt所源自的全長Wnt蛋白的受體特異性的能力。通常，此類方法中使用的小型wnt與相應(yīng)的全長Wnt蛋白具有高序列一致性，其中所述小型wnt通常與相應(yīng)的全長Wnt蛋白在至少50、60、70、80、90個或更多個連續(xù)氨基酸的區(qū)段上相同。確定fct-Fz相互作用的主要阻礙在于不能表達Wnt以測量它們與卷曲蛋白受體的結(jié)合。例如，見 Kikuchi A, Yamet al.(2007)Cell Signal 19:659-71;Loganand Nusse (2004) Annu Rev Cell Dev Biol20:781-810;和 Wang et al.(2005)Mol CellBiol 25:5022-30。采用容易重組表達且能結(jié)合所述Fz-CRD的小型Wnt，現(xiàn)在使用所述小型Wnt作為結(jié)合劑可能以直接的方式匹配Fz受體與Wnt。以這種方式破解Wnt-Fz相互作用對發(fā)育生物學(xué)和再生生物學(xué)以及藥物設(shè)計是變革性的。
[0084]在用于確定Wnt蛋白的同源受體的方法中，將候選Wnt受體或其片段與對應(yīng)于目標全長fct蛋白的小型wnt多肽接觸,所述全長Wnt蛋白可以為天然Wnt蛋白；并確定所述小型wnt與所述候選受體的結(jié)合，其中特異性結(jié)合的存在表明所述全長Wnt蛋白為所述候選受體的配體。目標受體包括可以使用C末端小型wnt接觸的Fz蛋白、ROR蛋白或Ryk蛋白；和可以使用N末端小型wnt接觸的LRP5、LRP6或FRLl/crypto?？墒褂枚喾N結(jié)合測定，例如利用表達所述候選受體的細胞，但特別讓人感興趣的為能在溶液中進行的測定，例如利用所述受體的可溶性片段用于結(jié)合，其包括但不限于Fz-CRD多肽和水溶性C末端小型wnt間的相互作用。
[0085]在一些實施方案中，將本發(fā)明的小型wnt多肽與各種功能部分綴合，例如多肽、藥物、放射性核苷酸或毒素。換句話說，本申請的組合物包括與所述小型wnt多肽綴合的功能部分。見,例如，PCT 公開 WO 92/08495 ；W0 91/14438 ；W0 89/12624 ;美國專利 5，314，995 ;和 EP 396,387。
[0086]可以與小型wnt多肽綴合的功能部分的一個實例為治療性部分。治療性部分包括但不限于，促進細胞死亡的部分和改變細胞活性的部分。[0087]促進細胞死亡的部分的實例包括細胞毒性劑，即細胞毒素，例如，抑制細胞生長或殺細胞的小分子、多肽藥劑或放射性金屬離子。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞不利的任何藥劑。實例包括紫杉醇、細胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙啶、吐根堿、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、長春新堿、長春花堿、秋水仙堿、阿霉素、道諾霉素、二羥蒽醌、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、l-去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘諾爾和嘌呤霉素以及其類似物或同系物。細胞毒性劑還包括具有細胞毒素生物活性的蛋白、肽類或多肽，例如，毒素，如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假單胞菌外毒素、霍亂毒素和白喉毒素。細胞毒性劑還包括放射性金屬離子，即放射性核素，例如α -放射體，如鉍-213、鐳-226、鉛-212、錒-225和砹-211，和β -放射體，例如碘化物-131、釔-90、錸-188、镥-177、銅-67和銅-64，以及用于使放射性金屬離子(例如131In、131L、131Y、131Ho、131Sm)綴合到多肽或那些先前列出的任何多肽的大環(huán)螯合劑。可以通過連接子分子將大環(huán)螯合劑結(jié)合到所述抗體上，例如，如 Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res.4(10):2483-90;Petersonet al., 1999, Biocon jug.Chem.10 (4): 553-7 和 Zimmerman et al., 1999, Nucl.Med.Biol.26(8):943-50中所描述，此類文獻的每篇都通過引用全部并入本文中。
[0088]促進細胞死亡的部分還包括將細胞引向抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞介導(dǎo)的吞噬作用(ADCP)或補體依賴性細胞毒性(CDC，又稱補體介導(dǎo)的細胞裂解或CMC)的部分，例如免疫球蛋白的Fe組分。見，例如，Raghavan etal., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220;Ghetie et al., 2000, Annu Rev Tmmunol18:739-766; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Tmmunol 19:275-290)。為了評價目標分子的ADCC活性，可進行體外ADCC測定。這類測定的有用效應(yīng)細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和自然殺傷細胞(NK)細胞?？蛇x地或另外地，可以在在體內(nèi)評價目標分子的ADCC活性，例如在動物模型如Clynes et al.PNAS (USA) 95:652-656 (1998)中公開的模型中評價。所有的Fe Y Rs結(jié)合Fe上的相同區(qū)域，在所述C Y 2結(jié)構(gòu)域的N末端和前面的鉸鏈處，該區(qū)域可以用作本發(fā)明目的的功能部分。在Fe上重疊但分開的位點充當補體蛋白Clq的界面。以Fc/Fc YR結(jié)合介導(dǎo)ADCC和ADCP相同的方式，F(xiàn)c/Clq結(jié)合調(diào)節(jié)補體依賴性細胞毒性(OTC)。Fe上Cy2和Cy3結(jié)構(gòu)域間的位點 介導(dǎo)與新生受體FcRn的相互作用，其中FcRn的結(jié)合從核內(nèi)體回收內(nèi)吞體到血流。
[0089]如本文中所使用，F(xiàn)e融合物和本領(lǐng)域中使用的術(shù)語"免疫粘附素"、"Ig融合物"、"Ig 嵌合體"以及"受體球蛋白"(Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol14:52-60;Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Tmmunol9:195-200)是同義的。例如，F(xiàn)e 融合物將免疫球蛋白的Fe區(qū)域與C末端或N末端小型wnt組合。見例如美國專利5，766，883和5，876，969，這兩篇文獻都通過引用特別地包括在本文中。
[0090]在促進細胞死亡的治療性部分之外的治療性部分包括改變細胞活性的藥劑。此類治療藥劑包括但不限于，細胞因子、趨化因子、抗代謝物(例如，甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、
