專利名稱：：使用Dickkopf-1和/或-4抗體的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及使用Dickkopf-l("DKKl，，)抗體、Dickkopf-4("DKK4")抗體或其兩者的組合物和方法，以治療DKK異常性相關(guān)的骨密度、新陳代謝、糖尿病、癌癥等。
背景技術(shù)：
：Wnt信號(hào)通路涉及胚胎發(fā)育和瘤形成過程的調(diào)控。胞外Wnt蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)許多細(xì)胞類型生長(zhǎng)和分化，所述生長(zhǎng)和分化尤其包括成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和調(diào)節(jié)。許多癌癥與骨組織相關(guān)，并可導(dǎo)致例如在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)的那些成骨細(xì)胞病變，或例如在肺癌、乳腺癌和多發(fā)性骨髓瘤中發(fā)現(xiàn)的那些骨質(zhì)溶解性損傷(例如，Tian等人，2003NewEnglandJ.Med.349:2483-2494)。Wnt基因家族的成員編碼多種發(fā)育過程所需的分泌型糖蛋白(Fedi等人，1999丄Bio.Chem.274:19465-19472)。Wnt家族成員蛋白質(zhì)啟動(dòng)對(duì)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)和分化重要的信號(hào)通路，其引起骨沉積。除了骨形成之外，骨再吸收是由稱為破骨細(xì)胞的細(xì)胞執(zhí)行的進(jìn)行性正常過程。反之，核因子kB配體的受體活化劑(RANKL)是破骨細(xì)胞性骨再吸收的最終介導(dǎo)者，其在絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)理中具有重要作用，也在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、轉(zhuǎn)移癌、多發(fā)性骨髓瘤、芳化酶抑制劑治療和抗雄激素治療(androgendeprivationtherapy)相關(guān)的骨丟失中具有重要作用(參見例如Lewiecki(2006)ExpertOpinBiolTher.6:1041-50)。由成骨細(xì)胞表達(dá)的護(hù)骨蛋白(OPG)抑制RANKL，因而減少石皮骨細(xì)胞活性和形成。合成代謝的骨形成和分解代謝的(analytic)骨再吸收的平衡調(diào)節(jié)正常骨密度，合成代謝的骨形成和分解代謝的骨再吸收中一個(gè)或另一個(gè)增加分別導(dǎo)致骨密度增加或骨丟失增加。Wnt與其他細(xì)胞表面蛋白結(jié)合并由此發(fā)揮作用，并且Wnt信號(hào)可促成瘤形成過程。此外，基因改變可影響涉及稱為腺瘤結(jié)腸息肉的蛋白質(zhì)(3-聯(lián)蛋白的細(xì)胞蛋白質(zhì)復(fù)合體，并且在患有如人結(jié)腸癌、黑素瘤和肝細(xì)胞癌的患者細(xì)胞中已檢測(cè)到這些復(fù)合體，這表明Wnt信號(hào)通路的異常與這些以及其他可能的人類癌癥的發(fā)生有關(guān)(Fedi等人，1999J.Bio.Chem.274:19465-19472)。至少有兩個(gè)家族的蛋白質(zhì)抑制Wnt信號(hào)發(fā)放，即分泌型巻曲相關(guān)家族和Dickkopf(DKK)家族。目前DKK家族包括四個(gè)家族成員，即DKK1(人類DNA，登錄號(hào)NM—12242;PRT，登錄號(hào)094907)、DKK2(人類，登錄號(hào)NM—014421;PRT登錄號(hào)NP_055236)、DKK3(人類，登錄號(hào)NM_015881;PRT,登錄號(hào)AAQ88了")和DKK4(人類，登錄號(hào)NM—014420;PRT,登錄號(hào)NP_055235)。Dickkopf-l(DKKl)是Wnt/(3-聯(lián)蛋白信號(hào)通路的分泌型抑制劑。參見例如Niehrs的美國(guó)專利申請(qǐng)2005-0079173、McCarthy的美國(guó)專利申請(qǐng)2004-0234515。DKK1具有抑制Wnt誘導(dǎo)的軸(axis)復(fù)制能力，并且遺傳分析顯示DKK1向上游抑制Wnt信號(hào)發(fā)放。暴露于增加水平的DKKl后，對(duì)小雞和小鼠胚胎中骨結(jié)構(gòu)丟失的影響證明DKKl在骨骼發(fā)育中也很重要(Tian等人，2003NewEnglandJ.Med.349:2483-2494)。增加的DKKl血清水平已與前列腺癌相關(guān)，并且在患有多發(fā)性骨髓瘤的患者骨髄血漿和外周血中增強(qiáng)的DKKl和RANKL水平與病灶性的骨病變相關(guān)，參見例如Tian2003,OMIM登錄號(hào)605189。DKKl在脂肪形成、軟骨形成、胃腸道上皮增生、風(fēng)濕癥相關(guān)的骨丟失和毛囊14^形成的開始中也發(fā)揮作用。OMIM登錄號(hào)605189。Dickkopf-4(DKK4)未被良好表征但同樣是Wnt途徑的分泌型抑制劑。已顯示DKK4在患有阿爾茨海默病患者的斑點(diǎn)中沉積并且在肌肉中表達(dá)。Wnt在肌肉形成中的作用未知，因此本文假定DKK4對(duì)肌肉形成具有抑制作用。需要治療癌癥和骨密度異常的組合物和方法，其包括干擾或中和DKK1和/或DKK4介導(dǎo)的Wnt信號(hào)發(fā)放的拮抗作用的這類物質(zhì)。發(fā)明概述本文本發(fā)明的實(shí)施方案提供抗體或其選擇性結(jié)合的抗原結(jié)合部分，所述部分中和DKK1和/或DKK4多肽或其片段。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體是DKKI/4中和抗體。在多個(gè)實(shí)施方案中，DKKI/4中和抗體的抗原結(jié)合部分未結(jié)合DKK2或DKK3。在一個(gè)實(shí)施方案中抗體或其抗原結(jié)合部分置于免疫球蛋白樣支架內(nèi)，如選自例如人的、人源化的、人改造的(humaneer)、鯊魚或駱駝支架的構(gòu)架，所述抗體或其抗原結(jié)合部分和/或還可是重組、嵌合或CDR移植的抗體。例如，在本發(fā)明中旨在設(shè)計(jì)使人抗鼠抗體應(yīng)答最小化的技術(shù)(Kalobios的人改造技術(shù)或PDL的人源化技術(shù))。此外，DKK1或DKK4特異性的抗原結(jié)合部分也可在非免疫球蛋白樣支架內(nèi)，包括例如，置于Adnectin、血纖蛋白原、源自錨蛋白的重復(fù)序列等類型的構(gòu)架內(nèi)。在具體實(shí)施方案中，DKK1抗體表征為具有特異性靶向蛋白DKK1的抗原結(jié)合區(qū)，并且該抗體或功能片段結(jié)合到DKK1或其片段。在相關(guān)的實(shí)施方案中，DKK4抗體表征為具有特異性靶向蛋白DKK4的抗原結(jié)合區(qū)，并且該抗體或功能片段結(jié)合到DKK4或其片段。在相關(guān)的實(shí)施方案中，DKK4抗體表征為具有特異性靶向蛋白DKK4的抗原結(jié)合區(qū)，并且該抗體或功能片段結(jié)合到DKK4或其片段。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合至DKK1和DKK4多肽，而非DKK2或DKK3多肽。在另一實(shí)施方案中抗體或其抗原結(jié)合部分是單克隆的。在另一實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部分是多克隆的。在多個(gè)實(shí)施方案中，DKK1抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合由DKK1或DKK4多肽的30個(gè)連續(xù)氨基酸組成的肽。在相關(guān)的實(shí)施方案中，至少通過下列一種檢測(cè)來測(cè)定對(duì)DKK1或DKK4的結(jié)合抑制Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)錄的DKKl或DKK4拮抗作用；表面等離振子共振親合測(cè)定，酶聯(lián)免疫吸收試驗(yàn)結(jié)合；基于電化學(xué)發(fā)光的結(jié)合分析；FMAT、SET、SPR、ALP、TopFlash、生物標(biāo)志物如人骨鉤蛋白(OCN)、前膠原1型含氮前肽(PINP)和護(hù)骨蛋白(OPG)的血清濃度，以及結(jié)合到細(xì)胞表面的受體如Frizzled(Fz)、LRP(LRP5/6)或Kremen(Krm)的血清濃度。在某些實(shí)施方案中，DKK1抗體或抗原結(jié)合部分具有至少一種以下特性對(duì)DKK1比對(duì)人類DKK2或DKK3的選擇性至少多103、104或105倍；以小于100nM、50nM、10nM、1.0nM、500pM、100pM、50pM或10pM的K。n結(jié)合到DKK1或DKK4;并且具有小于1()-2每秒、10-3每秒、10-4每秒或10-5每秒的DKK1解離率(off-rate)。在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與DKK1和/或DKK4竟?fàn)幗Y(jié)合LRP5/6。在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體與DKK1和/或DKK4竟?fàn)幗Y(jié)合Krm。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供任一上述抗體或這些抗體的功能片段的分離的抗原結(jié)合區(qū)，以及這些區(qū)域的M^列。因此在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供選自SEQIDNO:2-20和SEQIDNO:40-72的分離的氨基酸序列以及這些序列的保守的或人改造的變體。此外，在某些其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供^J^酸序列SEQIDNO:2-20、65-72，以及這些序列的保守的或人改造的變體，所述M酸序列提供各自是H-CDR-3的分離的抗原結(jié)合區(qū)。在相關(guān)的實(shí)施方案中，分離的抗原結(jié)合區(qū)是具有選自SEQIDNO:2-20、57-64的氨基酸序列以及這些序列的保守的或人改造的變體的H-CDR2區(qū)。在另一相關(guān)實(shí)施方案中，分離的抗原結(jié)合區(qū)是描述于選自以下序列的共有H-CDR2區(qū)具有氨基酸序列GISGSGSYTYYADSVKF的SEQIDNO:40,具有^^斷列GISYYGGNTYYADSVKF的SEQIDNO:41，具有#^財(cái)列GISYYGGSTYYADSVKF的SEQIDNO:42，以及這些序列的氮基酸殘基的保守的或人改造的變體。在某些實(shí)施方案中，提供的新序列是SEQIDNO:2-5、8-11、20、49-56,以及這些序列的保守的或人改造的變體，其提供的分離的抗原結(jié)合區(qū)是H畫CDR1區(qū)。在相關(guān)的實(shí)施方案中，分離的抗原結(jié)合區(qū)是具有選自以下氨基酸序列的共有H-CDR1區(qū)^J^酸序列(使用單字母^^酸代碼)GFTFSSYGMT(SEQIDNO:43)、GFTFNSYGMT(SEQ腦O:44)、GFTFSNYGMT(SEQIDNO:45)、GFTFSSYWMT(SEQIDNO:46)、GFTFSSYAMT(SEQIDNO:47)、GFTFSSYGMS(SEQIDNO:48)以;Sjf壬意這些序列的保守的或人改造的變體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的M酸序列是具有L-CDR3區(qū)的分離的抗原結(jié)合區(qū)，例如選自SEQIDNO:21-39、89-96，以及這些序列的保守的或人改造的變體的氨基酸序列。在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，分離的抗原結(jié)合區(qū)是具有選自SEQIDNO:21-39、73-80，以及這些序列的保守的或人改造的變體的M酸序列的L-CDR1區(qū)。在另一實(shí)施方案中，分離的抗原結(jié)合區(qū)是具有選自SEQIDNO:21-39、81-88，以及這些序列的保守的或人改造的變體的氨基*列的L-CDR2區(qū)。在某些實(shí)施方案中，分離的抗原結(jié)合區(qū)是具有選自SEQIDNO:21-39,以及這些序列的保守的或人改造的變體的M酸序列的可變輕鏈。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供選自SEQIDNO:97-103的核苷^列。在相關(guān)的實(shí)施方案中，每個(gè)這些核苷酸序列編碼M酸序列并且這些編碼的氨基^列的保守的或人改造的變體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，每個(gè)SEQIDNO:97-100的核苷酸序列編碼抗原結(jié)合輕鏈。在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，每個(gè)SEQIDNO:101-103的核苷酸序列編碼抗原結(jié)合重鏈。在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步將這些核酸序列中的每一個(gè)最優(yōu)化以用于表達(dá)。優(yōu)選的細(xì)胞包括但不限定于，例如中國(guó)倉鼠(如CHO)細(xì)胞、桿狀病毒、酵母、細(xì)菌、骨髓瘤細(xì)胞，和/或智人(H.sapiens)。優(yōu)選地，將序列進(jìn)行表達(dá)、生產(chǎn)以及臨床用途的優(yōu)化。臨床使用優(yōu)化的特征包括但不限定于，例如，半壽期、藥物代謝動(dòng)力學(xué)(PK)、抗原性、效應(yīng)功能、FcRn清除，以及包括抗體依賴細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)或補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性(CDC)活性的患者應(yīng)答。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有由選自SEQIDNO:101-103的核苷酸序列編碼的重鏈的分離的抗原結(jié)合區(qū)。在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有由選自SEQIDNO:97-100的核苷酸序列編碼的輕鏈的分離的抗原結(jié)合區(qū)。在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有由選自SEQIDNO:97-100的核苷酸序列編碼的輕鏈，以及由選自SEQIDNO:101-103的核苦酸序列編碼的重鏈的分離的抗原結(jié)合區(qū)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供選自SEQIDNO:104-110的核苷^列。在相關(guān)的實(shí)施方案中，這些核苷酸序列中的每一個(gè)編碼M酸序列，并且本文這些M酸序列保守的或人改造變體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，SEQIDNO:104-107的核苷酸序列中的每一個(gè)編碼抗原結(jié)合輕鏈。在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，SEQIDNO:108-110的核普酸序列中的每一個(gè)編碼抗原結(jié)合重鏈。在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，將這些核苷酸序列中的每一個(gè)進(jìn)行表達(dá)和/或臨床用途的優(yōu)化。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的抗原結(jié)合區(qū)，其具有由選自SEQIDNO:108-110的核苷酸序列編碼的重鏈。在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的抗原結(jié)合區(qū)，其具有由選自SEQIDNO:104-107的核香酸序列編碼的輕鏈。在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的抗原結(jié)合區(qū)，其具有由選自SEQIDNO:104-107的核普酸序列編碼的輕鏈，以及由選自SEQIDNO:108-110的核苦酸序列編碼的重鏈。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供選自SEQIDNO:111-117的氨基,列，并且提供這些序列的保守變體。在相關(guān)的實(shí)施方案中，每一SEQIDNO:111-114描迷抗原結(jié)合輕鏈。在另一實(shí)施方案中，每一SEQIDNO:115-117描述抗原結(jié)合重鏈。在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，將氨基酸序列進(jìn)行表達(dá)和/或臨床用途的優(yōu)化。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的抗原結(jié)合區(qū)，其具有描述于選自SEQIDNO:115-117的M酸序列中的重鏈，并且提供這些序列的保守變體。在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的抗原結(jié)合區(qū)，其具有描述于選自SEQIDNO:111-114的氨基^列中的輕鏈，并且提供這些序列的保守變體。在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的抗原結(jié)合區(qū)，其具有描述于選自SEQIDNO:115-117的氨基酸序列中的重鏈(并且提供這些序列的保守變體)，以及描迷于選自SEQIDNO:111-114的氨基酸序列中的輕鏈(并且提供這些序列的保守變體)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供選自SEQIDNO:120-121的核苷,列，和/或分離的抗原結(jié)合區(qū)，其具有由各核苷酸序列編碼的輕鏈或重鏈可變區(qū)。在相關(guān)的實(shí)施方案中，每個(gè)這些核苷酸序列編碼M酸序列，并且這些M酸序列的保守的或人改造的變體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，核苷酸序列SEQIDNO:120編碼抗原結(jié)合輕鏈。在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，核苦酸序列SEQIDNO:121編碼抗原結(jié)合重鏈。在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，進(jìn)一步將每個(gè)這些核苷酸序列進(jìn)行表達(dá)和/或臨床用途的優(yōu)化。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供選自118-119的M酸序列以及這些序列的保守的或人改造的變體。在相關(guān)的實(shí)施方案中，SEQIDNO:118描述輕鏈的抗原結(jié)合可變區(qū)。在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，SEQIDNO:119描述重鏈的抗原結(jié)合可變區(qū)。在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，將M酸序列進(jìn)行表達(dá)和/或臨床用途的優(yōu)化。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與描述于SEQIDNO:2-39的CDR區(qū)具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99。/o同一性的^J^,列，在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與描述于SEQIDNO:111-120的序列具有至少60、70、80、卯、95、96、97、98或99%同一性的#^斷列。在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與描述于SEQIDNO:97-110和120-121中的序列具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%同一性的核苷酸序列。在某個(gè)實(shí)施方案中，任一上述分離的抗體都是IgG。在相關(guān)的實(shí)施方案中，任一上述分離的抗體都是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在另一實(shí)施方案中，抗體是IgE、IgM、IgD或IgA。在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明選自單克隆抗體組合物或多克隆抗體組合物。在另一實(shí)施方案中，抗體是嵌合的、人源化的、人改造的、重組的等。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有DKK1表位特異性的抗原結(jié)合區(qū)的分離的人或人源化抗體或其功能片段，并且所述抗體或功能片段結(jié)合DKK1或DKK4,或阻止DKK1或DKK4結(jié)合細(xì)胞表面受體(例如受體如LRP5/6，Kremen，F(xiàn)rizzled)。在某些實(shí)施方案中抗體或其片段預(yù)防、治療或改善骨質(zhì)溶解性損傷的發(fā)展。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗DKK組合物預(yù)防、治療或改善DKK1或DKK4相關(guān)的癌癥或疾病。在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的人或人源化抗體或其功能片段，具有靶向DKK1或DKK4的表位的特異性抗原結(jié)合區(qū)，并且該表位包含來自多肽片段的六個(gè)或更多個(gè)M酸殘基，所述多肽片段含有DKK1和/或DKK4的CYSl-交聯(lián)(linker)-CYS2結(jié)構(gòu)域。在相關(guān)的實(shí)施方案中，表位是構(gòu)象表位。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，表位存在于CYS2結(jié)構(gòu)域內(nèi)。在具體實(shí)施方案中，表位包括修飾的氨基酸殘基。在相關(guān)的實(shí)施方案中，表位包含至少一個(gè)糖基化的氨基酸殘基。功能片段包括Fv和Fab片段(包括單鏈型，如scFv)，以及抗體的其他抗原結(jié)合區(qū)，所述抗體包括那些連接到非免疫球蛋白支架的抗體、重鏈抗體如駱駝和鯊魚抗體，以及納米抗體(nanobody)。在相關(guān)的實(shí)施方案中，上述分離的抗體是IgG。在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，上述分離的抗體是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。在另一實(shí)施方案中，抗體是IgE、IgM或IgA。在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明是多克隆抗體組合物。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供藥物組合物，其具有至少一個(gè)任一上述抗體或功能片段或保守變體，以及可藥用載體或賦形劑。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其具有編碼任一上述抗體或其功能片段的基因。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療與DKK1或DKK4表W目關(guān)的障礙或病癥的方法。本文所用的"DKK1相關(guān)疾病"或"DKK4相關(guān)疾病，，包括但不限定于，骨質(zhì)溶解性損傷，特別是與骨髓瘤(尤其是多發(fā)性骨髓瘤)相關(guān)的骨質(zhì)溶解性損傷，或與骨癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、黑素瘤、肝細(xì)胞癌、上皮癌、食道癌、腦癌、肺癌、前列腺癌或胰腺癌或其轉(zhuǎn)移瘤相關(guān)的骨質(zhì)溶解性損傷；與移植相關(guān)的骨丟失。另外的疾病或障礙包括但不限定于，例如，骨肉瘤、前列腺癌、肝細(xì)胞癌(HCC)、骨髓瘤包括多發(fā)性骨髓瘤、糖尿病、肥胖癥、肌萎縮、阿爾茨海默病、骨質(zhì)疏爭(zhēng)〉癥、骨質(zhì)減少、風(fēng)濕病、結(jié)腸炎和/或不希望的脫發(fā)。該方法涉及在受試者需要時(shí)向其施用有效量的任一上述藥物組合物。在相關(guān)的實(shí)施方案中，待治療的障礙或病癥是骨密度異常性。在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，待治療的骨密度異常性是受試者中骨質(zhì)溶解性損傷的存在。在另一實(shí)施方案中，待治療的障礙或病癥是骨質(zhì)疏^"病癥，如與癌癥相關(guān)的骨質(zhì)溶解性損傷。在相關(guān)的實(shí)施方案中，治療的癌癥是骨髓瘤，如多發(fā)性骨髓瘤，或骨癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、黑素瘤、肝細(xì)胞癌、上皮癌、食道癌、腦癌、肺癌、前列腺癌或胰腺癌或其轉(zhuǎn)移瘤。在另一實(shí)施方案中，骨質(zhì)疏木>病癥是骨質(zhì)疏*〉癥或骨質(zhì)減少或骨肉瘤。在某些實(shí)施方案中，任一上述方法還涉及施用化療物質(zhì)。在相關(guān)的實(shí)施方案中，化療物質(zhì)是抗癌物質(zhì)。在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，化療物質(zhì)是抗骨質(zhì)疏^"物質(zhì)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供處理靶細(xì)胞的方法，該方法包括以任一上述抗體或其功能片段阻礙DKK1或DKK4與細(xì)胞的相互作用。通常，耙細(xì)胞具有結(jié)合DKK1或DKK4的受體。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是成骨細(xì)胞，其中以本發(fā)明的中和抗DKK1/4組合物進(jìn)行處理將增加增殖并刺激骨形成。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是肌細(xì)胞，其中處理將阻礙肌萎縮。在相關(guān)的實(shí)施方案中，本方法還涉及以化療物質(zhì)或輻射處理具有乾細(xì)胞的患者。在相關(guān)的實(shí)施方案中，施用或接觸后，上述任一方法還包括觀察骨質(zhì)溶解性損傷發(fā)展的改善或延緩。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供識(shí)別血清中DKK1或DKK4的方法，該方法涉及以另外具有可檢測(cè)標(biāo)記的任一上述抗體或抗體片段檢測(cè)DKK1或DKK4。該標(biāo)記是放射性的、焚光的、磁性的、順磁性的或化學(xué)發(fā)光的。在另一實(shí)施方案中，任一上述人或人源化抗體或抗體片段都是合成的。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供任一上述抗體或這些抗體的功能片段以及其他治療物質(zhì)的藥物組合物，其他治療物質(zhì)可選自抗癌物質(zhì)、抗骨質(zhì)疏松物質(zhì)、抗生素、抗新陳代謝物質(zhì)、抗糖尿病物質(zhì)、抗炎癥物質(zhì)、抗血管生成物質(zhì)、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子。本發(fā)明還涉及以藥物組合物在哺乳動(dòng)物特別是人類中預(yù)防或治療增殖性疾病或諸如癌癥的疾病的方法，其中所迷組合物包括(a)本發(fā)明的DKK1/4中和物質(zhì)；和(b)—種或多種藥物活性物質(zhì)；其中至少一種藥物活性物質(zhì)是抗癌治療劑。本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包括(a)DKK1/4中和抗體；(b)藥物活性物質(zhì)；和(c)可藥用載體；其中至少一種藥物活性物質(zhì)是抗癌治療劑。本發(fā)明還涉及商業(yè)性包裝或產(chǎn)品，其包括(a)DKK1/4中和抗體的藥物制劑；和(b)用于同時(shí)、并列、分別或順次使用的藥物活性物質(zhì)的藥物制劑；其中至少一種藥物活性物質(zhì)是抗癌治療劑。在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抗體，其具有選自SEQIDNO:2-20的重鏈的笫一M酸序列(其CDR區(qū)與具有SEQIDNO:2-20的CDR區(qū)具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列同一性)，以及選自SEQIDNO:21-39的輕鏈的第二絲酸序列(其CDR區(qū)與SEQIDNO:21-39所示的CDR區(qū)具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%序列同一性)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供免疫連接物，其由為上述抗體或片段的第一成分，和含有第二M酸序列的第二成分制成。例如，免疫連接物是細(xì)胞毒素，或者免疫連接物是結(jié)合蛋白或具有不同于DKKl或DKK4的靶標(biāo)結(jié)合特異性的抗體。例如，不同于DKKl或DKK4結(jié)合特異性的靶標(biāo)是癌細(xì)胞表面上的腫瘤抗原或腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供任一上述抗體作為雙重特異性抗體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供含有任一上述抗體或抗體片段的試劑盒。在某些實(shí)施方案中，試劑盒另外包含可藥用栽體或賦形劑。在另一相關(guān)的實(shí)施方案中，試劑盒中任一上述抗體以單位劑量存在。在另一實(shí)施方案中，試劑盒是ELISA診斷試劑盒。在相關(guān)的實(shí)施方案中，試劑盒包括向受試者施用任一上述抗體的說明書。附圖簡(jiǎn)述圖1圖示當(dāng)未洗滌的小珠與那些不同HuCAI^嚴(yán)格性洗滌的小珠相比，Str印-Tactin包被的小珠中His-Strep標(biāo)記的DKK1無明顯損失。圖2條形圖示實(shí)施例3提供的使用100jil明亮熒光素酶試劑的Wnt活性試驗(yàn)結(jié)杲。圖3圖示酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。熒光在TECANSpectrafluor平板讀數(shù)儀中測(cè)定并且顯示結(jié)合曲線。圖4圖示實(shí)施例6提供的標(biāo)準(zhǔn)Wnt3a依賴性TCF/LEFhic報(bào)告基因試驗(yàn)。圖5圖示TCF/LEFluc報(bào)告基因試驗(yàn)的改良版本，顯示由Kremen共同受體蛋白的共表達(dá)介導(dǎo)的對(duì)DKK1靈敏性的高度提高。圖6A圖示結(jié)合到DKK1的抗DKK1/4抗體的表面纖維蛋白溶酶共振測(cè)量法。圖6B是計(jì)算出的結(jié)合親和力和動(dòng)力學(xué)值的列表。圖7A圖示用于表位作圖的全長(zhǎng)和截短的DKK1.圖7B描述本發(fā)明抗體與圖7A的DKK1蛋白質(zhì)和片段的結(jié)合。圖8圖示在竟?fàn)幮訣LISA試驗(yàn)中DKK1/4抗體結(jié)合。圖9圖示W(wǎng)nt調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄下游DKK1/4抗體相關(guān)的再激活。圖10圖示DKK1/4抗體逆轉(zhuǎn)DKK1抑制的ALP分泌。圖11圖示DKKl/4抗體對(duì)異種移植的體內(nèi)影響。圖12圖示體內(nèi)DKKl/4抗體相關(guān)的骨密度增加。圖13圖示比較唑來膦酸(Zometa)與DKKI/4抗體的抗溶骨效應(yīng)。圖14圖示DKKI/4抗體對(duì)骨合成代謝的劑量依賴效應(yīng)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及分離的DKK1/4抗體，特別是人抗體，其特異性結(jié)合DKK1或DKK4并抑制DKK1或DKK4的功能性質(zhì)的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，DKK1/4抗體不特異性結(jié)合DKK2或DKK3。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體衍生自特定重鏈和輕鏈序列，和/或包括特定結(jié)構(gòu)特征，如包含特定氨基酸序列的CDR區(qū)。本發(fā)明提供分離的抗體、制備這類抗體的方法、免疫連接物和包括這些類抗體的雙特異性分子以及包含抗體的藥物組合物、本發(fā)明的免疫連接物或雙特異性分子.本發(fā)明也涉及使用抗體以抑制與DKK1或DKK4相關(guān)的障礙或病癥的方法。預(yù)期的疾病和障礙包括但不限定于，骨質(zhì)溶解性損傷，特別是與骨髓瘤(特別是多發(fā)性骨髓瘤)相關(guān)的骨質(zhì)溶解性損傷，或與骨癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、黑素瘤、肝細(xì)胞癌、上皮癌、食道癌、腦癌、肺癌、前列腺癌或胰腺癌或其轉(zhuǎn)移瘤相關(guān)的骨質(zhì)溶解性損傷；與移植相關(guān)的骨丟失。其他的疾病或障礙包括但不限定于，例如，骨肉瘤、前列腺癌、肝細(xì)胞癌(HCC)、包括多發(fā)性骨髓瘤的骨髓瘤、糖尿病、肥胖癥、肌萎縮、阿爾茨海默病、骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)減少、風(fēng)濕病、結(jié)腸炎和/或不希望的脫發(fā)。以便更易于理解本發(fā)明，首先定義某些術(shù)語。在詳述描述中列出其他定義。術(shù)語"免疫應(yīng)答"指淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和上述細(xì)胞或肝臟產(chǎn)生的可溶性大分子(包括抗體、細(xì)胞因子和補(bǔ)體)的作用，其導(dǎo)致選擇性損害、破壞或M體清除侵入性病原體、受病原體感染的細(xì)胞或組織、癌性細(xì)胞，或者(在自身免疫或病理炎癥的情況下)正常人細(xì)胞或組織。"信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑"指多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之間的生物化學(xué)關(guān)系，所述分子在信號(hào)從細(xì)胞的一部分傳遞到細(xì)胞的另一部分中起作用。本文所用的短語"細(xì)胞表面受體"包括例如，分子或分子復(fù)合體，其能夠接受信號(hào)并且能夠?qū)⑦@種信號(hào)經(jīng)細(xì)胞的質(zhì)膜傳遞。本發(fā)明的"細(xì)胞表面受體"的實(shí)例是DKK1或DKK4蛋白質(zhì)分子結(jié)合的受體。這類細(xì)胞表面受體包括但不限定于Frizzled(Fz)、LRP(LRP5和LRP6)和Kremen(Krm)。本文所用的術(shù)語"抗體，，指多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、單鏈抗體及其片段如Fab、F(ab)2、Fv，以及保留母體抗體的抗原結(jié)合功能的其他片段。同樣地，抗體可指免疫球蛋白或糖蛋白，或其片段或部分，或指包括修飾的免疫球蛋白樣構(gòu)架內(nèi)包含的抗原結(jié)合部分的結(jié)構(gòu)，或指包含非免疫球蛋白樣構(gòu)架或支架的結(jié)構(gòu)內(nèi)包括的抗原結(jié)合部分。本文所用的術(shù)語"單克隆抗體"指含有同源抗體群體的抗體組合物。該術(shù)語未限定關(guān)于抗體的種類或來源，也未旨在由制備的方式所限定。該術(shù)語包括全部免疫球蛋白以及片段如F化、F(ab)2、Fv，以及保留抗體的抗原結(jié)合功能的其他片段。在本發(fā)明中可使用任一哺乳動(dòng)物種類的單克隆抗體。然而，由于大鼠或鼠細(xì)胞系在用于制備產(chǎn)生單克隆抗體所需的雜交細(xì)胞系或雜交瘤中的實(shí)用性，抗體一般將是大鼠或鼠源性的。本文所用的術(shù)語"多克隆抗體"指含有異源抗體群體的抗體組合物。多克隆抗體常源自免疫動(dòng)物或所選人類的混合血清。本文所用的短語"單鏈抗體"指通過測(cè)定結(jié)合抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(重鏈和輕鏈)，以及提供允許保持結(jié)合功能的連接部分制備的抗體。實(shí)質(zhì)上，這形成僅具有結(jié)合抗原所需可變結(jié)構(gòu)域的部分的極短縮抗體。單鏈抗體的測(cè)定和構(gòu)建描述于Ladner等人的美國(guó)專利號(hào)4,946,778。"天然存在的抗體"是是糖蛋白，其包含通過二硫鍵連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈。每條重鏈包含重鏈可變區(qū)(本文中簡(jiǎn)寫為VH)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(本文中簡(jiǎn)寫為VO和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個(gè)結(jié)構(gòu)域CL。可以將Vh和Vt進(jìn)一步細(xì)分為高變區(qū)，稱作互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其散布著更保守的稱作構(gòu)架區(qū)(FR)的區(qū)域。毎個(gè)Vh和Vl由三個(gè)CDR和四個(gè)DR組成，它們從氛基末端到氯基末端以下面的順序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，所述組織或因子包括免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(CIq)。本文所用的術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"(或簡(jiǎn)單地"抗原部分")指結(jié)合靶標(biāo)的蛋白質(zhì)序列，例如一個(gè)或多個(gè)CDR。它包括例如，全長(zhǎng)抗體、一個(gè)或多個(gè)抗體片段，和/或保留抗原(如DKK1)特異性結(jié)合能力的非免疫球蛋白相關(guān)的支架上的CDR?？贵w的抗原結(jié)合功能可以通過全長(zhǎng)抗體的片段執(zhí)行。術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"內(nèi)包括的結(jié)合片段的實(shí)例包括Fab片段、由V^VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；F(ab)2片段、包含通過二硫鍵在鉸鏈區(qū)連接的兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；由抗體的單臂的V!^和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；由Vh結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward等人，1989Nature341:544-546);和分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。本文所用的"抗原"或"表位"可互換使用，指靶蛋白上的多肽序列，所述靶蛋白由抗體、抗體片段或其等價(jià)體的抗原結(jié)合部分特異識(shí)別。抗原或表位包括在耙序列內(nèi)連續(xù)或非連續(xù)的至少六個(gè)氨基酸。構(gòu)象表位可包括非連續(xù)殘基，并且任選可包括天然或人工修飾的氨基酸殘基。對(duì)殘基的修飾包括但不限定于，磷酸化、糖基化、聚乙二醇化、泛素化、呋喃化等。此外，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域Vt和VH由單獨(dú)的基因編碼，但是它們可以用重組方法通過合成接頭連接，所述接頭使得它們成為一條蛋白質(zhì)鏈，其中Vt和VH區(qū)配對(duì)形成單價(jià)分子(稱作單鏈Fv(scFv);參見例如，Bird等人，1988Science242:423-426;和Huston等人，1988Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883)。此類單鏈抗體意在被術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"包括。