Ron組合物及其使用方法
【專利說明】RON組合物及其使用方法
[0001] 相關(guān)申請
[0002] 本申請涉及并要求2012年11月30日提交的美國臨時申請?zhí)?1/732, 048和2013 年5月15日提交的美國臨時申請?zhí)?1/823, 744的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，所述專利申請通過引用的 方式完整并入本文。
[0003] 序列表
[0004] 本申請含有通過EFS網(wǎng)提交的序列表并因而通過引用方式將其完整并入。所述 ASCII副本在2013年11月20日創(chuàng)建，命名為P5505R1-W0_SL. txt，大小是382千比特。
[0005] 相關(guān)技術(shù)背景
[0006] 克羅恩氏?。–D)和潰瘍性結(jié)腸炎（UC)是以腸道內(nèi)部慢性炎癥反應(yīng)為特征的兩 種炎性腸?。↖BD)形式。在CD和UC患者中檢查單核苷酸多態(tài)性（SNP)頻率的全基因組 相關(guān)性研宄（GWAS)已經(jīng)鑒定到許多共有的和獨特的易感性等位基因。使用GWAS和候選 基因方法，已經(jīng)鑒定到巨噬細(xì)胞刺激蛋白（MSP)中認(rèn)為與CD和UC易感性相關(guān)的多態(tài)性。 參見例如，Barrett 等人，2008, Nat Genet 40:955-62,和 Consortium WTCC. 2007, Nature 447:661-78。
[0007] 負(fù)責(zé)這種增加的遺傳風(fēng)險的可能起因性等位基因是MSP中導(dǎo)致氨基酸689處精 氨酸變成半胱氨酸（689R至689C)的非同義編碼性SNP(rs3197999)。參見Goyette等 人，2008, Mucosal Tmmunol 1:131-8。
[0008] MSP是由肝表達(dá)的纖維蛋白溶酶原相關(guān)的可溶性生長因子，以不能夠結(jié)合其受體 (Met家族受體酪氨酸激酶，Recepteur d'Origine Nantais(RON))的無活性單鏈蛋白（MSP 原）形式分泌至血清中。MSP原在R483和V484之間的蛋白酶剪切使其轉(zhuǎn)變成能夠以高 親和力結(jié)合RON并誘導(dǎo)受體信號傳導(dǎo)的有活性、二硫鍵連接的雙鏈α/β異二聚體。參見 Gaudino 等人，1994, EMBO J 13:3524-32 和 Wang 等人，1994, Science 266:117-9。α 鏈包 含N末端PAN結(jié)構(gòu)域和后續(xù)的4個三環(huán)結(jié)構(gòu)域，β -鏈含有C末端胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶 結(jié)構(gòu)域。MSP原可以由許多不同的絲氨酸蛋白酶以蛋白酶解方式激活，所述絲氨酸蛋白酶包 含參與凝血級聯(lián)和在炎癥反應(yīng)期間誘導(dǎo)的那些。參見例如，Wang等人，1994, J Biol Chem 269:3436-40。因此，MSP在組織損傷部位的切割導(dǎo)致RON局部激活。
[0009] 已經(jīng)報道RON表達(dá)在上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞亞群、神經(jīng)內(nèi)分泌組織和正在發(fā)育的骨 中，并且已經(jīng)與誘導(dǎo)上皮細(xì)胞增殖、存活、移行和黏附于胞外基質(zhì)關(guān)聯(lián)。參見例如Iwama等 人，1995, Blood 86:3394-403、Gaudino 等人，1995, Oncogene 11:2627-37、Danilkovitch 等人，1999，Exp Cell Res248:575-82 和 Danilkovitch 等人，2000，M〇1 Cell Biol 20:2218-27。最近，已經(jīng)提出MSP-RON途徑是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵負(fù)向調(diào)節(jié)物。主要基于對鼠 腹膜巨噬細(xì)胞的脂多糖和干擾素-γ刺激的研宄，發(fā)現(xiàn)RON信號傳導(dǎo)抑制促炎性因子的表 達(dá)并上調(diào)可能參與組織修復(fù)的途徑。參見例如，Chen等人，1998, J Immunol, 161:4950-9和 Wilson等人，2008, J Immunol, 181:2303-10。