6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟二氧嘧啶氨烯咪胺)、烷基化藥劑(例如，二氯甲基二乙胺、噻替派苯丁酸氮芥、馬法蘭、卡莫司汀(BSNU)和環(huán)己亞硝脲(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉素C和順式-二氯二胺鉬(II) (DDP)順鉬)、蒽環(huán)類藥物(例如，道諾霉素(以前稱為道諾霉素和阿霉素)、抗生素(例如，放線菌素(以前稱為放線菌素)、博萊霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))，和抗有絲分裂藥劑(例如，長春新堿和長春花堿)。[0091]適合于與本申請所述小型wnt綴合的其它功能部分包括成像部分。如上所述，成像部分為非細胞毒性劑，其可以用于定位細胞和任選地可視化細胞，例如由本申請的組合物所靶向的細胞。例如，可以使用熒光染料作為成像部分。在另一個實例中，非細胞毒性的放射性試劑還可以為成像部分。成像部分可能需要添加用于檢測的底物，例如辣根過氧化物酶(HRP)、β-半乳糖苷酶、熒光素酶等?；蛘?，成像部分可以不需要添加用于檢測底物而提供可檢測的信號，例如突光團或發(fā)色團染料，如Alexa Fluor 488?或Alexa Fluor647'或者包括熒光團或發(fā)色團的蛋白，例如GFP、RFP、dsRED、phiYFP等及其突變體。
[0092]能產(chǎn)生兩個或更多個小型wnt的多聚體的功能部分是感興趣的，例如，如本領(lǐng)域所了解，包括具有高親和力的結(jié)合對，如生物素和抗生物素蛋白/鏈霉親和素，肽序列，如拉鏈結(jié)構(gòu)域等。
[0093]用于將功能部分與多肽綴合的技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知，見，例如，Amon etal., " Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy " , in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld etal.(eds.), pp.243-56 (Alan R.Liss, Inc.1985) ; Hellstrom et al., " AntibodiesFor Drug Delivery " , in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinsonet al.(eds.), pp.623-53 (MarceI Dekker, Inc.1987) ;Thorpe, " AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review " , in MonoclonalAntibodies ' 84:Biological And Clinical Applications, Pinchera et al.(eds.), pp.475-506(1985) ;" Analysis, Results, And Future Prospective Of The TherapeuticUse Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy " , in Monoclonal AntibodiesFor Cancer Detection And Therapy,Baldwin et al.(eds.), pp.303-16(AcademicPressl985), and Thorpe et al., " The Preparation And Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates" , Tmmunol.Rev.62:119-58 (1982)。
[0094]功能部分通常通過共價相互作用結(jié)合到本申請的組合物的小型wnt多肽。在一些實施方案中，可以使用連接子 ，其中所述連接子可以為能用于將所述小型wnt多肽連接到所述功能部分的任何部分。在一些實施方案中，所述連接子為可切割連接子?？汕懈钸B接子的使用使得連接到小型wnt多肽的部分一旦被細胞吸收并運送到細胞體，能夠從所述小型wnt多肽上釋放出來。所述可切割連接子可以被化學(xué)試劑切割、被酶切割，由于pH改變被切割，或通過暴露到能量下被切割?？赡苁褂玫哪芰啃问降膶嵗ü?、微波、超聲和射頻。
[0095]在一些應(yīng)用中，釋放所述功能部分可能是可取的，尤其是當所述部分為治療性部分時，一旦該化合物進入細胞，就會導(dǎo)致所述部分的釋放。因此，在一個變形實施方案中，連接子L為可切割連接子。這使得所述部分M—旦位于細胞內(nèi)時從所述化合物上釋放。這在一些情況下可能是可取的，例如，所述功能部分當從所述小型wnt多肽上分離時，為具有較大的治療效果的治療性部分。例如，所述治療性部分當從所述小型wnt多肽上分離時，可能具有更強的被細胞內(nèi)細胞組分吸附的能力。因此，可能需要或合理的做法是使所述治療性部分與所述小型wnt多肽分離，以使所述治療性部分可以進入細胞內(nèi)室。
[0096]方法
[0097]在本發(fā)明的方法中，例如通過使細胞與有效量的組合物接觸，將有效量包含小型wnt的組合物提供給細胞，以達到期望的效果，例如，用以抑制fct信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抑制增殖或異常的血管形成、遞送治療或成像部分、產(chǎn)生抗體等。
[0098]在本發(fā)明的一些方法中，提供有效量的所述組合物來抑制細胞內(nèi)的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。從生物化學(xué)角度說，有效量或有效劑量的fct抑制劑為，相對于不存在所述小型wnt時的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，能將細胞內(nèi)Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)減少或減弱至少約30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%的抑制劑的量。換句話說，相對于在沒有與有效量/劑量小型wnt組合物接觸的細胞中觀察到的Wnt信號響應(yīng)強度，與有效量或有效劑量小型wnt組合物接觸的細胞的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的響應(yīng)為約70%或更少、約60%或更少、約50%或更少、約40%或更少、約30%或更少、約20%或更少、約10%或更少、約5%或更少，或為約0%，即可忽略不計。Wnt對細胞活性的調(diào)節(jié)量(即，細胞對Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的響應(yīng))可以通過為fct生物學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所了解的許多方法進行確定。例如，可以測量細胞內(nèi)磷酸化β -連環(huán)蛋白的量；可以測量細胞內(nèi)胞質(zhì)β -連環(huán)蛋白的量；或可以測量通常由Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活的轉(zhuǎn)錄因子的活性量，例如TCF/LEF，例如通過測量作為TCF/LEF的轉(zhuǎn)錄靶標的基因的RNA或蛋白水平，或通過使用包含可操作地連接到報道蛋白(如熒光素酶(TOPFlash)、EGFP (TOP-EGFP)等)的TCF結(jié)合位點(TOP)的核酸載體轉(zhuǎn)染/感染細胞，并定性或定量地測量所產(chǎn)生的報道蛋白的量。以這種方式，可以確定試劑的拮抗效應(yīng)。
[0099]以臨床的角度來說，有效劑量的小型wnt組合物為如下劑量，當施用該劑量合適的時間段，通常至少約一周，且可能為約兩周或更長時間，直到約4周、8周或更長的時期周期，將會表現(xiàn)出與不期望的fct信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的癥狀的改變。例如，有效劑量為如下劑量，當給予該劑量合適的時間段，通常至少約一周，且可能為約兩周或更長時間，直到約4周、8周或更長的時間周期，將會減緩或者甚至停止癌癥患者內(nèi)的腫瘤生長或糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的眼內(nèi)新血管化。在一些實施方案中，有效劑量可能不僅減緩或停止疾病狀態(tài)的進展，還可能誘導(dǎo)所述疾病狀態(tài)的逆轉(zhuǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，可能施用起始劑量持續(xù)這樣的時間段，隨后施用維持劑量，其在一些情況下為減小的劑量。