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)得到這些抗體片段，并且以與完整抗體相同的方式篩選所述片段的效用。如本文描述的，保守變體包括任一鑒定的氨基酸序列中的氨基酸殘基，特別是蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域任一普通技術(shù)人員眾所周知的保守改變。本文所用的"分離的抗體"指指抗體，其基本上沒有具有不同抗原特異性的其他抗體(例如，特異結(jié)合DKK1的分離的抗體基本上無特異結(jié)合不同于DKK1的抗原的抗體)。然而，特異結(jié)合DKK1的分離的抗體可以與其他抗原，如來自其他物質(zhì)的DKK1分子，或其他家族成員如DKK4或相關(guān)的側(cè)向同源物具有交叉反應(yīng)性。此外，分離的抗體可以基本上無其他細(xì)胞物質(zhì)和/或化學(xué)品。本文所用的術(shù)語"人抗體，，意在包括具有可變區(qū)的抗體，其中構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)都來自人來源的序列。此外，如果抗體含有恒定區(qū)，那么該恒定區(qū)也來自此類人序列，例如，人種系序列，或者人種系序列的突變形式。本發(fā)明的人抗體可以包括不由人序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過在體外隨機(jī)或位點(diǎn)特異性誘變或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變導(dǎo)入的突變)。然而，如本文所用的術(shù)語"人抗體，，不意在包括這樣的抗體，其中來自另一哺乳動(dòng)物物種如小鼠的種系的CDR序列已經(jīng)被嫁接到人構(gòu)架序列上。術(shù)語"人單克隆抗體，，指顯示出單結(jié)合特異性的抗體，其具有可變區(qū)，其中構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)都來自人序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過雜交瘤產(chǎn)生人單克隆抗體，雜交瘤包括來自轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠的B細(xì)胞，其具有包含與永生細(xì)胞融合的人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。本文所用的術(shù)語"人源化抗體，，指衍生自人類免疫球蛋白序列的免疫球蛋白構(gòu)架區(qū)的至少一部分。已移植到人類構(gòu)架序列上的"人源化，，抗體如具有CDR序列的抗體源自其他物種的種系，特別是哺乳動(dòng)物種如小鼠。實(shí)技術(shù)例包括PDL的人源化技術(shù)。本文所用的術(shù)語"人改造的抗體"指結(jié)合相同表位但序列不同的抗體。技術(shù)實(shí)例包括通過Kalobios的人改造技術(shù)制備的人改造抗體，其中抗原結(jié)合區(qū)序列是源于例如突變而非源于保守性氨基酸取代。本文所用的術(shù)語"重組人抗體"包括通過重組手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，如^M"于人免疫球蛋白基因?yàn)檗D(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的動(dòng)物(例如，小鼠)或從其制備的雜交瘤分離的抗體，從被轉(zhuǎn)化而表i^A抗體的宿主細(xì)胞分離的抗體，例如，從轉(zhuǎn)染瘤分離的抗體，從重組的組合人抗體文庫分離的抗體，和通過涉及將人免疫球蛋白基因序列的全部或部分剪接成其他DNA序列的任何其他手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。此類重組人抗體具有可變區(qū)，其中構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)來自人種系免疫球蛋白序列。然而，在一些實(shí)施方案中，此類重組人抗體可以進(jìn)行體外誘變(或者，當(dāng)使用人Ig序列轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物時(shí)，體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，并且從而重組抗體的Vh和區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列，其盡管來自并且涉;s^種系VH和Vl序列，但是可以不天然在體內(nèi)存在于人抗體種系所有組成成分。本文所用的"同種型"指重鏈恒定區(qū)基因提供的抗體類別(例如IgA、IgD、IgM、1gE、IgG如IgGl、IgG2、IgG3或lgG4)。短語"識(shí)別抗原的抗體，，和"抗原特異性的抗體"在本文中與術(shù)語"特異性結(jié)合抗原的抗體，，可互換使用。本文所用的"特異性結(jié)合人DKK1"的抗體意指以5x10-9M或更小、2xl(T9M或更小，或1x10—1QM或更小的Kd結(jié)合到人DKK1的抗體。"與不同于人DKK1的抗原交叉反應(yīng)"的抗體意指以0.5x10-Sm或更小、5x10"M或更小，或2xl(T9m或更小的Kd結(jié)合該抗原的抗體。"不與特定抗原交叉反應(yīng)"的抗體意指以1,5x10-8M或更大，或5-10x10-8M或1x10-7M或更大的Ko結(jié)合該抗原的抗體。在某些實(shí)施方案中，不與所述抗原交叉反應(yīng)的此類抗體在標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測(cè)定中顯示出對(duì)于這些蛋白質(zhì)的基本上檢測(cè)不到的結(jié)合。本文所用的"抑制DKK1結(jié)合細(xì)胞表面受體"的抗體如LRP、Fz或Krm，指以lnM或更小，0.75nM或更小，0.5nM或更小，或0.25nM或更小的K抑制DKK1結(jié)合受體的抗體。本文所用的"骨質(zhì)溶解"指骨密度的減少，其可能由于多種作用機(jī)理，包括例如，減少的成骨細(xì)胞活性、增加的破骨細(xì)胞活性。骨質(zhì)溶解因此包含通常影響骨礦物質(zhì)密度的機(jī)理。本文所用的"抑制骨溶解活性，，的抗體意指通過增加骨形成或阻礙骨再吸收來抑制骨密度損失的抗體。本文所用的術(shù)語"K鵬。e，，或"Ka"意指特定抗體-抗原相互作用的結(jié)合速率，而本文所用的術(shù)語"Kdis"或"KD，"意指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。如本文所用的，術(shù)語"KD"意指解離常數(shù)，其從Kd與Ka的比(即Ka/Ka)得到并且表達(dá)為摩爾濃度(M)。可以使用本領(lǐng)域成熟的方法測(cè)定抗體的K。值。用于測(cè)定抗體KD的方法是通過使用表面等離振子體共振，或者使用生物傳感器系統(tǒng)，如Biac(H^系統(tǒng)。本文所用的術(shù)語"親和力"指在單個(gè)抗原位點(diǎn)上抗體和抗原之間相互作用的強(qiáng)度。在每一抗原位點(diǎn)，抗體"臂"的可變區(qū)通過弱的非共價(jià)力與抗原在多位點(diǎn)相互作用；相互作用越強(qiáng)，親和力越強(qiáng)。本文所用的術(shù)語"抗體親抗原性"指抗體-抗原復(fù)合物全部的穩(wěn)定性或強(qiáng)度的信息度量。它由三種主要因素調(diào)節(jié)抗體表位親和力；抗體和抗原的效價(jià)；以及相互作用部分的結(jié)構(gòu)排列。最終這些因素限定抗體的特異性，即特定抗體結(jié)合到精確的抗原表位的可能性。為獲得更高抗體親抗原性探針，可構(gòu)建二聚綴合物(連結(jié)FACS標(biāo)記的兩分子JWJ-1),從而使得低親和力相互作用(如與種系抗體)通過FACS更易檢測(cè)到。此外，增加結(jié)合抗原的抗體親抗原性的其他方法包括產(chǎn)生DKK1或DKK4抗體的任一本文描述的纖連蛋白結(jié)構(gòu)的二聚體或多聚體。可通過各個(gè)分子間的共價(jià)結(jié)合產(chǎn)生這類多聚體，例如，通過模擬天然C至N端結(jié)合或通過才莫擬經(jīng)其恒定區(qū)保持在一起的抗體二聚物。設(shè)計(jì)進(jìn)入Fc/Fc界面的鍵可以是共價(jià)的或非共價(jià)的。此外，在DKK1或DKK4雜化物中可使用不同于Fc的二聚化或多聚化配偶體以創(chuàng)建這種更有序的結(jié)構(gòu)。本文所用的術(shù)語"交叉反應(yīng)，，指抗體或抗體群體結(jié)合其他抗原表位。這可由抗體的低抗體親抗原性或特異性，或由具有同樣或非常相似表位的多個(gè)不同抗原引起。當(dāng)需要大體結(jié)合到抗原相關(guān)組時(shí)，或當(dāng)抗原表位序列在進(jìn)化中不是高度保守而嘗試跨種標(biāo)記時(shí)，交叉反應(yīng)有時(shí)是所期望的。本文所用的術(shù)語IgG抗體的"高親和力"或"高特異性"指對(duì)耙抗原具有10-SM或更小、10力M或更小，或10"0M或更小的Kd的抗體。然而，"高親和力"結(jié)合可因其他抗體同種型而不同。例如，IgM同種型的"高親和力"結(jié)合指具有1(T"M或更小，或1(^M或更小的Kd的抗體。本文所用的術(shù)語"受試者，，包括任何人或非人動(dòng)物。術(shù)語"非人動(dòng)物，，包括所有脊推動(dòng)物，例如，哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，如非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、綿羊、狗、貓、馬、奶牛、雞、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物等。。本文所用的術(shù)語"優(yōu)化"指已被改變成此類氨基酸序列的核酸序列，所述M酸序列使用在產(chǎn)生的細(xì)胞或有機(jī)體中優(yōu)選的密碼子，和/或已被改變成除去潛在的剪接供體或剪接受體位點(diǎn)的核酸序列。對(duì)于多種物種的優(yōu)化的密碼子表是本領(lǐng)域眾所周知的。剪接供體或受體位點(diǎn)的序列也是本領(lǐng)域公知的并且潛在的剪接位點(diǎn)可通過例如分析轉(zhuǎn)錄或表達(dá)數(shù)據(jù)來鑒定。產(chǎn)生的細(xì)胞包括但不限定于，原核細(xì)胞，例如傳浙狀病毒或細(xì)菌(大腸桿菌(E"/Z))的原核細(xì)胞，或真核細(xì)胞，例如酵母(如畢赤酵母(尸/c&Vi))、中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、骨髓瘤細(xì)胞或人細(xì)胞。將優(yōu)化的核苷酸序列設(shè)計(jì)成完全保留或盡可能多地保留由也被認(rèn)為是"母本"序列的啟動(dòng)核苷酸序列最初編碼的M酸序列和殘基數(shù)。本文已將優(yōu)化序列設(shè)計(jì)成具有在產(chǎn)生的細(xì)胞中優(yōu)選的密碼子，然而本文也預(yù)見其他真核或原核細(xì)胞中這些序列的優(yōu)化表達(dá)。優(yōu)化核苷酸序列編碼的J^酸序列任選稱為優(yōu)化的。在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明的中和抗-DKK1/4組合物的多肽序列以及編碼它們的核苷酸優(yōu)選進(jìn)行生產(chǎn)和臨床用途的優(yōu)化。臨床使用優(yōu)化的特征包括但不限定于，例如，半壽期、藥物代謝動(dòng)力學(xué)(PK)、抗原性、效應(yīng)功能、FcRn清除，以及包括抗體依賴細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)或補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性(CDC)活性的患者應(yīng)答。本文所用的"DKK1相關(guān)的疾病"或"DKK4相關(guān)的疾病"包括但不限定于，骨質(zhì)溶解性損傷，特別是與骨髓瘤(特別是多發(fā)性骨髓瘤)相關(guān)的骨質(zhì)溶解性損傷，或與骨癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、黑素瘤、肝細(xì)胞癌、上皮癌、食道癌、腦癌、肺癌、前列腺癌或胰腺癌或其轉(zhuǎn)移瘤相關(guān)的骨質(zhì)溶解性損傷；與移植相關(guān)的骨丟失。其他的疾病或障礙包括但不限定于，例如，骨肉瘤、前列腺癌、肝細(xì)胞癌(HCC)、包括多發(fā)性骨髓瘤的骨髓瘤、糖尿病、肥胖癥、肌萎縮、阿爾茨海默病、骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)減少、風(fēng)濕病、結(jié)腸炎和/或不希望的脫發(fā)。本文所用的"治療"是以預(yù)防發(fā)展或改變障礙的病狀為目的進(jìn)行的干預(yù)。因此，"治療"指治療性處理和預(yù)防或預(yù)止性。需要治療的個(gè)體包括患有障礙的個(gè)體以及待預(yù)防障礙的個(gè)體。在腫瘤(如癌癥)治療中，治療劑可直接減少腫瘤細(xì)胞的病狀，或通過其他的治療劑如輻射和/或化學(xué)療法使腫瘤細(xì)胞更易治療。癌癥的"病狀"包括危害患者健康的所有現(xiàn)象。這非限定地包括異?；驘o法控制的細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、干擾鄰近細(xì)胞的正常功能、異常水平釋放細(xì)胞因子或其他分泌產(chǎn)物、炎癥或免疫應(yīng)答的抑制或惡化等?；加信R床疾病、生物化學(xué)疾病、放射性疾病或主觀疾病(如骨質(zhì)溶解)的患者治療，可包括減輕一些或全部這類癥狀或減少患病誘因。通常，本發(fā)明的中和抗-DKKl/4組合物預(yù)防、治療或改善與DKK1、DKK4或該兩者有關(guān)，而不是與DKK2、DKK3或Wnt途徑的其他調(diào)節(jié)劑有關(guān)的Wnt相關(guān)疾病。本發(fā)明的多個(gè)方面進(jìn)一步詳細(xì)描述于下面部分。Wnt途徑是充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)分化成成骨細(xì)胞的主要調(diào)節(jié)因子。它也是活性成骨細(xì)胞的重要存活因子。Dickkopf-l(DKK1)是主要在成人骨中表達(dá)的Wnt途徑拮抗物并且在患有骨質(zhì)溶解性損傷的骨髓瘤患者中纟皮增量調(diào)節(jié)。中和抗-DKKl/4的抗體確切地是同化劑，其通過增加成骨細(xì)胞的活性同時(shí)減少破骨細(xì)胞活性來起作用。相反，目前的藥物如作為同化劑銷售的PTH，實(shí)際上增加了成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記。本發(fā)明提供的是選擇用于結(jié)合DKK1的多克隆和單克隆抗體。優(yōu)選的抗體具有針對(duì)人DKK1小于10pM的親和力。在某些實(shí)施方案中，抗DKK1抗體與DKK4(Kd300pM)而不與DKK2交叉反應(yīng)(進(jìn)行中的親和力分析)。將抗-DKKl或抗-DKK4抗體的優(yōu)選表位定位到Cys-2結(jié)構(gòu)域(第189-263位氨基酸)，其被認(rèn)為負(fù)責(zé)LRP6和Kremen的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，該表位包括DKK1或DKK4多肽的Cys-2結(jié)構(gòu)域的至少六個(gè)且至多三十個(gè)氨基酸殘基。在某一實(shí)施方案中，表位包括至少六個(gè)連續(xù)的^酸的一段序列。在另一實(shí)施方案中，優(yōu)選的結(jié)合位點(diǎn)是非線性的，即包括非連續(xù)性的氮基酸殘基。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合取決于N-糖基化。僅僅預(yù)知Cys-2結(jié)構(gòu)域中的殘基256處的一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。在本發(fā)明中，中和抗-DKK1/4抗體在ELISA和細(xì)胞表面結(jié)合試驗(yàn)中阻礙DKK1與LRP6的相互作用。如所預(yù)期的，其在體外以低于1nM的EC50有效中和DKK1的Wnt抑制活性。在成骨細(xì)胞分化的體外模式中，用Wnt3A處理小鼠10T1/2細(xì)胞以刺激成骨細(xì)胞活性標(biāo)記物堿性磷酸酶(AP)的分泌。在該模型中DKK1阻礙AP產(chǎn)生并且本發(fā)明的抗體充分逆轉(zhuǎn)該抑制作用。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體在小鼠中顯示劑量線性藥物代謝動(dòng)力學(xué)(AUC)，在小鼠中劑量超過20-200照/小鼠時(shí)具有35-96小時(shí)的劑量依賴性終末半壽期。使用溶骨性前列腺胂瘤轉(zhuǎn)移的脛骨內(nèi)模型，本發(fā)明的抗體抑制腫瘤誘導(dǎo)的骨皮質(zhì)損傷。在該模型中通過腫瘤移植和虛擬移植對(duì)骨造成機(jī)械損傷的觀測(cè)不能區(qū)分對(duì)骨小梁的影響，其導(dǎo)致在隨后重塑的編織骨的初始增加，因此引M觀骨容量的減少。在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體在腫瘤和虛擬移植的脛骨中增加編織骨的產(chǎn)生，并且抑制伴隨重塑的骨容量的減少。在相關(guān)的實(shí)施方案中，使用骨標(biāo)記物的改變(骨鈣蛋白、sRANKL、OPG、AP、TRAP)來說明本發(fā)明抗體對(duì)骨相關(guān)疾病的臨床效果，并以藥物有效水平的本文提供的中和抗DKK1抗體預(yù)測(cè)治療的臨床結(jié)果。Krm在與LRP大約同樣的區(qū)域結(jié)合DKK。經(jīng)由DKK與LRP相互作用的Wnt信號(hào)抑制需要Krm。Krm-DKK-LRP聯(lián)合以便內(nèi)在化用于Wnt途徑失活。本發(fā)明的中和抗-DKK1/4組合物優(yōu)選結(jié)合DKK1或DKK4，阻礙它們與LRP和/或Krm的相互作用，從而在Wnt信號(hào)途徑中中和DKK1或DKK4效應(yīng)。Wnt途徑再活化僅^L生在DKK1和/或DKK4受限制處。評(píng)估抗體與不同種類DKK1結(jié)合能力的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)是本領(lǐng)域公知的，包括例如，ELISA、western印跡和RIA。合適的試驗(yàn)詳細(xì)描述于實(shí)施例中?？贵w的結(jié)合動(dòng)力學(xué)(例如結(jié)合親和力)也可通過本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)來評(píng)估，例如通過Biacore分析、BioVerisSET試驗(yàn)、FMAT、化學(xué)發(fā)光和/或SPR試驗(yàn)——信號(hào)抑制或釋放試驗(yàn)。評(píng)估抗體對(duì)DKK1功能性質(zhì)的影響的試驗(yàn)進(jìn)一步詳細(xì)描述于實(shí)施例中。因此，"抑制"依據(jù)本領(lǐng)域公知并描述于本文的方法學(xué)測(cè)定的一種或多種這些DKK1功能性質(zhì)(例如，生物化學(xué)活性、免疫化學(xué)活性、細(xì)胞活性、生理學(xué)活性或其他生物學(xué)活性)的抗體，將被認(rèn)為與相對(duì)于缺乏抗體時(shí)(例如，或當(dāng)無相關(guān)特異性的對(duì)照抗體存在時(shí))所顯示的特定活性的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著降低相關(guān)。抑制DKK1活性的抗體影響這類統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著降低至少10。/。的測(cè)量參數(shù)，至少50%、80%或90%，并且在某些實(shí)施方案中本發(fā)明抗體可抑制大于95%、98%或99%的DKK1功能性活性。Dickkopf家族成員適當(dāng)?shù)墓谴x包括調(diào)節(jié)途徑的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)以及成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和周圍基質(zhì)間的相互聯(lián)系。這些調(diào)節(jié)機(jī)制中的不平衡涉及溶骨病癥，例如骨質(zhì)疏松癥、腫瘤誘導(dǎo)的骨質(zhì)溶解性損傷、腎和肝移植誘導(dǎo)的骨丟失，以及抗激素化學(xué)療法^^導(dǎo)的骨丟失。這些病癥可具有嚴(yán)重癥狀包括骨痛、骨折、脊堆壓縮和靈活性降低。批準(zhǔn)的或目前臨床評(píng)估中的大多數(shù)治療通過抑制破骨細(xì)胞功能而產(chǎn)生顯著效果。例如，二磷酸鹽類如唑來膦酸(Zometa)是治療的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)并且通過抑制破骨細(xì)胞的功能和存活而起作用。雖然二磷酸鹽類通常有效時(shí)，某些患者無法有效應(yīng)答或由于腎毒性或骨壞死而停止使用[Markowitz2003[Ruggiero2004。另外，有耙向破骨細(xì)胞發(fā)育的多種試驗(yàn)藥物如RANKL和M-CSF中和抗體，或耙向破骨細(xì)胞功能的多種試驗(yàn)藥物如組織蛋白酶K抑制劑。成骨細(xì)胞活性的刺激將提供新^4'j以治療溶骨性疾病。Wnt途徑在成骨細(xì)胞分化和活性中起重要作用，而作為拮抗劑的Dickkopf(DKK)家族已被特別鑒定作為該過程的體外關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子(參見綜述[Krishnan2006])。在體外，Wnt是必需的成骨細(xì)胞存活和分化因子。Wnt途徑作用的臨床確認(rèn)由Wnt途徑共受體LRP5中的突變來提供。LRP5中的失活突變導(dǎo)致骨質(zhì)疏木乂假性神經(jīng)膠質(zhì)瘤綜合征(OPPG)[Ai2005，而激活突變導(dǎo)致高的骨量[Boyden2002。這些激活突變發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域并已證實(shí)可削弱對(duì)Wnt拮抗劑Dickkopf(DKK)家族的結(jié)合。已報(bào)道DKK1在患有骨病變患者的骨髓瘤細(xì)胞中過表達(dá)，但在正常漿細(xì)胞或未患骨病變患者的漿細(xì)胞中缺失[Tian2004][Politou2006。這種骨髓瘤細(xì)胞的DKK1過表達(dá)可通過阻礙成骨細(xì)胞分化從而促進(jìn)骨再吸收而擾亂成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞間的正常平衡。此外，已報(bào)道用于骨髓瘤的某些抗癌治療如地塞米^^可增量調(diào)節(jié)DKK1[Ohnaka2004。因此，抗DKK1中和抗體應(yīng)當(dāng)允許骨質(zhì)溶解性損傷中Wnt途徑的再激活，而不影響DKK1水平相對(duì)低或其他拮抗劑占優(yōu)勢(shì)的其他組織中的Wnt信號(hào)發(fā)放。成人中，已報(bào)道DKK1僅在骨中高量表達(dá)[Li2006]，顯示DKK1在調(diào)節(jié)成人骨代謝中的持續(xù)作用。轉(zhuǎn)基因小鼠在乳房組織中過表達(dá)Wnt促進(jìn)乳腺癌[Tsukamoto1988并且約90%的人類結(jié)直腸癌在Wnt途徑的兩種細(xì)胞質(zhì)成分APC或p-聯(lián)蛋白中具有突變[Morin1997][Rowan2000。這種證據(jù)引起對(duì)Wnt途徑的激活可能是增加腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)注。另外，DKK在結(jié)直腸腫瘤和黑素瘤中是減量調(diào)節(jié)的，這顯示潛在的腫瘤抑制作用。本發(fā)明的DKK多肽包括DKK1(SEQIDNO:l)和DKK4(SEQIDNO:124)，以及DKK2(SEQIDNO:122)和DKK3(SEQIDNO:123)。DKK家族成員具有示于表A-DKK1家族成員集(pileup)中的兩個(gè)CYS結(jié)構(gòu)域(CYS1和CYS2)。DKK蛋白質(zhì)包含酸性N端信號(hào)肽、由分枝連接區(qū)(divergentlinkerregion)隔開的含半胱氨酸殘基蔟的兩個(gè)CYS結(jié)構(gòu)域，以及潛在的C末端N糖基化位點(diǎn)。DKK4中的CYS2結(jié)構(gòu)域具有可在質(zhì)膜上促進(jìn)WNT/DKK相互作用的脂質(zhì)結(jié)合功能。OMIM登錄號(hào)605417。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>抗DKK1和DKK4的抗體在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體對(duì)人DKK蛋白質(zhì)有特異性。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體DKKI或DKK4中和抗體與腫瘤誘發(fā)相關(guān)的Wnt途徑修飾不同。Wnt途徑由細(xì)胞外配基、受體和僅DKK1是拮抗物的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)。由于成人中DKK1的限制性表達(dá)及其與其他Wnt拮抗物的功能冗余，中和DKK1的抗體不太可能引起Wnt信號(hào)發(fā)放或所致的腫瘤發(fā)生的廣泛激活。這另外由兩個(gè)觀察所支持首先，激活的LRP5突變(抑制DKK結(jié)合)誘導(dǎo)高骨量表現(xiàn)型但沒有明顯增加癌癥風(fēng)險(xiǎn)[Moon2004]，而DKK1雜合棵細(xì)胞或雙脊小鼠(Doubleridgemice)具有降低的DKK1水平、高骨量表現(xiàn)型，但未報(bào)到具有增加的肺瘤形成概率[MacDonald2004]?？笵KK1抗體應(yīng)確實(shí)影響骨髓瘤誘導(dǎo)的溶骨性疾病而不增加產(chǎn)生(denovo)腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。期望與抗腫瘤化學(xué)療法以及可能與抑制破骨細(xì)胞功能的抗骨再吸收藥物組合使用這類抗體。多克隆抗體本發(fā)明抗體可以是多克隆抗體，特別是人多克隆抗體。多克隆來自免疫動(dòng)物或選擇的人的混合血清。單克隆抗體本發(fā)明的抗體是如實(shí)施例1-8所述的分離的和結(jié)構(gòu)表征的人單克隆抗體。所述抗體的VH氨基酸序列分別示于SEQIDNO:2-20。所述抗體的Vt氨基酸序列分別示于SEQIDNO:21-39?？蓪⒖贵w的VH氨基酸序列優(yōu)化，例如示于SEQIDNO:119中的序列，以用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。可將抗體的Vt^J^酸序列優(yōu)化，例如示于SEQIDNO:118中的序列，以用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。同樣，可將序列優(yōu)化用于在例如酵母、細(xì)菌、倉鼠和其他細(xì)胞中表達(dá)，這取決于優(yōu)選的特征優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明的其他抗體包括已經(jīng)被突變，然而在CDR區(qū)中與上述序列中描述的CDR區(qū)具有至少60、70、80、卯、95、96、97、98或99°/。同一性的氨基酸。另外，全長(zhǎng)輕鏈母本核苷^列示于SEQIDNO:97-100中。全長(zhǎng)重鏈母本核苷酸序列示于SEQIDNO:101-103中。優(yōu)化用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的全長(zhǎng)輕鏈核苷酸序列示于SEQIDNO:104-107中。優(yōu)化用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的全長(zhǎng)重鏈核苷酸序列示于SEQIDNO:108-110中。由優(yōu)化的輕鏈核苦酸序列編碼的全長(zhǎng)輕鏈氨基酸序列示于EQIDNO:111-114中。由優(yōu)化的重鏈核苷酸序列編碼的全長(zhǎng)重鏈M酸序列示于EQIDNO:115-117中。本發(fā)明的其他抗體包括已經(jīng)被突變，然而與上述序列具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99%同一性的氛基酸或核苷酸。因?yàn)檫@些抗體的每一種都可以結(jié)合DKK1，所以，可以將Vh、Vl序列、全長(zhǎng)輕鏈和全長(zhǎng)重鏈序列(核苷酸序列和氨基酸序列)"混合和匹配"以產(chǎn)生本發(fā)明的其他抗DKK1結(jié)合分子?？梢允褂蒙鲜龊蛯?shí)施例中所述的結(jié)合測(cè)定法(例如，ELISA)測(cè)試此類"混合和匹配的"抗體的DKK1結(jié)合。當(dāng)Vh和VL鏈被混合和匹配時(shí)，來自具體VH/VL配對(duì)的VH序列應(yīng)該用結(jié)構(gòu)上相似的VH序列置換。同樣，來自具體VH/VL配對(duì)的Vt序列應(yīng)該用結(jié)構(gòu)上相似的v^序列置換。同樣，來自具體全長(zhǎng)重^/全長(zhǎng)輕鏈配對(duì)的全長(zhǎng)輕鏈序列應(yīng)該用結(jié)構(gòu)上相似的全長(zhǎng)輕鏈序列置換。本發(fā)明抗體的VH、Vl、全長(zhǎng)輕鏈和全長(zhǎng)重鏈序列尤其服從混合和置換，因?yàn)檫@些抗體使用來自相同種系序列的VH、Vp全長(zhǎng)輕鏈和全長(zhǎng)重鏈序列，并且從而顯示出結(jié)構(gòu)相似性。因此，一方面，本發(fā)明提供分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其具有包含選自SEQIDNO:2-20和119的^j^酸序列的Vh區(qū)；以及包含選自SEQIDNO:21-39和118的氨基酸序列的VL區(qū)；其中該抗體特異性結(jié)合DKK1。重鏈和輕鏈組合的實(shí)例包括包含SEQIDNO:2的M酸序列的VH區(qū)和包含SEQIDNO:21的氨基酸序列的V^區(qū)；或包含SEQIDNO:3的VH區(qū)和包含SEQIDNO:22的VL區(qū)；或包含SEQIDNO:4的VH區(qū)和包含SEQIDNO:23的VL區(qū)；或包含SEQIDNO:5的VH區(qū)和包含SEQIDNO:24的VL區(qū)；或包含SEQIDNO:6的VH區(qū)和包含SEQIDNO:25的VL區(qū)；或包含SEQIDNO:7的VH區(qū)和包含SEQIDNO:28的VL區(qū)；或包含SEQIDNO:8的VH區(qū)和包含SEQIDNO:29的VL區(qū)；或包含SEQIDNO:9的VH區(qū)和包含SEQIDNO:30的VL區(qū)；或包含SEQIDNO:10的VH區(qū)和包含SEQIDNO:31的VL區(qū)；或包含SEQIDNO:11的VH區(qū)和包含SEQIDNO:32的Vl區(qū)；或包含SEQIDNO:12的Vh區(qū)和包含SEQIDNO:33的VL區(qū)；或包含SEQIDNO:119的VH區(qū)和包含SEQIDNO:118的Vl區(qū)。另一方面，本發(fā)明提供分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其具有包含選自SEQIDNO:115-117的氨基酸序列的全長(zhǎng)重鏈；以及包含選自SEQIDNO:111-114的^j^酸序列的全長(zhǎng)輕鏈。因此，全長(zhǎng)重鏈和全長(zhǎng)輕鏈組合的實(shí)例分別包括SEQIDNO:115與SEQIDNO:111;或SEQIDNO:116與SEQIDNO:112;或SEQIDNO:117與SEQIDNO:113;或SEQIDNO:117與SEQIDNO:114。另一方面，本發(fā)明提供分離的單克隆抗體或抗原結(jié)合部分，其含有選自SEQIDNO:101-103的核苷酸序列編碼的全長(zhǎng)重鏈；以及選自SEQIDNO:97-100的核苷酸序列編碼的全長(zhǎng)輕鏈。因此，編碼全長(zhǎng)重鏈和全長(zhǎng)輕鏈的核苷酸實(shí)例可分別組合包括SEQIDNO:101和97;或SEQIDNO:102和98;或SEQIDNO:103和99;或SEQIDNO:103和100。另一方面，本發(fā)明提供已進(jìn)行在細(xì)胞中表達(dá)的優(yōu)化的分離的單克隆抗體或抗原結(jié)合部分，其具有包含選自SEQIDNO:108-110的核苷酸序列的全長(zhǎng)重鏈；以及包含選自SEQIDNO:104-107的核香酸序列的全長(zhǎng)輕鏈。另一方面，本發(fā)明提供包括抗體重鏈和輕鏈CDR1、重鏈和輕鏈CDR2和重鏈和輕鏈CDR3的抗體，或其組合?？贵w的VHCDR1的氨基酸序列示于SEQIDNO:2-5、8-11、20和49-56。抗體的VHCDR2的氨基^f列示于SEQIDNO:2-20和57-64。抗體的VHCDR3的#^酸序列示于SEQIDNO:2-20和65-72。抗體的VLCDR1的氨基酸序列示于SEQIDNO:21-39和73-80。抗體的VLCDR2的^J^酸序列示于SEQIDNO:21-39和81-88。抗體的VLCDR3的^ij^酸序列示于SEQIDNO:21-39和89-96。使用Kabat系統(tǒng)描述CDR區(qū)(Kabat，E.A.等人，1991SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)?？紤]到這些抗體的每一種可以結(jié)合DKK1并且抗體結(jié)合特異性主要通過CDR1、2和3區(qū)提供，可以將VhCDRI、2和3序列與VLCDRl、2和3序列"混合和匹配，，(即，來自不同抗體的CDR可以4皮混合和匹配，盡管每個(gè)抗體必須含有VHCDRl、2和3和VLCDR1、2和3)以產(chǎn)生本發(fā)明的其他抗DKK1結(jié)合分子?？梢允褂蒙衔暮蛯?shí)施例中描述的結(jié)合測(cè)定法(例如，ELISA)測(cè)試此類"混合和匹配的"抗體的DKK1結(jié)合。當(dāng)混合和匹配VHCDR序列時(shí)，來自具體Vh序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列應(yīng)該用結(jié)構(gòu)上相似的CDR序列置換。同樣，當(dāng)混合和匹配VLCDR序列時(shí)，來自具體Vl序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列應(yīng)該用結(jié)構(gòu)上相似的CDR序列置換。此外，具體Vh或Vl序列的CDR1、CDR2和/技術(shù)人員將容易顯而易見的是，對(duì)于本發(fā)明的單克隆抗體，通過用來自本文所示CDR序列的結(jié)構(gòu)上相似的序列替^f戈一個(gè)或多個(gè)Vh和/或VlCDR序列，可以產(chǎn)生新的Vh和Vl序列。分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其具有包含選自SEQIDNO:2畫5、8-11、20和49-56的^j^酸序列的VH區(qū)CDR1;包含選自SEQIDNO:2-20和57-64的^j^酸序列的VH區(qū)CDR2;包含選自SEQIDNO:2-20和65-72的#^絲列的VH區(qū)CDR3;包含選自SEQIDNO:21-39和73-80的>#^酸序列的VL區(qū)CDR1;包含選自SEQIDNO:21-39和81-88的氨基酸序列的VL區(qū)CDR2;以及包含選自SEQIDNO:21-39和89-96的氨基酸序列的Vl區(qū)CDR3;其中該抗體特異性結(jié)合DKKl。在某一實(shí)施方案中，抗體組成為包含SEQIDNO:2的VH區(qū)CDR1;包含SEQIDNO:6的VH區(qū)CDR2;包含SEQIDNO:7的VH區(qū)CDR3;包含SEQIDNO:21的VL區(qū)CDR1;包含SEQIDNO:22的VL區(qū)CDR2;以及包含SEQIDNO:23的VL區(qū)CDR3。在另一實(shí)施方案中，抗體組成為包含SEQIDNO:3的VH區(qū)CDR1包含SEQIDNO:12的VH區(qū)CDR2;包含SEQIDNO:13的VH區(qū)CDR3包含SEQIDNO:24的VL區(qū)CDR1;包含SEQIDNO:25的VL區(qū)CDR2以及包含SEQIDNO:26的VL區(qū)CDR3。在另一實(shí)施方案中，抗體組成為包含SEQIDNO:4的VH區(qū)CDR1;包含SEQIDNO:14的VH區(qū)CDR2;包含SEQIDNO:15的VH區(qū)CDR3;包含SEQIDNO:27的VL區(qū)CDR1;包含SEQIDNO:28的VL區(qū)CDR2;以及包含SEQIDNO:29的VL區(qū)CDR3。在另一實(shí)施方案中，抗體組成為包含SEQIDNO:5的VH區(qū)CDR1;包含SEQIDNO:16的VH區(qū)CDR2;包含SEQIDNO:17的VH區(qū)CDR3;包含SEQIDNO:30的VL區(qū)CDR1;包含SEQIDNO:31的VL區(qū)CDR2;以及包含SEQIDNO:32的VL區(qū)CDR3。在某一實(shí)施方案中，抗體組成為包含SEQIDNO:8的VH區(qū)CDR1;包含SEQIDNO:18的VH區(qū)CDR2;包含SEQIDNO:19的VH區(qū)CDR3;包含SEQIDNO:33的VL區(qū)CDR1;包含SEQIDNO:34的VL區(qū)CDR2;以及包含SEQIDNO:35的VL區(qū)CDR3。在某一實(shí)施方案中，抗體組成為包含SEQIDNO:9的VH區(qū)CDR1;包含SEQIDNO:10的VH區(qū)CDR2;包含SEQIDNO:ll的VH區(qū)CDR3;包含SEQIDNO:36的VL區(qū)CDR1;包含SEQIDNO:37的VL區(qū)CDR2;以及包含SEQIDNO:38的VL區(qū)CDR3。如本文所用的，人抗體包含重鏈或輕鏈可變區(qū)，如果該抗體的可變區(qū)從使用種系免疫球蛋白基因的系統(tǒng)得到，那么所述可變區(qū)是特定種系序列的"產(chǎn)物，，或"來自，，該特定種系序列。此類系統(tǒng)包括用目的抗原免疫攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或者用目的抗原篩選在噬菌體上展示的人免疫球蛋白基因文庫。為人種系免疫球蛋白序列的"產(chǎn)物"或者"來自"所述序列的人抗體可以如下鑒定通過比較人抗體的M酸序列與人種系免疫球蛋白的氨基酸序列并選自序列與人抗體的序列最接近(即，最大的％同一性)的人種系免疫球蛋白序列。為人種系免疫球蛋白序列的"產(chǎn)物"或者"來自，，所述序列的人抗體可以由于例如天然存在的體細(xì)胞突變或者有意引入位點(diǎn)定向誘變而與種系序列相比含有氨基酸差異。然而，所選的人抗體通常與人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列在氨基^f列上至少90%同一并且含有這樣的氨基酸殘基，當(dāng)與其他物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠種系序列)比較時(shí)，所述氨基酸殘基將所i4A抗體鑒定為人的。在一些情況中，人抗體可以在M,列上與種系免疫球蛋白基因編碼的^J^酸序列至少60%、70%、80%、90%、或至少95%、或甚至至少96%、97%、98%、或99。/。同一。通常，來自具體人種系序列的人抗體將顯示出與人種系免疫球蛋白基因編碼的M,列不超過10個(gè)^酸差異。在一些情況中，人抗體可以顯示出與種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列不超過5個(gè)，或甚至不超過4、3、2或1個(gè)氣基酸差異。同源抗體在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體具有全長(zhǎng)重鏈和輕鏈氨基酸序列，全長(zhǎng)重鏈和輕鏈核苷酸序列，可變區(qū)重鏈和輕鏈核苷酸序列，或可變區(qū)重鏈和輕鏈M酸序列，其與本文所述抗體的氨基酸和核苷酸序列同源，并且其中所述抗體保留本發(fā)明中和抗DKK1/4組合物所希望的功能性質(zhì)。例如，本發(fā)明提供分離的單克隆抗體或抗原結(jié)合部分，其包括VH區(qū)和Vl區(qū)，其中Vh區(qū)包含與逸自SEQIDNO:2-20和119的^iJ^斷列至少80%同源的氨基斷列；Vl區(qū)包含與逸自SEQIDNO:21-39和118的M酸序列至少80。/。同源的M酸序列；該抗體特異性結(jié)合DKK1和/或DKK4，并且抗體顯示至少一種以下功能性質(zhì)抗體中和DKK1蛋白質(zhì)與LRP6、Fz和/或Krm的結(jié)合，或抗體中和DKK4蛋白質(zhì)與LRP、Pz和/或Krm的結(jié)合。