RON在先天炎癥反應(yīng)中的阻抑作用已經(jīng)得到 體內(nèi)研宄支持，所述體內(nèi)研宄顯示在RON中具有定向突變的小鼠顯示出增強(qiáng)的內(nèi)毒素攻擊 敏感性。參見Waltz等人，2001，J Clin Invest, 108:567-76。這些體外和體內(nèi)研宄導(dǎo)致了 以下推論：與MSP 689C多態(tài)性相關(guān)的增加的IBD遺傳風(fēng)險是由MSP和RON之間結(jié)合作用的 改變、以及RON介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化抑制作用方面的缺陷所導(dǎo)致的直接結(jié)果。參見Khor等 人，2011，Nature 474:307-17、Gorlatova 等人，2011，PLoS One 6:e27269。矛盾的是，更 為近來的研宄發(fā)現(xiàn)，689C多態(tài)性增加人單核細(xì)胞系中的MSP刺激性活性，引起更大的體外 移行和增殖。Hauser 等人，2012, Genes Tmmun 13:321-7〇
[0010] 因此，需要更好地理解MSP多態(tài)性在RON信號傳導(dǎo)和RON相關(guān)疾病（包括IBD)中 的作用、和更好的療法用于治療。
[0011] 發(fā)明概述
[0012] 本申請?zhí)峁┥婕笆荏wd'Origine Nantais(RON)的試劑和組合物，尤其是RON激動 劑，以及其使用方法和生產(chǎn)方法。在一個方面，本發(fā)明提供一種RON激動劑，其包含抗RON 激動劑抗體或其抗原結(jié)合片段、或者與RON結(jié)合的巨噬細(xì)胞刺激蛋白（MSP)融合蛋白或其 功能性片段。在一些實施方案中，RON激動劑包含MSP融合蛋白或其功能性片段。在一些實 施方案中，MSP融合蛋白包含MSP β和融合結(jié)構(gòu)部分。在某些優(yōu)選的實施方案中，融合結(jié)構(gòu) 部分包含二聚化結(jié)構(gòu)域，包括而不限于免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，免疫球 蛋白Fc結(jié)構(gòu)域包含IgG Fc結(jié)構(gòu)域；并且在某些其他實施方案中，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域是IgGl、IgG2、 IgG3或IgG4Fc結(jié)構(gòu)域。在某些其他實施方案中，F(xiàn)e結(jié)構(gòu)域是IgGlFc結(jié)構(gòu)域。在一些實施 方案中，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域還包含D265A和N297A(DANA)突變。在某些具體實施方案中，MSP融 合蛋白是二聚體。在某些其他實施方案中，MSP融合蛋白在RON結(jié)合方面是雙價的。在 ? 某些其他實施方案中，MSP融合蛋白還包含連接MSP β和融合結(jié)構(gòu)部分的接頭、優(yōu)選地肽接 頭。在一些實施方案中，肽接頭具有2至20個氨基酸殘基長度、優(yōu)選地4-16個氨基酸殘基 長度和更優(yōu)選地8-16個氨基酸殘基長度。在一些實施方案中，肽接頭具有16個氨基酸殘基 長度。在某些其他實施方案中，肽接頭具有4個氨基酸殘基長度。在某些具體實施方案中， MSP融合蛋白是人MSP融合蛋白。在其他實施方案中，MSP融合蛋白包含人MSPI3。在某些 其他實施方案中，MSP融合蛋白包含人IgGlFc結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，RON激動劑包含 與 SEQ ID Ν0:20、22 或24 的氨基酸序列具有至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、 95 %、96 %、97 %、98 %或99 %序列同一性的MSP融合蛋白。在某些其他實施方案中，RON激 動劑包含與SEQ ID Ν0:20的氨基酸序列具有至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、 95 %、96 %、97 %、98 %或99 %序列同一性的MSP融合蛋白。在某些具體實施方案中，MSP融 合蛋白包含SEQ ID Ν0:20的氨基酸序列。