[0100]在一些實施方案中， 提供有效量的本申請組合物來將功能部分遞送至細胞，例如，治療性部分或成像部分。在這類實施方案中，有效量為所述功能部分獲得治療或成像功效
的所需量。
[0101]例如，在一些實施方案中，所述功能部分為細胞毒性治療性部分。有效量的包括細胞毒性部分的組合物為足以選擇性地促進被所述細胞毒性部分融合到的小型Wnt組合物所靶向的細胞內(nèi)的細胞死亡的量。在某些情況下，有效量的功能部分是公知的，例如放射性核素的遞送通常在10_30cGy/h的范圍，方案取決于所述放射性同位素的半衰期。在另外的情況下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員使用本領(lǐng)域已知的用于分析細胞死亡的任何方便的方法(例如TUNEL染色、膜聯(lián)蛋白染色、碘化丙啶攝取等)可以容易地確定所述有效量。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以施用初始劑量持續(xù)這樣的時間段，接著施用維持劑量，其在一些情況下為減少的劑量。
[0102]作為另外一個實例，在一些實施方案中，所述功能部分為將細胞引向ADCC或CDC的治療性部分。有效量的包括將細胞引向ADCC或CDC的部分的組合物為足以選擇性促進所述細胞毒性部分融合到的小型wnt組合物所靶向的細胞內(nèi)的ADCC或CDC的量。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以使用本領(lǐng)域已知的任何用于分析ADCC和CDC的方便方法容易地確定所述有效量。
[0103]作為另外一個實例，在一些實施方案中，所述功能部分為成像部分。有效量的包含成像部分的組合物為足以選擇性地標記細胞毒性部分融合到的小型wnt組合物所靶向的細胞的量。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可以使用可視化成像部分的領(lǐng)域已知的任何方便的方法(例如顯微鏡檢查，如熒光顯微鏡或光學(xué)顯微鏡)容易地確定所述有效量。
[0104]所要施用的小型wnt組合物的有效量或有效劑量的計算在本領(lǐng)域一般技術(shù)人員能力范圍內(nèi)，且對本領(lǐng)域技術(shù)人員是常規(guī)的。顯而易見的是，所要施用的最終量取決于給藥途徑且取決于所要治療的病癥或疾病狀態(tài)的性質(zhì)。
[0105]適合用于本申請方法的細胞為包含一種或多種Wnt受體的細胞。如上所述，Wnt受體包括Fz蛋白、ROR蛋白、Ryk、LRP5、LRP6和EGF-CFC蛋白。在一些實施方案中，所述細胞為表達包含CRD結(jié)構(gòu)域或WIF結(jié)構(gòu)域的Wnt受體的細胞。在此類實施方案中，用于所述方法的組合物包括為C末端小型wnt的小型wnt多肽。包含CRD結(jié)構(gòu)域的Wnt受體的實例包括Fz蛋白和ROR跨膜激酶。包含WIF結(jié)構(gòu)域的Wnt受體的實例包括Derailed/Ryk。在一些實施方案中，所述細胞為表達fct受體LRP5、LRP6或crypto的細胞。在此類實施方案中，用于所述方法的組合物包括N末端小型wnt的小型wnt多肽。
[0106]用于接觸的細胞可能位于體外，即，在培養(yǎng)物中，或者它們可以位于體內(nèi)，即，在個體體內(nèi)。細胞可能來自/位于任何生物體，但優(yōu)選來自哺乳類，包括人、家養(yǎng)和農(nóng)場動物，以及動物園、實驗室或?qū)櫸飫游锶绻?、貓、牛、馬、綿羊、豬、山羊、兔、大鼠、小鼠、青蛙、斑馬魚、果蠅、蠕蟲等。優(yōu)選地，所述哺乳類為人。細胞可以來自任何組織。細胞可以是冷凍的，或者它們可以為新鮮的。它們可以為原代細胞，或者可以為細胞系。更通常地，它們?yōu)轶w內(nèi)的原代細胞。
[0107]尤其感興趣的細胞為能響應(yīng)于Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)且與不良或其它異常細胞增殖(例如腫瘤發(fā)生、血管生成等)相關(guān)的細胞，尤其是因為它們可能與下述fct介導(dǎo)的疾病狀態(tài)相關(guān)。作為實例，感興趣的細胞包 括內(nèi)皮細胞，其襯于血管的內(nèi)表面的細胞，且當受到異常激活時，其可能與異常的血管生成相關(guān)。作為另外一個實例，感興趣的細胞包括癌細胞，例如腫瘤細胞，如癌癥干細胞，其為一種具有與正常干細胞相關(guān)的特性的癌細胞類型，即具體癌癥樣品中存在的能產(chǎn)生所有細胞類型的能力，且其與異常細胞增殖相關(guān)。
[0108]可以通過許多本領(lǐng)域熟知方法中的任何方法，使包含小型wnt多肽的組合物接觸體外的細胞。例如，可以將所述組合物提供給培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基中的細胞。在本領(lǐng)域熟知的促進核酸攝取的條件下(例如電穿孔、氯化鈣轉(zhuǎn)染和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染)，可以將編碼所述小型wnt多肽的核酸提供給所述細胞或提提給在載體上與所述細胞共同培養(yǎng)的細胞。或者，可以通過病毒將編碼所述fct抑制劑的核酸提供給細胞或提供給與所述細胞共同培養(yǎng)的細胞，即，使包含編碼所述小型wnt多肽的核酸的病毒顆粒接觸所述細胞。逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如，慢病毒，尤其適合于本發(fā)明的方法，因為它們可以用于轉(zhuǎn)染非分裂細胞(見，例如，Uchida etal.(1998)P.N.A.S.95(20): 11939-44)。通常使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為“缺陷型的”，即不能產(chǎn)生有效感染所需的病毒蛋白。當然，載體的復(fù)制需要在包裝細胞系內(nèi)生長。
[0109]同樣地，可以通過所述領(lǐng)域內(nèi)許多熟知的將多肽或核酸施用于個體的方法中的任何方法，使所述小型wnt組合物接觸體內(nèi)的細胞。可以將所述小型wnt組合物并入到多種制劑內(nèi)，其中在一些實施方案且尤其是C末端小型wnt的實施方案中，所述制劑可在沒有去垢劑、脂質(zhì)體等存在下配制，如對于全長fct蛋白的配制中所描述。更具體而言，可以通過與恰當?shù)乃帉W(xué)可接受載體或稀釋劑組合，將本發(fā)明的組合物配制成藥物組合物，且可以將其配制成固體、半固體、液體或氣體形式的制劑，例如片劑、膠囊、粉末、顆粒劑、軟膏、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠、微球和氣霧劑。同樣地，可以以不同的方式施用所述小型wnt組合物，包括經(jīng)口給藥、頰的給藥、直腸給藥、腸胃外給藥、腹膜內(nèi)給藥、皮膚內(nèi)給藥、經(jīng)皮給藥、氣管內(nèi)給藥等。通過使用局部施用、內(nèi)部施用，或者使用用于在植入位點處保留活性劑量的植入物，活性劑在給藥后可以為全身的或者可以為局部的。所述活性劑可以配制用于即時活性或者可以配制用于持續(xù)釋放。