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括全長(zhǎng)重鏈和全長(zhǎng)輕鏈，其中全長(zhǎng)重鏈包含與選自SEQIDNO:115-117的M酸序列至少80%同源的氨基酸序列；全長(zhǎng)輕鏈包含與選自SEQIDNO:111-114的氨基紗列至少80%同源的氨基紗列；該抗體特異性結(jié)合DKK1，并且抗體顯示至少一種以下功能性質(zhì)抗體抑制DKK1蛋白質(zhì)與DKKl受體的結(jié)合，或抗體抑制DKKl受體的結(jié)合，以預(yù)防或改善骨質(zhì)溶解，或抗體抑制DKK1受體的結(jié)合，以預(yù)防或改善骨質(zhì)溶解性損傷，或抗體抑制DKK1受體的結(jié)合，以預(yù)防或改善癌癥。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供分離的單克隆抗體或抗原結(jié)合部分，其包括全長(zhǎng)重鏈和全長(zhǎng)輕鏈，其中全長(zhǎng)重鏈包含與選自SEQIDNO:101-103的核苦酸序列至少80%同源的核苷酸序列；全長(zhǎng)輕鏈包含與選自SEQIDNO:97-100的核苷酸序列至少80%同源的核苷酸序列；該抗體特異性結(jié)合DKK1，并且抗體顯示至少一種以下功能性質(zhì)抗體抑制DKKl蛋白質(zhì)與DKKl受體的結(jié)合，或抗體抑制DKKl受體的結(jié)合，以預(yù)防或改善骨質(zhì)溶解，或抗體抑制DKK1受體的結(jié)合，以預(yù)防或改善骨質(zhì)溶解性損傷，或抗體抑制DKK1受體的結(jié)合，以預(yù)防或改善癌癥。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供已進(jìn)行細(xì)胞中表達(dá)的優(yōu)化的分離的單克隆抗體或抗原結(jié)合部分，其包括全長(zhǎng)重鏈和全長(zhǎng)輕鏈，其中全長(zhǎng)重鏈包含與選自SEQIDNO:108-110的核苷酸序列至少80%同源的核苷酸序列；全長(zhǎng)輕鏈包含與選自SEQIDNO:104-107的核苷酸序列至少80%同源的核苷酸序列；該抗體特異性結(jié)合DKK1，并且抗體顯示至少一種以下功能性質(zhì)抗體抑制DKK1蛋白質(zhì)與DKK1受體的結(jié)合，或抗體抑制DKK1受體的結(jié)合，以預(yù)防或改善骨質(zhì)溶解，或抗體抑制DKK1受體的結(jié)合，以預(yù)防或改善骨質(zhì)溶解性損傷，或抗體抑制DKK1受體的結(jié)合，以預(yù)防或改善癌癥。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明提供已進(jìn)行細(xì)胞中表達(dá)的優(yōu)化的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括Vh區(qū)和Vl區(qū)，其中全長(zhǎng)重鏈包含與選自SEQIDNO:121的核苷酸序列至少80%同源的核苷酸序列；全長(zhǎng)輕鏈包含與選自SEQIDNO:120的核苷酸序列至少80%同源的核苷*列；該抗體特異性結(jié)合DKK1，并且抗體顯示至少一種以下功能性質(zhì)抗體抑制DKK1蛋白質(zhì)與DKK1受體的結(jié)合，或抗體抑制DKK1受體的結(jié)合，以預(yù)防或改善骨質(zhì)溶解，或抗體抑制DKK1受體的結(jié)合，以預(yù)防或改善骨質(zhì)溶解性損傷，或抗體抑制DKK1受體的結(jié)合，以預(yù)防或改善癌癥。在多種實(shí)施方案中，抗體可以顯示出上面討論的功能性質(zhì)的一種或多種、兩種或多種，或三種。該抗體可以是例如，人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。如本文所用的，兩個(gè)氨基酸序列之間的同源性百分比等于兩個(gè)序列之間的同一性百分比。兩個(gè)序列之間的同一性百分比是這兩個(gè)序列共有的相同位置數(shù)目的函數(shù)(即，。/。同源性-相同位置勤位置總數(shù)xl00)，考慮缺口數(shù)、每個(gè)缺口的長(zhǎng)度，它們被引入以進(jìn)行兩個(gè)序列的最佳比對(duì)?？梢允归g同一性百分?jǐn)?shù)的確定?？梢浴独粲肊.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci"4:11-17，1988)的算法，使用PAM120權(quán)重殘基表、缺口長(zhǎng)度罰分12和缺口罰分4，確定兩個(gè)M酸序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)，該算法已經(jīng)被結(jié)合到ALIGN程序(版本2.0)中。此外，可以使用整合到GCG軟件包(可以在h加:〃www.gcg.com得到)的GAP程序的Needleman和Wunsch(J.Mol，Biol.48:444-453，1970)算法，使用Blossom62矩陣或PAM250矩陣，和缺口權(quán)重16、14、12、10、8、6或4和長(zhǎng)度權(quán)重1、2、3、4、5或6確定兩個(gè)JL^^列之間的同一性百分?jǐn)?shù)。額外或備選地，本發(fā)明的蛋白質(zhì)序列還可以進(jìn)一步用作"查詢序列"以對(duì)公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索以例如鑒定相關(guān)的序列?？梢允褂肁ltschul，等人，1990J.Mol.Biol.215:403-10的XBLAST程序(版本2.0)進(jìn)行此類搜索?？梢杂肵BLAST程序，得分=50,字長(zhǎng)-3進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)搜索來得到與本發(fā)明的抗體分子同源的氨基酸序列。為了得到用于比較目的的缺口比對(duì)，可以用如Altschul等人，1997NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402中描述的缺口BLAST。當(dāng)利用BLAST和缺口BLAST時(shí)，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。見具有保守修飾的抗體在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體具有由CDR1、CDR2和CDR3序列組成的Vh區(qū)和由CDR1、CDR2和CDR3序列組成的Vl區(qū)，其中這些CDR序列中的一個(gè)或多個(gè)具有基于本文所述抗體的特定氨基酸序列或者其保守修飾，并且其中所述抗體保留本發(fā)明的中和抗DKK1/4組合物的所需功能性質(zhì)。因此，本發(fā)明提供分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其組成為由CDR1、CDR2和CDR3序列組成的VH區(qū)和由CDR1、CDR2和CDR3序列組成的VL區(qū)，其中CDR1的VH區(qū)是選自SEQIDNO:2-5、8-11、20、49-56的氨基酸序列的氨基酸序列及其保守修飾組成的序列；CDR2的VH區(qū)是選自SEQIDNO:2-20、57-64的^J^^列的"^^列及其保守1務(wù)飾組成的序列；CDR3的Vh區(qū)是逸自SEQIDNO:2-20、65-72的^J^酸序列的^J^酸序列及其保守修飾組成的序列；CDR1的區(qū)是選自SEQIDNO:21-39、73-80的絲酸序列的絲酸序列及其保守修飾組成的序列；CDR2的VL區(qū)是選自SEQIDNO:21-39、81-88的^J^酸序列的M酸序列及其保守修飾組成的序列；CDR3的VL區(qū)是選自SEQIDNO:21-39，89-96的M酸序列的M酸序列及其保守修飾組成的序列；該抗體特異性結(jié)合DKK1，并且抗體顯示至少一種以下功能性質(zhì)抗體抑制DKKl蛋白質(zhì)與DKKl受體的結(jié)合，或抗體抑制DKKl受體的結(jié)合，以預(yù)防或改善骨質(zhì)溶解，或抗體抑制DKKl受體的結(jié)合，以預(yù)防或改善骨質(zhì)溶解性損傷，或抗體抑制DKKl受體的結(jié)合，以預(yù)防或改善癌癥。在多種實(shí)施方案中，抗體可以顯示出上面討論的功能性質(zhì)的一種或多種、兩種或多種，或三種。該抗體可以是例如，人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體具有全長(zhǎng)重鏈序列和全長(zhǎng)輕鏈序列，其中一種或多種這些序列具有基于本文描述的抗體或其保守修飾的特定氨基酸序列，并且其中所述抗體保留本發(fā)明的中和抗DKK1/4組合物的所希望的功能性質(zhì)。因此，本發(fā)明提供分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括全長(zhǎng)重鏈序列和全長(zhǎng)輕鏈序列，其中全長(zhǎng)重鏈具有選自SEQIDNO:115-117的^J^酸序列及其保守修飾；全長(zhǎng)輕鏈具有選自SEQIDNO:111-114的氨基酸序列及其保守修飾；該抗體特異性結(jié)合DKKl,并且抗體顯示至少一種以下功能性質(zhì)抗體抑制DKKl蛋白質(zhì)與DKKl受體的結(jié)合，或抗體抑制DKKl受體的結(jié)合，以預(yù)防或改善骨質(zhì)溶解，或抗體抑制DKK1受體的結(jié)合，以預(yù)防或改善骨質(zhì)溶解性損傷，或抗體抑制DKKl受體的結(jié)合，以預(yù)防或改善癌癥。在多種實(shí)施方案中，抗體可以顯示出上面討論的功能性質(zhì)的一種或多種、兩種或多種，或三種。該抗體可以是例如，人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。在其他的實(shí)施方案中，進(jìn)行在細(xì)胞中表達(dá)優(yōu)化的本發(fā)明抗體具有VH區(qū)序列和Vx^區(qū)序列，其中這些序列中的一個(gè)或多個(gè)具有基于本文所述抗體的特定M酸序列或者其保守修飾，并且其中所述抗體保留本發(fā)明的中和抗DKKl/4組合物的所需功能性質(zhì)。因此，本發(fā)明提供分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括VH區(qū)和Vl區(qū)，其中Vh區(qū)具有選自SEQIDNO:119的氨基酸序列及其保守修飾；VL區(qū)具有選自SEQIDNO:118的M酸序列及其保守修飾；該抗體特異性結(jié)合DKKl,并且抗體顯示至少一種以下功能性質(zhì)抗體抑制DKK1蛋白質(zhì)與DKK1受體的結(jié)合，或抗體抑制DKK1受體的結(jié)合，以預(yù)防或改善骨質(zhì)溶解，或抗體抑制DKK1受體的結(jié)合，以預(yù)防或改善骨質(zhì)溶解性損傷，或抗體抑制DKK1受體的結(jié)合，以預(yù)防或改善癌癥。在多種實(shí)施方案中，抗體可以顯示出上面討論的功能性質(zhì)的一種或多種、兩種或多種，或三種。該抗體可以是例如，人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。本文所用的術(shù)語"保守序列修飾"意指M酸修飾，其不顯著影響或改變含有該M酸序列的抗體的結(jié)合特征。此類保守修飾包括M酸取代、添加和缺失?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn):技術(shù)，如位點(diǎn)定向i秀變和PCR介導(dǎo)的誘變向本發(fā)明的抗體中引入修飾。換的取代。在本領(lǐng)域中已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電極性側(cè)鏈氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸)、p分枝側(cè)鏈氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。從而，本發(fā)明抗體的CDR區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可以用來自相同側(cè)鏈家族的其他氨基酸殘基置換，并且可以使用本文所述的功能測(cè)定法測(cè)試經(jīng)改變的抗體所保留的功能。結(jié)合到與本發(fā)明的中和抗DKK1/4組合物相同表位的抗體在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了結(jié)合與本文提供的本發(fā)明的多種中和抗DKK1/4組合物結(jié)合相同表位的抗體。此類額外的抗體可以基于它們?cè)跇?biāo)準(zhǔn)DKK1結(jié)合測(cè)定法中與本發(fā)明的其他抗體交叉竟?fàn)?即，以統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著方式竟?fàn)幮砸种平Y(jié)合)來鑒定。受試抗體抑制本發(fā)明的抗體與人DKK1結(jié)合的能力表明該受試抗體與本發(fā)明抗體竟?fàn)幗Y(jié)合人DKK1;根據(jù)非限制性理論，這種抗體可以與它所竟?fàn)幍目贵w結(jié)合人DKK1上相同或相關(guān)的(例如，結(jié)構(gòu)上相似或空間上接近的)表位。在一些實(shí)施方案中，與本發(fā)明的抗體結(jié)合人DKK1上相同表位的抗體是人單克隆抗體。此類人單克隆抗體可以如實(shí)施例中所述的制備和分離。駱駝的和其他的重鏈抗體獲自包括新界成員如美洲駝物種(羊駝lfl附fl/mCCM、原駝丄fl(附ag/fl/Wfl和瘦駝Wc"^m)的駱駝和單峰駱駝家族成員(雙峰駝6tt"n'a"ws和CVi/e/wsdn/wa^ten.ws)的抗體蛋白質(zhì)已為人類受試者表征了大小、結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和抗原性。對(duì)于其他動(dòng)物的抗體，自然界中發(fā)現(xiàn)的該家族哺乳動(dòng)物的某些IgG抗體缺乏輕鏈，并因此在結(jié)構(gòu)上明顯不同于典型的含兩條重鏈和兩條輕鏈的四鏈四級(jí)結(jié)構(gòu)。見PCT/EP93/02214(WO94/04678，7>開于1994年3月3日)。鑒定為VHH的小單鏈可變域的駱駝抗體區(qū)可通過基因工程獲得以產(chǎn)生對(duì)靶標(biāo)具有高親和力的小蛋白質(zhì)，結(jié)果形成已知為"駱駝抗體"的低分子量的源自抗體的蛋白質(zhì)。見美國(guó)專利號(hào)5,759,808，出版于1998年6月2日，也見Stijlemans，B.等人2004JBiolChem279:1256-1261,Dumoulin，M.等人，2003Nature424:783-788,Pleschberger，M.等人2003BioconjugateChem14:440448，Cortez-Retamozo，V.等人2002IntJCancer89:456-62，以及Lauwereys，M.等人1998EMBOJ17:3512-3520。駱駝抗體和抗體片段的工程化文庫通過商業(yè)途徑獲得，例如，來自Ablynx、Ghent、Belgium。與非人源的其他抗體一樣，可重組改變駱駝抗體的氨基酸序列以獲得更相似于人類序列的序列，即可將納米抗體"人源化"。因此可將駱駝抗體對(duì)人類的天然低抗原性進(jìn)一步降低。駱駝抗體具有人類IgG分子的大約十分之一的分子量，并且該蛋白質(zhì)具有僅僅幾納米的物理直徑。小尺寸的一個(gè)結(jié)果是駱駝納米抗體結(jié)合到對(duì)于較大抗體蛋白質(zhì)是功能不可見的抗原位點(diǎn)的能力，即駱駝納米抗體可用作檢測(cè)抗原的試劑，否則使用典型的免疫學(xué)技術(shù)是隱蔽的，以及作為可能的治療制劑。因此小尺寸的另一個(gè)結(jié)果是駱駝納米抗體由于能夠抑制結(jié)合到靶蛋白的凹槽或窄裂縫中的特異位點(diǎn)，因而能夠提供比典型抗體更相似于典型低分子量藥物的功能。低分子量和緊湊尺寸進(jìn)一步導(dǎo)致駱駝納米抗體極端耐熱，對(duì)極端pH和蛋白酶解消化穩(wěn)定，并且是低抗原性的。另一個(gè)結(jié)果是駱駝納米抗體易于從循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移進(jìn)組織，并且甚至穿過血腦屏障而可以治療影響神經(jīng)組織的障礙。納米抗體可進(jìn)一步促進(jìn)穿過血腦屏障的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)。參見美國(guó)專利申請(qǐng)20040161738，20047>開于8月19日。組合這些對(duì)人類低抗原性的特征顯示很大的治療潛力。另外，這些分子在原核細(xì)胞如E"/,'中可完整表達(dá)并且在噬菌體中作為融合蛋白表達(dá)并具有功能。因此，本發(fā)明的特征是對(duì)DKK1具有高親和力的駱駝抗體或納米抗體。在本文的某些實(shí)施方案中，駱駝抗體或納米抗體是在駱駝?lì)悇?dòng)物中天然產(chǎn)生的，即用DKK1或其肽片段免疫后的駱駝產(chǎn)生的，對(duì)其他抗體使用本文所述技術(shù)。備選地，中和抗DKKl/4駱駝納米抗體是改造的，即使用如本文實(shí)施例中所述的以DKK1和/或DKK4作為耙標(biāo)的篩選程序，通過例如從噬菌體展示文庫中選擇產(chǎn)生適當(dāng)突變的駱駝納米抗體蛋白質(zhì)。改造的納米抗體可進(jìn)一步通過基因工程定制，使其在受體受試者中具有從45分鐘到兩周的半壽期。除了駱駝抗體，重鏈抗體天然產(chǎn)生于其他動(dòng)物，所述動(dòng)物包括但不限定于例如篁魚和河豚魚的某些物種(參見例如PCT公開WO03/014161)。盡管源自這些重鏈抗體的可變域可使用于本發(fā)明，但源自駱駝的重鏈抗體和/或其可變結(jié)構(gòu)域序列的用途優(yōu)選最優(yōu)化、人源化、人改造等和/或用于人類臨床用途。改造和^f奮飾的抗體還可以使用具有本文所示的一個(gè)或多個(gè)Vh和/或V^序列的抗體作為起始物質(zhì)進(jìn)一步制備本發(fā)明的抗體以改造修飾的抗體，該修飾的抗體可以具有從起始抗體改變的形式。通過修飾一個(gè)或兩個(gè)可變區(qū)(即，Vh和/或Vl)，例如，一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)內(nèi)和/或一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架區(qū)內(nèi)的可變區(qū)，可以改造抗體。額外或備選地，通過修飾恒定區(qū)內(nèi)的殘基，例如，以改變抗體的效應(yīng)功能來改造抗體?？梢赃M(jìn)行的一種類型的可變區(qū)改造是CDR嫁接?？贵w主要通過位于六個(gè)重鏈和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基與耙抗原相互作用。為此，各抗體之間CDR內(nèi)的氨基^列比CDR外的序列更多樣化。因?yàn)镃DR序列負(fù)責(zé)多數(shù)抗體-抗原相互作用，所以可能通過構(gòu)建表達(dá)載體表達(dá)重組抗體，其模擬特定天然存在的抗體的性質(zhì)，所述表達(dá)載體包括來自特定天然存在的抗體的CDR序列，其嫁接到來自具有不同性質(zhì)的不同抗體的構(gòu)架區(qū)上(見例如，Riechmann,L.等人，1998Nature332:323-327;Jones，P.等人，1986Nature321:522-525;Queen，C.等人，1989Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86:10029-10033;winter的美國(guó)專利號(hào)5,225,539，和Queen等人的美國(guó)專利號(hào)5，530，101;5,585,089;5,693,762和6,180,370)。因此，本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括，包含分別具有選自SEQIDNO:2-5、8-11、20、49-56的^J^酸序列的CDR1序列，具有選自SEQIDNO:2-20和57-64的^J^酸序列的CDR2序列，具有選自SEQIDNO:2-20和65-72的氨基酸序列的CDR3序列的VH區(qū)；以及包含分別具有選自SEQIDNO:21-39和73-80的^&酸序列的CDR1序列，具有選自SEQIDNO:21-39和81-88的^J^酸序列的CDR2序列，具有選自SEQIDNO:21-39和89-96的#^酸序列的CDR3序列的Vl區(qū)。因此，這類抗體包含單克隆抗體的Vh和VlCDR序列，也可包含這些抗體的不同的構(gòu)架序列。此類構(gòu)架序列可以從公共DNA數(shù)據(jù)庫或公布的參考文獻(xiàn)得到，其包括種系抗體基因序列。例如，人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可以在"VBase"人種系序列數(shù)據(jù)庫(可以在英特網(wǎng)網(wǎng)址www.mrc-cpe.c3m.ac.uk/vbase獲取)，以及在Kabat，E.A.，等人，1991SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242;Tomlinson，I.M.，等人，1992J.fol.Biol.227:776-798;和Cox，J.P.L.等人，1994Eur.JImmunol.24:827-836中找到，將它們都明確引入本文作為參考。列，例如，本發(fā)明的單克隆抗體使用的共有序列和/或構(gòu)架序列結(jié)構(gòu)上相似的那些構(gòu)架序列?？梢詫hCDR1、2和3序列，和VlCDR1、2和3嫁接在構(gòu)架區(qū)上，該構(gòu)架區(qū)具有與該構(gòu)架序列所來源的種系免疫球蛋白基因中發(fā)現(xiàn)的相同序列，或者可以將CDR序列嫁接在構(gòu)架區(qū)上，該構(gòu)架區(qū)與種系序列相比具有一個(gè)或多個(gè)突變。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在一些情況中，有益的是突變構(gòu)架區(qū)內(nèi)的殘基以保持或增強(qiáng)抗體的抗原結(jié)合能力(見，例如，Queen等人的美國(guó)專利號(hào)5，530，101;5,585,089;5,693,762和6，180，370)。另一類型的可變區(qū)修飾是突變Vh和/或VlCDR1、CDR2和/或CDR3區(qū)內(nèi)的氨基酸殘M而提高目的抗體的一種或多種結(jié)合性質(zhì)(例如，親和力)，稱作"親和力成熟"?？梢赃M(jìn)行位點(diǎn)定向誘變或者PCR介導(dǎo)的誘變以以導(dǎo)入突變，并且可以用如本文所述的和實(shí)施例中提供的體外或體內(nèi)測(cè)定法評(píng)估對(duì)抗體結(jié)合或者其他目的功能性質(zhì)的影響?？梢砸氡Ｊ匦揎?如上文討論)。突變可以是M酸取代、添加或缺失。此外，通常改變CDR區(qū)內(nèi)不超過一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)殘基。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的中和抗DKKl/4組合物或其抗原結(jié)合部分，其組成為VH區(qū)具有組成為選自SEQIDNO:2-5、8-11、20、49-56的#^,列或與SEQIDNO:2-5、8-11、20、49-56相比具有一、二、三、四或五個(gè)M酸取代、添加或缺失的^J^^f列的VHCDR1區(qū)；具有選自SEQIDNO:2-20和57-64的4J^酸序列或與SEQIDNO:2-20和57-64相比具有一、二、三、四或五個(gè)氨基酸取代、添加或缺失的^J^麟列的VHCDR2區(qū)；具有選自SEQIDNO:2-20和65-72的氨基酸序列或與SEQIDNO:2-20和65-72相比具有一、二、三、四或五個(gè)氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列的VHCDR3區(qū)；具有選自SEQIDNO:21-39和73-80的氨基酸序列或與SEQIDNO:21-39和73-80相比具有一、二、三、四或五個(gè)氨基酸取代、添加或缺失的^J^酸序列的VLCDR1區(qū)；具有選自SEQIDNO:21-39和81-88的^i^酸序列或與SEQIDNO:21-39和81-88相比具有一、二、三、四或五個(gè)M酸取代、添加或缺失的氨基紗列的VLCDR2區(qū)；具有選自SEQIDNO:21-39和89-96的^J^酸序列或與SEQIDNO:21-39和89-96相比具有一、二、三、四或五個(gè)氨基酸取代、添加或缺失的^J^酸序列的VLCDR3區(qū)。本發(fā)明的經(jīng)改造的抗體包括這樣的抗體，其中已經(jīng)對(duì)Vh和/或VL內(nèi)的構(gòu)架殘基進(jìn)行修飾以例如改善抗體的性質(zhì)。通常，進(jìn)行此類構(gòu)架修飾以降低抗體的免疫原性。例如，一種方法是"回復(fù)突變"一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架殘基成對(duì)應(yīng)的種系序列。更特別地，已經(jīng)經(jīng)歷體細(xì)胞突變的抗體可以含有與該抗體所來源的種系序列不同的構(gòu)架殘基通過比較抗體構(gòu)架序列與該抗體所來源的種系序列可以鑒定此類殘基。為了4吏構(gòu)架區(qū)序列回復(fù)到它們的種系構(gòu)型，可以例如通過位點(diǎn)定向誘變或PCR介導(dǎo)的誘變將體細(xì)胞突變"回復(fù)突變"成種系序列。此類"回復(fù)突變"抗體也意在被本發(fā)明包括。另一類型的構(gòu)架修飾涉及突變構(gòu)架區(qū)內(nèi)，或者甚至一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)殘基，以除去T細(xì)胞表位，從而降低抗體的潛在免疫原性。該方法也稱作"去免疫"并且在Carr等人的美國(guó)專利公布號(hào)20030153043中進(jìn)一步詳細(xì)描述。作為在構(gòu)架或CDR區(qū)內(nèi)進(jìn)行修飾，額外或備選地可以改造本發(fā)明的抗體以包括Fc區(qū)內(nèi)的j務(wù)飾，通常改變抗體的一種或多種功能性質(zhì)，如血清半壽期、補(bǔ)體固定、Fc受體結(jié)合，和/或抗原依賴性細(xì)胞毒性。此外，本發(fā)明的抗體可以被化學(xué)修飾(例如，一個(gè)或多個(gè)化學(xué)部分可以連接到抗體)或經(jīng)〗務(wù)飾而改變它的糖基化，再次改變?cè)摽贵w的一種或多種功能性質(zhì)。這些實(shí)施方案的每一個(gè)都在下面詳細(xì)描述。Fc區(qū)內(nèi)的殘基編號(hào)為Kabat的EU指數(shù)編號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾CH1的鉸鏈區(qū)使得改變，例如，增加或減少鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)目。該方法在Bodmer等人的美國(guó)專利號(hào)5，677，425中進(jìn)一步描述。改變CH1的鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基數(shù)目以例如方便輕鏈和重鏈的裝配或增加或降低抗體的穩(wěn)定性。在另一實(shí)施方案中，將抗體的Fc鉸鏈區(qū)突變以降低該抗體的生物學(xué)半壽期。更具體地，將一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變導(dǎo)入Fc-鉸鏈片段的CH2-CH3結(jié)構(gòu)域界面區(qū)，使得該抗體相對(duì)于天然Fc鉸鏈結(jié)構(gòu)域SpA結(jié)合具有受損的葡萄球菌A蛋白(SpA)結(jié)合。該方法在Ward等人的美國(guó)專利號(hào)6,165,745中進(jìn)一步詳細(xì)描述。在另一實(shí)施方案中，修飾抗體以增加其生物學(xué)半壽期。多種方法是可能的。例如，可以導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)下面的突變T252L、T254S、T256F，如Ward的美國(guó)專利號(hào)6，277,375所述。備選地，為了延長(zhǎng)生物學(xué)半壽期，可以在抗體的CH1或CL區(qū)內(nèi)改變以含有從IgG的Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)環(huán)得到的回復(fù)受體結(jié)合表位，如Presta等人的美國(guó)專利號(hào)5,869,046和6,121,022中描述。在其他實(shí)施方案中，通過將至少一個(gè)氨基酸殘基用不同的氨基酸殘基置換以改變抗體的效應(yīng)功能來改變Fc區(qū)。例如，一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以用不同的氨基酸殘基置換，使得該抗體對(duì)于效應(yīng)配體具有改變的親和力但是保留親本抗體的抗原結(jié)合能力。改變親和力的效應(yīng)配體可以是例如，F(xiàn)c受體或補(bǔ)體的Cl組分。該方法在Winter等人的美國(guó)專利號(hào)5,624,821和5,648,260中進(jìn)一步詳述。在另一實(shí)施方案中，選自氛基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以用不同氨基酸殘基置換使得該抗體具有改變的Clq結(jié)合和/或減小或消除的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。該方法在Idusogie等人的美國(guó)專利號(hào)6，194，551中進(jìn)一步詳述。在另一實(shí)施方案中，改變一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基以改變?cè)摽贵w固定補(bǔ)體的能力。該方法在Bodmer等人的PCT公布WO94/29351中進(jìn)一步描述。在另一實(shí)施方案中，通過修飾一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾Fc區(qū)以增加該抗體介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)和/或增加抗體對(duì)Fqr受體的親和力。該方法在Presta的PCT公布號(hào)WO00/42072中進(jìn)一步描述。此外，已經(jīng)為人IgGl對(duì)FcyRl、FqRII、FcyRIII和FcRn的結(jié)合位點(diǎn)作圖并且已經(jīng)描述了具有提高的結(jié)合的變體(見Shields,R丄.等人，2001J.Biol.Chen.276:6591-6604)。在另一實(shí)施方案中，修飾抗體的糖基化。例如，可以制備無糖基化抗體(即，缺少糖基化的抗體)。可以改變糖基化以例如，增加抗體對(duì)"抗原"的親和力。此類糖類修飾可以通過例如改變抗體序列內(nèi)一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)完成。例如，可以進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，其導(dǎo)致去除一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)構(gòu)架糖基化位點(diǎn)，從而去除該位點(diǎn)的糖基化。此類無糖基化可以增加抗體對(duì)抗原的親和力。這種方法在Co等人的美國(guó)專利號(hào)5，714，350和6，350，861中進(jìn)一步詳細(xì)描述。額外或備選地，可以制備具有改變類型的糖基化的抗體，如具有減少量的巖藻糖殘基的^f氐巖藻糖基化抗體或者具有增加的等分GlcNac結(jié)構(gòu)的抗體。已經(jīng)表明此類改變的糖基化模式增加抗體的ADCC能力。通過例如在具有改變的糖基化系統(tǒng)的宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體完成此類糖類修飾。具有改變的糖基化系統(tǒng)的細(xì)胞已經(jīng)在本文中描述并且可以用作宿主細(xì)胞，在其中表達(dá)本發(fā)明的重組抗體從而產(chǎn)生具有改變的糖基化的抗體。例如，Hang等人的EP1,176,195描述了具有功能被破壞的FUT8基因的細(xì)胞系，所述FUT8基因編碼巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，使得在這種細(xì)胞系中表達(dá)的抗體顯示出低巖藻糖化。Presta的PCT公開WO03/035835描述了變體CHO細(xì)胞系Lecl3細(xì)胞，其將巖藻糖連接到Asn(297)-連接的糖類的能力降低，也導(dǎo)致在該宿主細(xì)胞中表達(dá)的抗體的低巖藻糖化(也見Shields,R丄.等人，2002J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人的PCT公開WO99/54342描述了細(xì)胞系，其被改造而表達(dá)修飾糖蛋白的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(例如，P(l，4)-N乙?；咸前坊D(zhuǎn)移酶III(GnTIII)，使得在該改造細(xì)胞系中表達(dá)的抗體顯示出增加的等分GlcNac結(jié)構(gòu)，其導(dǎo)致抗體增加的ADCC活性(也見Umana等人，1999Nat.Biotech.17:176-180)。本發(fā)明設(shè)想的本文抗體的另一種修飾是聚乙二醇化?？梢詫⒖贵w聚乙二醇化，例如，以延長(zhǎng)該抗體的生物學(xué)(例如，血清)半壽期。為了聚乙二醇化抗體，通常將該抗體或其片段與聚乙二醇(PEG),如PEG的活性酯或^時(shí)生物在這樣的條件下反應(yīng)，在所述條件下，一個(gè)或多個(gè)PEG基團(tuán)變得附著到抗體或抗體片段。通過用反應(yīng)性PEG分子(或其類似的反應(yīng)性水溶性聚合物)進(jìn)行酰化反應(yīng)或烷基化反應(yīng)，可以進(jìn)行聚乙二醇化。本文所用的術(shù)語"聚乙二醇"意在包括任一形式的PEG,其已經(jīng)被用于衍生其他蛋白質(zhì)，如單(C1-C10)烷氧基一或芳氧基聚乙二醇或者聚乙二醇-馬來酰亞胺。在一些實(shí)施方案中，待聚乙二醇化的抗體是無糖基化的抗體。聚乙二醇化蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域已知的，并且可以應(yīng)用于本發(fā)明的抗體。見例如，Nishimura等人的EP0154316和Ishikawa等人的EP0401384。非免疫球蛋白支架可應(yīng)用多種的抗體/免疫球蛋白構(gòu)架或支架，只要得到的多肽包括至少一個(gè)耙蛋白特異性結(jié)合區(qū)。這類構(gòu)架或支架包括人類免疫球蛋白的五個(gè)主要的獨(dú)特型或其片段(例如本文別處公開的那些片段)，并包括其他動(dòng)物物種的免疫球蛋白，優(yōu)選地具有人源化特征。如在駱駝和/或鯊魚中鑒定的那些單一的重鏈抗體在這方面特別受關(guān)注。將由本領(lǐng)域的技術(shù)人員繼續(xù)發(fā)現(xiàn)和開發(fā)新的構(gòu)架、支架和片段。一方面，本發(fā)明涉及使用可移植本發(fā)明的CDR于其上的非免疫球蛋白支架來產(chǎn)生基于非免疫球蛋白的抗體?？蓱?yīng)用已知或未知的非免疫球蛋白構(gòu)架和支架，只要它們包括目的蛋白質(zhì)SEQIDNO:1或SEQIDNO:122的特異性結(jié)合區(qū)。這類化合物在本文中稱為"包括靶標(biāo)特異性結(jié)合區(qū)的多肽"。已知的非免疫球蛋白構(gòu)架和支架包括但不限定于，Adnectin(纖連蛋白)(CompoundTherapeutics,Inc.,Waltham，MA)、錯(cuò)蛋白(MolecularPartnersAG,Zurich,瑞士)、結(jié)構(gòu)域抗體(Domantis，Ltd(Cambridge,MA)和Ablynxnv(Zwijnaarde，Belgium))、月旨籠蛋白(Anticalin)(PierisProteolabAG,Freising，德國(guó))、小型免疫藥物(smallmodularimmuno-pharmaceutical)(TrubionPharmaceuticalsInc.,Seattle,WA)、maxybodies(Avidia，Inc.(MountainView,CA))、A蛋白(AfiibodyAG,瑞典)以及affilin(y-晶體蛋白或泛素)(ScilProteinsGmbH,Halle,德國(guó))。(i)Adnectin—化合物治療Adnectin支架基于纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域(例如纖連蛋白III型的第十模塊(IOFn3結(jié)構(gòu)域))。纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域具有7或8條分布在兩個(gè)p片層的P鏈，其中它們之間相互包裝(packagainsteachother)以形成蛋白質(zhì)核心，并且還包含互相連接p鏈并且暴露于溶劑的環(huán)(類似于CDR)。在P片層夾心層的每一邊緣至少有三個(gè)這樣的環(huán)，其中邊緣是蛋白質(zhì)垂直于p鏈方向的界線。(US6,818,418)。這些基于纖連蛋白的支架不M疫球蛋白，盡管全部折疊密切涉及最小的功能性抗體片"R——重鏈可變區(qū)，其包括駱駝和美洲駝IgG中的完整抗原識(shí)別單位。由于這種結(jié)構(gòu)，非免疫球蛋白抗體模擬與抗體特性在本質(zhì)上和親和力上相似的抗原結(jié)合特性。可將這些支架用于體外的環(huán)隨機(jī)化和改組策略中，其與體內(nèi)抗體親和力成熟過程相似。這些基于纖連蛋白的分子可用作支架，其中使用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)可將分子的環(huán)區(qū)用本發(fā)明的CDR取代。(ii)錨蛋白一分子伴侶該技術(shù)基于使用具有錨蛋白來源的重復(fù)模塊的蛋白質(zhì)作為攜帶可變區(qū)的支架，其可用于結(jié)合到不同靶標(biāo)。錨蛋白重復(fù)模塊是由兩個(gè)反平行的a-螺旋和p-轉(zhuǎn)角構(gòu)成的33個(gè)M酸多肽?？勺儏^(qū)的結(jié)合主要通過使用核糖體展示來最優(yōu)化。(iii)Maxybodies/Avimer畫AvidiaAvimer源自包含蛋白質(zhì)如LRP-1的天然結(jié)構(gòu)域A。這些結(jié)構(gòu)域本來是用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用并且在超過250個(gè)人蛋白質(zhì)中結(jié)構(gòu)性基于結(jié)構(gòu)域A。由大量不同的經(jīng)由氨基酸鍵連接的"A結(jié)構(gòu)域"單體(2-10)構(gòu)成Avimer。l吏用描述于例如20040175756、20050053973、20050048512以及20060008844中的方法能夠產(chǎn)生可結(jié)合到目的抗原的Avimer。(vi)A蛋白一親和體Uffibody)Affibody⑧親和配基是小型的、簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)，其組成為基于A蛋白的一種IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域的支架的三個(gè)螺旋束。A蛋白是細(xì)菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的表面蛋白。該支架域由58個(gè)氨基酸構(gòu)成，其中的13個(gè)隨機(jī)產(chǎn)生含大量配體變體的Affibody⑧文庫(參見例如US5,831,012)。Affibody⑧分子模擬抗體，與150kDa分子量的抗體相比，它們具有6kDa的分子量。雖然它的尺寸小，但Affibody⑧分子的結(jié)合位點(diǎn)與抗體的結(jié)合位點(diǎn)相似。(v)Anticalin—PierisAnticalins⑧是由PierisProteoLabAG公司開發(fā)的產(chǎn)品。它們?cè)醋灾\蛋白，一組分布廣泛的小而強(qiáng)力的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)通常涉及化學(xué)敏感的或不溶的化合物的生理轉(zhuǎn)運(yùn)或貯藏。某些天然的脂籠蛋白產(chǎn)生于人類組織或體液中。該蛋白質(zhì)構(gòu)造讓人聯(lián)想到具有剛性構(gòu)架頂部高變環(huán)的免疫球蛋白。然而，與抗體或其重組片段相反，脂籠蛋白由含160至180個(gè)氨基酸殘基的單一多肽鏈構(gòu)成，僅在邊緣比單一免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域更大些。一套四個(gè)環(huán)組成結(jié)合口袋，顯示顯著的結(jié)構(gòu)可塑性并耐受多種側(cè)鏈?？梢虼嗽趯Ｓ械某绦蛑懈脑旖Y(jié)合位點(diǎn)以識(shí)別指定的具有高親和力和特異性的不同形狀的耙分子。通過誘變一套四個(gè)環(huán)，脂籠蛋白家族的一種蛋白質(zhì)，甘蘭菜粉蝶(PierisBrassicae)的膽汁三烯結(jié)合蛋白(BBP)已用于開發(fā)Anticalin。描述"Anticalin"的專利申請(qǐng)書的一個(gè)實(shí)例是PCTWO199916873。