[0013] 在另外的其他實施方案中，RON激動劑包含抗RON激動劑抗體或其抗原結(jié)合片段。 在一些實施方案中，抗RON激動劑抗體包含單克隆抗體YW651. 1或2Ε5. 8. 1的一個或多個 高變區(qū)。在某些其他實施方案中，抗體是抗人RON激動劑抗體。在某些其他實施方案中，抗 體是單克隆抗體、嵌合抗體人抗體、雙特異性抗體或人源化抗體。
[0014] 在另一個方面，本發(fā)明提供了包含一種或多種本文所述的RON激動劑和可藥用載 體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。在一些實施方案中，藥物組合物包含人MSP融合蛋白或 其功能性片段。在某個實施方案中，藥物組合物包含含有SEQ ID Ν0:20的氨基酸序的人 MSP融合蛋白。在某些其他實施方案中，藥物組合物包含抗人RON激動劑抗體或其抗原結(jié)合 片段。
[0015] 在又一個方面，本發(fā)明提供在有需求的受試者中治療MSP相關(guān)的或RON相關(guān)的疾 病或病癥的方法，所述方法包括步驟：向受試者施用如本文所述的RON激動劑或包含該RON 激動劑的藥物組合物。在一些實施方案中，RON相關(guān)的疾病或病癥與降低的RON活性相關(guān)。 在某些具體實施方案中，降低的RON活性與上皮細(xì)胞增殖、存活或移行相關(guān)。在一些實施方 案中，降低的RON活性與傷口愈合方面的缺陷、病況或障礙相關(guān)。在某些其他實施方案中， 降低的RON活性與消化道或皮膚中上皮傷口愈合方面的缺陷、病況或障礙相關(guān)。在某些其 他實施方案中，RON相關(guān)的疾病或病癥包括而不限于炎性腸病（IBD)(包括潰瘍性結(jié)腸炎和 克羅恩氏?。⒃l(fā)性硬化性膽管炎、或傷口愈合上的缺陷、病況或障礙。在某些其他實施方 案中，IBD是潰瘍性結(jié)腸炎。在另外的其他實施方案中，IBD是克羅恩氏病。
[0016] 在一些實施方案中，傷口愈合上的缺陷、病況或障礙是纖維化疾病。在某些其他實 施方案中，傷口愈合上的缺陷，病況或障礙與慢性上皮損傷相關(guān)，所述慢性上皮損傷包括而 不限于特發(fā)性肺纖維化、硬皮病和原發(fā)性膽汁性肝硬化。在某些其他實施方案中，傷口愈合 是上皮傷口愈合。在某些具體實施方案中，上皮傷口愈合缺陷發(fā)生在腔室、通道或管道的上 皮襯層中。在一些實施方案中，上皮傷口愈合缺陷發(fā)生在腸的上皮襯層中。在一些實施方 案中，上皮傷口愈合缺陷發(fā)生在結(jié)腸的上皮襯層中。不限于特定機(jī)制，在一些實施方案中， 增強(qiáng)的上皮傷口愈合由增加的上皮增殖、存活和/或移行反映或?qū)崿F(xiàn)。在某些其他實施方 案中，傷口愈合由傷口閉合程度度量。在某些其他實施方案中，上皮傷口愈合缺陷出現(xiàn)在皮 膚中。在一些實施方案中，傷口是慢性傷口、壓力性傷口或壓力性潰瘍。在某些其他實施方 案中，上皮傷口愈合缺陷與糖尿病相關(guān)。在一些實施方案中，傷口是糖尿病性傷口或糖尿病 性潰瘍，包括糖尿病性足潰瘍。在某些具體實施方案中，受試者是糖尿病受試者。在某些其 他實施方案中，受試者是糖尿病人患者。在一些實施方案中，RON激動劑包含人MSP融合蛋 白或其功能性片段、或者抗人RON抗體或其抗原結(jié)合片段。在某些其他實施方案中，RON激 動劑包含SEQ ID N0:20的氨基酸序列。
[0017] 在一些實施方案中，本發(fā)明方法還包括步驟：檢測受試者中的血清MSP水平，任 選地檢測正常對照中的血清MSP水平，并且當(dāng)受試者中的血清MSP水平與正常對照中的血 清MSP水平相比較低時，向受試者施用RON激動劑或包含該RON激動劑的藥物組合物。在 某些其他實施方案中，該方法還包括步驟：檢測受試者中的血清MSP水平，并且當(dāng)受試者中 的血清MSP水平與在正常對照中預(yù)先確定的血清MSP水平相比較低時，向受試者施用RON 激動劑或包含該RON激動劑的藥物組合物。在一些實施方案中，該方法還包括檢測正常 對照中血清MSP水平的步驟。在某些其他實施方案中，該方法還包括步驟：檢測受試者中 rs3197999多態(tài)性的存在，并且當(dāng)受試者中檢出rs3197999多態(tài)性時和/或當(dāng)受試者中的 血清MSP水平比正常對照低時，向受試者施用RON激動劑。在某些其他實施方案中，該方法 還包括步驟：當(dāng)受試者中檢出rs3197999多態(tài)性并且受試者中的血清MSP水平比正常對照 低時，向受試者施用RON激動劑。