[0110]對于一些病癥，尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)病癥，可能需要將藥劑配制成能穿過血腦屏障(BBB)。一種穿過血腦屏障(BBB)給藥的策略需要通過滲透性手段例如甘露醇或白細胞三烯，或利用生物化學(xué)方式通過使用作用于血管的物質(zhì)(例如緩激肽)破壞BBB。對腦腫瘤使用BBB對目標特異性開放的藥劑的可能性也是一種選擇。當所述組合物通過血管注射施用時，BBB破壞藥劑可以與本發(fā)明的治療組合物共同施用。其它穿過BBB的策略可能需要使用內(nèi)生運輸系統(tǒng)，包括caveoil-Ι介導(dǎo)的轉(zhuǎn)包吞作用、載體_介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運蛋白如葡萄糖和氨基酸載體、受體介導(dǎo)的胰島素或轉(zhuǎn)鐵蛋白的轉(zhuǎn)包吞作用和主動外向轉(zhuǎn)運蛋白例如P-糖蛋白。主動運輸部分還可能結(jié)合到用于本發(fā)明的治療化合物上，以促進運輸部分穿過血管的內(nèi)壁?；蛘?，BBB后的治療藥劑的給藥可以通過局部給藥，例如通過囊內(nèi)，如通過奧馬耶貯器(Ommaya reservoir)給藥(見例如US專利編號5、222、982和5385582，本文中通過引用進行了包括)；通過快速注射，如通過注射器，如玻璃體內(nèi)或顱內(nèi)注射給藥；通過持續(xù)輸注，如通過管腔，如傳送給藥(見例如美國申請20070254842，其通過引用并入本文中);或通過植入藥劑可逆地附著于其上的裝置(見例如US申請編號20080081064和20090196903，將其通過引用并入本文)。
[0111]治療用途。如上提及，本發(fā)明的小型wnt組合物在抑制對Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有響應(yīng)的細胞內(nèi)fct信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有作用。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可以通過本領(lǐng)域和本文前面表述的已知的方法，容易地確定細胞對fct的響應(yīng)。具有生物活性的小型wnt組合物會抑制(即對抗或壓制)細胞內(nèi)的fct信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)。換句話說，具有生物活性的小型wnt組合物為Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的顯性負性調(diào)節(jié)劑。
[0112]Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的顯性負性調(diào)節(jié)劑(如本發(fā)明的小型wnt組合物)在治療患有Wnt介導(dǎo)的疾病病癥(如與異常細胞增殖或異常血管生成相關(guān)的病癥，包括不同的與fct相關(guān)的癌癥)的哺乳動物，例如人患者中具有作用?；加幸源祟惒“Y為特征的疾病的患者，通過本申請要求保護的未決發(fā)明的治療方案，將會受益匪淺。
[0113]術(shù)語"癌癥"是指哺乳動物中的生理學(xué)病癥，即通常以非調(diào)節(jié)的細胞生長/增殖為特征。癌癥的實例包括，但不限于:惡性上皮腫瘤、淋巴癌、胚細胞癌和血癌。癌癥的更具體的實例包括，但不限于:結(jié)腸直腸癌、慢性粒細胞白血病(CLL)、肺癌包括非小細胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、小腸類癌、膀胱癌、胃癌、胰癌、肝癌(肝細胞癌)、肝胚細胞癌、食道癌、肺腺癌、間皮瘤、滑膜肉瘤、骨肉瘤、頭和頸鱗狀細胞癌、青少年鼻咽血管纖維瘤、脂肪肉瘤、甲狀腺癌、黑素瘤、基底細胞癌(BCC)、成神經(jīng)管細胞瘤和硬纖維瘤。用于通過所述方法治療的尤其讓人感興趣的癌癥包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、肝癌和胃癌。[0114]包含抑制腫瘤生長的小型wnt多肽的組合物為導(dǎo)致體外癌細胞增殖速率可測量的降低或者體內(nèi)腫瘤生長抑制的組合物。例如，相比于合適的對照，優(yōu)選的生長抑制fct拮抗劑會將腫瘤生長抑制至少約5%、至少約10%、至少約20%，優(yōu)選約20%至約50%，且甚至更優(yōu)選地，大于50%(例如，約50%至約100%)，其中對照通常為不使用測試的Wnt拮抗劑分子處理的癌細胞。如果以約I μ g/kg至約100mg/kg體重施用Wnt拮抗劑，在距離初次施用約5天至3個月內(nèi)，優(yōu)選在約5至30天內(nèi)，導(dǎo)致腫瘤大小或細胞增殖的減少,該Wnt拮抗劑為體內(nèi)生長抑制性的。
[0115]另外一個實例，本發(fā)明的組合物和方法在抑制CNS細胞內(nèi)的異常的血管生成中具有作用。術(shù)語“血管生成”用于描述新血管從先已存在的血管中生長或萌發(fā)的生物學(xué)過程。在胚胎發(fā)生期間和在成熟生物體內(nèi)，血管生成在脈管系統(tǒng)的加工中都起著至關(guān)重要的作用，例如，在傷口愈合中。然而，存在著許多由持續(xù)的非調(diào)控的或非恰當調(diào)控的血管生成引起的疾病狀態(tài)。在此類疾病狀態(tài)中，該異常的血管生成可能引起特定的疾病或者加劇已經(jīng)存在的病理狀態(tài)。例如，眼內(nèi)的脈絡(luò)膜新生血管(CNV)和隨后的視網(wǎng)膜病被認為是失明的最常見原因，且成為許多眼病，最顯而易見的為糖尿病視網(wǎng)膜病變和年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD、ARMD)，尤其是濕性/滲出性年齡相關(guān)性黃斑變性的病理基礎(chǔ)。Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在發(fā)育期間參與促進CNS和視網(wǎng)膜內(nèi)的血管生成。因此，Wnt抑制劑在治療(即阻止所述CNS的疾病病癥的)發(fā)展或進程中具有作用，其中異常的血管生成為影響因素。
[0116]抑制CNS內(nèi)異常血管生成的小型wnt組合物或抑制CNS內(nèi)新血管形成的wnt組合物導(dǎo)致對新脈絡(luò)系統(tǒng)發(fā)育的可測量的抑制，例如培養(yǎng)物內(nèi)的內(nèi)皮細胞的管腔形成或者個體內(nèi)的血管形成。相比適合的對照，優(yōu)選的fct拮抗劑將新脈絡(luò)系統(tǒng)發(fā)育速率抑制至少約10%、至少約20%，優(yōu)選約20%至約50%，且甚至更優(yōu)選地，大于50% (例如，約50%至約100%)，其中對照通常為不使用測試的fct拮抗劑分子處理的細胞。如果在距離初次施用所述fct抑制劑約5天至6個月內(nèi)，優(yōu)選在約5天至約2個月內(nèi)，以約I μ g/kg至約100mg/kg體重施用Wnt拮抗劑導(dǎo)致心血管系統(tǒng)發(fā)育的減緩或停止，所述Wnt拮抗劑為體內(nèi)抑制性的。心血管系統(tǒng)發(fā)育可以通過許多本領(lǐng)域熟知的和對普通技術(shù)人員顯而易見的方法進行觀察。例如，脈絡(luò)膜新生血管的抑制可以容易地通過眼底照相直接觀察，或通過分析視敏度測試的得分提高來間接觀察。
[0117]此外，其它病癥與異常Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，包括但不限于骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、多囊性腎病、糖尿病、精神分裂癥、血管疾病、心臟疾病、非致瘤增殖性疾病和神經(jīng)退行性疾病如阿爾滋海默氏病。
[0118]作為抑制Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的替換方案或附加方案，小型wnt組合物可以用于遞送此前描述的治療性部分以治療前面提及的任何疾病。例如，小型wnt組合物可用于將細胞毒性部分遞送至致瘤細胞，或用Fe部分標記致瘤細胞,所述Fe部分將細胞引導(dǎo)向ADCC或CDC介導(dǎo)的細胞死亡。另外一個實例，小型wnt組合物可用于將促進突觸形成的細胞因子遞送至處于神經(jīng)退行狀態(tài)的神經(jīng)細胞，或者促進CNS損傷位點的軸突增生。所述小型wnt組合物的這些和其它治療應(yīng)用可以容易地為一般技術(shù)人員所了解。