(vi)Affilin-Scil蛋白質(zhì)AffilinTM分子是設(shè)計(jì)成對(duì)蛋白質(zhì)和小分子具有特異親和力的小的非免疫球蛋白蛋白質(zhì)，新的AffilinTM分子可從兩個(gè)文庫中非常迅速地篩選出，每一文庫都是基于源自不同人類的支架蛋白質(zhì)。AffilinTM分子未顯示與免疫球蛋白蛋白質(zhì)的任何結(jié)構(gòu)同源性。Sell蛋白質(zhì)使用兩種AffilinTM支架，其中一種是，晶體蛋白，人類結(jié)構(gòu)性眼晶狀體蛋白質(zhì)以及另一種是"泛素"超家族蛋白質(zhì)。兩種人類支架都非常小，顯示高溫穩(wěn)定性并且?guī)缀跄艿挚筽H變化和變性劑。這種高穩(wěn)定性主要是由于蛋白質(zhì)的延展(5片層結(jié)構(gòu)。源自蛋白質(zhì)的？晶體蛋白的實(shí)例描述于WO200104144中并且"泛素樣"蛋白質(zhì)的實(shí)例描述于WO2004106368中。改造抗體的方法如上面討論，具有本文所示的Vh和Vl序列，或全長(zhǎng)重鏈和輕鏈序列的抗DKK1抗體可以用于通過修飾全長(zhǎng)重鏈和/或輕鏈序列、Vh和/或Vl序列或其連接的恒定區(qū)而產(chǎn)生新的抗DKKl/4抗體。從而，在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的抗DKK1抗體的結(jié)構(gòu)特征用于產(chǎn)生結(jié)構(gòu)相關(guān)的抗DKKl/4抗體，其保留本發(fā)明抗體的至少一種功能性質(zhì)，如結(jié)合人DKK1或DKK4或其兩者，以及抑制DKK1或DKK4或其兩者的一種或多種功能性質(zhì)。例如，本發(fā)明抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)或其突變可以與已知的構(gòu)架區(qū)和/或其他CDR重組組合，以產(chǎn)生如上文討論的額外的重組改造的抗DKK1抗體。其他類型的修飾包括前面部分中描述的那些修飾。用于改造方法的起始材料是本文提供的一種或多種Vh和/或V^序列，或者其一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)。為了產(chǎn)生改造的抗體，不必實(shí)際上制備(即，作為蛋白質(zhì)表達(dá))具有本文提供的一個(gè)或多個(gè)Vh和/或v^序列或其一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)的抗體。相反，將序列中所含的信息用作起始材料產(chǎn)生來自最初序列的"第二代"序列，然后制備"第二代"序列并表達(dá)為蛋白質(zhì)。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備抗DKK1抗體的方法，所述抗DKK1抗體由VH區(qū)抗體序列和VL區(qū)抗體序列組成，所述VH區(qū)抗體序列具有選自SEQIDNO:2-5、8-11、20、49-56的CDR1序列，選自SEQIDNO:2-20和57-64的CDR2序列和/或選自SEQIDNO:2-20和65-72的CDR3序列；所述VL區(qū)抗體序列具有選自SEQIDNO:21-39和73-80的CDR1序列，選自SEQIDNO:21-39和81-88的CDR2序列和/或選自SEQIDNO:21-39和89-96的CDR3序列；改變所述VH區(qū)抗體序列和/或VL區(qū)抗體序列內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基以產(chǎn)生至少一個(gè)改變的抗體序列；并將該改變的抗體序列表達(dá)為蛋白質(zhì)。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備抗DKK1抗體的方法，所述抗DKKl抗體由全長(zhǎng)重鏈抗體序列和全長(zhǎng)輕鏈抗體序列組成，所述全長(zhǎng)重鏈抗體序列具有選自SEQIDNO:115-117的序歹J;所述全長(zhǎng)輕鏈抗體序列具有選自SEQIDNO:111-114的序列；改變所述全長(zhǎng)重鏈抗體序列和/或全長(zhǎng)輕鏈抗體序列內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基以產(chǎn)生至少一個(gè)改變的抗體序列；并將該改變的抗體序列表達(dá)為蛋白質(zhì)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備進(jìn)行哺乳動(dòng)物表達(dá)的優(yōu)化的中和抗DKK1/4組合物的方法，所述中和抗DKK1/4組合物由VH區(qū)抗體序列和VL區(qū)抗體序列組成，所述VH區(qū)抗體序列具有選自SEQIDNO:119的序列；所述Vt區(qū)抗體序列具有選自SEQIDNO:118的序列；改變所述VH區(qū)抗體序列和/或VL區(qū)抗體序列內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基以產(chǎn)生至少一個(gè)改變的抗體序列；并將該改變的抗體序列表達(dá)為蛋白質(zhì)。可以用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)制備和表達(dá)改變的抗體序列。所改變的抗體序列編碼的抗體是保留本文所述的中和抗DKK1/4組合物的一種、一些或所有功能性質(zhì)的抗體，其功能性質(zhì)包括但不限于，特異性結(jié)合人DKKl;和顯示出至少一種下面的功能性質(zhì)的抗體該抗體抑制DKKl蛋白質(zhì)與DKK1受體的結(jié)合，或該抗體抑制DKKl受體結(jié)合，以預(yù)防或改善骨質(zhì)溶解；或該抗體抑制DKKl受體結(jié)合，以預(yù)防或改善骨質(zhì)溶解性損傷；或該抗體抑制抑制DKKl受體結(jié)合，以預(yù)防或改善癌癥。所改變的抗體可以顯示出一種或多種、兩種或多種，或三種或多種上面討論的功能性質(zhì)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中可得的和/或本文所述的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定法，如實(shí)施例中給出的那些(例如，ELISA)評(píng)估改變的抗體的功能性質(zhì)。在改造本發(fā)明抗體的方法的一些實(shí)施方案中，可以沿著抗DKK1抗體編碼序列的全部或者部分隨機(jī)或者選擇性導(dǎo)入突變，并可以對(duì)得到的經(jīng)修飾的抗DKK1抗體篩選如本文所述的結(jié)合活性和/或其他功能性質(zhì)。突變方法已經(jīng)在本領(lǐng)域描述。例如，Short的PCT公布WO02/092780描述了使用飽和誘變、合成連接裝配，或者其組合產(chǎn)生和篩選抗體突變的方法。備選地，Lazar等人的PCT公布WO03/074679描述了使用計(jì)算機(jī)篩選方法優(yōu)化抗體的理化性質(zhì)的方法。抗體的Fc恒定區(qū)對(duì)確定血清半壽期和效應(yīng)功能，即抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)活性是至關(guān)重要的。可設(shè)計(jì)Fc片段的特定突變以改變效應(yīng)功能和/或血清半壽期(參見例如Xencortechnology,也參見例如WO2004029207),改變抗體的效應(yīng)功能和血清半壽期的方法是嫁接具有適當(dāng)效應(yīng)功能的Fc片段的抗體片段的可變區(qū)?？舍槍?duì)細(xì)胞殺傷活性來選擇IgGl或lgG4同種型，而lgG2同種型可用于沉默或中和抗體(不具有細(xì)胞殺傷活性)。通過用血清蛋白如HSA或結(jié)合到這種血清蛋白的蛋白質(zhì)如HSA結(jié)合蛋白制備抗體可變區(qū)的嵌合融合物，以獲得具有長(zhǎng)血清半壽期的沉默抗體。效應(yīng)功能也可通過調(diào)節(jié)抗體的糖基化模式來改變。Glycart(例如US6，602，684)、Biowa(例如US6，946，292)和Genentech(例如WO03/035835)已將哺乳動(dòng)物細(xì)胞系改造為產(chǎn)生具有增加的或減少的效應(yīng)功能的抗體。具體地，非巖藻糖基化的抗體將具有增強(qiáng)的ADCC活性。Glycofi也已開發(fā)能產(chǎn)生抗體的特定糖形的酵母細(xì)胞系。編碼本發(fā)明抗體的核酸分子本發(fā)明的另一方面涉及編碼本發(fā)明抗體的核酸分子。全長(zhǎng)輕鏈母M苷酸序列的實(shí)例示于SEQIDNO:97-100中。全長(zhǎng)重鏈母本核苷酸序列的實(shí)例示于SEQIDNO:101-103中。進(jìn)行細(xì)胞中表達(dá)的優(yōu)化的全長(zhǎng)輕鏈核苷酸序列的實(shí)例示于SEQIDNO:104-107中。進(jìn)行細(xì)胞中表達(dá)的優(yōu)化的全長(zhǎng)重鏈核苷酸序列的實(shí)例示于SEQIDNO:108-110中。核酸可以存在于完整細(xì)胞、細(xì)胞裂解物中，或者可以是部分純化或者基本上純的形式。當(dāng)通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化核酸以除去其他細(xì)胞組分或其他污染物，例如，其他細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì)時(shí)，核酸是"分離的"或"使得基本上純的"，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括^SDS處理、CsCl分帶(binding),柱層析、瓊脂糖凝膠電泳和本領(lǐng)域公知的其他技術(shù)。見F.Ausubel，等人，編著，1987CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience，NewYork。本發(fā)明的核酸可以是例如DNA或RNA,并且可以含有或不含有內(nèi)含子序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸是cDNA分子。核酸可以存在于載體，如噬菌體展示栽體，或者重組質(zhì)粒栽體中?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)得到本發(fā)明的核酸。對(duì)于雜交瘤(例如，如下文進(jìn)一步描述的攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠制備的雜交瘤)表達(dá)的抗體，編碼通過雜交瘤制備的抗體的重鏈和輕鏈的cDNA可以通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增或cDNA克隆技術(shù)得到。對(duì)于從免疫球蛋白基因文庫(例如，使用噬菌體展示技術(shù))得到的抗體，可以從作為文庫成員的多種噬菌體克隆回收編碼所述抗體的核酸。一旦得到編碼Vh和VL區(qū)段的DNA片段，就可以通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)進(jìn)一步操作這些DNA片段，例如，以將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)變成全長(zhǎng)抗體鏈基因、Fab片M因，或者scFv基因。在這些操作中，編碼Vt-或VH的DNA片段有效連接到另一DNA分子，或者編碼另一蛋白質(zhì)的片段，如抗體恒定區(qū)或柔性接頭。該上下文中使用的術(shù)語"有效連接"意指兩個(gè)DNA片段以功能性方式連接，例如，使得這兩個(gè)DNA片段編碼的#^*列保持符合讀框，或者使得該蛋白質(zhì)在所希望的啟動(dòng)子控制下表達(dá)?？梢詫⒕幋aVH區(qū)的分離的DNA轉(zhuǎn)變成全長(zhǎng)重鏈基因，通過將Vh編碼DNA有效連接到編碼重鏈恒定區(qū)(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子實(shí)現(xiàn)所述轉(zhuǎn)變。人重鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域已知的(見例如，Kabat,E.A.，等人，1991SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)并且可以通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增得到包含這些區(qū)域的DNA片段。重鏈恒定區(qū)可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)。對(duì)于Fab片段重鏈基因，可以將編碼VH的DNA有效連接至編碼僅僅重鏈CHI恒定區(qū)的另一DNA分子。通過將V^編碼DNA有效連接到編碼輕鏈恒定區(qū)CL的另一DNA分子，可以將分離的編碼Vt區(qū)的DNA轉(zhuǎn)變成全長(zhǎng)輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人輕鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域已知的(見例如，Kabat，E.A.，等人,1991SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)并且包含這些區(qū)的DNA片段可以通過標(biāo)準(zhǔn)DNA擴(kuò)增得到。輕鏈恒定區(qū)可以是k或k恒定區(qū)。為了產(chǎn)生scFv基因，可以將編碼VH和VL的DNA片段有效連接到編碼柔性接頭，例如，編碼M酸序列(Gly4-861")3的另一片段，使得Vh和Vt序列可以作為連續(xù)的單鏈蛋白質(zhì)表達(dá)，通過柔性接頭連接Vl和VH區(qū)(見，例如，Bird等人，1988Science242:423-426;Huston等人，1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883;McCafferty等人，1990Nature348:552-554)。本發(fā)明單克隆抗體的制備可以通過多種技術(shù)產(chǎn)生單克隆抗體(mAb)，所述技術(shù)包括常規(guī)的單克隆抗體方法，例如，Kohler和Milstein,1975Nature256:495的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜^:技術(shù)。可以使用多種用于產(chǎn)生單克隆抗體的技術(shù)，例如，b淋巴細(xì)胞的病毒或瘙基因轉(zhuǎn)化。用于制備雜交瘤的動(dòng)物系統(tǒng)是鼠系統(tǒng)。在小鼠中的雜交瘤產(chǎn)生是成熟的方法。用于分離用于融合的經(jīng)免疫的脾細(xì)胞的免疫方案和技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。融合配偶體(例如，鼠骨髓瘤細(xì)胞)和融合步驟也是已知的。可以基于如上述制備的鼠單克隆抗體的序列制備本發(fā)明的嵌合或人源化抗體。編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA可以從目的鼠雜交瘤得到并使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)改造成含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，為了產(chǎn)生嵌合抗體，可以使用本領(lǐng)域已知的方法將鼠可變區(qū)連接到人恒定區(qū)(見，例如，Cabilly等人的美國(guó)專利號(hào)4，816，567)。為了產(chǎn)生人源化抗體，可以使用本領(lǐng)域已知的方法將鼠CDR區(qū)插入到人構(gòu)架區(qū)。見例如，Winter的美國(guó)專利號(hào)5,225,539和Queen.等人的美國(guó)專利號(hào)5,530,101;5,585,089;5，693，762和6;180;370。在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是人單克隆抗體?？梢允褂脭y帶部分人免疫系統(tǒng)而不是小鼠免疫系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠產(chǎn)生針對(duì)DKK1的此類人單克隆抗體。這些轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠包括在本文中分別稱作HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且它們?cè)诒疚闹薪y(tǒng)稱為"人Ig小鼠"。HuMAb小鼠*(Medarex，Inc.)含有人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)，其編碼未重排的人重鏈O和y)和k輕鏈免疫球蛋白序列，以及定向突變，其失活內(nèi)源fi和k鏈基因座(見例如，Lonberg，等人，1994Nature368(6474):8S6-859)。因此，小鼠顯示出小鼠IgM或k的降低的表達(dá)，并且在應(yīng)答免疫時(shí)，所導(dǎo)入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變以產(chǎn)生高親和性人IgGK單克隆抗體(Lonberg,N.等人，1994上文；Lonberg，N.，1994HandbookofExperimentalPharmacology113:49-101;Lonberg,N.和Huszar，D.，1995Intern.Rev.Immunol.13:65-93，和Harding,F.和Lonberg,N.，1995Ann.N.Y.Acad.Sci，764:536-546中綜述)。HuMAb小鼠的制備和用途，和此類小鼠攜帶的基因組修飾在Taylor,L.等人，1992NucleicAcidsResearch20:6287-6295;Chen,J.等人，1993InternationalImmunology5:647-656;Tuaillon等人，1993Pro"Natl.Acad.Sci.USA94:3720-3724;Choi等人，1993NatureGenetics4:117-123;Chen,丄等人，1993EMBOJ.12:821-830;Tuaillon等人，1994J.Immunol.152:2912-2920;Taylor,L.等人，1994InternationalImmunology579-591;和Fishwild，D.等人，1996NatureBiotechnology14:845-851中進(jìn)一步描述，將它們的內(nèi)容都完整引入本文作為參考。還見，Lonberg和Kay的美國(guó)專利號(hào)5，545，806;5，569，825;5，625，126;5,633,425;5，789，650;5，877，397;5,661，016;5,814,318;5,874,299;和5,770,429;Surani等人的美國(guó)專利號(hào)5，545，807;和Lonberg和Kay的PCT公開號(hào)WO92103918、WO93/12227、WO94/25585、WO97113852、WO98/24884和WO99/45962;和Korman等人的PCT公開號(hào)WO01/14424。在另一實(shí)施方案中，使用在轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體上攜帶人免疫球蛋白序列的小鼠，如攜帶人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體。此類小鼠在本文中稱作"KM小鼠"，在Ishida等人的PCT公布號(hào)WO02/43478中詳細(xì)描述。此外，表^免疫球蛋白基因的備選的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物系統(tǒng)可以在本領(lǐng)域中得到并且可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗DKK1抗體。例如，可以使用稱作Xenomouse(Abgenix，Inc.)的備選轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)；此類小鼠在例如Kucherlapati等人的美國(guó)專利號(hào)5，939，598;6,075,181;6,114,598;6，150,584和6,162,963中描述。此外，表ii^免疫球蛋白基因的備選的轉(zhuǎn)染色體動(dòng)物系統(tǒng)可以在本領(lǐng)域中獲得并且可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗DKK1抗體。例如，可以使用稱作"TC小鼠"的攜帶人重鏈轉(zhuǎn)染色體和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠；此類小鼠在Tomizuka等人，2000Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:722-727中描述。此外，攜帶人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)染色體的奶牛已經(jīng)在本領(lǐng)域描述(Kuroiwa等人，2002NatureBiotechnology20:889-894)并且可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗DKK1抗體。也可以使用篩選人免疫球蛋白基因文庫的噬菌體展示方法制備本發(fā)明的人單克隆抗體。此類用于分離人抗體的噬菌體展示方法在本領(lǐng)域中建立。見例如Ladner等人的美國(guó)專利號(hào)5，223，409;5，403，484;和5，571，698;Dower等人的美國(guó)專利號(hào)5,427,908和5,580,717;McCafferty等人的美國(guó)專利號(hào)5,969,108和6,172,197;和Griffiths等人的美國(guó)專利號(hào)5,885,793;6，521，404;6，544，731;6,555,313;6，582，915和6,593,081。也可以使用其中已經(jīng)重建了人免疫細(xì)胞的SCID小鼠制備本發(fā)明的人單克隆抗體，從而當(dāng)免疫時(shí)可以產(chǎn)生人抗體應(yīng)答。此類小鼠在例如Wilson等人的美國(guó)專利號(hào)5,476,996和5,698,767中描述。篩選人抗體文庫可用以鑒定本發(fā)明的抗體。篩選技術(shù)的選擇包括但不限定于，例如噬菌體展示(Morphosys)、文庫類型(例如Morphosys的HuCaI文庫)、親和力突變技術(shù)和另外的密碼子優(yōu)化序列。產(chǎn)生抗DKK1的人單克隆抗體將來自大腸桿菌、桿狀病毒或HEK-EBNA細(xì)胞的純化重組人DKK1、或純化的綴合到鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)的重組人DKK1用作抗原。使用表達(dá)人抗體基因的HuMab轉(zhuǎn)基因小鼠的HCo7品系制備針對(duì)IL-13的完全人單克隆抗體。在每一該小鼠品系中，可以如Chen等人，1993EMBOJ.12:811-820中描述的純合地破壞內(nèi)源小鼠k輕鏈基因并且可以如PCT^HfWO01109187的實(shí)施例1中所述的純合地破壞內(nèi)源小鼠重鏈基因。每一該小鼠品系攜帶如Fishwild等人，1996NatureBiotechnology14:845-851中描述的人k輕鏈轉(zhuǎn)基因KCo5。如美國(guó)專利號(hào)5,545,806;5，625，825;和5,545,807中所述的HCo7品系攜帶HCo7人重鏈轉(zhuǎn)基因。如PCT公開WO01/09187的實(shí)施例2中描述的HCo12品系攜帶HCo12人重鏈轉(zhuǎn)基因。HCol7品系攜帶HCol7人重鏈轉(zhuǎn)基因。如PCT公開WO02/43478中描述的KNM品系包括SC20轉(zhuǎn)染色體。為產(chǎn)生DKK1的全長(zhǎng)人單克隆抗體，HuMab小鼠和KM小鼠使用來自大腸桿菌的純4匕重組DKK1或DKK1-KLH綴合物作為抗原來免疫。HuMab小鼠的一般免疫方案在Lonberg，N.等人，1994Nature368(6474):856-859;Fishwild,D.等人，1996NatureBiotechnology14:845-851和PCT公開WO98/24884中描述。第一次輸注抗原時(shí)小鼠為6-16周齡。DKK1抗原的純化重組制劑(5-50照)(例如從表達(dá)DKK1的轉(zhuǎn)染的大腸桿菌細(xì)胞中純化的)用于HJ度內(nèi)、皮下(Sc)或經(jīng)由足墊的注射來免疫HuMab小鼠和KM小鼠。轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)腹膜內(nèi)(IP)、皮下(Sc)或足墊(FP)由完全弗氏佐劑或Ribi佐劑中的抗原免疫兩次，之后的3-21天用在不完全弗氏佐劑或Ribi佐劑中的抗原IP、Sc或FP免疫(總共免疫11次)。免疫應(yīng)答通過眼眶^jfit來監(jiān)測(cè)。血漿由ELISA篩選，并且具有足夠抗DKK1人免疫球蛋白效價(jià)的小鼠用于融合。處死和移除脾臟前的3天和2天使用抗原對(duì)小鼠進(jìn)行靜&,射。通常，對(duì)每一種抗原進(jìn)行10-35次融合。每一種抗原免疫幾打小鼠。用DKK1免疫HCo7、HCo12、HCo17和KM小鼠品種(strain)總共82只小鼠。為選擇產(chǎn)生結(jié)合DKK1的抗體的HuMab或KM小鼠，來自免疫小鼠的血清可通過由Fishwild，D等人，1996描述的ELISA檢測(cè)。簡(jiǎn)要地，微量滴定板用PBS中來自大腸桿菌的1-2照/ml純化的重組DKK1包被，50jil/孔4°C溫育過夜然后用200nl/孔PBS/Tween(0.05%)中的5%雞血清封閉。將來自DKK1免疫小鼠的血漿稀釋液加入到每孔中并在室溫下溫育1-2小時(shí)。平板用PBS/Tween洗滌并然后用與辣根過氧化物酶(HRP)綴合的山羊抗人IgGFc多克隆抗體于室溫下溫育1小時(shí)。洗涂后，平板用ABTS底物顯色(Sigma,A-1888,0.22mg/ml)并且通過分光光度計(jì)在OD415-495處分析。具有最高效價(jià)的抗DKK1抗體的小鼠用于融合。進(jìn)行融合并且通過ELISA測(cè)定雜交瘤上清液的抗DKK1活性?；跇?biāo)準(zhǔn)方案，分離自HuMab小鼠和KM小鼠的小鼠脾細(xì)胞在PEG存在下融合小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。然后篩選得到的雜交瘤的抗原特異性抗體的產(chǎn)生。將來自免疫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液在50%PEG(Sigma)存在下融合四分之一數(shù)量的SP2/0非分泌性小鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCC，CRL1581)。細(xì)胞以大約lxl()5/孔涂布于平底孩i量滴定板中，接下來在包含10。/。胎牛血清、10%P388Dl(ATCC、CRLTIB-63)的條件培養(yǎng)基、以及含有3-5。/oorigen(IGEN)、5mMHEPES、0.055mM2-巰基乙醇、50mglnni慶大霉素和lxHAT(Sigma,CRLP-7185)的DMEM(Mediatech，CRL10013，含有高葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉)的選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)約兩周。1-2周后，細(xì)胞培養(yǎng)于其中的HAT替換成HT的培養(yǎng)基中。然后通過EUSA來篩選各孔中的人抗DKK1單克隆IgG抗體。一旦雜交瘤大量生長(zhǎng)，就通常在10-14天后監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基。抗體分泌性雜交瘤重涂布、再次篩選并且，如果仍然對(duì)人類IgG呈陽性，則將抗DKK1單克隆抗體通過限制性稀釋進(jìn)行至少兩次亞克隆。然后將穩(wěn)定的亞克隆于體外培養(yǎng)以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生小量抗體用于進(jìn)一步的表征。人類Ig小鼠的免疫如描述于Lonberg，N等人，1994Nature368(6474):856-859;Fishwild，D.等人，1996NatureBiotechnology14:845-851;和PCT公開WO98124884和WO01/14424中的，當(dāng)人類Ig小鼠用于產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體時(shí)，這類小鼠可用DKKl抗原和/或重組DKK1、或DKKl融合蛋白的純化的或濃縮的制劑來免疫，第一次注射時(shí)小鼠可以是6-16周齡。例如，DKKl抗原的純化的或重組的制劑(5-50ng)可用于進(jìn)行腹膜內(nèi)免疫人類Ig小鼠。產(chǎn)生對(duì)DKK1的完整人單克隆抗體的詳細(xì)程序如上所述。不同抗原累時(shí)，轉(zhuǎn)基因小鼠應(yīng)答，接下來使用不完全弗氏佐劑中的抗原進(jìn)行每隔一周IP免疫(總達(dá)6次)。然而，發(fā)現(xiàn)除弗氏之外的佐劑也有效。另外，缺乏佐劑的整個(gè)細(xì)胞顯現(xiàn)非常高的免疫原性。眼眶#獲得的血漿樣品可在免疫方案的過程中監(jiān)測(cè)免疫應(yīng)答。血漿可通過ELISA篩選，并且具有充分效價(jià)的抗DKK1人類免疫球蛋白的小鼠可用于融合。處死和移除脾臟前的3天用抗原對(duì)小鼠可進(jìn)行靜脈推射。預(yù)期每次免疫可能需要進(jìn)行2-3次融合。每種抗原通常免疫6至24只小鼠。通常使用HCo7和HCo12品種。另夕卜，HCo7和HCo12轉(zhuǎn)基因可共同培育成具有兩種不同人類重鏈轉(zhuǎn)基因的單一小鼠(HCo7/HCo12)。產(chǎn)生人單克隆抗體的雜交瘤的制備為制備產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體的雜交瘤，可將免疫小鼠的脾細(xì)胞和/或淋巴腺細(xì)胞分離并融合到合適的永生化細(xì)胞系，如小鼠骨髓瘤細(xì)胞。得到的雜交瘤可篩選用于產(chǎn)生抗原特異性抗體。例如，可將免疫小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液用50%PEG融合到六分之一量的P3X63-Ag8.653非分泌性小鼠骨髓瘤細(xì)胞。細(xì)胞在平底^L量滴定板中以約2xl45涂布，接下來在含20。/。胎克隆血清、18%"653"M培養(yǎng)基、5%origen(IGEN)、4mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉、5mMHEPES、0:055mM2-巰基乙醇、50單位/ml青霉素、50mg/ml鏈霉素、50mg/ml慶大霉素和IXHAT(Sigma;融合后24h加入HAT)的選擇性培養(yǎng)基中溫育兩周。約兩周后，細(xì)胞可培養(yǎng)于其中的HAT培養(yǎng)基替換為HT培養(yǎng)基中。然后單獨(dú)的孔通過ELISA來篩選人類單克隆IgM和IgG抗體。只要發(fā)生廣泛的雜交瘤生長(zhǎng)，通常就在10-14天后觀測(cè)培養(yǎng)基?？贵w分泌性雜交瘤重涂布、再次篩選，并且如果仍然對(duì)人類IgG呈陽性，則可將單克隆抗體通過限制性稀釋進(jìn)行至少兩次亞克隆。然后將穩(wěn)定的亞克隆于體外培養(yǎng)，用以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生小量抗體用于表征。為純化人單克隆抗體，可將選擇的雜交瘤在兩升攪拌式培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)以純化單克隆抗體。采用A蛋白-瓊脂糖凝膠(Pharmacia,Piscataway,N.J.)的親和色諳法前可過濾和濃縮上清液。洗脫的IgG可通過凝膠電泳和高效液相色語檢測(cè)以確保純度。緩沖溶液可調(diào)換成PBS，并且濃度可通過使用消光系數(shù)為1.43的OD細(xì)來測(cè)定?？蓪慰寺】贵w等分并儲(chǔ)存于-80'C。產(chǎn)生單克隆抗體的轉(zhuǎn)染瘤的制備還可以在宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤中產(chǎn)生本發(fā)明的抗體，使用例如，本領(lǐng)域公知的重組DNA才支術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法的組合(例如，Morrison,S.(1985)Science229:1202)。例如，為了表達(dá)抗體，或者其抗體片段，可以通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(例如，PCR擴(kuò)增或cDNA克隆，使用表達(dá)目的抗體的雜交瘤)可以得到編碼部分或全長(zhǎng)輕鏈和重鏈的DNA，并且可以將DNA插入到表達(dá)栽體中，使得基因有效連接到轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列。在該上下文中，術(shù)語"有效連接，，意指抗體基因連接到載體中，從而載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列發(fā)揮它們調(diào)節(jié)抗體基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的預(yù)期功能。選擇表達(dá)載體和表達(dá)控制序列以與所用的表達(dá)宿主細(xì)胞相容?？梢詫⒖贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因插入到單獨(dú)的載體，或者更典型地，可以將兩種基因插入到相同的表達(dá)載體中。通過標(biāo)準(zhǔn)方法向表達(dá)載體中插入抗體基因(例如，在抗體基因片段或載體上連接互補(bǔ)限制性位點(diǎn)，或者如果不存在限制性位點(diǎn)，那么為平末端連接)。本文所述抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)可以用于產(chǎn)生任何抗體同種型的全長(zhǎng)抗體基因，通過將所述基因插入到已經(jīng)編碼所希望同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)栽體中，使得VH區(qū)段有效連接載體內(nèi)的CH區(qū)段并且VL區(qū)段有效連接載體內(nèi)的CL區(qū)段，可以實(shí)現(xiàn)所述產(chǎn)生。額外或備選地，重組表達(dá)栽體可以編碼信號(hào)肽，其方便抗體鏈從宿主細(xì)胞的分泌?？梢詫⒖贵w鏈基因克隆到栽體中使得信號(hào)肽與抗體鏈基因的g末端符合讀框地連接。信號(hào)肽可以是免疫球蛋白信號(hào)肽或異源信號(hào)肽(即，來自非免疫球蛋白蛋白質(zhì)的信號(hào)肽)。除了抗體鏈基因外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還可以攜帶控制抗體鏈基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"意在包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其他表達(dá)控制元件(例如，多聚腺苷酸化信號(hào))，其控制抗體鏈基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯。此類調(diào)節(jié)序列描述于例如Goeddel(GeneExpressionTechnology.MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,CA1990)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白表達(dá)載體的設(shè)計(jì)，包括調(diào)節(jié)序列的選擇，可以依賴于此類因素，如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、所希望的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，等等。哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)的調(diào)節(jié)序列包括指導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平蛋白質(zhì)表達(dá)的病毒元件，如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子，其來自巨細(xì)胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(AdMLP))，和多瘤。備選地，可以使用非病毒調(diào)節(jié)序列，如泛蛋白啟動(dòng)子或P珠蛋白啟動(dòng)子。此外，由不同來源的序列組成的調(diào)節(jié)元件，如SRa啟動(dòng)子系統(tǒng)，其含有來自SV40早期啟動(dòng)子的序列和人T細(xì)胞白血病病毒1型的長(zhǎng)末端重復(fù)的序列(Takebe，Y.等人，1988Mol.Cell.Biol.8:466-472)。除了抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列外，本發(fā)明的重組表達(dá)栽體可以攜帶額外的序列，如調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中載體復(fù)制的序列(如復(fù)制原點(diǎn))和選擇標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記基因方便已經(jīng)導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞的選擇(見，例如，Axel等人的美國(guó)專利號(hào)4，399，216，4，634，665和5,179,017)。例如，通常，選擇標(biāo)記基因?qū)σ呀?jīng)導(dǎo)入載體的宿主細(xì)胞賦予對(duì)藥物(如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性。選擇標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主細(xì)胞，使用氨甲蝶呤選擇/擴(kuò)增)和neo基因(用于G418選擇)。對(duì)于輕鏈和重鏈的表達(dá)，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼重鏈和輕鏈的表達(dá)栽體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞。術(shù)語"轉(zhuǎn)染"的多種形式意在包括常用于向原核或真核宿主細(xì)胞中導(dǎo)入外源DNA的多種技術(shù)，例如，電穿孔、磷酸4丐沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等等。在理論上可能在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的抗體。討論了抗體在真核細(xì)胞，尤其哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的表達(dá)，因?yàn)榇祟愓婧思?xì)胞，尤其哺乳動(dòng)物細(xì)胞，比原核細(xì)胞更可能裝配和分泌正確折疊的和免疫活性抗體。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)抗體基因的原核表達(dá)對(duì)于產(chǎn)生高產(chǎn)量的活性抗體是無效的(Boss，M.A.和Wood,C.R"1985ImmunologyToday6:12-13)。用于表達(dá)本發(fā)明的重組抗體的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞(包括dhfr-CHO細(xì)胞，描述于Urlaub和Chasin，1980Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220，使用DHFR選擇標(biāo)記，如RJ.Kaufman和P.A.Sharp,1982Mol.Biol.159:601-621中描述)、NSO骨髓瘤細(xì)胞、COS細(xì)胞和SP2細(xì)胞。具體地，為使用NSO骨髓瘤細(xì)胞，另一種表達(dá)系統(tǒng)是示于WO87/04462，WO89/01036和EP338,841中的GS基因表達(dá)系統(tǒng)。當(dāng)將編碼抗體基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞時(shí)，通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞足夠允許抗體在宿主細(xì)胞中表達(dá)的時(shí)間或者將抗體分泌到宿主細(xì)胞所生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中來產(chǎn)生抗體?