在一些實施方案中，RON激動劑包含人MSP融合蛋白或其 功能性片段、或者抗人RON抗體或其抗原結(jié)合片段。在某些其他實施方案中，RON激動劑包 含SEQ ID N0:20的氨基酸序列?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法，包括而不限于ELISA測 定法，測量血清MSP水平?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法檢測rs3197999多態(tài)性；示例 性方法包括使用基于測序或基于PCR的測定法，如Applied Biosystem提供的TaqMan平臺 (TaqMan SNP基因分型分析，目錄號4351379, Carlsbad，CA)，檢測。
[0018] 在另一個方面，本發(fā)明提供增強(qiáng)有需求的受試者中上皮傷口愈合的方法，所述方 法包括向受試者施用RON激動劑或包含該RON激動劑的藥物組合物的步驟。在又一個方面， 本發(fā)明提供一種增加上皮細(xì)胞增殖、存活和/或移行的方法，所述方法包括使細(xì)胞與RON激 動劑接觸。在又一個方面，本發(fā)明提供一種增加有需求的受試者中上皮細(xì)胞增殖、存活和/ 或移行的方法，所述方法包括向受試者施用RON激動劑或包含該RON激動劑的藥物組合物。 在一些實施方案中，受試者患有IBD。在某些其他實施方案中，IBD是潰瘍性結(jié)腸炎。在某 些其他實施方案中，IBD是克羅恩氏病。在一些實施方案中，將RON激動劑或包含本發(fā)明激 動劑的藥物組合物有利地施用于已接受了外科手術(shù)的受試者，以增強(qiáng)在外部或內(nèi)部手術(shù)切 開后傷口愈合。在某些其他實施方案中，受試者是糖尿病受試者。在另外的其他實施方案 中，受試者是糖尿病人患者。因此，在又一個方面中，本發(fā)明提供一種增強(qiáng)糖尿病受試者中 上皮傷口愈合的方法。在一些實施方案中，上皮傷口愈合發(fā)生在糖尿病受試者的皮膚中。在 一些實施方案中，RON激動劑包含人MSP融合蛋白或其功能性片段、或者抗人RON抗體或其 抗原結(jié)合片段。在某些其他實施方案中，RON激動劑包含SEQ ID N0:20的氨基酸序列。
[0019] 在這些方面的一些實施方案中，所述方法還包括步驟：檢測（l)rs3197999多態(tài)性 的存在和/或（2)受試者的血清MSP水平，當(dāng)受試者中檢出rs3197999多態(tài)性時或當(dāng)受試 者的血清MSP水平比正常對照低時，向受試者施用RON激動劑。在一些實施方案中，該方法 還包括檢測正常對照中血清MSP水平的步驟。在一些實施方案中，該方法還包括步驟：（a) 檢測受試者中rs3197999多態(tài)性的存在并且當(dāng)受試者中檢出rs3197999多態(tài)性時向受試者 施用RON激動劑，或（b)檢測受試者中的血清MSP水平并且當(dāng)受試者中的血清MSP水平與 正常對照中的血清MSP水平相比較低時，向受試者施用RON激動劑。在某些其他實施方案 中，該方法還包括步驟：當(dāng)受試者中檢出rs3197999多態(tài)性并且受試者中的血清MSP水平比 正常對照低時，向受試者施用RON激動劑。
[0020] 在又一個方面，本發(fā)明提供在有需求的受試者中治療糖尿病的方法，所述方法包 括向受試者施用RON激動劑或包含該RON激動劑的藥物組合物的步驟。在另一個方面，本 發(fā)明提供在有需求的受試者中降低血糖的方法，所述方法包括向受試者施用RON激動劑或 包含該RON激動劑的藥物組合物的步驟。在又一個方面，本發(fā)明提供治療與糖尿病相關(guān)的 病狀的方法。在一些實施方案中，病狀是但不限于糖尿病酮癥酸中毒、代謝性酸中毒、高血 糖、高血糖高滲性綜合征或代謝綜合征。在這些方面的一些實施方案中，RON激動劑包含人 MSP融合蛋白或其功能性片段、或者抗人RON抗體或其抗原結(jié)合片段。在某些其他實施方案 中，RON激動劑包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列。
[0021] 在這些方面的某些其他實施方案中，治療糖尿病的方法還包括步驟：(a)檢測受 試者中rs3197999多態(tài)性的存在并且當(dāng)受試者中檢出rs3197999多態(tài)性時向受試者施用 RON激動劑，和/或（b)檢測受試者中的血清MSP水平并且當(dāng)受試者中的血清MSP水平與正 常對照中的血清MSP水平相比較低時，向受試者施用RON激動劑。
[0022] 在一些實施方案中，還包括步驟：檢測