[0119]為了包含到藥劑中，小型wnt多肽可以使用普遍接受的制備方法獲得。作為一般建議，非腸道的一次劑量施用的總藥學(xué)有效量的fct抑制劑化合物在可以通過劑量響應(yīng)曲線測量的范圍內(nèi)。[0120]根據(jù)期望的劑型，藥物組合物可以包括，藥學(xué)可接受的、無毒性稀釋劑載體，其定義為通常用來配制用于動物或人施用的藥物組合物的介質(zhì)。所選擇的稀釋劑不影響所述組合物的生物活性。此類稀釋劑的實例為蒸餾水、緩沖水、生理鹽水、PBS、林格氏溶液、葡萄糖溶液和Hank' s溶液。此外，所述藥物組合物或制劑可以包含其它載體、佐劑，或無毒性的、非治療的、無致免疫性的穩(wěn)定劑、賦形劑等。所述組合物還可以包含其它物質(zhì)來使生理條件接近，如pH調(diào)整和緩沖劑、毒性調(diào)整劑、濕潤劑和洗滌劑。
[0121]所述組合物還可以包含多種穩(wěn)定劑中的任何一種，例如，抗氧化劑。當所述藥物組合物包含多肽時，該多肽可以與不同的熟知化合物進行絡(luò)合，該化合物提高所述多肽的體內(nèi)溶解性或者促進其藥理學(xué)性質(zhì)(例如，增加所述多肽的半衰期、減少其毒性、增加溶解性或吸收)。此類修飾劑或絡(luò)合劑的實例包括硫酸鹽、葡糖酸鹽、檸檬酸鹽和磷酸鹽。組合物的多肽還可以與提高它們的體內(nèi)屬性的分子絡(luò)合。此類分子包括，例如，糖類、多胺、氨基酸、其它多肽、離子(例如，鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子、錳離子)和脂類。
[0122]關(guān)于適合于不同施用類型的劑型的進一步指導(dǎo)可以在Remington ' sPharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company,Philadelphia,Pa., 17thed.(1985)中找到。至于給藥方法的簡述，見，Langer, Science249:1527-1533 (1990)。
[0123]所述藥物組合物可施用于預(yù)防性和/或治療性治療。活性成分的毒性和治療功效可以根據(jù)標準的制藥過程在細胞培養(yǎng)物和/或?qū)嶒瀯游镏羞M行確定，包括，例如，確定LD50 (群體的50%致死劑量)和ED5tl (群體的50%治療有效劑量)。毒性效應(yīng)和治療效應(yīng)之間的劑量比為治療指數(shù)，且其可以表示為比值LD5(i/ED5(i。優(yōu)選展現(xiàn)大的治療指數(shù)的化合物。
[0124]從細胞培養(yǎng)和/或動物研究中獲得的數(shù)據(jù)可以用于為人制定劑量范圍。有效成分的劑量通常在一系列包括低毒性的ED5tl的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。所述劑量可以在該范圍內(nèi)變化，其取決于采用的劑型和所用的施用途徑。
[0125]用于配制所述藥物組合物的組分優(yōu)選具有高純度且大體上沒有潛在有害的污染物(例如，至少為國家食品(NF)級，通常至少為分析級，且更通常至少為藥物級)。此外，用于體內(nèi)使用的組合物通常為無菌的?？紤]到給定的化合物必須在使用之前合成，產(chǎn)生的產(chǎn)品通?；旧喜痪哂腥魏螡撛诘亩拘詣绕涫侨魏蝺?nèi)毒素，其在合成或純化過程中可能存在。用于腸胃外施用的組合物也是無菌的、基本等滲的，且在GMP條件下制得。
[0126]本發(fā)明的方法還在聯(lián)合療法中具有作用。例如，許多藥劑可用于治療異常的血管生成，例如血管抑素、內(nèi)皮抑素、VEGF抑制劑等。同樣地，許多藥劑可用于治療癌癥，例如化療劑、放射療法等。聯(lián)合使用本發(fā)明的小型wnt和這些其它藥劑可能具有優(yōu)勢，即其中個體藥物的所需劑量較低，且不同藥物的效果互為補充。
[0127]成像部分的遞送。如上文所提到，本發(fā)明的小型wnt組合物還可用于將成像部分遞送至表達fct受體的細胞。例如，出于研究目的，例如，可以將與熒光部分綴合的小型wnt組合物用于標記和追蹤體外和體內(nèi)的細胞。
[0128]抗體牛成。本發(fā)明的小型wnt組合物還可以用于生成抗體?？贵w可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法生成。本發(fā)明的抗體可以為多克隆或單克隆抗體。它們可以為單價的、二價的或多價的。它們可以為片段，例如F(ab)片段。制備抗體的方法為熟練技術(shù)人員所了角軍(Harlow, et al.,抗體:a Laboratory Manual, (Cold spring Harbor LaboratoryPress, 2nd ed.(1988),其通過引用全部并入本文中)。[0129]在生成本發(fā)明的抗體中，將包含小型wnt多肽的所述組合物配制為用于注射，例如與佐劑注射，且將生成的免疫原用于免疫動物?？梢詫⒚庖咴M合物的小型wnt多肽，有益處時，制成在其中所述小型wnt多肽被附加到融合片段上的融合蛋白。例如，通過使得所述融合蛋白通過親和色譜法分離和純化，所述融合片段往往有助于蛋白純化。融合蛋白可以通過培養(yǎng)使用融合核酸序列轉(zhuǎn)染的重組細胞制得，其中所述融合核酸序列編碼包括連接至所述蛋白羧基和/或氨基末端的融合片段的蛋白。融合片段可以包括，但不限于，免疫球蛋白Fe區(qū)域、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、β -半乳糖苷酶、能結(jié)合二價金屬離子的多組氨酸片段和麥芽糖結(jié)合蛋白。
[0130]為了制備多克隆抗體，可以將如上所述的免疫原施用于不同的宿主動物，包括但不限于，兔、小鼠、大鼠等，以誘導(dǎo)生產(chǎn)包含對所述抗原具有特異性的多克隆抗體的血清。所屬免疫原的施用可能需要一次或多次免疫劑的注射，且如果需要，包括佐劑的注射。根據(jù)宿主物種，可以使用不同的佐劑用于增加免疫反應(yīng)，其包括但不限于，F(xiàn)reundi s(完整和不完整的)、礦物膠如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、復(fù)合多元醇、多聚陰離子、肽、乳化油、鑰孔蟲戚血蘭素、二硝基酚和潛在有用的人佐劑如BCG(卡介苗)和短棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。可能采用的佐劑的其它實例包括MPL-TDM佐劑(單磷酰脂A、合成海藻糖雙紫堇靈霉菌酸酯(dicorynomycolate))。免疫方案為本領(lǐng)域所熟知且可以通過引起所選動物宿主內(nèi)免疫反應(yīng)的任何方法進行。佐劑也為本領(lǐng)域所熟知。
[0131]通常，通過多次皮下或腹腔注射，或肌內(nèi)注射或通過IV將免疫原(有或沒有佐劑)注射到哺乳類體內(nèi)。免疫原可以包含有IL13多肽、融合蛋白或其變體。根據(jù)多肽的性質(zhì)(即百分比疏水性、百分比親水性、穩(wěn)定性、凈電荷、等電點等)，將免疫原結(jié)合到已知在被免疫的哺乳類體內(nèi)產(chǎn)生免疫原性的蛋白上可能是有用的。這類結(jié)合包括通過將活性化學(xué)功能基團衍生到免疫原和將要結(jié)合的免疫原性蛋白上以形成共價鍵的化學(xué)結(jié)合，或者通過基于融合蛋白的方法學(xué)，或熟練技術(shù)人員了解的其它方法進行的結(jié)合。此類免疫原性蛋白的實例包括，但不限于，鑰孔戚血藍蛋白、卵白蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白、大豆胰蛋白酶抑制劑和混雜的輔助T多肽。可以采用不同的佐劑來增加如上所述的免疫反應(yīng)。