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法從培養(yǎng)基回收抗體。藥物組合物另一方面，本發(fā)明提供了組合物，例如，藥物組合物，其含有本發(fā)明的中和抗DKK1/4組合物或其抗原結(jié)合片段之一或組合，與可藥用載體一起配制。此類組合物可以包括本發(fā)明的抗體或免疫連接物或雙特異性分子之一或組合(例如，兩種或多種不同抗體的組合)。例如，本發(fā)明的藥物組合物可以包含結(jié)合耙抗原上不同表位或者具有互補(bǔ)活性的抗體(或者免疫連接物或雙特異性分子)的組合。也可以以組合療法，即與其他藥劑相組合來施用本發(fā)明的藥物組合物。例如，組合療法可以包括與至少一種其他抗炎劑或抗骨多孔性制劑組合的本發(fā)明的抗DKK1抗體?？梢杂糜诮M合療法的治療劑的實(shí)例在下面關(guān)于本發(fā)明抗體用途的章節(jié)中更詳細(xì)地描述。本文所用的"可藥用載體"包括生理上相容的任何和所有溶劑、M介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸M緩劑，等等。載體應(yīng)該適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、脊柱或表皮施用(例如，通過注射或灌輸)。取決于施用途徑，活性化合物，即抗體、免疫連接物，或雙特異性分子可作用。本發(fā)明的藥物化合物可以包括一種或多種可藥用鹽。"可藥用鹽"指保留親本化合物的所希望的生物活性并且不賦予任何不希望的毒理學(xué)效應(yīng)的鹽(見例如，Berge，S.M.，等人，1977J.Pharm，Sci.66:1-19)。此類鹽的實(shí)例包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括來自無毒無機(jī)酸的鹽，如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸的鹽，等等，以及來自無毒有機(jī)酸的鹽，所迷無毒有機(jī)酸為如脂肪族一或二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳族酸、脂肪族和芳族磺酸，等等。堿加成鹽包括來自堿土金屬如鈉、鉀、鎂、鈣等等的那些鹽，以及來自無毒有機(jī)胺的鹽，所述無毒有機(jī)胺為如N，N'-二苯曱基乙二胺、N-曱基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因，等等。本發(fā)明的藥物組合物還可以包括可藥用抗氧化劑?？伤幱每寡趸瘎┑膶?shí)例包括水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、石危酸氬鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞石危酸鈉等等；油可溶的抗氧化劑，如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基化羥基苯曱醚(BHA)、丁基化羥基曱苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、a生育酚，等等；和金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸，等等?？梢杂糜诒景l(fā)明的藥物組合物中的合適的水性和非水性載體的實(shí)例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇，等等)，和其合適的混合物，植物油，如橄欖油，和可注射的有機(jī)酯，如油酸乙酯。例如，通過使用包衣材料，如卵磷脂，對(duì)于^t體的情況通過保持所需的顆粒大小，和通過使用表面活性劑，可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。這些組合物還可以含有佐劑，如防腐劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑和分狀劑。孩支生物存在的防止可以通過如上消毒程序，和通過包括多種抗細(xì)菌和抗真菌劑來確保，所述抗細(xì)菌和抗真菌劑為例如對(duì)羥基苯曱酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等等。還希望在組合物中包括等滲劑，如糖、氯化鈉等等。此外，通過包括延緩吸收的試劑，如單硬脂酸鋁和明膠可以引起可注射藥物形式的延長(zhǎng)吸收?？伤幱幂d體包括無菌水溶液或#體和無菌粉劑，其用于臨時(shí)制備無菌注射液或^t體。此類介質(zhì)和試劑在藥學(xué)活性物質(zhì)中的用途是本領(lǐng)域已知的。除了與活性化合物不相容的常規(guī)介質(zhì)或試劑之外，預(yù)期其用于本發(fā)明的藥物組合物。還可以將補(bǔ)充性活性化合物摻入組合物中。治療組合物通常必須是在生產(chǎn)和保存條件下是無菌的和穩(wěn)定的?？梢詫⒔M合物配制成溶液劑、微乳劑、脂質(zhì)體或適于高藥物濃度的其他有序結(jié)構(gòu)。載體可以是溶劑或^L介質(zhì)，含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇，等等)，和其合適的混合物?？梢员３诌m當(dāng)流動(dòng)性，例如，通過使用包衣，如卵磷脂，對(duì)于M體的情況通過保持所需的顆粒大小和通過使用表面活性劑。在許多情況中，可以在組合物中包括等滲劑，例如，糖、多元醇，如甘露醇，山梨醇，或者氯化鈉。可注射組合物的延長(zhǎng)吸收可以通過在組合物中包括延緩吸收的物質(zhì)，如單硬脂酸鹽和明膠來實(shí)現(xiàn)。通過將活性化合物以所需的量在合適的溶劑中與上面列舉的成分之一或者組合摻和，如果需要，接著無菌微量過濾來制備無菌注射溶液。通常，通過將活性化合物摻入無菌栽體制備M體，所迷栽體含有基本M介質(zhì)和來自上面列舉的那些成分的所需的其他成分。對(duì)于用于制備無菌注射溶液的無菌粉劑的情況，制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，其產(chǎn)生活性成分加上來自其之前無菌過濾溶液的任何額外的所需成分的粉末。可以與載體物質(zhì)組合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量將取決于,皮治療的受試者、具體施用方式而變。可以與栽體物質(zhì)組合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量將通常是產(chǎn)生治療效果的組合物的量。通常，以百分比計(jì)，該量將為約0.01%到約99%活性成分、約0.1%到約70%，或約1%到約30%活性成分與可藥用載體組合。調(diào)節(jié)劑量方案以提供最佳的目的應(yīng)答(例如，治療應(yīng)答)。例如，可以施用單次快速濃注，可以隨時(shí)間施用幾個(gè)分份劑量，或者可以根據(jù)治療情況的緊迫性成比例地減小或增加劑量。特別有利的是以劑量單位形式配制腸胃外組合物以容易施用和劑量統(tǒng)一。如本文所用的劑量單位形式指適宜作為待治療受試者的單一劑量的物理上^t的單位；每個(gè)單位含有預(yù)定量的活性成分，所述量經(jīng)計(jì)算以與所需的藥物栽體結(jié)合產(chǎn)生所希望的治療效果。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格由如下決定并且直掩昧賴于活性化合物的獨(dú)特特征和待實(shí)現(xiàn)的具體治療效果，和本領(lǐng)域中配制用于治療個(gè)體中敏感性的這種活性化合物的固有局限性。對(duì)于抗體施用，劑量為約0.0001到200mg/kg,更通常0.01到50mg/kg宿主體重。例如，劑量可以為0.3mg/kg體重、lmg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重或1-20mg/kg的范圍內(nèi)。示例性治療方案需要每周施用一次、每?jī)芍芤淮?、每三周一次、每四周一次、每月一次、?月一次、或每3到6月一次。本發(fā)明的抗DKK1抗體的劑量方案可以包括通過靜脈內(nèi)或皮下施用lmg/kg體重或3mg/kg體重，用下面的給藥方案之一施用抗體例如，每四周一次施用6次劑量，然后每3月一次；每3周一次；3mg/kg體重一次，接著每3周1mg/kg體重。在一些方法中，同時(shí)施用具有不同結(jié)合特異性的兩種或多種單克隆抗體，在這種情況下施用的每種抗體的劑量落入所指出的范圍內(nèi)。通常在多個(gè)時(shí)機(jī)施用抗體。單次劑量之間的間隔可以是例如每周、每月、每3月或每年。間隔也可以是不規(guī)則的，通過測(cè)量患者中針對(duì)靶抗原或某些生物標(biāo)記物如OCN、OPG或P1NP的抗體的血液水平來指示。在一些方法中，調(diào)節(jié)劑量以實(shí)現(xiàn)血漿抗體濃度為約1-1000|ag/ml并且在一些方法中為約25-300pg/ml。備選地，可以作為持續(xù)釋放制劑施用抗體，在該情況中，需要低頻率的施用。劑量和頻率取決于抗體在患者中的半壽期而變。通常，人抗體顯示出最長(zhǎng)的半壽期，其次是人源化抗體、嵌合抗體，和非人抗體。劑量和施用頻率可以隨著治療是預(yù)防性還是治療性的而變。在預(yù)防性應(yīng)用中，在長(zhǎng)時(shí)間期間內(nèi)以相對(duì)不頻繁的間隔施用相對(duì)低的劑量。一些患者終生持續(xù)接受治療。在治療應(yīng)用中，有時(shí)需要以相對(duì)較短的間隔施用相對(duì)高劑量直到疾病的逸艮減'隻或者終止或者直到患者顯示出疾病癥狀的部分或完全減輕。之后，可以對(duì)患者施用預(yù)防方案。本發(fā)明的藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可以改變，只要活性成分的量對(duì)于具體患者、組合物和施用方式實(shí)現(xiàn)所希望的治療應(yīng)答，而對(duì)該患者無毒性。所選的劑量水平將取決于多種藥物代謝動(dòng)力學(xué)因素，包括使用的本發(fā)明的具體組合物或者其酯、鹽或酰胺的活性，施用途徑，施用時(shí)間，使用的具體化合物的排泄速率，治療持續(xù)時(shí)間，與所用的具體組分組合使用的其他藥物、化合物和/或物質(zhì)、被治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、一般健康和以前的醫(yī)療史，和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中公知的其他因素。本發(fā)明抗DKK1抗體的"治療有效劑量，，可以導(dǎo)致疾病癥狀嚴(yán)重性的降低、無疾病癥狀期的頻率和持續(xù)時(shí)間的增加，或者由于疾病折磨而引起的病損或殘疾的預(yù)防?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的一種或多種方法，通過一種或多種施用途徑施用本發(fā)明的組合物。如技術(shù)人員將理解，施用途徑和/或方式將取決于所希望的結(jié)果而變。本發(fā)明抗體的施用途徑包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、皿內(nèi)、皮下、脊柱其他腸胃外施用途徑，例如，通過注射或灌注。如本文使用的短語"腸胃外施用"指不同于經(jīng)腸和局部施用的施用方式，通常通過注射，并且包括但不限于，靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、嚢內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、真皮內(nèi)、JM內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、,iLM下、蛛網(wǎng)膜下腔、脊柱內(nèi)、石更膜外和intrastemal注射和灌注。備選地，本發(fā)明的抗體可以通過非腸胃外途徑施用，如局部、表皮或粘膜施用途徑，例如，鼻內(nèi)、口腔、陰道、直腸、舌下或局部?？梢杂帽Ｗo(hù)活性化合物免于快速釋放的載體制備活性化合物，如控釋制劑，包括植入物、經(jīng)皮貼劑，和微嚢化遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾纳锵嗳莸木酆衔?，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備此類制劑的許多方法被申請(qǐng)專利或者是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。見例如,SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems,J.R.Robinson,ed.，MarcelDekker，Inc.,NewYork,1978?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的醫(yī)學(xué)裝置施用治療組合物。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，可以用無針頭的皮下注射裝置施用本發(fā)明的治療組合物，如美國(guó)專利號(hào)5，399，163;5，383，851;5,312,335;5，064，413;4,941,880;4，7卯，824或4，596，556中所示的裝置?？捎糜诒景l(fā)明的公知的植入物或組件的實(shí)例包括美國(guó)專利號(hào)4,487,603，其說明了用于以受控速率分配藥物的可^的微量輸液泵；美國(guó)專利號(hào)4,486,194，其說明了用于通過皮膚施用藥物的治療裝置；美國(guó)專利號(hào)4,447,233，其說明了用于以精確的輸注速率遞送藥物的藥物輸液泵；美國(guó)專利號(hào)4,447,224，其說明了用于連續(xù)藥物遞送的變速流可植入輸液器；美國(guó)專利號(hào)4,439,196，其說明了具有多個(gè)腔室的滲透藥物遞送系統(tǒng)；和美國(guó)專利號(hào)4,475,196，其說明了滲透藥物遞送系統(tǒng)。將這些專利引入本文作為參考。許多其他此類植入物、遞送系統(tǒng)，和組件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在一些實(shí)施方案中，可以配制本發(fā)明的人單克隆抗體以確保在體內(nèi)適當(dāng)分配。例如，血腦屏障(BBB)排除許多高親水性化合物。為了確保本發(fā)明的治療化合物穿過BBB(如果希望)，可以將它們用例如脂質(zhì)體配制。關(guān)于生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法，見例如，美國(guó)專利4,522,811;5，374，548;和5,399,331。脂質(zhì)體可以包含一種或多種部分，其被選擇性運(yùn)輸?shù)教囟?xì)胞或器官中，從而增強(qiáng)定向藥物遞送(見，例如，V.V.Ranade，1989J.ClinePharmacol.29:685)。示例性定向部分包括葉酸或生物素(見，例如，Low等人的美國(guó)專利5,416,016);甘露糖苷類(Umezawa等人，1988Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038);抗體(P.GBloeman等人，1995FEBSLett.357:140;M.Owais等人，1995Antimicrob.AgentsChernother.39:180);表面活性劑A蛋白受體(Briscoe等人，1995Am.J.Physiol.l233:134);pl20(Schreier等人，1994J.Biol.Chem.269:9090);也見K.Keinanen;M丄.Laukka腦,1994FEBSLett.346:123;J.J.Killion;I.J.Fidler，1994Immnunomethods4:273。組合本發(fā)明還涉及在哺乳動(dòng)物特別是人類中以藥用物質(zhì)的組合預(yù)防或治療增殖性疾病或疾病如癌癥的方法，其中包括(a)中和抗DKKl/4組合物；和(b)—種或多種藥用活性物質(zhì)。本發(fā)明另外涉及的藥物組合物，其包括(a)中和抗DKKl/4組合物；(b)藥用活性物質(zhì)；和(c)可藥用載體。本發(fā)明另外涉及商業(yè)包裝或產(chǎn)品，其包括(a)中和抗DKKl/4組合物的藥物制劑；和(b)同時(shí)、并列、單獨(dú)或依次使用的藥用活性物質(zhì)的藥物制劑。藥用活性物質(zhì)術(shù)語"藥用活性物質(zhì)"是涵蓋許多具有不同作用機(jī)理的藥用活性物質(zhì)的廣義范疇。若干這些藥用活性物質(zhì)和中和DKK1/4抗體/組合物的組合可導(dǎo)致癌癥治療的改進(jìn)。通常，藥用活性物質(zhì)依據(jù)其作用4幾理分類。許多可獲得的物質(zhì)是多種腫瘤發(fā)生途徑的抗代謝物，或與腫瘤細(xì)胞的DNA反應(yīng)。這些也有抑制酶例如拓樸異構(gòu)酶I和拓樸異構(gòu)酶II的物質(zhì)，或抗有絲分裂的物質(zhì)。術(shù)語"藥用活性物質(zhì)"尤其指不同于中和抗DKK1/4組合物或其衍生物的任一藥用活性物質(zhì)。它包括但不限定于i.芳化酶抑制劑；ii.抗雌激素藥、抗雄激素藥或促性腺激素釋放因子激動(dòng)劑；iii.拓樸異構(gòu)酶I抑制劑或拓樸異構(gòu)酶II抑制劑；iv.微管活性劑、烷化劑、抗肺瘤的抗代謝物或鉑化合物；v.靶向/降低蛋白質(zhì)或脂質(zhì)激酶活性、或者蛋白質(zhì)或脂質(zhì)磷酸酶活性的化合物，或進(jìn)一步的抗血管生成的化合物或誘導(dǎo)細(xì)胞分化過程的化合物；vi.單克隆抗體；vii.環(huán)加氧酶抑制劑、二磷酸鹽、類肝素酶抑制劑、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑；viii.Ras致癌同種型抑制劑；ix.端粒末端轉(zhuǎn)移酶抑制劑；x.蛋白酶抑制劑、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、甲硫氨酸氨肽酶抑制劑或蛋白酶體抑制劑；xi.用于治療血液性惡性腫瘤的試劑、靶向，降低或抑制Flt-3活性的xiii.抗增殖性抗體；xiv.組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑；xv.靶向、降低或抑制絲氨^/蘇氨酸mTOR激酶活性/功能的化合物；xvi.促生長(zhǎng)素抑制素受體拮抗劑；xvii.抗白血病的4t合物；xviii.肺瘤細(xì)胞損傷方式；xix.EDG結(jié)合劑；xx.核苷酸還原酶抑制劑；xxi.S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶抑制劑；xxii.VEGF或VEGFR的單克隆抗體；xxiii.光動(dòng)力學(xué)治療；xxiv.血管穩(wěn)定(Angiostatic)類固醇；xxv.包含糖皮質(zhì)激素的植入物；xxvi.ATI受體拮抗劑；和xxvii.ACE抑制劑。本文所用的術(shù)語"芳化酶抑制劑"涉及抑制雌激素生成即抑制底物雄烯二酮和睪酮分別轉(zhuǎn)化為雌酮和雌二醇的化合物。該術(shù)語包括但不局限于類固醇、尤其是阿他美坦、依西美坦和福美坦，以及特別地非類固醇的、尤其是氨魯米特、洛太米特、吡魯米特、曲洛司坦、睪內(nèi)脂、膚康王、伏氯唑、法倔唑、阿那曲唑和來曲唑。依西美坦商標(biāo)為AROMASIN;福美坦商標(biāo)為L(zhǎng)ENTARON;法倔唑商標(biāo)為AFEMA;阿那曲唑商標(biāo)為ARIMIDEX;來曲唑商標(biāo)為FEMARA或FEMAR;氨魯米特商標(biāo)為ORIMETEN。包含的藥用活性物質(zhì)為芳化酶抑制劑的本發(fā)明組合對(duì)于治療諸如乳腺腫瘤的激素受體陽性腫瘤尤其有用。本文所用的術(shù)語"抗雌激素藥"涉及在雌激素受體水平對(duì)抗雌激素效應(yīng)的化合物。該術(shù)語包括但不局限于他莫西芬、氟維司群、雷咯昔芬和鹽酸雷咯昔芬。他莫西芬可以以其NOLVADEX的商品化形式進(jìn)行施用。鹽酸雷咯昔芬可以以其EVISTA的商品化形式進(jìn)行施用。氟維司群可以按照美國(guó)專利號(hào)4，659，516配制并且商標(biāo)為FASLODEX。包含的藥用活性物質(zhì)為抗雌激素藥的本發(fā)明組合對(duì)于治療諸如乳腺肺瘤的雌激素受體陽性肺瘤尤其有用。本文所用的術(shù)語"抗雄激素"涉及任何能夠抑制雄激素生物效應(yīng)的物質(zhì)，并且包括但不局限于能夠按照美國(guó)專利號(hào)4,636，505所公開的配制的比卡魯胺(CASODEX)。本文所用的術(shù)語"促性腺激素釋放因子激動(dòng)劑"包括但不局限于阿巴瑞克、戈舍瑞林和醋酸戈舍瑞林。戈舍瑞林在美國(guó)專利號(hào)4,100，274中得到公布，并且商標(biāo)為ZOLADEX,阿巴瑞克可以按照美國(guó)專利號(hào)5，843，901中公布的配方進(jìn)行制造。本文所用的術(shù)語"拓樸異構(gòu)酶I抑制劑"包括但不局限于托泊替康、gimatecan、依立替康、喜樹堿及其類似物、9-硝基喜樹堿和大分子的喜樹堿結(jié)合物PNU-166148(WO99/17804中的化合物Al)。依立替康可以以例如其諸如商標(biāo)CAMPTOSAR的商品化形式進(jìn)行施用。托泊替康可以以例如其諸如商標(biāo)HYCAMTIN的商品化形式進(jìn)行施用。本文所用的術(shù)語"拓樸異構(gòu)酶n抑制劑"包括但不局限于諸如多柔比星，其包含脂質(zhì)體制劑，如CAELYX;其包含脂質(zhì)體制劑，如DAUNOSOME、柔紅霉素、表柔比星、伊達(dá)比星和奈莫柔比星、米托蒽醌和洛索蒽醌(蒽醌)、以及依托泊苷和替尼泊苷(鬼臼毒素)。依托泊苷商標(biāo)為ETOPOPHOS;替尼泊苷商標(biāo)為VM26-BRISTOL;多柔比星商標(biāo)為ADRIBLASTIN或ADRIAMYCIN;表柔比星商標(biāo)為FARMORUBICIN;伊達(dá)比星商標(biāo)為ZAVEDOS且米托蒽醌商標(biāo)為NOVANTRON。本文所用的術(shù)語"微管活性劑"涉及微管穩(wěn)定劑、微管去穩(wěn)定劑和微管聚合抑制劑，其包括但不局限于諸如紫杉醇和多西紫杉的紫杉烷、諸如長(zhǎng)春喊、尤其;lj琉酸長(zhǎng)春減鹽的長(zhǎng)春花生物堿、尤其^L^t酸長(zhǎng)春新堿的長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春瑞濱、discodermolide、矛火7jM山堿和i者:i口epothiloneB或其f汴生物的epothilone及其衍生物。紫杉醇商標(biāo)為TAXOL;多西紫杉商標(biāo)為TAXOTERE;石泉酸長(zhǎng)春喊商標(biāo)為VINBLASTINR.P;二琉酸長(zhǎng)春新堿商標(biāo)為FARMISTIN。也包括紫杉醇的一般形式以及紫杉醇的多種劑量形式。紫杉醇的一般形式包括但不限定于鹽酸倍他洛爾。紫杉醇的多種劑量形式包括但不限定于商標(biāo)為ABRAXANE、ONXOL、CYTOTAX的清蛋白納米紫杉醇；discodermolide可例如美國(guó)專利號(hào)5，010，099中所公開的獲得。還包含美國(guó)專利號(hào)6,194，181、WO98/10121、WO98/25929、WO98/08849、W099/43653、WO98/22461和WO00/31247中公布的Epothilone衍生物。特別優(yōu)選EpothiloneA和/或B。本文所用的術(shù)語"烷化劑，，包括但不局限于環(huán)磷酰胺、異磷酰胺、美法侖，或亞硝基脲(BCNU或Gliadel)，或泰莫佐羅(TEMODAR)。環(huán)磷酰胺可以以例如其諸如商標(biāo)CYCLOSTIN的商品化形式進(jìn)行施用。環(huán)磷酰胺可以以例如其諸如商標(biāo)CYCLOSTIN的商品化形式進(jìn)行施用；而異環(huán)磷酰胺可以以例如其諸如商標(biāo)HOLOXAN的商品化形式進(jìn)行施用。術(shù)語"抗胂瘤的抗代謝物"包括但不局限于5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他濱、吉西他濱、DNA脫甲基化劑、例如5-阿扎胞苷和地西他濱、氨曱喋呤和依達(dá)曲沙、以及諸如培美曲塞的葉酸拮抗劑?？ㄅ嗨麨I可以以例如其諸如商標(biāo)XELODA的商品化形式進(jìn)行施用。吉西他濱可以以例如其諸如商標(biāo)GEMZAR的商品化形式進(jìn)行施用。本文所用的術(shù)語"鉑化合物"包括但不局限于卡鉑、順鉑、順氯氨柏、奧沙利鉑、沙鉑和鉑物質(zhì)如ZD0473?？ㄣK可以以例如其商標(biāo)CARBOPLAT的形式進(jìn)行施用。奧沙利鉑可以以例如其商標(biāo)ELOXATIN的形式進(jìn)行施用。本文所用的術(shù)語"靶向/減少蛋白質(zhì)或脂質(zhì)激酶活性，或蛋白質(zhì)或脂質(zhì)磷酸酶活性的化合物，或其他抗血管生成的化合物，，包括但不限定于，酪氨酸蛋白激酶和/或絲氨酸和/或蘇氨酸激酶抑制劑或脂質(zhì)激酶抑制劑，例如i)靶向、降低或抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)活性的化合物，如耙向、降低或抑制VEGF活性的化合物，尤其是抑制VEGF受體的化合物，例如但不限定于，7H-吡咯[2，3-d]嘧啶衍生物(AEE788)、BAY43-9006、公開于WO00/09495中的異膽堿(isolcholine)化合物如(4-叔丁基-苯基)-94-吡咬-4-基甲基-異會(huì)啉-l-基)-胺(AAL881);和ii)靶向、降低或抑制血小板衍生的生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)活性的化合物，例如把向、降低或抑制PDGFR活性的化合物，尤其是抑制PDGF受體的化合物，例如N-苯基-2-嗜咬-胺衍生物，如imatinib、SUIOI、SU6668和GFB誦lll;iii)靶向、降低或抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)活性的化合物；iv)靶向、降低或抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子受體1(IGF-1R)活性的化合物，例如耙向、降低或抑制IGF-1R活性的化合物，尤其是抑制IGF-1R受體的化合物，如WO02/092599中公布的那些化合物以及衍生物，4-氨基-5-苯基-7-環(huán)丁基-吡咯p，3-d嘧咬衍生物(AEW541)。v)耙向、降低或抑制Trk受體酪氨酸激酶家族活性的化合物；vi)靶向、降低或抑制Axl受體酪氨酸激酶家族活性的化合物；vii)靶向、降低或抑制c-Met受體活性的化合物；viii)靶向、降低或抑制Ret受體酪氨酸激酶活性的化合物；ix)耙向、降低或抑制Kit/SCFR受體酪氨酸激酶活性的化合物；x)耙向、降4氐或抑制C-kit受體酪氨酸激酶(PDGFR家族的一部分)活性的化合物，例如粑向、降低或抑制c-Kit受體酪氨酸激酶家族活性的化合物，尤其是抑制c-Kit受體的化合物，例如imatinib;xi)靶向、降低或抑制c-Abl家族成員及其基因融合產(chǎn)物(例如BCR-Abl激酶)活性的化合物，例如耙向、降低或抑制c-Abl家族成員及其基因融合產(chǎn)物的化合物，例如N-苯基-2-嘧咬-胺衍生物，例如imatinib、PD180970、AG957、NSC680410或來自ParkeDavis的PD173955、BMS354825;xii)靶向、降低或抑制蛋白激酶C(PKC)和絲氨^/蘇氨酸激酶的Raf家族成員、MEK、SRC、JAK、FAK、PDK和Ras/MAPK家族成員或者PI(3)激酶家族或PI(3)激酶相關(guān)激酶家族成員、和/或細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶家庭(CDK)成員活性的、并且尤其是那些美國(guó)專利號(hào)5,093，330中公布的諸如米哚妥林的星形孢菌素衍生物的化合物；其他化合物的實(shí)例還包括例如UCN-Ol、沙芬戈、BAY43-9006、莒蘚抑素I、哌立福辛、llmofosine、RO318220和RO320432;諸如WO00/09495中公布的那些異查啉化合物、FTI、PD184352或QAN697、P13K抑制劑；xiii)靶向、降低或抑制蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性的化合物，例如靶向、降低或抑制蛋白質(zhì)酪氨酸激酶抑制劑活性的、包括甲磺酸伊馬替尼(GLEEVEC)、酪氨酸磷酸化抑制劑(tyrphostin)或pyrymidylaminobenzamide及其f斤生物(AMN107)。酪氨酸磷酸化抑制劑優(yōu)選低分子量(Mr〈1500)的化合物或其可藥用鹽，尤其是選自千叉丙二腈類或者S-芳基苯丙二腈或雙底物壹啉類(bisubstratequinolineclass)的化合物，更尤其是選自酪氨酸磷酸化抑制劑A23/RG-50810、AG99、酪氨酸磷酸化抑制劑AG213、酪氨酸磷酸化抑制劑AG1748、酪氨酸磷酸化抑制劑AG490、酪氨酸磷酸化抑制劑B44、酪氨酸磷酸化抑制劑B44(+)對(duì)映異構(gòu)體、酪氨酸磷酸化抑制劑AG555、AG494、酪氨酸磷酸化抑制劑AG556、AG957和adaphostin(4-{(2，5-二羥基苯基)甲基]氨基}-苯甲酸金剛烷酯、NSC680410、adaphostin)的化合物；xiv)靶向、降低或抑制受體酪氨酸激酶的表皮生長(zhǎng)因子家族(同二聚體或異二聚體的EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4)活性的化合物，例如耙向、降低或抑制表皮生長(zhǎng)因子受體家族活性的化合物尤其是抑制諸如EGF受體、ErbB2、ErbB3和ErbB4的EGF受體酪氨酸激酶家族成員或者結(jié)合EGF或EGF相關(guān)配體的化合物、蛋白質(zhì)或抗體，并且特別是那些WO97/02266中一般性和特別地公布的化合物、蛋白質(zhì)或單克隆抗體，例如實(shí)施例39的化合物或EP0564409、WO99/03854、EP0520722、EP0566226、EP0787722、EP0837063、美國(guó)專利號(hào)5,747，498、WO98/10767、WO97/30034、WO97/49688、WO97/38983、并且尤其是WO96/30347(例如命名為CP358774的化合物)、WO96/33980(例如化合物ZD1839)和WO95/03283(例如化合物ZM105180)中的化合物，例如司徒曼布(HERCEPTIN)、西妥昔單抗、Iressa、Tarceva、OSI-774、CI陽1033、EKB隱569、GW-2016、El.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.ll、E6.3或E7.6.3、以及WO03/013541中公開的7H-吡咯并-[2，3-d嘧咬衍生物、厄洛替尼和吉非替尼。厄洛替尼可以以例如其諸如商標(biāo)TARCEVA的商品化形式進(jìn)行施用；而吉非替尼可以以例如其諸如商標(biāo)IRESSA的商品化形式進(jìn)行施用；以及xv)靶向、降低或抑制絲氨^/蘇氨酸mTOR激酶活性的化合物尤其是抑制mTOR激酶家族成員化合物、蛋白質(zhì)或抗體，例如RAD、RAD001、CCI-779、ABT578、SAR543、雷帕霉素及其衍生物、來自Ariad的AP23573、伊維莫司(CERTICAN)和西羅莫司。CERTICAN(伊維莫司，RAD)是防止T細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞增殖的研究性新型增殖信號(hào)抑制劑。當(dāng)提及抗體時(shí)，其包括完整的單克隆抗體、納米抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體組成的多特異性抗體，以及抗體片段，只要它們呈現(xiàn)預(yù)期的生物學(xué)活性。本文所用的短語"靶向、降低或抑制蛋白質(zhì)或脂質(zhì)磷酸酶活性的化合物"包括但不限定于，磷酸酶l、磷酸酶2A、PTEN或CDC25的抑制劑，例如岡田酸或其衍生物。本文所用的術(shù)語"單克隆抗體，，包括但不限定于，貝伐單抗、西妥昔單抗、曲妥單抗、替伊莫單抗、狄諾塞麥、抗-CD40、抗-GM-CSF，以及托西莫單抗和碘I131。貝伐單抗可以以例如AVAST1N的商品化形式進(jìn)行施用；西妥昔單抗可以以例如ERB1TUX的商品化形式進(jìn)行施用；曲妥單抗可以以例如HERCEPTIN的商品化形式進(jìn)行施用；利妥昔單抗可以以例如MABTHERA的商品化形式進(jìn)行施用；替伊莫單抗可以以例如ZEVULIN的商品化形式進(jìn)行施用；抗-RANKL可以以例如狄諾塞麥(AMG162)的商品化形式進(jìn)行施用、抗-CD40可以以例如HCD122(美國(guó)專利申請(qǐng)2002-0106371)的商品化形式進(jìn)行施用，并且托西莫單抗和硤I131可以以例如BEXXAR的商品化形式進(jìn)行施用。短語"進(jìn)一步的抗血管生成的化合物，，包括但不限定于具有它們的活性具有另一機(jī)制、例如與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)激酶抑制無關(guān)的化合物，例如沙利度胺(THALOMID)和TNP-470。本文所用的短語"誘導(dǎo)細(xì)胞分化過程的化合物"包括但不限定于視黃酸、oc-y-或P-生育盼或oc-v-或5-生育三烯酚。本文所用的術(shù)語"環(huán)加氧酶抑制劑"包括但不限定于例如Cox-2抑制劑、5-烷基取代的2-芳基氨基苯乙酸及衍生物，例如塞來考昔(CELEBREX)、羅非考昔(VIOXX)、艾托考昔、伐地考昔或5-烷基-2-芳基氨基苯乙酸，例如5-曱基-2-(2，-氯-6'-氟苯胺基)苯乙酸、魯米昔布。本文所用的術(shù)語"二磷酸鹽"包括但不限定于etridonicacid、氯膦酸、替魯磷酸、帕米磷酸、阿侖磷酸、伊班磷酸、利塞磷酸和唑來磷酸。"Etridonicacid"可以以例如DIDRONEL的商品化形式進(jìn)行施用。"氯膦酸，，可以以例如BONEFOS的商品化形式進(jìn)行施用。"替魯磷酸，，可以以例如SKELID的商品化形式進(jìn)行施用。"帕米磷酸，，可以以例如AREDIA的商品化形式進(jìn)行施用。"阿侖磷酸"可以以例如FOSAMAX的商品化形式進(jìn)行施用。"伊班磷酸"可以以例如BONDRANAT的商品化形式進(jìn)行施用。"利塞磷酸"可以以例如ACTONEL的商品化形式進(jìn)行施用。"唑來磷酸"可以以例如ZOMETA的商品化形式進(jìn)行施用。本文所用的術(shù)語"類肝素酶抑制劑"是指靶向、降低或抑制疏酸肝素降解的化合物。該術(shù)語包括但不局限于PI-88。本文所用的術(shù)語"生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑"包括但不限定于是指淋巴因子或干擾素，例如干擾素y。本文所用的術(shù)語"Ras致瘤同種型的抑制劑"包括但不限定于H-Ras、K-Ras或N-Ras,如本文所用的，指耙向、降低或抑制Ras致癌活性的化合物，例如"法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑"，例如L-744832、DK8G557或P115777(ZARNESTRA)。本文所用的術(shù)語"端粒末端轉(zhuǎn)移酶抑制劑"包括但不限定于靶向、降低或抑制端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性的化合物.靶向、降低或抑制端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性的化合物尤其是抑制端粒末端轉(zhuǎn)移酶受體的化合物，例如telomestatin。本文所用的術(shù)語"基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑"或(MMP抑制劑)包括但不限定于膠原肽模擬抑制劑和非肽模擬抑制劑、四環(huán)素衍生物，例如異羥坊酸肽模擬抑制劑巴馬司他及其口服的生物有效性類似物馬立馬司他(BB-2516)、普淋司他(AG3340)、metastat(NSC683551)、BMS-279251、BAY12-9566、TAA211、MM1270B或AAJ996。本文所用的術(shù)語"甲硫氨酸氨肽酶抑制劑"包括但不限定于靶向、降低或抑制曱硫氨酸氨肽酶活性的化合物。耙向、降低或抑制甲硫氨酸氨肽酶活性的化合物例如bengamide或其f汙生物。本文所用的術(shù)語"蛋白酶體抑制劑"包括耙向、降低或抑制蛋白酶體活性的化合物。靶向、降低或抑制蛋白酶體活性的化合物包括例如PS-341、MLN341、硼替佐米或萬珂。本文所用的短語"用于治療血液性惡性腫瘤的物質(zhì)"包括但不限定于FMS樣酪氨酸激酶抑制劑(例如靶向、降低或抑制FMS樣酪氨酸激酶受體(Flt-3R)活性的化合物)、干擾素、l-b-D-阿糖呋喃胞嘧啶(ara-c)和重硫酸鹽(bisulfan)、以及諸如靼向、降低或抑制退行性淋巴瘤激酶的化合物的ALK抑制劑。本文所用的短語"靶向，降低或抑制Flt-3活性的物質(zhì)，，包括但不限定于抑制Flt-3的化合物、蛋白質(zhì)或抗體，例如N-苯甲?；?星孢菌素、米哚妥林、星孢菌素衍生物、SU11248和MLN518。本文所用的術(shù)語"HSP90抑制劑"包括但不限定于靶向、降低或抑制HSP90的內(nèi)源ATP酶活性的化合物；通過泛素蛋白酶體途徑降解、靶向、降低或抑制HSP90服務(wù)蛋白(HSP90clientprotein)的化合物。靶向、降低或抑制HSP90內(nèi)源的ATP酶活性的化合物尤其是抑制HSP90的ATP酶活性的化合物、蛋白質(zhì)和抗體，例如一種格爾德霉素衍生物17-烯丙氨基，17-去甲氧基格爾德霉素(17AAG)、格爾德霉素相關(guān)的其他化合物、根赤殼菌素抑制劑和HDAC抑制劑。本文所用的術(shù)語"抗增殖抗體"包括但不限定于曲妥單抗(HERCEPTIN)、曲妥單抗-DM1、厄洛替尼(TARCEVA)、貝伐單抗(AVASTIN)、利妥昔單抗(RITUXAN)、PR064553(抗CD40)和抗體2C4。抗體是指例如完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體組成的多特異性抗體、以及抗體片段,只要它們呈現(xiàn)目的生物學(xué)活性。本文所用的術(shù)語"HDAC抑制劑"涉及抑制組蛋白脫乙酰酶和具有抗增殖活性的化合物。該化合物包括但不限定于公開于WO02/22577中的化合物，特別是N-羥基-l[4-[[(2-羥乙基)[2-(lH-吲咮-3-基)乙基3-絲I甲基苯基l-2￡-2-丙烯酰胺和]\-羥基-3-[4-[[[2-(2-甲基-lH-丐l咪-3-基)-乙基-氨基]甲基]苯基]-2E-2-丙烯酰胺及其可藥用鹽(LBH589)。另外特別包括辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA);14-(2-氨基-苯氨羰基)-苯曱基-氨基曱酸吡啶-3-基甲基酯及其衍生物；丁酸、pyroxamide、曲古抑菌素A、Oxamflatin、apiddin、酉旨狀、depudecin和trapoxin。本文所用的短語"靶向、降低或抑制絲氨l蘇氨酸mTOR激酶的活性/功能的化合物"包括但不限定于靶向/抑制mTOR激酶家族成員的化合物、蛋白質(zhì)或抗體，例如RAD、RADOOl、CCI-779、ABT578、SAR543、雷帕霉素及其衍生物/類似物、來自Ariad的AP23573和AP23841、依維莫司(CERTICAN)和西羅莫司(RAPAMUNE)、CCI-779和ABT578。CERTICAN(依維莫司，RAD)是防止T細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞增殖的研究性新型增殖信號(hào)抑制劑。本文所用的術(shù)語"生長(zhǎng)素抑制素受體拮抗劑"包括但不限定于靶向、治療或抑制生長(zhǎng)素抑制素受體的物質(zhì)，例如奧曲肽和SOM230。本文所用的術(shù)語"抗白血病的化合物，，包括但不限定于嘧啶類似物Ara-C，所述嘧啶類似物為脫W&苷的2'-oc-羥基核糖(阿糖胞苷)衍生物。還包括次黃噤呤、6-巰基噤呤(6-MP)和磷酸氟達(dá)拉濱的嘌呤類似物。短語"胂瘤細(xì)胞損傷方式"意指諸如電離輻射的方式。上文和下文所述術(shù)語"電離輻射"表示以電磁射線(例如X-射線和Y-射線)或粒子(例如a-粒子和P-粒子)發(fā)生的電離輻射。電離輻射用于(但不局限于)輻射療法，并在本領(lǐng)域是已知的。見Hellman，PrinciplesofRadiationTherapy,Cancer,inPrinciplesandPracticeofOncology,Devita等人編輯，第四版，第1巻，第248-275頁(1993)。本文所用的術(shù)語"EDG結(jié)合劑"包括但不限定于一類調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞再循環(huán)的免疫抑制劑，例如FTY720。本文所用的術(shù)語"核苷酸還原酶抑制劑"包括但不限定于氟達(dá)拉濱和/或ara-C、6-硫代鳥噤呤、5-FU、克拉曲濱、6-巰基嘌呤(尤其是與ara-C聯(lián)用治療ALL)和/或噴司他丁的嘧啶或噤呤核苷類似物。核苷酸還原酶抑制劑尤其是羥基脲或2-羥基-lH-異吲哚-l，3-二酮衍生物，例如Nandy等人在ActaOncologica,第33巻，第8期，第953-961頁(1994)中提及的PL畫1、PL畫2、PL畫3、PL畫4、PL-5、PL-6、PL-7或PL國(guó)8。