M971嵌合抗原受體的制作方法
【專利說明】M971嵌合抗原受體
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2012年10月24日提交的美國臨時申請第61/717, 960號的權(quán)益， 其全部內(nèi)容通過引用并入本文。
[0003] 以電子方式提交的材料通過引用并入
[0004] 通過引用整體并入本文的是隨本文同時提交的并且如下確定的計算機可讀的核 苷酸/氨基酸序列表：名稱為"714144_ST25. txt"，日期為2013年8月30日的一份31，786 字節(jié)ASCII (文本）文件。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 癌癥為公共健康問題。雖然在治療諸如化療中有所進展，但對于許多癌癥，包括血 液惡性腫瘤的預(yù)后可能很差。例如，據(jù)估計，2000年在美國預(yù)期超過45, 000例死亡是由于 非霍奇金氏淋巴瘤和白血?。℅reenlee等，CA Cancer J. Clin. ,50:7-33 (2000))。因此，存 在對癌癥，特別是血液惡性腫瘤的其他治療的未得到滿足的需求。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 本發(fā)明的實施方案提供包含含有SEQ ID NO: 1-6的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域 和細胞內(nèi)T細胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體（CAR)。
[0009] 本發(fā)明的其它實施方案提供涉及本發(fā)明的CAR的相關(guān)的核酸、重組表達載體、宿 主細胞、細胞群體、抗體或其抗原結(jié)合部分以及藥物組合物。
[0010] 本發(fā)明的另外的實施方案提供檢測哺乳動物中存在癌癥的方法以及治療或預(yù)防 哺乳動物中癌癥的方法。
[0011] 附圖中幾個視圖的簡要說明
[0012] 圖IA至圖IG為示出在不同的效應(yīng)物與靶標（E:T)比率下，靶標51Cr標記的白血 病細胞系 REH(A)、SEM(B)、NALM6-GL (C)、K0PN8 (D)、Daudi (E)、Raji (F)和 K562 (G)被未轉(zhuǎn) 導(dǎo)的（模擬，魯；圓形）或用以下CAR(HA22-SH-第二代第1版（▼ )，m971-第二代第1版 (▲;空心三角形）或CD19-特異性CAR(_ ;正方形））轉(zhuǎn)導(dǎo)的人T細胞效應(yīng)物裂解％的圖。
[0013] 圖2A至圖2C為示出在不同的E:T比率下，靶標白血病細胞系Raji (A)、 NALM6-GL(B)或K562(C)被未轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞（模擬，魯；圓形），m971-第二代第1版CAR(A) 或m971-第三代CAR( ▼)效應(yīng)物裂解百分比的圖。
[0014] 圖3A至圖3C為示出在與白血病細胞系NALM6-GL(CD22? ) (A)、Raji (CD22高）（B) 或K562(CD22-陰性）（C)共培養(yǎng)后，由未轉(zhuǎn)導(dǎo)的（模擬）或用以下CAR中的一種（抗-CD19， m971-第二代第 1 版（SEQ ID N0:23)，m971-第三代（SEQ ID N0:24)，HASH22-第二代第 1 版，HASH22-第二代第2版或HASH22-第三代）轉(zhuǎn)導(dǎo)qA分泌的干擾素（IFN)-Y (pg/ml)的 量的圖。 ^
[0015] 圖3D至圖3F為示出在與白血病細胞系NALM6-GL(CD22? ) (A)、Raji (CD22高）（B) 或K562(CD22-陰性）（C)共培養(yǎng)后，由未轉(zhuǎn)導(dǎo)的（模擬）或用以下CAR中的一種（抗-CD19， m971-第二代第 1 版（SEQ ID N0:23)，m971-第三代（SEQ ID N0:24)，HASH22-第二代第 1 版，HASH22-第二代第2版或HASH22-第三代）轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞分泌的白細胞介素（IL)-2(pg/ ml)的量的圖。
[0016] 圖3G至圖31為示出在與白血病細胞系NALM6-GL(CD22is) (A)、Raji(CD22hi)⑶或 K562(CD22-陰性）（C)共培養(yǎng)后，由未轉(zhuǎn)導(dǎo)的（模擬）或用以下CAR中的一種（抗-CD19， m971-第二代第 1 版（SEQ ID N0:23)，m971-第三代（SEQ ID N0:24)，HASH22-第二代 第1版，HASH22-第二代第2版或HASH22-第三代）轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞分泌的腫瘤壞死因子 (TNF)-a (pg/ml)的量的圖。
[0017] 圖4A為示出在30天的時段內(nèi)測量由熒光素酶（轉(zhuǎn)染到白血病細胞內(nèi)，所述白血 病細胞被注射到小鼠）與注射至小鼠的焚光素反應(yīng)生成的生物發(fā)光信號（光子/s/cm 2/sr) 的圖。用對照T細胞（"模擬"，未轉(zhuǎn)導(dǎo)的，魯；圓形）或用HASH22CAR-第二代第1版（; 正方形）或m971-第二代第1版（三角形，SEQ ID NO: 23)轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞處理小鼠。光子/ s/cm2/sr值越高指示腫瘤負荷越大。
[0018] 圖4B為示出用對照T細胞（"模擬"，未轉(zhuǎn)導(dǎo)的，正方形）或用HASH22CAR-第二 代第1版（圓形）或97ICAR-第二代第1版（三角形，SEQ ID NO: 23)轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞處理 的小鼠在30天的存活百分比的圖。（模擬V. HA22，p = 0. 0019 ;模擬V. m971，p = 0. 0019 ; m971v. HA22, p = 0·003)。
[0019] 圖5為示出在用未轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞（模擬）或用編碼m971-第二代第2版CAR (SEQ 10勵:22)的核苷酸序列轉(zhuǎn)導(dǎo)的151106、51106、11106或1110 51'細胞治療患有白血病的 小鼠之后三天、五天和八天的生物發(fā)光圖像的表。從灰至白的陰影變化指示腫瘤負荷增加。