[0132]可以使用雜交瘤技術(shù)，例如如下描述的雜交瘤技術(shù)來制備單克隆抗體:Kohler and Milstein, Nature, 256:495(1975)和美國專利 4，376，110，Harlow, etal., Antibodies:A Laboratory Manual, (Cold spring Harbor Laboratory Press,2.sup.nd ed.(1988)，HammerIing, et al., Monoclonal Antibodies and T-Cel IHybridomas (Elsevier, N.Y., (1981)),或技術(shù)人員已知的其它方法。可以被用于制備單克隆抗體的方法的其它實例包括，但不限于，人B細胞雜交瘤技術(shù)(Kosboret al., 1983, Immunology Today4: 72 ；Cole et al., 1983, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA80:2026-2030),和 EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole et al.，1985，Monoclonal Antibodies AndCancer Therapy, Alan R.Liss, Inc., pp.77-96)。此類抗體可以為任何的免疫球蛋白類,包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和任何其亞類。制備本發(fā)明的mAb的雜交瘤可以在體外或體內(nèi)培養(yǎng)。
[0133]本領(lǐng)域存在許多用于制備單克隆抗體的方法，因此，本發(fā)明不限于它們在雜交瘤中的唯一生產(chǎn)。例如，單克隆抗體可以通過重組體DNA方法制備，如美國專利4，816，567中描述的方法。由此而論，術(shù)語"單克隆抗體"指的是來源于真核、噬菌體或原核單一克隆的抗體。使用常規(guī)工藝(例如，通過使用能特異性結(jié)合到編碼鼠類抗體的重鏈和輕鏈或者來自人的、人化的或其它來源的這類鏈的基因上的寡核苷酸探針)，可以容易地對編碼本發(fā)明的單克隆抗體的DNA進行分離和測序。本發(fā)明的雜交瘤細胞充當這類DNA的優(yōu)選來源。一旦得到分離，所述DNA可以被放入到表達載體中，表達載體隨后被轉(zhuǎn)化到不另外制備免疫球蛋白的宿主細胞，例如NSO細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞，以得到重組宿主細胞內(nèi)的單克隆抗體的合成。還可以，例如，通過用編碼人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的序列取代同源的鼠類序列(美國專利4，816，567;Morrison et al.，同前)，或者通過將編碼非免疫球蛋白多肽的所有或部分序列共價結(jié)合到免疫球蛋白編碼序列上，對所述DNA進行修飾。這類非免疫球蛋白多肽可以取代本發(fā)明抗體的恒定區(qū)，或者可以取代本發(fā)明抗體的一個抗原結(jié)合位點的可變區(qū)，以制備嵌合的二價抗體。
[0134]抗體可以為單價的抗體。制備單價抗體的方法為本領(lǐng)域所熟知。例如，一種方法涉及免疫球蛋白輕鏈和修飾的重鏈的重組表達。通常在Fe結(jié)構(gòu)域中的任何位點處截斷重鏈，以阻止重鏈交叉連接?；蛘?，使用另一氨基酸殘基來取代相關(guān)的半胱氨酸殘基或者將其刪除以阻止交叉連接。
[0135]識別特定的抗原表位的抗體片段可以通過已知的技術(shù)產(chǎn)生。例如，使用諸如木瓜蛋白酶(產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(產(chǎn)生F(ab' )2片段)的酶，可以通過對免疫球蛋白分子進行蛋白水解來制備本發(fā)明的Fab和F(ab' )2片段。F(ab' )2片段包含可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)和重鏈的CHl結(jié)構(gòu)域。
[0136]對于一些用途，包括人體內(nèi)的抗體利用和體外的檢測方法，可能更優(yōu)選的是使用嵌合的、人化的或人的抗體。嵌合抗體為這樣的分子，其中抗體的不同部分來源于不同的動物物種，如具有來源于鼠類單克隆抗體的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體。制備嵌合抗體的方法為本領(lǐng)域所了解。參見例如，Morrison, Science 229:1202(1985) ;0iet al.,BioTechniques 4:214(1986) ;Gi11ies et al., (1989)J.Tmmunol.Methods125:191-202;美國專利5, 807, 715;4, 816, 567;和4，816397，將其通過引用全部并入本文中。
[0137]人化抗體為非人物種內(nèi)產(chǎn)生的抗體分子，其結(jié)合具有來自非人物種的一個或多個互補決定區(qū)(CDRs)和來自人免疫球蛋白分子的框架(FR)區(qū)的期望的抗原。通常，人框架區(qū)內(nèi)的框架殘基被來自CDR供體抗體的相應(yīng)的殘基取代，以改變，優(yōu)選地增加，抗原結(jié)合。這些框架取代通過本領(lǐng)域熟知的方法識別，例如，通過對CDR和框架殘基相互作用的建模來識別對抗原結(jié)合和序列比較重要的框架殘基，以識別特定位置的異?？蚣軞埢?參見，例如，Queen et al.,美國專利5，585，089;Riechmann etal.，Nature332:323 (1988)，其通過引用全部并入本文中)。可以使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)人化抗體，包括，例如，CDR-移植(EP 239, 400;PCT publication WO 91/09967;U.S.Pat.Nos.5, 225, 539; 5, 530, 101 和 5,585,089)，鍵飾(veneering)或重塑(resurfacing)(EP 592,106;EP 519,596;Padlan, Molecular Immunology28 (4/5):489-498(1991) ;Studnicka et al., Protein Engineering 7 (6):805-814 (1994);Roguska et al., PNAS91:969-973(1994)),以及鏈重組(chain shuffling)(美國專利 5，565，332)。
[0138]完全的人抗體尤其適合病人的治療處理。人抗體可通過本領(lǐng)域已知的多種方法制備，包括上述的使用來源于人免疫球蛋白序列的抗體文庫的噬菌體展示法。另參見，U.S.Pat.Nos.4，444，887 和 4，716，111 以及 PCT 公開 WO 98/46645、WO 98/50433、WO98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735 和 WO 91/10741 ;其每一個都通過引用全部并入本文中。Cole et al.和Boerder et al.的技術(shù),也可用于制備人單克隆抗體(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Riss, (1985)和Boerner et al., J.1mmunol., 147 (I):86-95, (1991)) ? 人抗體還可以使用轉(zhuǎn)基因小鼠制備，該轉(zhuǎn)基因小鼠不能表達功能性內(nèi)源免疫球蛋白，但能表達人免疫球蛋白基因。
[0139]可以通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、蛋白免疫印跡或其它的免疫化學(xué)技術(shù)測試候選小型wnt抗體以確認它們對目標Wnt的親和力和特異性。進行用于表征個別抗體的測定包括，但不限于(I)抑制癌癥干細胞的fct-自分泌增殖；以及(2)抑制Wnt誘導(dǎo)的TCF-LEF誘導(dǎo)的基因表達。