本文所用的術(shù)語"S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶抑制劑，，包括但不限定于公開于美國(guó)專利號(hào)5,461,076中公開的化合物。本文所用的短語"VEGF或VEGFR的單克隆抗體"包括但不限定于WO98/35958中公開的化合物，例如1-(4-氯苯胺)-4-(4-吡咬基曱基)-2，3-二氮雜萘或其可藥用鹽如琥珀酸鹽，或WO00/09495、WO00/27820、WO00/59509、WO98/11223、WO00/27819和EP0769947中公開的化合物；由WO00/37502和WO94/10202中由Prewett等人，CancerRes，第59巻，第5209-5218頁(1999)，Yuan等人，ProcNatlAcadSciUSA，第93巻，第14765-14770頁(1996)，Zhu等人，CancerRes，第58巻，第3209-3214頁(1998),以及Mordenti等人，ToxicolPathol,第27巻，第1期，第14-21頁(1999)描述的那些化合物；由O'Reilly等人，Cell,第79巻，第315-328頁(1994)描述的血管他丁(ANGIOSTATIN);由O'Reilly等人，Cell,第88巻，第277-285頁(1997)描述的內(nèi)皮他丁(ENDOSTATIN);鄰氨基苯甲酸酰胺；ZD4190;ZD6474;SU5416;SU6668;貝4戈單抗；或抗誦VEGF抗體或抗-VEGF受體抗體如rhuMAb和RHUFab;VEGF適體如Macugon;FLT-4抑制劑；FLT-3抑制劑；VEGFR-2IgGl抗體；Angiozyme(RPI4610)和Avastan。本文所用的術(shù)語"光動(dòng)力學(xué)治療，，意指使用某些已知為光增敏劑的化學(xué)物質(zhì)來治療或預(yù)防癌癥的療法。光動(dòng)力學(xué)療法的實(shí)例包括使用諸如VISUDYNE和卟^f鈉的物質(zhì)的療法。本文所用的術(shù)語"血管穩(wěn)定類固醇，，包括但不限定于阻止或抑制血管發(fā)生的試劑，例如阿奈可他、曲安西龍、氫化可的松、ll-oc-表氫化可的松、脫氧皮(甾)醇、17oc-羥孕酮、皮質(zhì)酮、去氧皮質(zhì)酮、睪酮、雌酮和地塞米松。本文所用的短語"血管穩(wěn)定類固醇的植入物"包括但不限定于諸如氟輕木>、地塞米爭(zhēng)〉的物質(zhì)。本文所用的術(shù)語"ATI受體拮抗劑"包括但不限定于諸如DIOVAN的物質(zhì)。本文所用的術(shù)語"ACE抑制劑"包括但不限定于CIBACEN、貝那普利、enazepril(LOTENSIN)、卡托普利、依拉普利、復(fù)辛普利、賴諾普利、莫昔普利、喹那普利、雷米普利、培味普利和群多普利。其他藥用活性物質(zhì)包括但不限定于植物生物堿、激素試劑和拮抗劑、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑、優(yōu)選淋巴因子或干擾素、反義寡核苷酸或寡核苷酸衍生物、或者混雜的試劑或具有其他或未知作用機(jī)理的試劑。在提供所引用的專利申請(qǐng)或科技出版物的情況，特別是這些公開物中的化合物權(quán)利要求、工作實(shí)施例的藥物制劑和最終產(chǎn)品，其主題物質(zhì)，藥物制劑及其權(quán)利要求因此引入本申請(qǐng)作為參考。這里公開的同樣包括相應(yīng)的立體異構(gòu)體以及相應(yīng)的晶體變型，例如溶劑化物和多晶型物。在這里所公開的組合中用作活性成分的化合物可以分別如所引用文件中所描述的那樣來進(jìn)行制備和給藥。通過代碼編號(hào)、通用名稱或商業(yè)名稱鑒定的活性劑結(jié)構(gòu)可以從實(shí)際版次的標(biāo)準(zhǔn)提綱"默克索引，，或諸如"國(guó)際專利(PatentsInternational)(IMS世界出版物)"的數(shù)據(jù)庫中獲得。其中相應(yīng)的內(nèi)容在此引用作為參考。應(yīng)當(dāng)清楚的是，在提及組分(a)和(b)是指也包括任一活性物質(zhì)的可藥用鹽。例如，如果由組分(a)和/或(b)構(gòu)成的活性物質(zhì)含有，至少一個(gè)堿性中心，它們可以形成酸加成鹽。如果需要，也可以形成含有另一個(gè)存在的堿性中心的相應(yīng)的酸加成鹽。含有酸根(例如COOH)的化合物也可以與堿形成鹽。組分(a)和/或(b)中所包含的活性物質(zhì)或其可藥用鹽中也可以以氬氧化物的形式應(yīng)用或包括其他用于結(jié)晶的溶劑。因此，一方面，本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人類患者)中增殖性疾病或由持續(xù)血管生成引發(fā)的疾病的方法，該方法包括用藥物有效量的下列組合共同或依次治療患者(a)中和抗DKK1/4的組合物；和(b)藥用活性物質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供藥物制劑，其包括(a)中和抗DKK1/4的組合物；和(b)選自芳化酶抑制劑、抗雌激素藥、抗雄激素藥、促性激素釋放素拮抗劑、拓樸異構(gòu)酶I抑制劑、拓樸異構(gòu)酶II抑制劑、-敞管活性劑、烷化劑、抗胂瘤的抗代謝物、鉑化合物、靶向/降低蛋白質(zhì)或脂質(zhì)激酶活性，或者蛋白質(zhì)或脂質(zhì)磷酸酶活性的化合物、抗血管生成化合物、誘導(dǎo)細(xì)胞分化過程的化合物、單克隆抗體、環(huán)加氧酶抑制劑、二磷酸鹽、類肝素酶抑制劑、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑、Ras致瘤同種型的抑制劑、端粒末端轉(zhuǎn)移酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、甲硫氨酸氨肽酶抑制劑、蛋白酶體抑制劑、粑向，降低或抑制Flt-3活性的物質(zhì)、HSP90抑制劑、抗增殖抗體、HDAC抑制劑、靶向，降低或抑制絲氨l蘇氨酸mTOR激酶的活性/功能的化合物、生長(zhǎng)素抑制素受體拮抗劑、抗白血病的化合物、腫瘤細(xì)胞損傷方式、EDG結(jié)合劑、核苷酸還原酶抑制劑、S-腺苷曱硫氨酸脫羧酶抑制劑、VEGF或VEGFR的單克隆抗體、光動(dòng)力學(xué)治療、血管穩(wěn)定類固醇、包含糖皮質(zhì)激素的植入物、ATI受體拮抗劑以及ACE抑制劑的一種或多種藥用活性物質(zhì)。組分(a)和/或(b)的任一組合，包括施用這兩種組分治療溫血?jiǎng)游锏姆椒ǎㄍ瑫r(shí)、分別或依次使用這兩種組分的藥物組合物，該組合在增殖性疾病的進(jìn)程延緩或治療中的用途，或制備用于該目的的藥物制劑的用途，或包括組分(a)和/或(b)的這類組合的商品，全部如上所提及或定義，隨后提及作為本發(fā)明的組合(因此該術(shù)語指可在適當(dāng)時(shí)代替該術(shù)語的任一這些實(shí)施方案)。同時(shí)給藥例如可以以兩種或多種活性成分的一種固定的組合進(jìn)行，或通過同時(shí)施用獨(dú)立配制的兩種或多種活性成分。依次使用(施用)優(yōu)選地指在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)施用組合的一種(或多種)組分，在不同的時(shí)間點(diǎn)施用其他組分，即以按時(shí)間順序交錯(cuò)的方式，優(yōu)選使該組合比單獨(dú)施用單一化合物顯示更有效(尤其顯示協(xié)同作用)。分別使用(施用)優(yōu)選指在不同的時(shí)間點(diǎn)彼此單獨(dú)地施用組合的組分，優(yōu)選指施用組分(a)和(b)以使在重疊時(shí)(在相同時(shí)間)，兩種化合物的可測(cè)量血液水平無重疊。兩種或多種依次、分別和同時(shí)施用的組合也是可能的，優(yōu)選組合的藥物成分顯示聯(lián)合治療效果，這種聯(lián)合治療效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過以時(shí)間間隔單獨(dú)使用組合藥物成分時(shí)產(chǎn)生的效果(在它們的治療功效上不能發(fā)現(xiàn)相互作用的效果)，協(xié)同作用效果是尤其優(yōu)選的。本文所用的術(shù)語"延緩進(jìn)程"指向處于待治療疾病的首發(fā)發(fā)作或復(fù)發(fā)的前期或早期的患者施用該組合，其中，例如診斷患者相應(yīng)疾病的前期形式，或哪些患者患有病癥，例如在醫(yī)學(xué)治療或由意外產(chǎn)生的病癥期間，在該情況下很可能產(chǎn)生相應(yīng)的疾病。"聯(lián)合治療活性"或"聯(lián)合治療效果"指化合物可以這樣的時(shí)間間隔(按時(shí)間順序交錯(cuò)的方式，尤其是特異時(shí)間順序的方式)分別施用，以使它們優(yōu)選在待治療的溫血?jiǎng)游锾貏e是人類中仍然顯示(優(yōu)選協(xié)同作用)相互作用(聯(lián)合治療效果)。不管是否如此，其可由下H液水平來測(cè)定，所述血液水平顯示至少在某些時(shí)段兩種化合物都存在于待治療的人類血液中。"藥物有效的"優(yōu)選意指針對(duì)增殖性疾病進(jìn)程在治療上或在更廣泛意義上也在預(yù)防上有效的量。本文所用的術(shù)語"商業(yè)包裝"或"產(chǎn)品"定義的尤其是一種"成套的試劑盒(kitofparts)",其指的是如上所定義的組分(a)和(b)可獨(dú)立地進(jìn)行給藥或通過使用具有不同數(shù)量的組分(a)和(b)的不同固定組合來進(jìn)行給藥，即可以同時(shí)或在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行給藥。此外，這些術(shù)語包括在增殖性疾病的進(jìn)程延緩或治療中同時(shí)、依次(優(yōu)選，按時(shí)間順序交錯(cuò)，特異時(shí)間順序)或單獨(dú)(較不優(yōu)選)使用的，包含有效成分組分(a)和(b)的商業(yè)包裝，及其說明書。然后試劑盒的各部分可以例如同時(shí)給藥或按時(shí)間順序交錯(cuò)給藥，即成套的試劑盒的4壬何部分可以在不同的時(shí)間點(diǎn)以相同或不同的時(shí)間間隔進(jìn)4亍給藥。特別優(yōu)選所選擇的時(shí)間間隔可以使各部分的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)所治療疾病的效果大于僅^f吏用該組合伴侶(a)和(b)中的任何一種所獲得的效果(如依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法可測(cè)定的)。在聯(lián)合制劑中用于進(jìn)行給藥的組合伴侶(a)與組合伴侶(b)的總量的比例可以變化，例如，為了符合所治療的患者亞A^的需要或單個(gè)患者的需要(這些患者由于年齡、性別、體重等的不同而具有不同的需要)而進(jìn)行變化。優(yōu)選可以獲得至少一種有益效果，例如組合伴侶(a)和(b)的作用相互增強(qiáng)，特別是具有協(xié)同作用，例如高于相加的作用、額外增加的有利作用、較少的副作用、在組合伴侶(a)和(b)中的一種或兩種的非有效劑量下獲得聯(lián)合治療效果，并且十分優(yōu)選組合伴侶(a)和(b)具有強(qiáng)的協(xié)同作用。在使用組分(a)和(b)的組合以及商業(yè)包裝兩種情況下，同時(shí)、依次和分別使用任一組合也是可能的，指可在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)同時(shí)施用組分(a)和(b);接著在之后的時(shí)間點(diǎn)(長(zhǎng)期例如超過3-4周)以日劑量施用低宿主毒性的僅僅一種組分，隨后是另外的組分；或者在更晚的時(shí)間點(diǎn)施用兩種組分的組合(在后續(xù)的藥物組合治療過程中用于最佳的抗腫瘤效果)等。本發(fā)明的組合也可與其他治療組合施用，其他治療例如外科手術(shù)、過熱和/或放射治療。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可通過常規(guī)方法制備,并且為那些經(jīng)腸內(nèi)(例如口腔的或直腸的)或腸胃外施用于哺乳動(dòng)物(包括人)的那些組合物，包括治療有效量的VEGF抑制劑，以及單獨(dú)或與一種或多種可藥用載體組合的至少一種藥用活性物質(zhì)，特別是那些適用于腸內(nèi)的或腸胃外的應(yīng)用。藥物組合物包括從約0.00002至約100%，特別例如在即用輸注稀釋液的情況下是0.0001至0.02。/。，或例如在注射或輸注濃縮物或特別是腸胃外制劑的情況下是從約0,1%至約95%，優(yōu)選從約1%至約90%,更優(yōu)選從約20%至約60%的活性成分(每一情況下都是以重量計(jì))。才艮據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以是例如單位劑量的形式，例如安瓿劑、小瓶、糖錠劑、輸液袋或者膠嚢劑形式。本發(fā)明制劑中所用的每一組合伴侶的有效劑量可依據(jù)所用的具體化合物或藥物組合物、給藥模式、待治療的病癥和待治療病癥的嚴(yán)重性而變化。常規(guī)技術(shù)人員中的內(nèi)科醫(yī)師、臨床醫(yī)師或獸醫(yī)師可容易地確定預(yù)防、治療或抑制病情*所需的每一活性成分的有效劑量。酪氨酸磷酸化抑制劑，特別是Adaphostin，以約1-6000mg/天，更優(yōu)選25-5000mg/天，最優(yōu)選50-4000mg/天的劑量范圍向溫血?jiǎng)游镉绕涫侨祟悆?yōu)選施用。除非本文另作說明，該化合物優(yōu)選以每天1-5次特別是1-4次來施用。用于腸內(nèi)的或腸胃外施用的組合治療的藥物制劑是例如單位劑量形式如糖衣片劑、膠嚢劑或栓劑以及另外的安瓿劑。如不另作說明，這些制劑通過常規(guī)方法制備，例如借助于常規(guī)混合、?；?、糖衣化、溶解或凍干過程。應(yīng)理解包含在每一劑型各個(gè)劑量所含組合伴侶的單位含量本身不需構(gòu)成有效量，因?yàn)樾枰挠行Я靠赏ㄟ^施用多個(gè)劑量單位來達(dá)到。本領(lǐng)域的專業(yè)沖支術(shù)人員具備確定組合組分的適宜藥物有效量的能力。優(yōu)選地，化合物或其可藥用鹽是以片劑、膠囊劑或糖漿劑的形式作為口服藥物制劑，或如果合適作為腸胃外注射劑來施用的。在口服施用的組合物制備中，可施用任一可藥用介質(zhì)例如水、乙二醇、油、乙醇、調(diào)味劑、防腐劑、著色劑。可藥用載體包括淀粉、糖類、微晶纖維素、稀釋劑、粒化劑、潤(rùn)滑劑、結(jié)合劑、崩解劑?；钚猿煞值哪c胃外施用可使用活性成分的溶液、還有懸液、特別是等滲水溶液或懸液，在為僅包含活性成分或包含活性成分和載體(例如甘露醇)的凍干組合物時(shí)是可能的，所述溶液或懸液可在使用之前制備。該藥物組合物可以進(jìn)4亍滅菌，和/或包含諸如防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑和/或乳化劑、增溶劑、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽和/或緩沖劑的賦形劑，并且通過本身已知的方式、例如通過常規(guī)的溶解或凍干過程的方式進(jìn)行制備。所述溶液或懸液可以包含增加粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素納、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯吡咯酮或者明膠。油中懸液包含作為油成分的、通常用于注射目的的植物的、合成的或者半合成油。等滲制劑可選自本領(lǐng)域任一公知的那些例如甘露醇、葡聚糖、葡萄糖和氯化鈉。輸注制劑可用含7jC介質(zhì)稀釋。作為稀釋劑應(yīng)用的含水介質(zhì)的量依據(jù)輸注溶液中活性成分的需要濃度來選擇。輸注溶液可包括用于靜脈內(nèi)施用的制劑中通常應(yīng)用的其他賦形劑例如抗氧化劑。本發(fā)明還涉及本文所用的術(shù)語"聯(lián)合制劑"，其定義的尤其是一種"成套的試劑盒(kitofparts)",其指的是如上所定義的組合伴倡(a)和(b)可獨(dú)立地進(jìn)行給藥或通過使用具有不同數(shù)量的組合伴侶(a)和(b)的不同固定組合來進(jìn)行給藥，即可以同時(shí)或在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行給藥。然后試劑盒的各部分可以例如同時(shí)給藥或按時(shí)間順序交錯(cuò)給藥，即成套的試劑盒的任何部分可以在不同的時(shí)間點(diǎn)以相同或不同的時(shí)間間隔進(jìn)行給藥。在聯(lián)合制劑中用于進(jìn)行給藥的組合伴侶(a)與組合伴侶(b)的總量的比例可以變化，例如，為了符合所治療的患者亞人群的需要或單個(gè)患者的需要(這些患者由于年齡、性別、體重等的不同而具有不同的需要)而進(jìn)行變化。本發(fā)明的用途和方法本發(fā)明的抗體(和免疫連接物和雙特異性分子)具有體外和體內(nèi)診斷和治療效用。例如，可以將這些分子施用于例如體外或體內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞，或者施用于受試者(例如，體內(nèi))以治療、預(yù)防或診斷多種障礙。如本文所用的術(shù)語"受試者，，意在包括人和非人動(dòng)物。非人動(dòng)物包括所有脊推動(dòng)物，例如，哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，如非人靈長(zhǎng)類、綿羊、狗、貓、奶牛、馬、雞、兩棲動(dòng)物和爬行類。所述方法尤其適于治療具有與DKK1表W目關(guān)的病癥的人類患者。當(dāng)一起施用DKK1抗體與另一活性劑時(shí)，可以將兩種以任一順序或同時(shí)施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體(和免疫連接物和雙特異性分子)可以用于檢測(cè)DKK1的水平，或者含有DKK1的細(xì)胞水平。這可以例如，通過將樣品(如體外樣品)和對(duì)照樣品與抗DKK1抗體在允許抗體和DKK1之間形成復(fù)合體的條件下接觸。檢測(cè)抗體和DKK1之間形成的任何復(fù)合體并在樣品和對(duì)照中比較。非限定的例如，可以使用本發(fā)明的組合物進(jìn)行本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，如ELISA和流式細(xì)胞測(cè)定法。因此，一方面，本發(fā)明還提供了檢測(cè)樣品中DKK1(例如，人DKK1抗原)的存在，或測(cè)量DKK1的量的方法，其包括將樣品、對(duì)照樣品與本發(fā)明的抗體或其特異結(jié)合DKK1的抗原結(jié)合部分在允許所述抗體或其部分與DKK1之間形成復(fù)合體的條件下接觸。然后檢測(cè)復(fù)合體的形成，其中樣品與對(duì)照樣品相比復(fù)合體形成的差異表明在該樣品中存在DKK1。本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括試劑盒，其由本發(fā)明的組合物(例如，抗體、人抗體、免疫連接物和雙特異性分子)和使用說明書組成。試劑盒可以還含有至少一種額外試劑，或者一種或多種本發(fā)明的額外抗體(例如，具有互補(bǔ)活性的抗體，其與笫一種抗體結(jié)合靶抗原上不同的表位)。試劑盒通常包括標(biāo)簽，指出該試劑盒內(nèi)含物的預(yù)期用途。術(shù)語標(biāo)簽包括在試劑盒上提供或試劑盒提供或附隨該試劑盒的任何書面或錄音材料。已經(jīng)完全描述了本發(fā)明，通過下面的實(shí)施例和權(quán)利要求進(jìn)一步闡明本發(fā)明，所述實(shí)施例是說明性的并且不意在進(jìn)一步限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到或者能夠僅僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定本文所述具體步驟的許多等同方案。此類等同方案在本發(fā)明和權(quán)利要求的范圍內(nèi)。將本申請(qǐng)全文引用的所有參考文獻(xiàn)，包括出版的專利和公布的專利申請(qǐng)的內(nèi)容都引入本文作為參考。實(shí)施例實(shí)施例1:從HuCALGOLD⑧文庫中制備人DKKl特異性抗體抗人DKK1蛋白質(zhì)的治療抗體可通過使用作為抗體變體蛋白質(zhì)來源的市售噬菌體展示文庫MorphoSysHuCALGOLD⑧文庫，來挑選具有高結(jié)合親和力的克隆來產(chǎn)生。HuCALGOLD是Fab文庫(Knappik等人，2000J.Mol.Biol.296:57-86;Krebs等人，2001JImmunol.Methods254:67-84;Rauchenberger等人，2003JBiolChem.278(40):38194-38205)，其中所有六個(gè)CDR通過適當(dāng)?shù)耐蛔兌鄻踊?，并且?yīng)用CysDisplayTM技術(shù)將Fab片段連接到噬菌體表面(WO01/05950L5hning2001)。常規(guī)程序噬菌?；貜?fù)、噬菌體擴(kuò)增以及純化HuCALGOLD⑧文庫在含有34ng/ml氯霉素和1。/。葡萄糖(2xYT-CG)的標(biāo)準(zhǔn)豐富細(xì)菌培養(yǎng)基(2xYT)中擴(kuò)增。在OD咖，為0.5時(shí)用VCSM13輔助噬菌體感染細(xì)胞(于37'C靜置溫育細(xì)胞和噬菌體的混合物30分鐘，接著于37。C以250轉(zhuǎn)/分鐘振蕩30分鐘)后，將細(xì)胞離心(4120g，5分鐘，4°C)、重懸于2xYT/34pg/ml氯霉素/50ng/ml卡那霉素/0.25mMIPTG中，并于22。C生長(zhǎng)過夜。在該階段結(jié)束時(shí)通過離心將細(xì)胞移出，且從上清液中用PEG沉淀噬菌體兩次，重懸于PBS/20。/。甘油中并于-80。C保存。兩輪篩選之間的噬菌體擴(kuò)增如下進(jìn)行以DKK1蛋白質(zhì)挑選后對(duì)用噬菌體感染的對(duì)數(shù)中期的大腸桿菌菌抹TG1細(xì)胞進(jìn)行洗脫，并且涂布于補(bǔ)充有1%葡萄糖和34叫/ml氯霉素的LB瓊脂上(LB-CG平板)。該平板于30。C溫育過夜后，將細(xì)菌克隆從瓊脂表面刮下，并用于接種到2xYT-CG肉湯以使OD6。。nm達(dá)到0.5，然后加入VCSM13輔助噬菌體以獲得如上所述的生產(chǎn)性感染。4吏用Strep-Tactin磁珠進(jìn)4亍溶液淘選(solutionpanning)的預(yù)試驗(yàn)已報(bào)道Strep-tagII對(duì)Strep-Tactin基質(zhì)具有低親和力(依據(jù)Voss和Skerra，1997ProteinEng.10:975-982,KD約1pM),因此，進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)以評(píng)估使用Str印-Tactin包被的MagStrep小珠在抗體選擇期間捕獲抗原且在淘選期間避免抗原丟失的適宜性。為此，8mg的MagStrep小珠與46jig的His-Strep標(biāo)記的DKK1于室溫溫育1h并且樣品分裝進(jìn)四個(gè)預(yù)封蓋的Eppendorf管中。一管作為陽性對(duì)照(未洗滌)并且依據(jù)HuCALGOLD⑧手冊(cè)的淘選部分以不同嚴(yán)格性洗滌其他三個(gè)樣品。使用山羊抗DKK1抗體和麵標(biāo)記的抗山羊檢測(cè)抗體，在BioVeris中對(duì)His-Strep標(biāo)記的DKK1與MagStrep磁珠(獲自IBA的Strep-Tactin包被的磁珠，Gattingen，德國(guó))的結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)。如本文中圖1所示，當(dāng)未洗滌的小珠與那些用不同HuCAL⑧嚴(yán)格性洗滌的小珠比較時(shí)，沒有檢測(cè)到明顯的His-Strep標(biāo)記的DKK1從Strep-Tactin包4皮的小珠丟失。因此，His-Str印標(biāo)記的DKK1似乎適用于用Strep-Tactin包被的磁珠(MagStrep磁珠)進(jìn)行的溶液淘選。通過從文庫中淘選DKK1特異性抗體來篩選為了篩選識(shí)別人DKK1的抗體，應(yīng)用兩種淘選策略?？偟膩碚f，將HuCALGOLD噬菌體抗體分成包括VH主基因的不同組合的四個(gè)集合(包含VH1/5^k的1集合；包含Vh31k的2集合；包含VH2/4/6Xk的3集合；以及包含VH1-6Xk的4集合)。這些集合單獨(dú)地接受兩輪捕獲于StrepTactin磁珠(MegaStrep小珠，IBA)上的His-Strep標(biāo)記的DKK1的溶液淘選，并且僅對(duì)于第三輪挑選，在捕獲于StrepTactin磁珠上的His-Str印標(biāo)記的DKK1上或在由Streptavidin小珠(Dynabeads逸M-280Streptavidin,Dynal)捕獲的APP標(biāo)記的人DKK1蛋白質(zhì)上都含生物素化的抗APP抗體。詳細(xì)地，為了使用結(jié)合StrepTactin磁珠的His-Strep標(biāo)記的DKK1進(jìn)行溶液淘選，應(yīng)用以下方案通過將預(yù)封蓋的管子(1.5mlEppendorf管)用以PBS1:1稀釋的1.5ml2xChemiBLOCKER于4'C處理過夜來準(zhǔn)備。預(yù)封閉的小珠通過如下處理來制備5幼pi(28mg的小珠)StrepTactin磁珠用580nlPBS洗滌一次并重懸于580^IxChemiBLOCKER(稀釋于一倍體積的IxPBS)中。小珠的封閉在預(yù)封蓋的管子中于4'C過夜進(jìn)行。為每一淘選條件而稀釋于終體積為500pi的PBS中的噬菌體顆粒與500pi2xChemiBLOCKER/0.1%Tween混合，并且于室溫下在搖床(rotatingwheel)上保持1小時(shí)。為去除StrepTactin或小珠結(jié)合的噬菌體而進(jìn)4亍兩次噬菌體顆粒的預(yù)吸附將160nl封閉的StrepTactin磁珠(4mg)加入到封閉的噬菌體顆粒中，并且于室溫在搖床上溫育30分鐘。通過磁性裝置(DynalMPC-E)分離小珠后，噬菌體上清液(約1.1ml)轉(zhuǎn)移到新鮮的、封蓋的反應(yīng)管中，并且使用160jil封閉的小珠重復(fù)預(yù)吸附30分鐘。然后，將400nM或100nMHis-Str印標(biāo)記的DKK1加入到新的、封蓋的1.5ml反應(yīng)管中的封閉的噬菌體顆粒中，并且混合物于室溫下在搖床上溫育60分鐘。噬菌體抗原復(fù)合物可使用分別加入到400nM或100nM噬菌體淘選集合中的320jil或160pl封閉的Str印Tactin磁珠來捕獲，然后于室溫下在搖床上溫育20分鐘。結(jié)合到StrepTactin磁珠的噬菌體顆粒再次用磁性顆粒分離器收集。小珠然后用PBS/0.05%Tween(PBST)洗滌七次，接著僅用PBS另夕卜洗滌三次。喧菌體顆粒從StrepTactin磁珠中的洗脫通過向每一管中加入10mMTris-HCl、pH8.0中的200fil20mMDTT進(jìn)行10分鐘。收集洗脫液，小珠用200piPBS洗滌一次并且將PBS洗脫液加入到DTT洗脫液中。該洗脫液才羊品用于感染14ml已生長(zhǎng)到OD60。nm為0.6-0.8的大腸桿菌TG-1培養(yǎng)物。在感染以及之后的5000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘后，每一細(xì)菌沉淀重懸于500jil2xYT培養(yǎng)基中，涂布于2xYT-CG瓊脂平板上并于30。C溫育過夜。第二天早上，將得到的克隆從平板上刮下并且通過上述的回復(fù)和擴(kuò)增來制備噬菌體。對(duì)His-Strep標(biāo)記的DKK1的第二輪溶液淘選依據(jù)第一輪的方案進(jìn)行，除了使用減少量的抗原(50nM和lOnM)和適當(dāng)改變洗滌程序的嚴(yán)格性。兩種不同的淘選策略應(yīng)用于第三輪篩選第二輪淘選的擴(kuò)增噬菌體的產(chǎn)量是分開的并且接受用于兩種不同篩選條件。笫一半噬菌體產(chǎn)量用于從上述StrepTactin小珠上捕獲的人His-Strep標(biāo)記的DKK1的標(biāo)準(zhǔn)淘選策略(抗原量分別是10nM或1nM)。第三輪挑選的第二種篩選變通方案是在人APP標(biāo)記的DKK1上進(jìn)行的。終濃度為50nM或10nM的APP標(biāo)記的DKK1蛋白質(zhì)與1ml預(yù)清洗的第二輪噬菌體顆?；旌希⑶一旌衔镉谑覝叵略趽u床上溫育1小時(shí)。平4亍地，8mg預(yù)封閉的DynabeadsM-280Streptavidin(Dynal)與40ng生物素化的小鼠抗APP抗體于室溫下在搖床上溫育30分鐘，接著用PBST進(jìn)行兩步洗滌。由結(jié)合到APP標(biāo)記的DKK1的噬菌體-抗體組成的預(yù)形成的復(fù)合物通過抗APP對(duì)包被的M-280Streptavidin磁珠于室溫下30分鐘。噬菌體的洗脫和擴(kuò)增如上進(jìn)行。可溶性Fab片段的亞克隆和表達(dá)將挑選的HuCALGOLD噬菌粒編碼Fab的插入序列亞克隆i^達(dá)載體pMORPHX9_Fab—FH,以促進(jìn)快速并有效地表達(dá)可溶性Fab。為此，所選克隆的質(zhì)粒DNA用限制性核酸內(nèi)切酶XbaI和EcoRI消化，從而切除編碼Fab的插入序列(ompA-VLCL和phoA-Fd)。然后將該插入序列克隆進(jìn)XbaI/EcoRI消化的表達(dá)載體pMORPHX9—Fab—FH。Fab蛋白質(zhì)從該載體中表達(dá)，并且從而攜帶用于檢測(cè)和純化的兩個(gè)C末端標(biāo)記(分別是FLAGtm和6xHis)。大腸桿菌中HuCALGOLDFab抗體的微表達(dá)為獲得足夠量的由上述獲得的每個(gè)克隆編碼的蛋白質(zhì)，在將挑選的Fab亞克隆進(jìn)pMORPHX9_Fab_FH表達(dá)載體后篩選耐受氯霉素的單一細(xì)菌克隆。然后每個(gè)這些克隆接種到滅菌的96孔微量滴定板的孔中，每個(gè)孔含有100pi2xYT-CG培養(yǎng)基每孔，并且細(xì)菌于37。C生長(zhǎng)過夜。將每一大腸桿菌TG-l培養(yǎng)物的樣品(5nl)轉(zhuǎn)移到新鮮的、滅菌的、預(yù)填有補(bǔ)充了34ng/ml氯霉素和0.1%葡萄糖每孔的100pi2xYT培養(yǎng)基的96孔微量滴定板中。微量滴定板于30。C在微量滴定板搖床上以400轉(zhuǎn)/分鐘振蕩溫育直至培養(yǎng)物稍微渾濁(約2-4小時(shí))，OD6,m約0.5。為以這些平板的形式表達(dá)，將補(bǔ)充了34ng/ml氯霉素和3mMIPTG(異丙基-j5-D-硫代半乳糖苷)的20nl2xYT培養(yǎng)基加入到每個(gè)孔中(終濃度為0.5mM的IPTG)，微量滴定板用氣體滲透帶密封，并于30。C以400轉(zhuǎn)/分鐘振蕩溫育過夜。全部細(xì)胞裂解物的制備(BEL提取物)向表達(dá)平板的每個(gè)孔中加入含2.5mg/ml溶菌酶的40plBEL緩沖液(2xBBS/EDTA:24.7g/1硼酸、18.7gNaCI/1、1.49gEDTA/1，pH8.0),并且平板于22。C在微量滴定板振蕩器上(400轉(zhuǎn)/分鐘)溫育1小時(shí)。BEL提取物用于通過FMAT的結(jié)合分析(參見實(shí)施例2)。大腸桿菌中微克量的HuCALGOLDFab抗體的表達(dá)和純化在50ml的塑料管中進(jìn)行由大腸桿菌TGIF細(xì)胞中的pMORPHX9—Fab—FH編碼的Fab片段的表達(dá)。為此，用單一克隆接種的預(yù)培養(yǎng)物于30。C在2xYT-CG培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過夜。第二天早上，50jil的每一預(yù)培養(yǎng)物用于接種到滅菌的50ml塑料管中以補(bǔ)充了4ng/ml氯霉素、1mMIPTG和0.1%葡萄糖的25ml2xYT培養(yǎng)基中，并于30。C溫育過夜。收獲大腸桿菌細(xì)胞，冷凍細(xì)胞沉淀最終用BugBuster(Novagen)裂解(disrupt),4吏用Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen，Hilden，德國(guó))分離Fab片段。大腸桿菌中毫克量的HuCALGOLDFab抗體的表達(dá)和純化在使用補(bǔ)充了34照/ml氯霉素的750ml2xYT培養(yǎng)基的搖瓶培養(yǎng)物中進(jìn)行由TG1F細(xì)胞中的pMORPHX9—Fab—FH編碼的Fab片段的表達(dá)。培養(yǎng)物于30。C振蕩直至OD6,m達(dá)到0.5。加入0.75mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)，接著于30。C溫育20小時(shí)。細(xì)胞使用溶菌酶裂解，并且Fab片段由Ni-NTA色語(Qiagen，Hilden，德國(guó))分離。蛋白質(zhì)濃度通過UV-分光光度計(jì)(Krebs等人,2001)測(cè)定。實(shí)施例2:DKK1特異性的HuCAI^抗體的鑒定由上述淘選策略挑選的各個(gè)大腸桿菌克隆的BEL提取物通過微體積熒光試驗(yàn)才支術(shù)(FMATTM，8200CellularDetectionSystemanalyzer,AppliedBiosystems,FosterCity,Calif)分析，以鑒定編碼DKKl特異性Fab的克隆。FMATTM8100HTS系統(tǒng)是共聚焦式高通量熒光篩選儀器，其自動(dòng)檢測(cè)活細(xì)胞或小珠的混合并讀取、是非放射性試驗(yàn)(Miraglia，J.Biomol.Screening(1999)，4(4)193-204)。用于從細(xì)菌裂解物中檢測(cè)DKKl結(jié)合的Fab的基于孩t體積熒光試驗(yàn)技術(shù)(FMAT)的結(jié)合分析為從大腸桿菌裂解物(BEL提取物)中檢測(cè)DKKl結(jié)合的Fab抗體，用FMAT8200細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)(AppliedBiosystems)來分析結(jié)合。為將His-Strep標(biāo)記的DKKl結(jié)合到M-450Expoxy小珠(Dynal)上，將300piM-450Epoxy小珠(1.2x108小珠)的樣品轉(zhuǎn)移進(jìn)反應(yīng)管中并用磁性顆粒分離器捕獲。移除上清液并且小珠用1mll00mM、pH7.4的磷酸鈉緩沖液洗滌四次。為包被抗原，向150pi100mM、pH7.4的磷酸鈉緩沖液中的小珠懸浮液中加入60ngHis-Strep標(biāo)記的DKKl?？乖?小珠懸浮液于室溫下在搖床上溫育16小時(shí)。然后包被的小珠用PBS洗滌三次并且重懸于g積為250的PBS中。為每一384孔平板準(zhǔn)備含3%BSA、0.005%Tween陽20、4DKKl包被的小珠(1.9x106小珠)的20mlPBS和4plCy5TM檢測(cè)抗體的混合物。45pi該溶液的樣品分配到384孑LFMAT黑色/透明的平底板的(AppliedBiosystems)各孔中。將含F(xiàn)ab的BEL提取物(5fil)加入每一孔中。FMAT平板于室溫下溫育過夜。第二天早上平板在8200CellularDetection系統(tǒng)(AppliedBiosystems)中分析。獲得陽性克隆，分析在FMAT中產(chǎn)生陽性的、特異性信號(hào)的克隆重鏈和輕鏈序列。據(jù)觀測(cè)，鑒定顯示對(duì)人DKK1強(qiáng)烈結(jié)合的57個(gè)獨(dú)特的(非冗余)抗DKK1克隆。將這些克隆表達(dá)、純化并測(cè)試親和力以及進(jìn)行功能性試驗(yàn)。使用表面等離振子共振測(cè)定納摩爾親和力使用這些克隆，在CM5芯片(Biacore，瑞典)上進(jìn)行動(dòng)力學(xué)的SPR分析，該芯片使用標(biāo)準(zhǔn)的EDC-NHS胺結(jié)合化學(xué)技術(shù)以10mM、pH4.5醋酸鈉中的400RXJ密度的重組人DKK1、小鼠DKK1(R&DSystem)或食蟹猴DKK1包被。相當(dāng)量的人血清白蛋白(HSA)固定在參考流動(dòng)池上。PBS(136mMNaCl、2.7mMKC1、10mMNa2HP04、1.76mMKH2P04pH7.4)用作運(yùn)轉(zhuǎn)緩沖液。Fab制劑以20nl/分鐘流速、16-500nM的濃度梯度應(yīng)用。聯(lián)合相設(shè)置于60秒且解離相設(shè)置于120秒。該方法測(cè)定的對(duì)每一人類、小鼠和食蟹猴DKK1的納摩爾級(jí)親和力的概迷于本文所示的表l中，表l.挑選的Fab對(duì)每一人類、小鼠和食蟹猴的親和力<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>*單一測(cè)定n.d.:未檢出實(shí)施例3:抑制DKK1的Wnt拮抗活性的抗人DKKlFab候選物的鑒定使用得到的選自HuCALGOLD⑧文庫的57個(gè)不同的DKK1特異性抗體以獲得純化抗體，然后用于測(cè)試抑制人DKK1的Wnt拮抗活性的能力。這些抗體中的17個(gè)抗體候選物具有功能性活性，如圖2和4所示。使用熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)檢測(cè)每一HuCALFab的功能性活性。在表現(xiàn)出熒光素酶基因TCF/Lef應(yīng)答的焚光素酶報(bào)告基因上游克隆12個(gè)TCF/Lef的結(jié)合位點(diǎn)。常規(guī)的規(guī)范Wnt蛋白質(zhì)導(dǎo)致p聯(lián)蛋白的穩(wěn)定性，從而激活TCF/Lef的轉(zhuǎn)錄并產(chǎn)生熒光素酶蛋白質(zhì)。DKK1蛋白質(zhì)的加入阻礙Wnt活性并因此也阻礙熒光素酶基因的轉(zhuǎn)錄。結(jié)果，期望由各個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的熒光素酶水平與挑選的Fab阻礙DKK1作用的能力相關(guān)。穩(wěn)定的TCF/Lef應(yīng)答的報(bào)告細(xì)胞系HEK293T/17-12xSTF使用穩(wěn)定的人胚胎腎細(xì)胞報(bào)告細(xì)胞系HEK293T/17-12xSTF來進(jìn)行生物試驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%FCS(PAN或BioWhittaker)和1pg/ml嘌呤霉素(BDBiosciences)的DMEM高葡萄糖培養(yǎng)基(Invitrogen)中，直至達(dá)到90%匯合。然后將細(xì)胞用胰蛋白酶消化、計(jì)數(shù)并稀釋于不含嘌呤霉素的培養(yǎng)基中以達(dá)到4xlOS細(xì)胞/ml的濃度。隨后，細(xì)胞接種到白色的、平底的96孔板中(Corning，每孔100pi細(xì)胞懸浮液)，并于37。C和5%C02中培養(yǎng)過夜。第二天，準(zhǔn)備試驗(yàn)培養(yǎng)基將500ng/mlDKK1-APP加入到Wnt3a條件培養(yǎng)基(CM)中?？笵KK1HuCALFab(20pg/ml的終濃度)和用作陽性對(duì)照的山羊抗人DKK1抗體(R&DSystems)(1.5jig/ml的終濃度)稀釋于CM中。從試驗(yàn)平板的每一孔中移出60jil體積的培養(yǎng)基而不擾亂貼壁的細(xì)胞，并用稀釋于CM中的60jil試驗(yàn)抗體或?qū)φ仗娲?。?xì)胞再培養(yǎng)24小時(shí)并向每孔加入IOOjil明亮(Bright-Glo)焚光素酶試劑。5分鐘溫育時(shí)間后，在光度計(jì)(GenioPro，Tecan)上讀取熒光。57個(gè)Fab中的20個(gè)獲得的結(jié)果顯示于本文圖2中。表達(dá)的萸光素酶范圍是抗體存在范圍的度量。實(shí)施例4:結(jié)合親和力的定量分析抑制DKK1的Wnt拮抗活性的抗人DKK1Fab候選物的測(cè)定親和力測(cè)定為進(jìn)一步表征抗DKK1抗體，測(cè)定對(duì)人類、食蟹猴和小鼠DKK1的親和力。重組DKK1蛋白質(zhì)固定在CM5Biacore芯片上并將Fab應(yīng)用于不同濃度的流動(dòng)相。為了可信地測(cè)定單價(jià)親和力，僅僅將這批Fab用于Biacore測(cè)定，所述這批Fab在大小排阻色譜中顯示為大于90%的單體片段。人類、小鼠和食蟹猴DKK1的親和力數(shù)據(jù)總結(jié)于表2中。發(fā)現(xiàn)所有17個(gè)待測(cè)Fab都具有對(duì)人DKKl的100nM以下的親和力。另外，產(chǎn)生抗體的9個(gè)克隆的親和力低于10nM。在所有測(cè)試情況下，對(duì)食蟹猴和小鼠DKK1的親和力幾乎等同于對(duì)人DKK1的那些親和力。表2.挑選的Fab對(duì)人類、小鼠和食蟹猴的親和力數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>*單一測(cè)定n.d.:未檢出ECs。測(cè)定顯示用于對(duì)DKK1具有最強(qiáng)親和力的抗體克隆抑制達(dá)50%的有效濃度的數(shù)據(jù)本文顯示于表3中。數(shù)據(jù)顯示有效濃度EC5。范圍從39至95nM，具有58和83nM間的中值。表3.用于對(duì)挑選的Fab抑制達(dá)50%的有效濃度抗體熒光素酶報(bào)道基因試驗(yàn)EC鄰[nMlMOR0447058MOR0451642MOR0445483MOR0445695MOR0446157MOR0445539實(shí)施例5:通過LCDR3和HCDR2盒的平行交換的挑選的抗DKKlFab的親和力成熟為優(yōu)化本文描述的抗體對(duì)DKK1的親和力，對(duì)于母本Fab片段的集合，每一母本Fab的輕鏈的LCDR3、構(gòu)架4和恒定區(qū)使用Bpil和Sphl來去除，并且用多樣化的LCDR3連同構(gòu)架4和恒定域的所用組成成分來替換。