[0020] 圖6為示出在44天的時段內(nèi)，圖5中顯示的小鼠的生物發(fā)光發(fā)射的光子總數(shù)目的 圖。對光子總數(shù)目進行定量并且作圖，并示出每個時間點的平均值和標準差。用未轉(zhuǎn)導(dǎo)的T 細胞（模擬）（加號符號）或用編碼m971-第二代第2版CAR (SEQ ID NO: 22)的核苷酸序 列轉(zhuǎn)導(dǎo)的15x 106(菱形）、5x 106(花）、lx 106(十字）或Ix 105(星號）T細胞治療小鼠。
[0021] 發(fā)明詳述
[0022] 本發(fā)明的實施方案提供包含含有SEQ ID NO: 1-6的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域 和細胞內(nèi)T細胞信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體（CAR)。
[0023] CAR為人工構(gòu)建的雜合蛋白質(zhì)或多肽，所述雜合蛋白質(zhì)或多肽含有連接至T細胞 信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（如，單鏈可變片段（scFv) )。CAR的特性包括它 們能夠以非-MHC-限制的方式重定向T細胞對選定的靶標的特異性和反應(yīng)性，從而利用單 克隆抗體的抗原結(jié)合性質(zhì)。非-MHC限制的抗原識別使表達CAR的T細胞能夠識別不依賴抗 原加工的抗原，從而繞過腫瘤逃逸的主要機制。此外，當在T細胞中表達時，有利的是，CAR 不會與內(nèi)源性T細胞受體（TCR) α鏈和β鏈二聚化。
[0024] 本文使用的短語"具有抗原特異性"和"引發(fā)抗原特異性應(yīng)答"意指CAR可特異性 結(jié)合于抗原并免疫識別抗原，使得CAR至抗原的結(jié)合引發(fā)免疫應(yīng)答。
[0025] 本發(fā)明的CAR對CD22具有抗原特異性。CD22為屬于免疫球蛋白（Ig)超家族的 譜系限制的B細胞抗原。CD22在60-70%的B細胞淋巴瘤和白血病（如，B-慢性淋巴細胞 白血病、多毛細胞白血病、急性淋巴細胞白血?。ˋLL)和伯基特（Burkitt' s)淋巴瘤）中 表達并且不存在于B細胞形成早期階段的細胞表面上或干細胞上。Vaickus等，Grit. Rev. Oncol. /HematoL, 11:267-297 (1991) ;Bang 等，Clin. Cancer Res.，11:1545-50 (2005) 〇
[0026] 不受特定理論或機制的束縛，據(jù)信通過引發(fā)對CD22的抗原特異性應(yīng)答，本發(fā)明的 CAR提供下述中的任何一種或多種：靶向并破壞表達CD22的癌細胞、減少或消除癌細胞、促 進免疫細胞浸潤至腫瘤位點以及增強/延伸抗癌應(yīng)答。因為CD22不在B細胞形成早期階 段或干細胞上表達，所以預(yù)期本發(fā)明的CAR大體上有利地避免靶向/破壞干細胞和/或早 期形成階段的B細胞。
[0027] 本發(fā)明的實施方案提供包含m971抗體（〃m971〃）的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的CAR。m971 的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性地結(jié)合于CD22。在這方面，本發(fā)明的優(yōu)選實施方案提供包含抗 原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的CAR，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含m971的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的單鏈可變片段 (scFv)，由m971的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的單鏈可變片段（scFv)組成，或基本上由m971的抗原 結(jié)合結(jié)構(gòu)域的單鏈可變片段（scFv)組成。與HA22免疫毒素相比，m971抗體提供至⑶22的 改善結(jié)合并且還結(jié)合于不同的CD22表位。Xiao等，mAbsl: 3, 297-303(2009)。
[0028] 抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可包含輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)。在本發(fā)明的實施方案中， 重鏈可變區(qū)包含⑶Rl區(qū)、⑶R2區(qū)和⑶R3區(qū)。在這方面，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可包含以下中的 一種或多種：含有SEQ ID NO: 1的重鏈⑶Rl區(qū)；含有SEQ ID NO:2的重鏈⑶R2區(qū)；和含有 SEQ ID N0:3的重鏈CDR3區(qū)。優(yōu)選地，重鏈包含全部SEQ ID N0:l-3。
[0029] 在本發(fā)明的實施方案中，輕鏈可變區(qū)可包含輕鏈CDRl區(qū)、輕鏈CDR2區(qū)和輕鏈CDR3 區(qū)。在這方面，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可包含以下中的一種或多種：含有SEQ ID N0:4的輕鏈⑶Rl 區(qū)；包含SEQ ID NO: 5的輕鏈CDR2區(qū)；和包含SEQ ID NO:6的輕鏈CDR3區(qū)。優(yōu)選地，輕 鏈包含全部SEQ ID N0:4-6。在特別優(yōu)選的實施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含全部SEQ ID NO:1-6〇
[0030] 抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的輕鏈可變區(qū)可包含SEQ ID NO: 7,由SEQ ID NO: 7組成，或基本 上由SEQ ID N0:7組成?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域的重鏈可變區(qū)可包含SEQ ID N0:8,由SEQ ID N0:8 組成或基本上由SEQ ID N