[0140]還可以依據(jù)本發(fā)明抗體的交叉反應(yīng)性來描述或詳細說明它們。本發(fā)明還包括結(jié)合小型wnt多肽的抗體，其與人Wnt具有至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%和至少50%的一致性(如使用本領(lǐng)域已知的方法和本文中描述的方法計算的)。因此，本發(fā)明的抗體結(jié)合到天然的母體Wnt蛋白的Wnt結(jié)構(gòu)域上，小型wnt來源于該蛋白并抑制通常被該Wnt結(jié)合的受體復(fù)合物的激活。
[0141]優(yōu)選的結(jié)合親和力包括平衡解離常數(shù)或KD為10_8至10_15M的親和力。本發(fā)明還提供了競爭性抑制抗體結(jié)合到本發(fā)明的抗原表位上的的抗體，其中所述抗原表位為通過本領(lǐng)域任何已知的方法，例如本文中描述的免疫測定，確定的決定競爭性結(jié)合的抗原表位。在優(yōu)選的實施方案中，所述抗體競爭性抑制到所述抗原表位的結(jié)合的至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%或至少50%。
實施例
[0142]提供下述實施例是為 了給本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供如何制作和利用本發(fā)明的完整公開和描述，且并不試圖限制本發(fā)明發(fā)明人所認為的發(fā)明范圍，也不試圖表示以下的實驗為所完成實驗的所有或僅有的實驗。已經(jīng)作出了努力以確保采用的數(shù)字的精確度(例如量、溫度等)，但應(yīng)當考慮到一些實驗誤差和偏差。除非另有說明，份數(shù)為重量份數(shù)，分子量為重量平均分子量，溫度為攝氏度數(shù)，并且壓強位于或接近大氣壓。
[0143]我們試圖通過使用體外演化方法鑒定保留生物活性的水溶性形式的Wnt或Wnt片段。考慮到野生型fct造成的困難在于，它們被修飾有能極大地減小它們的溶解性和被重組表達的能力的脂質(zhì)基團，我們推斷保留受體結(jié)合活性的水溶性fct或Wnt片段，將會對用于設(shè)計拮抗劑或激動劑型fct藥物的Wnt研究的每一層面:生物化學(xué)層面、功能層面和翻譯層面都具有改革意義。
[0144]為達到這一目的，采用了體外演化來揭示以下Wnt形式:a)具有結(jié)合受體卷曲蛋白活性的，和b)水溶性的。使用了酵母表面展示從fct變體中篩選符合這些標準的形式。由于酵母不具有將所述脂質(zhì)基團結(jié)合到fct上所必需的酶，酵母表面展示系統(tǒng)獨特地適合該目的:因為其在篩選中由酵母表達，任何鑒定為具有對Fz的結(jié)合親和力的突變型Wnt —定缺少脂質(zhì)基團并且因此為水溶性的。作為構(gòu)想的驗證，非洲爪蟾XWntS的野生型序列表達后，在酵母上沒有觀察到到Fz-CRD構(gòu)建體的結(jié)合。
[0145]為了鑒別能被酵母表達并正確結(jié)合到Fz-CRD上的突變體或變體形式的XWnt8，使用在每個基因中引入3-4個堿基改變的易錯PCR生成了突變型XWnt8基因的大文庫。接著將這些變體融合酵母Aga2蛋白，并將融合構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到酵母中。使用Fz-CRD(在此情形下Fz5-CRD)組合物篩選Wnt變體(~50，000拷貝每酵母)的文庫，其中所述Fz-CRD被結(jié)合到鏈霉親和素上以形成strep-Fz-CRD “四聚物”(圖1)。結(jié)合到鏈霉親和素提高了所述Fz-CRD的親和力或多聚性，因此增強了該試劑的敏感性。例如，如圖1b所示，由于鏈霉親和素的添加促使所述CRDs (現(xiàn)在被鏈霉親和素結(jié)合，見“ + ”泳道)以高得多的分子量運行，F(xiàn)z5和Fz8CRD被完全生物素化。因此str印-Fz-CRD “四聚物”為用于酵母文庫挑選的非常有效的試劑。
[0146]基于后面圖中顯示的實驗，該圖中基因的顏色編碼和名稱以及N末端結(jié)構(gòu)域、連接子和C末端結(jié)構(gòu)域在制圖后完成。在挑選實驗之前，不知道Wnt基因被細分為這些區(qū)域，并且僅僅考慮到體外演變實驗的結(jié)果，即這些邊界可以在fct基因上劃出。圖1C中的基因上的紅色箭頭指定了截短了的小型fct C末端片段的幾個邊界，以顯示小型Wnt包括的全長基因的比例。
[0147]從XWnt8易錯文庫中挑選Fz5和Fz8_CRD四聚物幾輪后，分離出了看來具有特異性和反應(yīng)性的單個酵母克隆。單個酵母克隆對Fz-CRD四聚物的特異性通過FACS分析進行了確認。簡略地說，每種融合構(gòu)建體被設(shè)計為包含在酵母和XWntS之間的連接子中的蛋白酶位點和在酵母上的XWnt8末端的C末端Myc標簽。在蛋白酶不存在和存在下，通過使用Fz-CRD四聚物或Myc特異性抗體沾染所述酵母，有力地確定了事實上所述四聚物是否特定性地與Wnt反應(yīng)，或者是否該反應(yīng)僅僅為非特定性結(jié)合到酵母上。如圖2和圖3中所示，當添加蛋白酶時所述Fz-CRD四聚物的FACS沾染被丟失，表明酵母克隆對所述Fz-CRD的反應(yīng)，確實是由該酵母克隆展示的fct變體引起，且并非為所述Fz-CRD對所述酵母的非特定性結(jié)合。類似地，在蛋白酶存在下，Myc反應(yīng)性被丟失。因此確認在鑒定的酵母克隆和FzCRD之間發(fā)生了特異性結(jié)合相互作用。
[0148]展示對Fz-CRD的特 異性結(jié)合活性的表達XWntS變體的酵母克隆，以可溶性重組體形式表達(圖4)。舉個例說，XWntS變體B7在昆蟲細胞中表達，并通過凝膠過濾得到純化，這表明其為在無清潔劑下折疊良好的水溶性蛋白。(圖4，頂端)。添加到這一純化的B7變體的Fz5-CRD與作為復(fù)合物的B7變體通過凝膠過濾共洗脫，證明Fz5_CRD “拉低”或特定性地結(jié)合到該重組的水溶性XWnt8變體上。因此，Xffnt8變體B7為水溶性的，且為Wnt的受體結(jié)合形式。
[0149]如上所述的其它XWnt8變體的分析揭示，所有可溶的和結(jié)合到Fz-CRD上的變體都為全長XWnt8的小的、截短了的形式。這些序列僅包含Wnt的C末端~100個氨基酸左右，因此，其被稱為“小型fct”。盡管只要包含有主要的區(qū)域(圖1中粉紅色)，小型Wnt的準確邊界可以不同(如圖1)，這些小型wnt仍然保留Fz結(jié)合活性。因為在物種間的所有fct中該區(qū)域為高度保守的，小型fct代表了所有物種間Wnt的保守Fz結(jié)合片段。
[0150]為了精確定量小型wnt變體對Fz-CRD的結(jié)合親和力，進行了表面等離子體共振(SPR)測定。從桿狀病毒中表達并純化小型XWnt8。將生物素化的Fz5-和Fz8-CRD結(jié)合到被桿狀病毒表達的小型XwntS淹沒的SPR芯片上。為了生成符合數(shù)學(xué)模型的結(jié)合曲線，將幾種小型Wnt濃度注射到芯片上，并以反應(yīng)單位(RU)記錄結(jié)合的程度。從該數(shù)據(jù)中我們能夠擬合結(jié)合曲線并計算~1-2微摩爾的親和常數(shù)(KD)。因此，在純化系統(tǒng)中該實驗證明，在缺少清潔劑的水緩沖液中，小型XWnt8結(jié)合到具有生理親和力的Fz-CRD上。
[0151]發(fā)現(xiàn)的小型XWnt8與其它Wnt的相關(guān)性非常明顯。圖6顯示了整體人Wnt與包含Wnt的小型Wnt區(qū)域的XWnt8的序列比對，所述小型Wnt區(qū)域約為Wnt的最后110個殘基。所述序列是高度保守的，表明所有哺乳類、脊椎動物和無脊椎動物fct的Fz結(jié)合結(jié)構(gòu)域都位于如此描述的C末端小型Wnt結(jié)構(gòu)域中。該結(jié)構(gòu)域不包含任何的脂質(zhì)結(jié)合位點且為水溶性的，因此其提供了完美的平臺，可以通過該平臺來制備調(diào)節(jié)fct信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的Wnt多肽。