將0.5ng的結(jié)合集合載體(binderpoolvector)樣品結(jié)合到超過攜帶多樣化LCDR3的3倍摩爾量插入片段。在相似的方法中，使用Xhol和BssHII位點(diǎn)將HCDR2多樣化，并且連接構(gòu)架區(qū)保持不變。為增加克隆效率，在插入多樣化HCDR2盒前用590bp填充序列來取代母本HCDR2。將11個(gè)不同文庫的連接混合物電穿孔i^7v4ml大腸桿菌TOP10F'細(xì)胞(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)中，產(chǎn)生2乂107至2乂108的各個(gè)克隆。如前所述地進(jìn)行文庫擴(kuò)增(Rauchenberger等人，2003JBiolChem.278(40):38.194-38205)。為了控制質(zhì)量，隨機(jī)i4選每一文庫中的幾個(gè)克隆并使用引物CFR84(VL)和OCAL_Seq_Hp(VH)進(jìn)行測(cè)序(SequiServe，Vaterstetten，德國(guó))。挑選親和力成熟的候選物選出的六個(gè)挑選的成熟候選物("母本Fab，，)表征為具有以下特征對(duì)人DKK1的親和力小于10nM，食蟹猴和小鼠DKK1具有顯著的交叉反應(yīng)，ECso小于100nM，并且優(yōu)于大腸桿菌中的(中等)Fab表達(dá)水平以及Fab純化后缺乏聚集。在親和力測(cè)定過程中，很顯然MOR04480在高度稀釋時(shí)極其不穩(wěn)定。為此，MOR04480從成熟候選物的列表中刪除，雖然其在所有待測(cè)Fab中具有最高親和力(lnM)和最好EC5o(7nM)。MOR04483對(duì)人DKK1具有5.5nM的高親和力，但是顯示對(duì)小鼠DKK1交叉反應(yīng)，且MOR04453包含純化后高比例的Fab聚集。因此，這兩種抗體也從成熟候選物中排除。在仔細(xì)評(píng)估所有可獲得數(shù)據(jù)后，選出六個(gè)成熟候選物(MOR04454、MOR04455、MOR04456、MOR04461、MOR04470和MOR04516)。這些候選物的特征在本文中列于表4中。表4.挑選的Fab的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>*單一測(cè)定n.d.:未檢出#單體部分大于90％用于親和力成熟的糸lL選的Fab文庫的制備為了獲得具有抗DKK1抗體的增強(qiáng)親和力和抑制活性的克隆，前面實(shí)施例中所示的挑選的Fab克隆MOR04454、MOR04455、MOR04456、MOR04461、MOR04470和MOR04516接受另一輪的多樣化和挑選，即稱為親和力成熟的過程。為此，使用由三核苷酸突變預(yù)建模的相應(yīng)的LCDR3和HCDR2成熟盒來使CDR區(qū)多樣化(Virnekas等人，1994NucleicAcidsRes.22:5600-5607;Nagy等人，2002NatureMedicine8:801-807)。本文的表5顯示針對(duì)母本克隆MOR04454、MOR04455、MOR04456、MOR061、MOR04470和MOR4516的LCDR3序列。表5.針對(duì)挑選的Fab的LCDR3序列<table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table>本文的表6顯示針對(duì)母本克隆MOR04454、MOR04455、MOR04456、MOR061、MOR04470和MOR4516的HCDR2序列。表6.針對(duì)挑選的Fab的HCDR2序列<table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table>將來自表達(dá)栽體pMORPHX9—Fab—FH的Fab片段亞克隆進(jìn)噬菌粒載體pMORPH25(參見US專利號(hào)6,753，136)中。該載體提供N端融合半胱氨酸殘基和C末端半胱氨酸也融合到Fd抗體鏈的噬菌體蛋白質(zhì)pm，并因此提供各個(gè)Fab片段在噬菌體表面的二硫化物連接的展示。兩種不同的策略平行應(yīng)用以優(yōu)化母本Fab的親和力和功效。產(chǎn)生五個(gè)噬菌體抗體Fab文庫，其中六個(gè)母本克隆中的五個(gè)LCDR3由單獨(dú)的輕鏈CDR3序列所用組成成分來取代。未進(jìn)行MOR04454的LCDR3成熟，因?yàn)樵摽寺≡谝粋€(gè)CDR區(qū)具有附加的BpiI限制性位點(diǎn)并將BpiI限制酶用于文庫克隆程序。平行地，每個(gè)母本克隆的HCDR2區(qū)由單獨(dú)的重鏈CDR2序列所用組成成分來取代。將每個(gè)母本Fab切除并用590bp填充片段取代。在成熟淘選期間該DNA填充片段促進(jìn)單消化載體從雙消化載體條帶中分離并且減少高親和力母本Fab的背景。在后續(xù)步驟中，填充片段從每個(gè)母本克隆的Fab編碼噬菌粒中切除并用高度多樣化的HCDR2成熟盒來取代。多于2xl07個(gè)成員的巨大的親和力成熟文庫通過標(biāo)準(zhǔn)的克隆程序來產(chǎn)生，并且將多樣化的克隆轉(zhuǎn)化進(jìn)電感受態(tài)大腸桿菌TOP10F'細(xì)胞(Invitrogen)。如上述實(shí)施例1中描述地來制備含F(xiàn)ab的噬菌體。構(gòu)建四個(gè)成熟集合以促進(jìn)后續(xù)的挑選過程集合la組成為MOR04470和MOR04516LCDR3文庫；集合lb組成為MOR04470和MOR04516HCDR2文庫；集合2a組成為MOR04454、MOR04455、MOR04456和MOR04461LCDR3文庫；以及集合2b組成為MOR04454、MOR04455、MOR04456和MOR04461HCDR2文庫。在溶液中使用減少量的His-Strep標(biāo)記的DKK1和由Strep-Tactin小珠捕獲的噬菌體-抗原對(duì)每個(gè)組成為進(jìn)行淘。平行地，使用減少量的在Neutravidin包,皮的平板捕獲的生物素化的DKK1將每個(gè)庫應(yīng)用于淘選。為增強(qiáng)淘選嚴(yán)格性并挑選出提高的解離率，在延長(zhǎng)溫育期期間進(jìn)行與純化的母本Fab以及未標(biāo)記抗原的竟?fàn)?。篩選后立即將富集的噬菌粒集合亞克隆進(jìn)pMORPHX9一FH表達(dá)載體。選出約2300個(gè)單克隆，并且以IPTG誘導(dǎo)Fab。成熟篩選策略在溶液中分別以His-Strep標(biāo)記的DKK1以及以生物素化的His-Strep標(biāo)記的DKK1進(jìn)行兩輪或三輪使用四個(gè)抗體集合的篩選程序。對(duì)于每一篩選策略，應(yīng)用與純化的母本Fab蛋白質(zhì)或與未標(biāo)記的APP標(biāo)記DKK1的竟?fàn)帲约暗涂乖瓭舛群痛罅康南礈靵碓鰪?qiáng)嚴(yán)格性。通過主*據(jù)描述于實(shí)施例1的標(biāo)準(zhǔn)方案的兩輪挑選來進(jìn)行對(duì)未標(biāo)記的His-Strep標(biāo)記的DKK1的溶液淘選。但是這些程序應(yīng)用減量抗原(從5nM減少至lnM)、含或不含竟?fàn)巹┑南礈斐绦虻母邍?yán)格性，以及抗體-噬菌體連同抗原的延長(zhǎng)的溫育期。對(duì)于第一輪湘lL選，使用生物素化的DKK1,將Neutravidin平板的孔用300piPBS洗滌兩次。孔用1:1稀釋于PBS(封閉緩沖液)中的2xChemiBLOCKER(Chemitcoii，Temecula，CA)封閉。挑選前，HuCALGOLD噬菌體也用一倍體積的含0.1。/。Tween-20的封閉緩沖液于室溫下封閉30分鐘。將封閉的噬菌體制劑以100nl等分量轉(zhuǎn)移至于室溫下經(jīng)30分鐘Neutravidin包凈皮的平板的孔中。該預(yù)吸附步驟重復(fù)一次。封閉的和預(yù)清洗的噬菌體制劑與5nM生物素化的DKK1于22'C在搖床上溫育2小時(shí)。加入母本Fab、APP-DKK1或非竟?fàn)巹┎⑶覙悠酚?。C在搖床上溫育過夜。于室溫經(jīng)20分鐘在Neutravidin平板的孔中捕獲抗原噬菌體復(fù)合物。在大量洗滌步驟后，通過向每孔加入200jil的lOmMTris中的20mMDTT(pH8.0)于室溫經(jīng)10分鐘來洗脫結(jié)合的噬菌體顆粒。將洗脫液移出并加入到OD6()0nm為0.6-0.8的14ml大腸桿菌TG1細(xì)胞中?？子?00piPBS洗滌一次并且該溶液也加入到大腸桿菌TG1細(xì)胞中。噬菌體感染大腸桿菌于37。C靜置進(jìn)行45分鐘。5000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘后，細(xì)茵沉淀各自重懸于500fd2xYT培養(yǎng)基中，涂布于2xYT-CG瓊脂板上并于30'c溫育過夜。通過從平板表面刮下來收獲克隆并且如上所述將噬菌體顆粒回復(fù)和擴(kuò)增。如上所述地對(duì)第一輪挑選進(jìn)行第二輪和第三輪挑選，只是洗滌條件更加嚴(yán)格并且抗原濃度分別是1和0.1nM。基于電化學(xué)發(fā)光(BioVeris)的結(jié)合Fab的DKK1的結(jié)合分析為了檢測(cè)大腸桿菌裂解物(BEL提取物)中親和力增強(qiáng)的、DKK1特異性抗體片段，使用BioVerisM-384SERIESWorkstation(BioVerisEurope,Witney，Oxfordshire,UK)。在96孔聚丙烯微量滴定板中完成進(jìn)行該試驗(yàn)并且以補(bǔ)充0.5%BSA和0.02%Tween-20的PBS作為試驗(yàn)緩沖液。依據(jù)供應(yīng)商的說明書將生物素化的人DKK1固定在M-280Streptavidin順磁小珠(Dynal)上。每孔加入1:25稀釋度的小珠貯備液。100pi稀釋的BEL提取物樣品和小珠于室溫下在振蕩器上溫育過夜。為了檢測(cè)，依據(jù)供應(yīng)商(BioVerisEurope,Witney,Oxfordshire,UK)的說明書，使用以BV-tagTM標(biāo)i己的抗人(Fab)'2(Dianova)。一組約2300個(gè)隨機(jī)挑出的克隆通過上述方法分析。選擇給出最高值的一組160個(gè)克隆用于溶液平衡滴定中的進(jìn)一步分析。使用溶液平衡滴定(SET)的皮摩爾親和力的測(cè)定對(duì)于Kd測(cè)定，使用Fab的單體片段(由分析性SEC分析的至少90%單體含量；Superdex75，AmershamPharmacia).如由Haenel等人，2005描述地從基本上進(jìn)行溶液中基于電化學(xué)發(fā)光(ECL)的親和力測(cè)定和數(shù)據(jù)評(píng)估。Fab的恒定量以溶液中不同濃度(3n的連續(xù)稀釋)的人DKKl(4nM初始濃度)平衡。加入連接順磁小珠(M-280Streptavidin,Dynal)的生物素化的人DKK1，以及BV-tagTM(BioVerisEurope,Witney,Oxfordshire,UK)標(biāo)記的抗人類(Fab)'2(Dianova)并且將混合物溫育30分鐘。隨后，未結(jié)合的Fab的濃度通過使用M-SERIES384分析儀(BioVerisEurope)的ECL檢測(cè)來定量。為此，挑選160個(gè)單一克隆并由Ni-NTA瓊脂糖以照級(jí)進(jìn)行純化。初步的親和力由BioVeris中的四點(diǎn)溶液平衡滴定(SET)來測(cè)定。從這些數(shù)據(jù)中挑選出顯示親和力的20個(gè)克隆。這些Fab以mg級(jí)進(jìn)行純化。由于在大小排阻色鐠中檢測(cè)到的Fab的局部聚集，MOR04950從親和力測(cè)定中排除并另行評(píng)估。使用八點(diǎn)SET測(cè)定和人類、小鼠和食蟹猴的DKK1，從每個(gè)Fab克隆的兩個(gè)獨(dú)立批次中檢測(cè)最終的親和力?；旧先缟纤觯褂米鳛槿芤褐蟹治鑫锏男∈驞KK1(R&DSystems)和食蟹猴DKK1而不是人DKK1來進(jìn)行對(duì)小鼠和食蟹猴DKK1的親和力測(cè)定。為檢測(cè)游離的Fab，使用連接順磁小珠的生物素化的人DKK1。依據(jù)Haenel等人，2005AnalBiochem339.1:182-184計(jì)算親和力。使用上述的試驗(yàn)條件，在溶液中測(cè)定親和力優(yōu)化的抗DKK1Fab的親和力。測(cè)定對(duì)MOR04910和MOR04946的親和力，對(duì)人DKK1的Kd低于30pM并且對(duì)小鼠和食蟹猴DKK1的Kd在36pM和42pM之間。另外七個(gè)抗體顯示對(duì)所有三種抗原低于100pM的親和力?？寺OR04950未顯示對(duì)生物素化的DKK1的結(jié)合。親和力總結(jié)于本文的表7中。表7.Fab親和力<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table>*:兩個(gè)不同F(xiàn)ab批次之間至少進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立的測(cè)定#:僅單一測(cè)定實(shí)施例6:親和力優(yōu)化的抗人DKKlFab的表征酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)技術(shù)在50"/o人類血清(HS)存在下測(cè)定成熟Fab的結(jié)合特異性。TBS中連續(xù)稀釋的人類重組的、生物素化的DKKl于室溫下經(jīng)2小時(shí)包被到Neutravidin樣史量滴定板上，從每孔8ngDKKl至每孔125ngDKKl的濃度?？乖缓?，用1。/。BSA補(bǔ)充的TBS/0.05%Tween(TBS-T)于室溫下經(jīng)1小時(shí)將孔封閉。上述純化的Fab以終濃度1ng/ml稀釋于TBS/4%BSA或TBS/50%HS中，加入到包被的和封閉的孔中并且平板于室溫下溫育1小時(shí)。為了檢測(cè)，使用抗FLAG堿性磷酸酶(AP)綴合的抗體(1:5000稀釋于TBST中)和熒光底物AttoPhos(Roche)。每次溫育后，微量滴定板的孔用TBST洗滌五次，只是在使用標(biāo)記的第二抗體的最終溫育步驟中孔洗滌三次。在TECANSpectrafluor平板讀數(shù)器中測(cè)定焚光。示例性的結(jié)合曲線本文顯示于圖3中。表8總結(jié)與4。/。BSA中的結(jié)合活性相比在50%人類血清存在下優(yōu)化的抗DKKlFab的結(jié)合活性，其范圍從83%至100%。中值顯示為93%,因此發(fā)現(xiàn)抗DKKlFab在人血清存在下充分結(jié)合到靶標(biāo)。表8.Fab的結(jié)合活性<table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table>*單一測(cè)定使用U20S細(xì)胞系的人類血清存在下的熒光素酶報(bào)告細(xì)胞試驗(yàn)為另外測(cè)定優(yōu)化的抗DKK1Fab的結(jié)合特異性，在15%人類血清存在下使用骨肉瘤細(xì)胞系U20S重復(fù)熒光素酶報(bào)告基因細(xì)胞試驗(yàn)。依據(jù)供應(yīng)商的方案(ATCC，Manassas，VA，USA)培養(yǎng)U20S細(xì)胞(ATCCNo.HTB-96)。將細(xì)胞用胰蛋白酶消化、計(jì)數(shù)并稀釋于培養(yǎng)基中(McCoy's5a/10%FCS)以達(dá)到2xl05細(xì)胞/ml的濃度。對(duì)于每2xl04個(gè)細(xì)胞，制備0,075照pTA-LUC-12xSuperTopFlash和0.004嗎phRL-SV40的混合物溶液。將這些混合到終體積為9.8pl的OPTI-MEM中。然后加入0.2plFuGENE6轉(zhuǎn)染試劑(Roche，Mannheim,德國(guó))。轉(zhuǎn)染混合物簡(jiǎn)單溫育并然后與預(yù)先制備的細(xì)胞混合。隨后，將細(xì)胞以100nl每孔接種到白色平底的96孔細(xì)胞培養(yǎng)亞中并于37。C和5。/。C02中培養(yǎng)過夜。笫二天，從試驗(yàn)板的每孔中移出75nl培養(yǎng)基并替代為10piHuCALFab抗體稀釋液(10至0.01照/ml稀釋于無血清培養(yǎng)基中)、15nl70%FCS或人血清，并向每孔加入50pi含600ng/mlDKK1畫APP的Wnt3a^ft培養(yǎng)基。對(duì)于陰性對(duì)照，加入無血清培養(yǎng)基以代替抗體稀釋液。為獲得最大量的熒光素酶信號(hào)，加入含代替抗體稀釋液的lOjil無血清培養(yǎng)基和不含DKK1-APP的50nlWnt3aCM的對(duì)照。于37°C、5%C02中培養(yǎng)24小時(shí)后，依據(jù)制造商說明4吏用Dual-Glo熒光素酶試驗(yàn)系統(tǒng)(Promega，Madison,WI,USA)來測(cè)定焚光。表9顯示在15%人類血清存在下優(yōu)化的抗DKKlFab的抑制活性(與15%FCS中的抑制活性相比)。數(shù)據(jù)顯示血清存在下獲得的活性范圍從26%至90%,中值為70-74%。這些數(shù)據(jù)顯示獲得<table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table>通過熒光素酶報(bào)告基因細(xì)胞試驗(yàn)測(cè)定親和力優(yōu)化的抗DKK1Fab的EC5。在使用10nMDKKl的標(biāo)準(zhǔn)Wnt3a依賴性TCF/LEF焚光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)中測(cè)試親和力改進(jìn)的Fab，以便獲得熒光素酶表達(dá)的抑制作用。由于試驗(yàn)的靈敏性太低，可見無法通過該方法產(chǎn)生ECs。值。通過本文圖4中所示的所有待測(cè)Fab的陡哨的抑制曲線和相似的ECso值可見。開發(fā)了TCF/LEF熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)的改良版本。DKKl結(jié)合到Kremen-1和-2跨膜蛋白質(zhì)并且該相互作用導(dǎo)致Wnt信號(hào)的強(qiáng)烈協(xié)同抑制作用(Mao等2002Nature:417:664-67)。因此，KremencDNA與TCF/LEF熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)共轉(zhuǎn)染。得到的Wnt3a依賴性報(bào)告試驗(yàn)顯示由Kremen共受體蛋白質(zhì)的共表達(dá)介導(dǎo)的對(duì)DKKl靈敏性的高度增強(qiáng)。在該試驗(yàn)中，0.33nMDKKl足夠誘導(dǎo)Wnt信號(hào)的完全抑制。使用0.33nMDKK1重復(fù)Fab滴定(以10倍濃度)，并且產(chǎn)生從中可計(jì)算EC幼值的S形抑制曲線(本文圖5)。考慮到上述ECso而分析親和力優(yōu)化的抗DKKlFab。如本文表10中所示，由該方法獲得的ECso值范圍從0.2nM至5.6nM。表10.Fab的EC:<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>親和力優(yōu)化的Fab的序列分析測(cè)定所有20個(gè)Fab的重鏈和VL區(qū)(Vh和VO的核苷酸序列?；パa(bǔ)決定區(qū)(CDR)的氨基i^列列于本文表llA和表llB中。Table11A.重鏈CDR的氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table>Table11B.輕鏈CDR的氨基酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table>序列分析顯示六個(gè)母本(P)Fab中的五個(gè)產(chǎn)生親和力增強(qiáng)的繼承者(successor)。在HCDR2以及在LCDR3中可優(yōu)化MOR04461和MOR04470。沒有獲得MOR04454的優(yōu)化繼承者。另外，如表11B中所示，各種CDR的共有序列1和共有序列2中完全不同的母本抗體間顯示高度同源性.使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法可為顯示于表10A中的母本序列提供相似的共有序列。另外，已確定MOR04920在HCDR2區(qū)具有突變(在第73位絲氨酸殘基突變?yōu)楦拾彼?，依?jù)Honegger和Pluckthun,2001JMolBiol309.3:657-670公布的編號(hào)方案)，因而偏離HuCAI^設(shè)計(jì)。顯示MOR04913具有在k輕鏈的構(gòu)架4中的點(diǎn)突變(在第148位賴氨酸變?yōu)樘於０?。因?yàn)椴黄谕撐稽c(diǎn)影響抗體的結(jié)合特性，在IgG轉(zhuǎn)變期間將突變回復(fù)成種系/HuCAL⑧組合物，產(chǎn)生抗體MOR05145,MOR04947在LCDR2中具有潛在的糖基化位點(diǎn)。由于MOR04947僅僅選作備選候選物之一，因而未去除該位點(diǎn)。實(shí)施例7:制備HuCAI^免疫球蛋白轉(zhuǎn)換成IgG形式為表達(dá)全長(zhǎng)免疫球蛋白(Ig),對(duì)于人類IgGl或人類IgG4，將重(Vh)和輕鏈(V^的可變區(qū)片段從pMORPHX9_FHFab表達(dá)載體中亞克隆進(jìn)pMORPH—h_Ig或pMORPH2—h—Ig載體系列。其他載體可用于人IgG2。限制酶EcoRI、Mfel和Blpl用于將VH域片段亞克隆進(jìn)pMORPH_h—IgGl和pMORPH—h_IgG4。限制酶Mfel和Blpl用于將VH結(jié)構(gòu)域片段亞克隆進(jìn)pMORPH⑧2—h—IgGlf和pMORPH逸2—hIgG4。使用EcoRV和BsiWl位點(diǎn)將VL結(jié)構(gòu)域片段亞克隆進(jìn)pMORPH—h—IgK和pMORPH2—h—IgK，而使用EcoRV和Hpa1將V^結(jié)構(gòu)域片段亞克隆進(jìn)pMORPH_h—Igk和pMORPH⑧2一h一Ig12。人類IgG的瞬時(shí)表達(dá)和純化用等摩爾量的IgG重鏈和輕鏈表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后4或5天時(shí)，收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清液。調(diào)節(jié)上清液的pH至8.0并且過濾滅菌后，將溶液進(jìn)4亍標(biāo)準(zhǔn)的A蛋白柱層析(Poros20A，PEBiosystems)。母本Fab轉(zhuǎn)換成IgG形式平行于親和力成熟的開始，將MOR04454、MOR04456和MOR04470克隆進(jìn)pMORPH—h—IgGl和pMORPH—h—IgG4表達(dá)載體。備選的構(gòu)建體可用于IgG2表達(dá)栽體的產(chǎn)生。由HEK293細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)行小范圍表達(dá)并且從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化全長(zhǎng)免疫球蛋白。由大小排阻色譜顯示的數(shù)據(jù)表明抗體是單體形式的。Wnt3a依賴性報(bào)告基因試驗(yàn)中的測(cè)試證實(shí)蛋白質(zhì)是有功能的。實(shí)施例8:優(yōu)化用于表達(dá)的氨基酸序列和基因的核苷酸序列為增強(qiáng)哺乳動(dòng)物的表達(dá)，將改變引入本文中的Fab的重鏈和輕鏈中，以進(jìn)行細(xì)胞中表達(dá)的密碼子選擇的優(yōu)化。已知的幾個(gè)負(fù)的順式作用基序減少在哺乳動(dòng)物中的表達(dá)。本文的優(yōu)化過程去除對(duì)表達(dá)起負(fù)作用的負(fù)的順式作用位點(diǎn)(例如剪接位點(diǎn)或poly(A)信號(hào))。本文的優(yōu)化過程另外豐富GC含量以延長(zhǎng)mRNA半壽期。使用本文通過噬菌體展示篩選分離到的Fab克隆MOR04945(全長(zhǎng)輕鏈母本核苦酸序列是SEQIDNO:98，并且全長(zhǎng)重鏈母本核苷酸序列是SEQIDNO:102)來優(yōu)化可變輕鏈和重鏈區(qū)。然后使用這些方案來優(yōu)化編碼這種或其他克隆的每一完整輕鏈和重鏈的核苷酸序列。對(duì)于MOR04945的Vh和VL鏈的優(yōu)化過程為優(yōu)化用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的每一Vt和VH鏈的核苦酸序列和氨基^列，使密碼子選擇適用于哺乳動(dòng)物基因的密碼子偏愛。另外，在可能的情況下減少或消除GC含量非常高(>80%)或非常低(<30%)的區(qū)域。備選地，對(duì)于細(xì)菌、酵母或桿狀病毒中表達(dá)的優(yōu)化，將基于它們各自基因改變密碼子的選擇。在哺乳動(dòng)物表達(dá)的優(yōu)化過程中，消除以下順式作用序列基序內(nèi)在的TATA盒、Chi位點(diǎn)和核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、富含AT或富含GC的序列片段、RNA不穩(wěn)定基序(ARE)序列元件、抑制RNA序列元件(INS)、cAMP響應(yīng)(CRS)序列元件、重復(fù)序列和RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、包括隱蔽位點(diǎn)的剪接供體和受體位點(diǎn)，以及分支點(diǎn)。除另外+兌明，在優(yōu)化V^鏈的核苷酸序列過程中避免MluI和Hindin位點(diǎn)的引入。除另外說明，在優(yōu)化VH鏈的核苷^列過程中避免MlyI和BstElI位點(diǎn)的引入。優(yōu)化用于表達(dá)的MOR04945的Vh和Vt鏈的^^酸序列為了對(duì)上述克隆MOR04945的Vh和VL鏈產(chǎn)生優(yōu)化的M酸序列，改變密碼子選擇為哺乳動(dòng)物的密碼子選擇，以l吏在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有更高和更穩(wěn)定的表達(dá)速率。參見實(shí)施例5。下面的表12A顯示可變輕鏈(SEQIDNO:120)的有義和反義(AS)核苷酸序列以及為表達(dá)而優(yōu)化產(chǎn)生的可變輕鏈氨基酸(稱為AA)序列(SEQIDNO:118)。表12A優(yōu)化用于表達(dá)的Vt鏈的核苷酸有義和反義序列，以及氨基酸序列ACGCGTTGCGATATCGCCCTGAOfCAGCCCGCCAGCGTGTCCGGCAGCCCTGGCCAGAGC(Sense)TGCGCAACGCTATAGCGGGACTGGGTCGGGCGGTCGCACAGGCC.GTCGGGACCGGTCTOS(AS)TRC.DIALTQ.PASVSGSPGQS(AA)Pvu工I"tATJTBstWJATCACCATCAGCTGTACCGGCACCAGCAGCGACCTG.GGCGGCTACAACTACGTGTCCTGG(Sense)61---------+---------+---------+---------+---------+---------+TAGTGGTAGTCGACATGGCCGTGGTCGTCGCTGGACCCGCCGATGTTGATGCACA(GAC(J(AS)ITISCTGTSSDLGGYNYVSW"A).TATCAGCAGCACCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGMGATCTACGACG了GAACAACAGACCT(Serise)121---------+---------+----^-----+---------+---------+---------+ATAGTCGTCGTGGGGCCGTTCCGGGGGTTCG今CTACTAGATGCTGCACTTGTTGTCTG(3A(AS>YHPGKAPKLMIYDVNtJRP'(AA)181-----■——+------——+---------+—-,-----一+---------+-------—-+'SGVgNRFSGSKS&ASI_(AA)TCTGGCCT(^CAGGCTGAGGACGAGGCCGACTACTACTGCCAGACCTACGACCAGATCAAG(Sense)24i'----一二一+,——-----一一----;-----+----------+---------+agaccggacgt^cgactcctgctccggctgatgatga6gg士ctggatgctggtctagttc(AS)■S.GLE￡)EADYYCQT*DQIK"A〉.H"indJI工''.CTGTCCGCCGTGTTTGGCGGCGGAACAAAGCTT(Sense)(SEQIDNO:120).301---------+—";一-----+—----■—-■"+二—一，gacaggcggcacaaAccgccgccttgtttcgaa(as;!LSAVFGGGIKL(AA)(SEQIDNO:118)下面的表12B顯示有義和反義可變重鏈核苷酸序列(SEQIDNO:121)以及為表達(dá)而優(yōu)化產(chǎn)生的可變重鏈氨基酸(稱為AA)序列(SEQIDNO:119)。表12B優(yōu)化用于表達(dá)的VH鏈的核苷酸有義和反義序列，以及氮基酸序列HinfJ1171fVuJ工.'(Seiise)-+---------+---------+---------+-------:——+(AS).GVQAQVQLVESGGGLVQ(AA)61---------+---------+---------十一一;-----一—-------_一+—一-------+GSLR.ISCAASGFTFSSYW"A〉GATGAGCTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCGTGATCAGCAf3.(Se咖)'l2l---=------+---------+---------+---------+----.-----+-------一一CTACTCGACCCACTCCGTCCGG"GGACCQTTCCCGGACCTCACCCACAGGCACTAGTCGfC(AS)MSWVRQAPGK.GLEWVSVI'SS(AA)CGATAGCAGCAGCACCTACTACGCCGATAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGA(Sense)131■—=--------+---------+---------+---------+---------+---------+DSSSTYYADSV_K—GRFTI_SRD"A>CAACAGCAAGAACACCCTGTACCiGCAGATGAACAGCCTGAGBLGCCGAGGACACCGCCGT'(Sense)'24i------;——+---------+—-----------7----+-------^-+---------+NSKNTLY-LGMNSIiRAEDTA'V(AA.)'Bs'tWI301--------一---------+——-----+---------+---------+-------5:(S.nse)catgatgacacggtccgtgcccjtAgctgaagctggtgaccccggtcccgtgggaccagtg(AS)yTfCARH.GIDFDHWGOGTLVTC(Sense).(SEQIDNO:121)361.-G(AS)—(aa.)(SE'QIDNO:119)優(yōu)化前和優(yōu)4匕后的圖表可分別對(duì)每一母本序列和優(yōu)化的基因提供序列密碼子的百分率，并分析編碼Vh和VL鏈的相關(guān)核普酸序列的質(zhì)量等級(jí)。本文所用的質(zhì)量值指在期望的表達(dá)系統(tǒng)中用于給定M酸的最高頻密碼子設(shè)置為100，并且余下的密碼子依據(jù)使用頻率按比例標(biāo)度。(Sharp,P.M.,Li，W.H"NucleicAcidsRes.15(3)，1987)另夕卜，密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)是描述核苷酸序列的密碼子與目的生物的優(yōu)選密碼子選擇匹配程度的數(shù)值。CAI的最大值設(shè)置為1.0,因此認(rèn)為大于0.9的CAI能夠高表達(dá)。優(yōu)化前的Vt鏈的CAI顯示為0.73，而優(yōu)化后，CAI測(cè)定為0.95。同樣地，優(yōu)化前的VH鏈的CAI顯示為0.74，而優(yōu)化后，在優(yōu)化的結(jié)構(gòu)中測(cè)定為0.98，Vt鏈中的GC含量從MOR04945的母本序列的51%增加到源自MOR04945的優(yōu)化序列的62%。如圖9A和9B中所示，VH鏈中的GC含量從MOR04945的母本序列的54%增加到MOR04945的優(yōu)4匕衍生物的64%。MOR04910、MOR04945、MOR04946和MOR05145的全長(zhǎng)輕鏈和重鏈用于表達(dá)的優(yōu)化將優(yōu)化過程應(yīng)用于MOR04910(SEQIDNO:97)、MOR04945(SEQIDNO:98)、MOR04946(SEQIDNO:99)和MOR05145(SEQIDNO:IOO)的輕鏈的每一母本全長(zhǎng)核苷酸序列以及MOR04910(SEQIDNO:101)、MOR04945(SEQIDNO:102)、MOR04946(SEQIDNO:103)和MOR05145(SEQIDNO:103)的重鏈的母本全長(zhǎng)核苷酸序列。使用優(yōu)化過程來構(gòu)建與母本克隆數(shù)相關(guān)的每一下列輕鏈核苷酸序列對(duì)于克隆MOR04910，優(yōu)化的核苷酸序列是SEQIDNO:104;對(duì)于克隆MOR04945，優(yōu)化的核苷酸序列是SEQIDNO:105;對(duì)于克隆MQR04946,優(yōu)化的核苷酸序列是SEQIDNO:106;以及對(duì)于克隆MOR05145，優(yōu)化的核香酸序列是SEQIDNO:107。另夕卜，使用優(yōu)化過程來構(gòu)建與母本克隆數(shù)相關(guān)的每一下列重鏈核苷酸序列對(duì)于克隆MOR04910,優(yōu)化的核苷酸序列是SEQIDNO:108;對(duì)于克隆MOR04945,優(yōu)化的核苷酸序列是SEQIDNO:109;對(duì)于克隆MOR04946,優(yōu)化的核苷酸序列是SEQIDNO:110;以及對(duì)于克隆MOR05145，優(yōu)化的核苷酸序列是SEQIDNO:110。優(yōu)化的輕鏈核苷酸序列與下列優(yōu)化的輕鏈M酸序列相關(guān)對(duì)于克隆MOR04910，優(yōu)化的絲酸序列是SEQIDNO:111;對(duì)于克隆MOR04945，優(yōu)化的^J^酸序列是SEQIDNO:112;對(duì)于克隆MOR04946，優(yōu)化的氨基酸序列是SEQIDNO:113;以及對(duì)于克隆MOR05145,優(yōu)化的氨基酸序列是SEQIDNO:114。優(yōu)化的重鏈核苦酸序列與下列優(yōu)化的重鏈氛基酸序列相關(guān)對(duì)于克隆MOR04910，優(yōu)化的氨基酸序列是SEQIDNO:115;對(duì)于克隆MOR04945,優(yōu)化的^i^酸序列是SEQIDNO:116;對(duì)于克隆MOR04946，優(yōu)4t的氨基酸序列是SEQIDNO:117;以及對(duì)于克隆MOR05145，優(yōu)化的#^酸序列是SEQIDNO:117。預(yù)期的全長(zhǎng)輕鏈和重鏈序列的核苦酸和多肽序列的列表提供于表13A和表13B中。表13A提供優(yōu)化的核苷酸序列和由它們編碼的多肽。優(yōu)化這些核苷酸序列以去除在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中識(shí)別的潛在的剪接位點(diǎn)。表13B為列于表13A中的克隆提供母本核苷酸序列。表13A:輕鏈(LC)和重鏈(HC)序列-優(yōu)化的IC<opt)4910~nucleotide^SEQ工D恥97AAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAAAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAGXiC4910(BHQ880)pcaypeptideSEQID恥111TTPSKQSNNKYAASSYIiSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEq:S<table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table>GGi3TAAATGA實(shí)施例9:生物活性試驗(yàn)在報(bào)告基因試驗(yàn)中測(cè)定中和抗DKK1/4抗體的生物活性，使用稱為SuperTopflashKrml7的遺傳修飾的細(xì)胞系T/17STF—70IRES_Krm_(17)。細(xì)胞系源自人胚腎細(xì)胞HEK293并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有i)其中啟動(dòng)子TCF融合到安火蟲熒光素酶基因上游的報(bào)道基因構(gòu)建體和ii)導(dǎo)致該細(xì)胞表面Krm過表達(dá)的構(gòu)建體。在該細(xì)胞系中，暴露于Wnt蛋白質(zhì)可刺激熒光素酶以劑量依賴性方式表達(dá)。在Wnt存在下向固定的、次最大劑量的DKK1中加入分級(jí)量的抗DKK1/4抗體，導(dǎo)致在16小時(shí)的溫育期期間熒光素酶表達(dá)的增加。在末期，基于細(xì)胞裂解物中的酶活性來定量熒光素酶的量。熒光素酶催化底物熒光素向化學(xué)發(fā)光產(chǎn)物氧化蟲熒光素的轉(zhuǎn)變。然后用適當(dāng)?shù)墓舛扔?jì)測(cè)定作為結(jié)果的發(fā)光型化學(xué)發(fā)光.中和抗DKK1/4抗體試驗(yàn)樣品的生物潛能通過與參考標(biāo)準(zhǔn)物比較其增加熒光素酶表達(dá)的能力來測(cè)定。基于蛋白質(zhì)含量來歸一化樣品和標(biāo)準(zhǔn)品。然后依據(jù)歐洲藥典l(EuropeanPharmaco-poeial)使用平行系試驗(yàn)來計(jì)算相對(duì)潛能。最終的結(jié)果表示成與參考標(biāo)準(zhǔn)相比的樣品的相對(duì)潛能(以百分?jǐn)?shù))。實(shí)施例10:相關(guān)生物靶標(biāo)的體外活性選擇的前導(dǎo)Fab具有低納摩爾范圍的親和力和細(xì)胞試驗(yàn)中的潛在活性。DKK1的生理學(xué)上的結(jié)合配偶體是LRP5/6(Kd340pM)以及Kremen1和2(Kd~280pM)[Mao加01[Mao2002]。鑒于這些高親和力相互作用，需要另外提高親和力以l更更好地與生理學(xué)上的DKK1相互作用竟?fàn)?。為增?<選的Fab的親和力和生物活性，通過^f吏用導(dǎo)致突變的三核苷酸的盒式突變來平行優(yōu)化CDR-L3和CDR-H2區(qū)[Virnekas1994[Knappik2000][Nagy2002。親和力成熟之后，挑選出具有低皮摩爾親和力的、以低于1nM的EC50抑制Wnt信號(hào)發(fā)放的再激活DKK1的、并與食蟹猴、小鼠和大鼠DKK1交叉反應(yīng)的FAb。然后將該FAb的可變區(qū)改造成兩個(gè)不同的人類IgGl構(gòu)架?？笵KK1/4抗體具有對(duì)人DKK1的高親和力(2pM)，具有特別針對(duì)該親和力抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。參見圖6。圖6.方法使用具有包含CM5(S)傳感器芯片(Cat弁BR-1006-68)的BiacoreTlOO(Biacore，Uppsala，瑞典)儀器的表面等離振子體共振來測(cè)定前導(dǎo)候選物和rhDKKl(重組人DKK1)(批次BTP7757)的結(jié)合親和力和動(dòng)力學(xué)，將抗人IgGlFc(JacksonImmunoResearch,Cat#109-006-098)固定在每一流動(dòng)細(xì)胞上，隨后以約IOORU的期望捕獲來捕獲前導(dǎo)候選物。最后，六種濃度的DKK1(范圍0.195-6.25nM)以一種重復(fù)濃度在芯片上運(yùn)行。將流動(dòng)細(xì)胞激活用于240秒的DKK1結(jié)合，而接下來的解離達(dá)30分鐘。在BIA評(píng)估1.0軟件中使用動(dòng)力學(xué)分析，使規(guī)范歸一化的數(shù)據(jù)(減去背景的)適合與大量運(yùn)輸模式以1:1結(jié)合。該試驗(yàn)進(jìn)行三次重復(fù)，并且得到的數(shù)據(jù)是具有標(biāo)準(zhǔn)偏差的這三個(gè)試驗(yàn)的平均值。實(shí)施例ll:表位作圖成熟的DKK1是含兩個(gè)半胱氨酸富集區(qū)(Cys-l和Cys-2)的266個(gè)M酸的蛋白質(zhì)。Cys-2域負(fù)責(zé)結(jié)合LRP和Kremen蛋白質(zhì)并且對(duì)于Wnt信號(hào)發(fā)放的抑制是必需且充分的[Li2002][Brott2002。免疫沉淀試驗(yàn)(圖7A、7B)證實(shí)抗DKK1/4抗體特異性結(jié)合Cys-2結(jié)構(gòu)域，而不是Cys-l結(jié)構(gòu)域?？笵KK1/4抗體在用變性DKK1進(jìn)行的Western印跡中的活性微弱，并且在肽作圖試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)特異結(jié)合包括蛋白質(zhì)(JTP)長(zhǎng)度的任一重疊的15個(gè)氨基酸肽，這提示抗DKKl/4抗體很可能識(shí)別Cys-2內(nèi)的非線性表位。圖7(A)圖示全長(zhǎng)和截短DKK1。