[0152]已經(jīng)了解通過Fz受體的大多數(shù)Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)需要Wnt結(jié)合到Fz和共受體上，例如LRP5/6。然而，還不知道該共受體相互作用必需的Wnt結(jié)構(gòu)域?；谖覀兊陌l(fā)現(xiàn)即小型Wnt C末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合到Fz上，我們推斷N末端結(jié)構(gòu)域(如圖1所示)結(jié)合到Lrp6上。為了確定fct的N末端結(jié)構(gòu)域是否與Lrp6存在相互作用，進行上述使用酵母展示的類似實驗。首先，顯示表達野生型XWnt8 N末端結(jié)構(gòu)域的酵母克隆與Myc抗體存在沾染,證明N末端小型fct在酵母表面上表達(圖7a，左側(cè)圖)。接著展示了酵母上LRP6到野生型XWntS的結(jié)合，清楚地證明小型Wnt的N末端結(jié)構(gòu)域為Lrp6結(jié)合結(jié)構(gòu)域(圖7a,右側(cè)圖)。
[0153]我們接著制備了 XWnt8 N末端結(jié)構(gòu)域的易錯文庫,并使用LRP6以與所述C末端小型wnt類似的方式挑選文庫。圖7b顯示了一系列的來自該易錯文庫的酵母克隆，其與myc抗體以及與Lrp6受體特異性沾染。這些克隆的幾個克隆比野生型N末端結(jié)構(gòu)域的沾染要強得多，因此可能更加穩(wěn)定或者具有更高的結(jié)合親和力。因此，圖7提供了制備出具有生物活性的小型N末端Wnt的證據(jù)。在圖8中，我們顯示了人Wnt的N末端區(qū)結(jié)構(gòu)域也是非常保守的，也顯示了這些形式的fct也使用N末端結(jié)構(gòu)域來結(jié)合到Lrp6上。因此，雖然我們的研究使用非洲爪蟾fct8，該結(jié)論可以外推至展現(xiàn)強的序列保守性的其它物種。
[0154]整體來說，這些實驗證明，Wnt被分為N末端Lrp5/6結(jié)合結(jié)構(gòu)域和水溶性的C末端小型Wnt Fz結(jié)合結(jié)構(gòu)域。每一個結(jié)構(gòu)域都可以被用作制備Lrp5/6或Fz結(jié)合分子的平臺，其中Lrp5/6或Fz結(jié)合分子用作診斷劑或作為調(diào)節(jié)Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的治療劑。
[0155]前述僅僅闡述了本發(fā)明的原理。應(yīng)當理解本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計不同的安排，這些安排在本文中盡管沒有被明確描述或顯示，但體現(xiàn)了本發(fā)明的原理且包括在其實質(zhì)和范圍中。此外，本文中敘述的所有實例和條件語言主要是為了幫助讀者理解本發(fā)明的原理，并且本發(fā)明
【發(fā)明者】貢獻的構(gòu)想是為了促進本領(lǐng)域，且應(yīng)當理解為不受限于此類具體敘述的實例和條件。此外，本文中敘述本發(fā)明的原理、方面和實施方案以及其具體實例的所有表述，都試圖包括其結(jié)構(gòu)和功能等效物。此外，此類等效物試圖包括現(xiàn)有已知的等效物和未來開發(fā)的等效物，即開發(fā)的執(zhí)行相同功能的任何成分，而不考慮其結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明的范圍，不試圖受限于本文中顯示和描述的示例性實施方案。當然，本發(fā)明的范圍和實質(zhì)由所附權(quán)利要求呈現(xiàn)。
【權(quán)利要求】
1.組合物，包含小型wnt多肽,其中所述小型wnt多肽為C末端小型wnt或N末端小型writ。
2.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述小型wnt多肽為C末端小型wnt,其能結(jié)合Fz蛋白、ROR蛋白或Ryk蛋白，且不結(jié)合相應(yīng)的Wnt共受體。
3.權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述C末端小型wnt為由圖6中所示的C末端小型wnt氨基酸序列組成的多肽或其變體。
4.權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述C末端小型wnt通過保守殘基與人Wntl的298-370位對齊，且缺少與人Wntl的1_257位殘基對齊的氨基酸序列，或其變體。
5.權(quán)利要求1所述的組合物，其中： 所述小型wnt多肽為N末端小型wnt,其能結(jié)合LRP5、LRP6或FRLl/crypto蛋白，且不結(jié)合相應(yīng)的fct共受體。
6.權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述N末端小型wnt為由圖8中所示的Wnt氨基酸序列組成的多肽或其變體。
7.權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述N末端小型wnt通過保守殘基與人Wntl的34-247位對齊，且缺少與對應(yīng)于人Wntl的288-370位殘基的殘基對齊的氨基酸序列，或其變體。
8.如權(quán)利要求2-7中任一項所述的組合物，其中所述變體為截短形式。
9.如權(quán)利要求2-7中任一項所述的組合物，其中所述變體包括一個或多個氨基酸缺失或取代。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項所述的組合物，其中所述小型wnt多肽為水溶性的。
11.如權(quán)利要求ι-?ο中任一項所述的組合物，還包含融合的或綴合的功能部分。
12.如權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述功能部分為治療性部分或成像部分。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項所述的組合物，其中使用佐劑配制所述組合物。
14.如權(quán)利要求1-12中任一項所述的組合物，其中所述組合物被配制用于藥物給藥。
15.抑制細胞內(nèi)fct信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，包括： 使有效量的權(quán)利要求1-14中任一項所述的組合物與表達Wnt受體的細胞接觸，其中Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受到抑制。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述細胞的增殖受到抑制。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述細胞為癌細胞。
18.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述細胞在體外。
19.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述細胞在體內(nèi)。
20.將功能部分遞送至細胞的方法，所述方法包括： 使權(quán)利要求11或12中所述的組合物與表達Wnt受體的細胞接觸。
21.確定Wnt蛋白的同源受體的方法，所述方法包括： 使對應(yīng)于目標Wnt蛋白的小型wnt多肽與候選Wnt受體或其片段接觸； 確定所述小型wnt多肽與所述候選受體的結(jié)合； 其中特異性結(jié)合的存在表明所述Wnt蛋白為所述候選受體的配體。
【文檔編號】A61K38/00GK103501799SQ201280014977
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2012年1月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月28日
【發(fā)明者】柯南·克里斯托弗·加西亞, 阿榮·萊文 申請人:萊蘭斯坦福初級大學(xué)評議會