全長(zhǎng)(FL，含有殘基1-266)、羧基端截短(AC，包含殘基1-185)、以及氨基端截短(AN,包含殘基1-60以及殘基157-266),在它們的C端與HA表位融合，并且克隆到巨細(xì)胞病毒(CMY)啟動(dòng)子控制下的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中。圖7(B)描述中和抗DKKl/4抗體和DKK1蛋白質(zhì)的結(jié)合。來自表達(dá)包含全長(zhǎng)的、氨基端截短的、氣基端截短的DKK1蛋白質(zhì)的短暫轉(zhuǎn)染的Hek293細(xì)胞的條件培養(yǎng)基與抗溶菌酶IgGl對(duì)照或抗DKK1/4抗體于室溫下溫育2小時(shí)，并且免疫復(fù)合物在G蛋白小珠上收集、由SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)移并用抗HA抗體進(jìn)行印跡?？傒斎肓康?/10上樣作為對(duì)照。實(shí)施例ll:表位作圖-N-糖基化Wnt信號(hào)發(fā)放途徑內(nèi)的大量蛋白質(zhì)是通過調(diào)節(jié)它們的細(xì)胞活性的酶翻譯后共價(jià)修飾。包括DKK1的DKK家族成員由N-糖基化來修飾[Krupnik1999]。DKK1在Cys-2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的第256位^J^酸具有一個(gè)理論上的N連接的糖基化位點(diǎn)。鑒于Cys-2結(jié)構(gòu)域的高度保守特性，以及DKK1對(duì)LRP6和抗DKK1/4抗體對(duì)DKK1的潛在結(jié)合位點(diǎn)，我們?cè)噲D確定抗DKK1/4抗體是否識(shí)別DKK1的N-糖基化形式。ELISA證實(shí)抗DKK1/4抗體識(shí)別rhDKKl的N-糖基化形式，勝過rhDKKl的特異N連接的去糖基化形式。參見表14A。而用直接針對(duì)重組蛋白質(zhì)的融合表位標(biāo)記區(qū)的第二抗體(抗HIS)完全等同地識(shí)別相同的蛋白質(zhì)。通過使用表面等離振子體共振來定量親和力的差異，并且發(fā)現(xiàn)相對(duì)于去糖基化蛋白質(zhì)，抗DKKl/4抗體對(duì)糖基化的rhDKKl具有100倍高的KD,參見表14B。表14A.結(jié)合百分比-結(jié)合到DKKl的抗DKKl/4抗體的糖基化依賴性<table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table>表14B，表面等離振子體共振<table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table>通過ELISA測(cè)定抗DKKl/4抗體與野生型(WT)rhDKKl(HEKHIS表位標(biāo)記的批次#BTP7757)和N連接的去糖基化的(N-DEGLY,使用酶PNGaseF(Sigma，Cat#E-DEGLY)的N連接的去糖基化)rhDKKl的結(jié)合。簡(jiǎn)要地，高度結(jié)合ELISA(Nunc糾42404)平板用1ng/mlWT或N-DEGLYDKKl包被。與它們分別結(jié)合N-DEGLY相比較，顯示抗DKKl/4抗體和抗HIS抗體結(jié)合WTDKK1的比率。該試驗(yàn)以三種不同濃度進(jìn)行(顯示一種代表性濃度的數(shù)據(jù))，所有濃度具有相似的結(jié)果。使用BiacoreT100測(cè)定抗DKKl/4抗體與WT和N-DEGLYDKK1(HEK293批次#BTP7757)的結(jié)合親和力和動(dòng)力學(xué)。與WTDKK1相比，抗DKKl/4抗體始終具有對(duì)N-DEGLYDKKl低100倍的親和力。實(shí)施例12:DKK家族成員的同一性百分比人Dickkopf家族包括四種側(cè)向同源物(參見表15)，其中三種(DKK1、2和4)結(jié)合LRP6和Kremen蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)LRP5/6的內(nèi)化并抑制常規(guī)Wnt信號(hào)發(fā)i文Mao2001[Mao2003。DKK2也協(xié)同LRP6過表達(dá)以增強(qiáng)Wnt信號(hào)發(fā)放，但是LRP6和Kremen2的共表達(dá)恢復(fù)該途徑的DKK2抑制作用[Mao2003。因此DKK2可充當(dāng)激動(dòng)劑和拮抗劑，這取決于細(xì)胞類型(cellcontext)。DKK3是最不保守的家族成員，其包括在負(fù)責(zé)LRP5/6和Kremen相互作用的Cys-2域內(nèi)，而且由于其不結(jié)合LRP及Kremen，并且不阻礙WnH言號(hào)而區(qū)別于其他DKK家族成員[Mao2001Mao2003。表15.跨越整個(gè)蛋白質(zhì)和Cys-2域內(nèi)的DKK家族成員的百分比同源<table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table>使用用于比較氨基酸同一性比率的配對(duì)序列比對(duì)的AlignX運(yùn)算法則來評(píng)估DKK家族成員間的同源性。應(yīng)用分別是10和0.1的空位開放罰分和空位延伸罰分。該評(píng)估包括整個(gè)蛋白質(zhì)的比較，以及僅僅Cys-2域的比較。如上表中指出的，DKK1、2和4在整個(gè)蛋白質(zhì)上有30-40%的氨基酸序列同源性。單獨(dú)Cys-2結(jié)構(gòu)域的比較顯示DKK1和2在該區(qū)內(nèi)有69%的同源性，而DKK4與DKK1和2共有約57%的相同結(jié)構(gòu)域。DKK3顯示與其他家族成員最低水平的同源性。Cys-2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的所有成員間的同源性最大。實(shí)施例13:抗DKK1/4抗體與人DKK家族成員的親和力除了結(jié)合DKK1，抗DKK1/4抗體也結(jié)合DKK4，參見表16。雖然對(duì)DKK4的親和力比對(duì)DKK1的親和力低大約100倍，它仍然是次納摩級(jí)并因此很可能是生物學(xué)上和臨床上相關(guān)的。值得注意的，DKK2和DKK4都沒有保留預(yù)測(cè)的在DKK1的Cys-2域中耙向用于糖基化的天冬酰胺殘基。初步的免疫沉淀試驗(yàn)提示抗DKK1/4抗體未特異結(jié)合DKK2。結(jié)合DKK2的抗DKK1/4抗體的結(jié)合親和力將在DKK2成功純化后測(cè)定。與DKK3的獨(dú)特功能和結(jié)合特性相一致，抗DKK1/4抗體不結(jié)合DKK3。表16.抗DKK1/4抗體對(duì)人DKK家族成員的親和力<table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table>-使用BiacoreT100測(cè)定抗DKK1/4抗體對(duì)人DKK家族蛋白質(zhì)其他成員的結(jié)合親和力和動(dòng)力學(xué)。與以前一樣，試驗(yàn)進(jìn)行三次重復(fù)，針對(duì)顯著結(jié)合抗DKK1/4抗體的蛋白質(zhì)并報(bào)告為具有標(biāo)準(zhǔn)偏差的三次試驗(yàn)的平均值。同源性最少的家族成員DKK3，在背景水平上不具有可檢測(cè)結(jié)合并因此稱為NSB(無顯著結(jié)合)。同樣地，近期數(shù)據(jù)顯示本發(fā)明的抗DKKl/4抗體也對(duì)DKK2具有無顯著結(jié)合。實(shí)施例14:抗DKK1/4抗體阻礙DKK1對(duì)LRP6的結(jié)合DKK1通過與LRP5/6和Kremen的相互作用來介導(dǎo)它的Wnt拮抗劑活性，誘導(dǎo)內(nèi)化并阻礙Wnt誘導(dǎo)的LRP5/6與Frizzled受體的相互作用。在圖8的竟?fàn)幮訣LISA試驗(yàn)中抗DKK1/4抗體竟?fàn)幮砸种艱KK1與LRP6的結(jié)合。HEK293T細(xì)胞^4^達(dá)足夠水平的內(nèi)源性LRP5或6以使DKK1結(jié)合顯現(xiàn)。然而，可在細(xì)胞表面檢測(cè)到LRP6與表面運(yùn)輸侶伴蛋白質(zhì)、MESD、GFP標(biāo)記的DKK1的共轉(zhuǎn)染，這表明DKK1/LRP6相互作用的特定性質(zhì)。與抗DKK1/4抗體具有相同可變區(qū)的MOR04910特異性地阻礙該相互作用。抗DKK1/4抗體抑制DKK1與LRP6直接結(jié)合的能力由ELISA測(cè)定。簡(jiǎn)要地，未處理平板(Fisher，Cat#1256S501)用1ng/ml重組LRP6(R&DSystemsCat#l505-LR)包被，然后將500ng/mlrhDKKl和抗DKK1/4抗體或hlgGl(抗溶菌酶MOR3207，ACE10915)的濃度曲線(concentrationcurve)在冰上預(yù)溫育30分鐘，然后將它們放置到LRP6包被的板上達(dá)2小時(shí)。洗滌平板并用抗DKK1抗體(R&DSystemsAF1096)檢測(cè)DKK1結(jié)合水平。顯示的是原始OD值(減去背景的)。增加濃度的抗DKK1抗體以劑量依賴方式抑制DKK1L與LRP6的直接結(jié)合，而增加濃度的hlgGl未阻礙DKK1與LRP6的結(jié)合。MOR04910抑制DKK1/LRP6結(jié)合到細(xì)胞表面上的能力由焚光顯微鏡測(cè)定。HEK293T細(xì)胞是以編碼LRP6和MESD的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的或短暫轉(zhuǎn)染的模擬體。細(xì)胞與DKK1-GFP條件培養(yǎng)基連同抗溶菌酶Fab或抗DKK1FAbMOR04910于37。C溫育1小時(shí)，并由熒光顯樣t鏡測(cè)定。GFP熒光反映DKK1-GFP在質(zhì)膜上對(duì)超量表達(dá)的LRP6的結(jié)合?？笵KK1/4抗體在細(xì)胞表面阻礙DKK1與LRP6相互作用。實(shí)施例14:報(bào)告基因試驗(yàn)-DKKl抑制的TCF/LEF基因轉(zhuǎn)錄的再激活常規(guī)的Wnt信號(hào)發(fā)放在p聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中時(shí)終止，其中p聯(lián)蛋白與導(dǎo)致Wnt應(yīng)答基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)的TCF/LEF家族的轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)。才艮告基因試驗(yàn)使用驅(qū)動(dòng)熒光素酶基因轉(zhuǎn)錄的TCF/LEF應(yīng)答啟動(dòng)子來構(gòu)建，以便于Wnt途徑調(diào)節(jié)的檢測(cè)。在該試驗(yàn)中DKK1有效地阻礙由Wnt3A條件培養(yǎng)基(CM)誘導(dǎo)的熒光素酶活性。抗DKKl/4抗體以明顯的0.16nMEC50重新激活DKK1抑制的Wnt信號(hào)發(fā)放，參見圖9。因?yàn)樵囼?yàn)需要約1nM的DKK1用于完全抑制并且抗體親和力是2pM，很可能該EC50反映試驗(yàn)的靈敏性和每一蛋白質(zhì)的相對(duì)量而不是抗DKK1/4抗體竟?fàn)幍慕^對(duì)限定。以SuperTopflash報(bào)道基因和Kremen穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞用10ng/mlrhDKK、50%Wnt3a條件培養(yǎng)基，以及多種量的抗DKK1/4抗體來處理。18小時(shí)后，熒光素酶活性由明亮焚光素酶試驗(yàn)試劑盒(Promega)測(cè)定。實(shí)施例15:報(bào)告基因試驗(yàn)-在前成骨細(xì)胞樣細(xì)胞中DKK1抑制的堿性磷酸酶分泌的反轉(zhuǎn)為測(cè)定抗DKK1/4抗體是否以更加生理相關(guān)的狀態(tài)阻礙DKK1功能，建立體外試驗(yàn)以測(cè)定多能性小鼠細(xì)胞系C3H10T1/2(10Tl/2)的Wnt介導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化，參見圖10。成骨細(xì)胞分化后，10T1/2細(xì)胞分泌堿性磷酸酶(AP)，該現(xiàn)象可由DKK1抑制，抗DKK1/4抗體但不是IgG對(duì)照，在Wnt3A條件培養(yǎng)基存在時(shí)阻礙DKK1對(duì)10T1/2分化的抑制作用。已^JiWnt-秀導(dǎo)增殖和抑制許多細(xì)胞類型上的細(xì)胞凋亡和Wnt途徑的激活，如由p聯(lián)蛋白穩(wěn)定性或核定位指示的，Wnt途徑的激活常與腫瘤發(fā)展相聯(lián)系。此外，在某些癌癥(例如結(jié)腸癌和黑素瘤)中DKK1的減量調(diào)節(jié)，已引導(dǎo)某些研究者提出DKK1對(duì)某些癌癥可能是腫瘤抑制劑[Gonzalez-Sancho2005][Kuphal2006。為測(cè)試DKK1對(duì)腫瘤增殖或存活是否具有影響，腫瘤細(xì)胞系用抗DKKl/4抗體處理并分析生長(zhǎng)中的變化。未發(fā)現(xiàn)抗DKK1/4抗體的加入顯著影響測(cè)試的腫瘤細(xì)胞系。在體外評(píng)估抗DKK1/4抗體對(duì)若干腫瘤細(xì)胞系的存活或增殖的影響。在該試驗(yàn)中，抗DKK1/4抗體(IOOng/ml)用腫瘤細(xì)胞系溫育，3天后細(xì)胞數(shù)量由ATP(Promega，CellTiterGIoAssay)的定量來評(píng)估，ATP作為與細(xì)胞數(shù)量呈線性關(guān)系的代謝活性細(xì)胞的度量。以三種不同血清濃度(無血清，最小生長(zhǎng)，以及完全生長(zhǎng))進(jìn)行該試驗(yàn)，與未處理的和hlgGl處理的細(xì)胞相比未發(fā)現(xiàn)明顯變化。通過ELISA分析細(xì)胞系上清液的DKK1表達(dá)。實(shí)施例16:種間交叉反應(yīng)和DKK1的中和中和抗DKK1/4抗體的選擇不是因其針對(duì)人DKK1的高親和力和中和能力，而是基于其與其他物種的交叉反應(yīng)，其中這些物種用于功效和安全研究?？笵KK1/4抗體以與對(duì)人DKK1相似的親和力來與小鼠、大鼠和食蟹猴(cyno，Macacafascicularis)DKKl交叉反應(yīng)，見表17。此外，抗DKK1/4抗體中和所有四個(gè)種的D與KK1介導(dǎo)的Wnt抑制活性(表17)，暗示這些物種應(yīng)該與安全和功效才莫式相關(guān)。表17.種間交叉反應(yīng)和DKK1的中和<table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table>對(duì)人類、食蟹猴、小鼠和大鼠DKK1的親和力測(cè)定通過使用M-384SERIES分析儀(BioVeris，Europe)的溶液平衡滴定(SET)來分析。對(duì)于由溶液平衡滴定(SET)測(cè)定的KD，使用IgG蛋白質(zhì)的單體片段(至少90%單體含量，由分沖斤'性SEC分沖斤的，Superdex75，AmershamPharmacia)。在溶液中基于電化學(xué)發(fā)光(ECL)的親和力測(cè)定和數(shù)據(jù)評(píng)估基本如描述于[Haeneletal.，2005中地進(jìn)行，應(yīng)用如依據(jù)[Piehler等人，1997]修飾改進(jìn)的結(jié)合安裝模型。恒量的MOR4910IgG用溶液中不同濃度的(3n稀釋)人DKK1(4nM初始濃度)平衡。加入連接生物素化的人DKK1的順磁小珠(M-280Streptavidin，Dynal)和BV-tagTM(BioVerisEurope,Witney,Oxfordshire,UK)標(biāo)記的山羊抗人類(Fab)，2多克隆抗體并溫育30分鐘。隨后，經(jīng)由采用M-384SERIES分析儀(BioVeris，Europe)的ECL檢測(cè)來定量未結(jié)合的IgG濃度。在溶液中使用小鼠、大鼠和食蟹猴DKK1而不是人DKKl作為分析物來基本上如上所述進(jìn)行對(duì)大鼠、小鼠和食蟹猴DKK1的親和力測(cè)定。為檢測(cè)游離的IgG分子，使用連接生物素化的人DKK1的順磁小珠。MOR4910和抗DKK1/4抗體以相同的EC50中和人DKKl(Novartis)，抗DKK1/4抗體也中和猴(Novartis)、小鼠(R&DSystems1765-DK-010)和大鼠(Novartis)的DKK1。基本如上所述(圖9yf吏用每一種的重組DKKl而不是人DKKl作為Wnt條件培養(yǎng)基的抑制劑來進(jìn)行對(duì)人類、大鼠、小鼠和食蟹猴DKK1的TOPFLASH報(bào)告基因試驗(yàn)。大鼠重組DKKl需要較高的蛋白質(zhì)濃度以達(dá)到TOPFLASH試驗(yàn)的顯著抑制。實(shí)施例17:抗DKK1/4抗體對(duì)PC3M2AC6異種移植物的脛骨內(nèi)生長(zhǎng)的影響前列腺腫瘤轉(zhuǎn)移由于它們主要是成骨細(xì)胞的而不是溶骨細(xì)胞的，因而在骨轉(zhuǎn)移中是獨(dú)特的[Keller20011。然而，甚至主要的成骨細(xì)胞性骨轉(zhuǎn)移具有潛在的骨質(zhì)溶解區(qū)并經(jīng)常具有低骨質(zhì)密度(BMD)，特別是當(dāng)患者正接受雄性激素撤除治療時(shí)[Saad2006。最近，證實(shí)DKKl可充當(dāng)開關(guān)，由此DKKl的表達(dá)增強(qiáng)混合的成骨性的/溶骨性的前列腺腫瘤細(xì)胞系(C4-2B)的溶骨細(xì)胞特征。另外，DKKl的shRNA抑制作用抑制主要的溶骨性前列腺腫瘤細(xì)胞系(PC3)的溶骨活性[Ha112005[Hall2006。DKKl敲除也抑制腫瘤異種移植物的脛骨內(nèi)生長(zhǎng)，導(dǎo)致本發(fā)明人推測(cè)溶骨活性可能對(duì)建立轉(zhuǎn)移生境很重要，但隨后在前列腺轉(zhuǎn)移中DKKl的損失將腫瘤轉(zhuǎn)變?yōu)槌晒羌?xì)胞表現(xiàn)型。溶骨性前列腺腫瘤模式由[Kim2003的方法來改進(jìn)。將穩(wěn)定表達(dá)焚光素酶的溶骨性前列腺腫瘤細(xì)胞系(PC3M)的變體注入小鼠脛骨。肺瘤的生長(zhǎng)由熒光素酶來監(jiān)測(cè)，而骨中變化由微計(jì)算機(jī)處理X線斷層攝影術(shù)(micro-CT)和組織學(xué)來監(jiān)測(cè)?？笵KK1/4抗體傾向于抑制肺瘤生長(zhǎng)，而非促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。當(dāng)在任一研究中抑制作用都不顯著時(shí)，目前它在實(shí)施的5/5研究中一致發(fā)生，顯示3倍劑量的抗DKK1/4抗體對(duì)肺瘤生長(zhǎng)影響的代表性研究顯示于圖11中。具有皮下PC3M2AC6異種移植物的抗DKKl/4抗體處理的小鼠產(chǎn)生針對(duì)抑制作用的相似的非顯著性趨勢(shì)。>{1^(0.2百萬個(gè)細(xì)胞/動(dòng)物)后第5天開始處理。以20、60和200fig/小鼠/天的劑量，每天、一周3次地靜脈內(nèi)注射施用抗DKKl/4抗體持續(xù)兩周。以200ng/小鼠/天，每天、一周3次地靜脈內(nèi)注射施用對(duì)照IgG持續(xù)兩周。處理后計(jì)算最終功效數(shù)據(jù)和體重變化。使用該模式，我們發(fā)現(xiàn)抗DKK1/4抗體抑制腫瘤誘導(dǎo)的骨皮質(zhì)損傷。對(duì)骨小梁的影響，其造成隨后重塑的編織骨中的初始增加，因此引起表觀骨容量上的減少。新形成的編織骨和小梁對(duì)整體骨容量/小梁容量比率的相對(duì)影響因而不明顯。然而，抗DKKl/4抗體在腫瘤和虛擬移植的脛骨中增加骨的產(chǎn)生，并抑制或延緩伴隨重塑的骨容量的減少是明顯的。使用相同的腫瘤誘導(dǎo)的溶骨性模式，抗DKK1/4抗體顯示與唑來膦酸當(dāng)量的抗溶骨活性，參見圖12?？笵KKl/4抗體的骨代謝效果在20-200叫/小鼠的范圍內(nèi)是劑量應(yīng)答的，最低有效劑量在20至60jig/小鼠之間，參見圖13。綜合這些數(shù)據(jù)，提示抗DKK1/4抗體對(duì)腫瘤誘導(dǎo)的溶骨性疾病應(yīng)具有效果，但可能也對(duì)非腫瘤性骨疾病如骨質(zhì)疏松癥或增強(qiáng)骨折修復(fù)有效。實(shí)施例18:在腫瘤和虛擬移植的脛骨中抗DKKl/4抗體維持增加的骨密度為了評(píng)估小鼠藥效學(xué)標(biāo)記中的功效，分析了骨代謝的三種血清標(biāo)記骨鈣蛋白(OC)、護(hù)骨蛋白(OPG)以及核因子kB配體分泌型受體活化因子(sRANKL)。由于預(yù)期的抗體作用機(jī)理，使用這些成骨細(xì)胞標(biāo)記而非更典型的破骨細(xì)胞標(biāo)記。然而，在與正常動(dòng)物相對(duì)的患胂瘤的動(dòng)物中未檢測(cè)到一致的改變。如由micro-CT或IHC測(cè)定的，以任一這些標(biāo)記始終未觀測(cè)到骨丟失的相關(guān)性。待治療小鼠脛骨的MicroCT再建的典型實(shí)例顯示于圖12A中。皮質(zhì)損傷劃分成從0=無損傷至3=嚴(yán)重?fù)p傷。參見圖12B。由microCT分析來人工劃分腫瘤移植的脛骨中的皮質(zhì)損傷，其對(duì)于研究的組是未知的。在任一虛擬移植的脛中未觀測(cè)到皮質(zhì)損傷。方法12周齡的雌性棵鼠在左脛骨中用2xl05PC-3M2AC6細(xì)胞進(jìn)行脛骨內(nèi)移植并且在右脛骨中進(jìn)行虛擬注射。處理開始于移植后的第5天。以200ng/小鼠/天的劑量，每天、一周3次地靜脈內(nèi)注射施用NVP-抗-DKKlAJ抗體-NX(抗DKKl/4抗體)和IgG對(duì)照持續(xù)兩周。也每天、一周3次地靜脈內(nèi)注射施用載體(PBS)對(duì)照持續(xù)兩周。在腫瘤移植后的第7、14和18天采用ji-CTVivaCT40掃描儀(SCANCO，瑞士)來掃描動(dòng)物。如方法中描述地來分析小梁的骨密度(BV/TV)。星號(hào)(*)指載體和IgG對(duì)照在相同時(shí)間點(diǎn)上統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(11=12),p<0.05。在圖13中，為測(cè)定骨密度，脛骨的次級(jí)^質(zhì)骨(spongiosa)用基于吉姆薩染色劑的ZeissImagerZ.l和Axiovision軟件進(jìn)行作圖。讀數(shù)基于整個(gè)視野中鈣化骨的百分比。每個(gè)柱形代表規(guī)定數(shù)目動(dòng)物的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。在PBS、IgG和抗DKKl/4抗體處理組中，僅分析患腫瘤的動(dòng)物。右脛沒有虛擬注射而左脛?dòng)心[瘤。統(tǒng)計(jì)分析Dunnett試驗(yàn)單因素方差分析。左脛或右脛與PBS組中的對(duì)應(yīng)脛進(jìn)行比較，p<0.05*，p<0.01**，p>0.05無顯著差異。圖14顯示抗DKK1/4抗體的代謝骨功效是劑量依賴性的，最低有效劑量在20至60ng/小鼠3x/周之間。12周齡的雌性棵鼠在左脛骨中用2xl05PC-3M2AC6細(xì)胞進(jìn)行脛骨內(nèi)移植并且在右脛骨中進(jìn)行虛擬注射。治療開始于移植后的第6天。以20、60和200ng/小鼠/天的劑量，每天、一周3次地靜脈內(nèi)注射施用NVP-抗-DKK1/4抗體-NX(抗DKK1/4抗體)持續(xù)兩周。每天、一周3次地靜脈內(nèi)注射施用載體對(duì)照(PBS)持續(xù)兩周。在腫瘤移植后的第7和20天使用n-CTVivaCT40掃描儀(SCANCO，瑞士)來掃描動(dòng)物。如方法中描述地來分析小梁的骨密度(BV/TV)。*指包括栽體、IgG、僅鉆孔和正常動(dòng)物的所有對(duì)照在相同時(shí)間點(diǎn)上統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，p<0.05。實(shí)施例18:生物標(biāo)記情況DKK1生物標(biāo)記已描述DKK1的RNA表ii^漠式。Kr叩nik(1999)通過Northern印跡分析顯示在胎盤中的表達(dá)，在心臟、腦、肺、肝、骨骼肌或胰腺中未檢測(cè)到表達(dá)。Wirths(2003)顯示在肝、腎和乳腺中缺乏RNA表達(dá)，盡管在肝胚細(xì)胞(hepatoblasomas)瘤和Wilms腫瘤亞種中可見RNA表達(dá)。技術(shù)人員通過RNA原位雜交檢測(cè)的DKK1胃腸道表達(dá)顯示在不管是正常的或惡性的胃和結(jié)腸內(nèi)均未表達(dá)(Byun2006)。小鼠中RNA表達(dá)分析顯示骨中的高DKK1表達(dá)水平，胎兒和胎盤中的中等表達(dá)，以及褐色脂肪組織、胸腺和十二指腸中的微弱表達(dá)[Li2006]。使用應(yīng)用于當(dāng)前研究中的相同的山羊抗體在骨髓瘤樣本中評(píng)估DKK1蛋白質(zhì)表達(dá)(Tian，2003)。本文中，在具有低級(jí)形態(tài)學(xué)的患者的骨髓瘤細(xì)胞中可見表達(dá)，在五種對(duì)照受試者的骨髓活組織切片樣本中未檢測(cè)到DKK1蛋白質(zhì)表達(dá)。通過對(duì)一系列正常人類和猴子組織的篩選來進(jìn)行治療性抗體抗DKK1/4抗體的組織分布和物種間交叉反應(yīng)研究。評(píng)估全部的組織切片和組織微陣列。陽性對(duì)照包括在相同組織體系中評(píng)估的抗DKK1的市售抗體。DKK1—15(F1TC綴合的抗DKK1/4抗體)和DKK1—8(FITC綴合的山羊抗DKK1，R&DSystems,#AF1096，lotsGBL013101和GBL14111)。其他生物標(biāo)記由于4艮少了解關(guān)于DKK1的病理生理作用，相當(dāng)大的努力正在并已經(jīng)集中于通過生物標(biāo)記研究來構(gòu)建關(guān)于抗DKK1/4抗體的體內(nèi)效果的知識(shí)基礎(chǔ)，以及如何利用和進(jìn)一步發(fā)展這一知識(shí)基礎(chǔ)。關(guān)注的重點(diǎn)領(lǐng)域包括1)在正常的和轉(zhuǎn)移性的骨代謝中通過測(cè)定破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞活性的循環(huán)標(biāo)i己來理解抗DKK1/4抗體的效果。2)在多發(fā)性骨髓瘤和其他胂瘤中用以確定和擴(kuò)大靶標(biāo)指示的DKK1的可比較的表達(dá)水平。3)在重要組織如結(jié)腸、骨髓、肺、皮膚和乳腺中用以評(píng)估p聯(lián)蛋白活性的基因表達(dá)水平上的效果。初步的分子流行病學(xué)研究已證實(shí)在患有多發(fā)性骨髓瘤的患者中具有增加的DKK1血清水平并在該跡象中支持POC?；诂F(xiàn)有知識(shí)，表18為抗DKK1/4抗體提供建議的潛在生物標(biāo)記。表18.針對(duì)DKK1和DKK4乾標(biāo)的生物標(biāo)記物<table>tableseeoriginaldocumentpage135</column></row><table>實(shí)施例19:抗DKK1抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的4J^酸序列抗DKK1抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的^J^g列全部提供于表19中，其中抗體的CDR區(qū)顯示于表5、6、11A和11B中。表19.抗DKK1抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:2-39)MOR04454VH-.(SEQie)NOs2)skntlylqmnslraedtavyycardgshmdkppgyvfafwgqgtlvtvssmor04454vl:(seq.idno:21)isslq'pedfatyyclqyygmpptfgggtkveikrtmor04455vh:(seqidno:3)skntijy:lqmns:lraedtavyycarhymdhwgqgtlvtvssMOR04455VL:(SEQIDNO:'22〉<table>tableseeoriginaldocumentpage137</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage138</column></row><table>將表19中的可變區(qū)的CDR和FR片段排列于針對(duì)重鏈(SEQIDNO:2國(guó)20;VH3是SEQIDNO:125，VH5是SEQIDNO:126)的表20A、針對(duì)k輕鏈(SEQIDNO:21、22、23、27、28和29;VKl是SEQIDNO:127并且VK3是SEQIDNO:128)的表20B以及針對(duì)X輕鏈(SEQIDNO:24、25、30、31、32、33、34、35、36和37;VL2是SEQIDNO:129并且VL1是SEQIDNO:130)的表20C中。<table>tableseeoriginaldocumentpage139</column></row><table>表20B.抗DKK1抗體k輕鏈可變區(qū)^J^酸序列的比對(duì)(SEQIDNO:24-25、30-37、129-130)VLVLtoppasequ印c的DKK1binders<image>imageseeoriginaldocumentpage140</image><table>tableseeoriginaldocumentpage141</column></row><table>共有CDR序列至少提供于SEQIDNO:40-48和表11B中。其他的一共有CDR序列可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用標(biāo)準(zhǔn)方法和本文提供的方法從表20A-20C的比對(duì)中確定。等同方案從上述本發(fā)明具體實(shí)施方案的詳細(xì)說明，顯而易見的是已對(duì)新抗體及其免疫學(xué)的片段進(jìn)行了描述。盡管本文已詳細(xì)公開了具體的實(shí)施方案，也要經(jīng)由僅僅示例性的實(shí)施例來完成該描述。特別地，本發(fā)明人預(yù)期可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行多種替換、更改和修飾，而不背離本發(fā)明的精神或范圍。權(quán)利要求1.組合物，其含有特異性結(jié)合DKK1多肽(SEQIDNO1)和/或DKK4多肽(SEQIDNO122)表位的抗原結(jié)合區(qū)，其中所述抗體或其功能片段結(jié)合DKK1或DKK4或其兩者的至少一個(gè)表位。2.權(quán)利要求l的抗體，其中在選自如下的至少一種試驗(yàn)中測(cè)定所述抗體與DKK1或DKK4的結(jié)合Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)錄的拮抗作用；基于電化學(xué)發(fā)光的結(jié)合分析；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的結(jié)合；FMAT;SET;SPR;骨鉀蛋白(OCN)血清濃度；護(hù)骨蛋白(OPG)血清濃度；前膠原1型含氮前肽(P1NP)血清濃度，ALP產(chǎn)物；TopFlash或骨質(zhì)溶解的改善。3.選自SEQIDNO:2-20和SEQIDNO:40-72的分離的^J^酸序列和其保守的或人改造的變體。4.權(quán)利要求3的分離的M酸序列，和其保守的或人改造的變體，其中所述M酸序列選自a)SEQIDNO:2-20、65-72;每個(gè)都包含含有H-CDR3區(qū)的抗原結(jié)合區(qū)；b)SEQIDNO:2-20、57-64;每個(gè)都包含H-CDR2區(qū)；c)包含序列GISGSGSYTYYADSVKF的SEQIDNO:40，包含序列GISYYGGNTYYADSVKF的SEQIDNO:41，和包含序列GISYYGGSTYYADSVKF的SEQIDNO:42;每個(gè)都包含共有序列H國(guó)CDR2區(qū)；d)SEQIDNO:2-5、8-11、20、49-56;上述每個(gè)都包含H-CDR1區(qū);和e)具有氨基酸序列GFTFSSYGMT的SEQIDNO:43,具有氬基酸序列GFTFNSYGMT的SEQIDNO:44，具有氨基餅列GFTFSNYGMT的SEQIDNO:45，具有^J^醋列GFTFSSYWMT的SEQIDNO:46,具有"tjw酸序列GFTFSSYAMTF的SEQIDNO:47，和具有^J^酸序列GFTFSSYGMS的SEQIDNO:48;每個(gè)都包含共有序列H-CDR1區(qū)；或f)SEQIDNO:21-39和73-88。5.權(quán)利要求4的分離的抗原結(jié)合區(qū)，其中選自SEQIDNO:21-39的氨基酸序列的均包含L-CDR3區(qū)，選自SEQIDNO:21-39、73-80的氨基酸序列的均包含L-CDR1區(qū)，選自SEQIDNO:21-39、81-88的^Jl,列的均包含L-CDR2區(qū)，選自SEQIDNO:21-39的^i^,列的均包含輕鏈的可變區(qū)。6.選自SEQIDNO:97-103的分離的核普酸序列。7.權(quán)利要求6的核苷酸序列編碼的分離的氨基酸序列，以及所述氨基^列的保守的或人改造的變體，其中a)每個(gè)SEQIDNO:97-100均編碼抗原結(jié)合輕鏈；和b)每個(gè)SEQIDNO:101-103均編碼抗原結(jié)合重鏈。8.權(quán)利要求6的分離的核苷^列，其中所述核苷i^f列進(jìn)一步進(jìn)行了用于表達(dá)和/或臨床用途的優(yōu)化。9.選自SEQIDNO:104-110的分離的核苷斷列。10.權(quán)利要求9的核苷#列編碼的分離的#^^列，以及所述M^列的保守的或人改造的變體，其中a)每個(gè)SEQIDNO:104-107均編碼抗原結(jié)合輕鏈；和b)每個(gè)SEQIDNO:108-110均編碼抗原結(jié)合重鏈。11.權(quán)利要求9的分離的核苷^列，其中所述核苷*列進(jìn)行了用于表達(dá)和/或臨床用途的優(yōu)化。12.選自111-117的分離的氨基酸序列，及其保守的或人改造的變體，其中a)每個(gè)SEQIDNO:111-114均編碼抗原結(jié)合輕鏈；和b)每個(gè)SEQIDNO:115-117均編碼抗原結(jié)合重鏈。13.權(quán)利要求12的分離的4JJ^列，其中所述M^列進(jìn)行了用于表達(dá)和/或臨床用途的優(yōu)化。14，選自SEQIDNO:120-121的分離的核苷財(cái)列。15.權(quán)利要求14的核苷酸序列編碼的分離的M酸序列，以及所述氨基,列的保守的或人改造的變體，其中a)SEQIDNO:120編碼輕鏈的抗原結(jié)合可變區(qū)；和b)SEQIDNO:121編碼重鏈的抗原結(jié)合可變區(qū)。16.權(quán)利要求14的分離的核苷*列，其中所述核苷^列進(jìn)行了用于表達(dá)和/或臨床用途的優(yōu)化。17.分離的抗原結(jié)合區(qū)，其包含選自SEQIDNO:120的核苦酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)，和選自SEQIDNO:121的核苦酸序列編碼的重鏈可變區(qū)。18.選自118-119的分離的氨基酸序列，及其保守的或人改造的變體。19.權(quán)利要求18的分離的^J^斷列，其中SEQIDNO:118為輕鏈的抗原結(jié)合可變區(qū)。20.權(quán)利要求18的分離的^J^,列，其中SEQIDNO:119為重鏈的抗原結(jié)合可變區(qū)。21.權(quán)利要求18的分離的JL&i^列，其中所述^^列進(jìn)行了用于表達(dá)和/或臨床用途的優(yōu)化。22.分離的氨基酸序列，其與選自SEQIDNO:2-121所示區(qū)域的至少一個(gè)CDR區(qū)具有至少95%同一性。23.分離的氨基酸序列，其具有表11A和11B所示CDR區(qū)的共有序列。24.權(quán)利要求l的分離的抗體，其含有選自IgM和IgG的支架，其中IgG選自IgGl、IgG2和IgG3或IgG4'25.權(quán)利要求24的分離抗體，其中IgM或IgG選自多克隆的或單克隆的。26.分離的抗體或其功能片段，其包含DKK1表位特異性的抗原結(jié)合區(qū)，其中抗體或其功能片段結(jié)合DKK1或DKK4，并預(yù)防或改善DKK1相關(guān)疾病或DKK4相關(guān)疾病的t艮。27.權(quán)利要求26的抗體或其功能片段的分離的抗原結(jié)合區(qū)。28.分離的抗體或其功能片段，其含有靶標(biāo)DKK1或DKK4或其兩者表位特異性的抗原結(jié)合區(qū)，其中所述表位包括靶標(biāo)DKK1或DKK4的CYS2結(jié)構(gòu)域的至少六個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基。29.上述權(quán)利要求l-28中任一項(xiàng)的分離的抗體或功能片段，其選自完整免疫球蛋白或其Fab片段或scFv抗體片段、重鏈抗體和非免疫球蛋白支架上的抗原結(jié)合區(qū)。30.權(quán)利要求29的分離的抗體或其功能片段，其中表位是構(gòu)象性表位。31.藥物組合物，其包含至少一種權(quán)利要求29的抗體或功能片段，以及可藥用載體或賦形劑。32.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其攜帶編碼權(quán)利要求29的抗體或其功能片段的基因。33.治療與DKK1或DKK4的存在相關(guān)的障礙或病癥的方法，其包括對(duì)所需患者施用有效量的權(quán)利要求31的藥物組合物。34.權(quán)利要求33的方法，其中障礙和病癥選自骨質(zhì)溶解性損傷，特別是與骨髄瘤相關(guān)的骨質(zhì)溶解性損傷，特別是與多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)的骨質(zhì)溶解性損傷；或與骨癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、黑素瘤、肝細(xì)胞癌、上皮癌、食道癌、腦癌、肺癌、前列腺癌或胰腺癌或其轉(zhuǎn)移瘤相關(guān)的骨質(zhì)溶解性損傷；與移植相關(guān)的骨丟失；或骨肉瘤、前列腺癌、肝細(xì)胞癌(HCC)、包括多發(fā)性骨髓瘤的骨髓瘤、糖尿病、肥胖癥、肌萎縮、阿爾茨海默病、骨質(zhì)疏+>癥、骨質(zhì)減少、風(fēng)濕病、結(jié)腸炎和/或不希望的脫發(fā)。35.權(quán)利要求33的方法，其中所述方法還包括施用第二治療物質(zhì)。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述化療劑是唑來膦酸。37.權(quán)利要求35的藥物組合物，其中另外的治療物質(zhì)選自抗癌物質(zhì)、抗新陳代謝物質(zhì)、抗糖尿病物質(zhì)、抗骨質(zhì)疏術(shù)>物質(zhì)、抗生素、抗炎物質(zhì)、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子。38.分離的抗體，其含有第一M醋列，其為選自SEQIDNO:2-20的重鏈，和其CDR區(qū)與SEQIDNO:2-20中所示CDR區(qū)具有至少95%序列同一性的序列，以及第二M酸序列，其為選自SEQIDNO:21-39的輕鏈，和其CDR區(qū)與SEQIDNO:21-39中所示的CDR區(qū)具有至少95%序列同一性的序列。39.免疫連接物，其含有第一成分，該成分是上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體或其片段。40.試劑盒，其含有上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗體或其片段。41.權(quán)利要求40的試劑盒，其還含有可藥用載體或賦形劑。42.權(quán)利要求40的試劑盒，其中抗體以單位劑量存在。43.權(quán)利要求40的試劑盒，其還含有對(duì)受試者施用的說明書。44.組合物，其含有中和抗DKKl/4抗體。45.權(quán)利要求0的抗體，其中所述抗體以小于100nM、50nM、10nM、1.0nM、500pM或100pM的K。n結(jié)合DKK1;并且具有小于102每秒、10-3每秒、IO"每秒或10-5每秒的DKK1解離率。46.權(quán)利要求0的抗體，其中所述抗體與DKK1或DKK4的親和力比其與DKK2或DKK3的高102-106倍。47.權(quán)利要求0的抗體，其所述抗體與中和抗DKK1/4竟?fàn)幮越Y(jié)合DKK1或DKK4。48.以組合物治療疾病的方法，所述組合物含有至少一種SEQIDNO:118的多肽序列和SEQIDNO:119的多肽序列，或其保守的或人改造的改變；其中所述組合物是中和抗DKK1/DKK4抗體。49.在哺乳動(dòng)物特別是人類中用藥物組合預(yù)防或治療增殖性疾病或疾病如癌癥的方法，其中所述藥物組合包含(a)中和抗DKK1M組合物；和(b)—種或多種藥用活性物質(zhì)。本發(fā)明另外涉及藥物組合物，其包含(a)中和抗DKKl/4組合物；(b)藥用活性物質(zhì)；和(c)可藥用栽體。本發(fā)明另外涉及商業(yè)包裝或產(chǎn)品，其包含:(a)中和抗DKKl/4組合物的藥物制劑；和(b)用于同時(shí)、并列、分別或依次使用藥用活性物質(zhì)的藥物制劑。50.權(quán)利要求49的方法，其中藥用活性物質(zhì)特別指不同于中和抗DKK1/4組合物或其衍生物的任意藥用活性物質(zhì)，其中所述物質(zhì)選自i.芳化酶抑制劑；ii.抗雌激素、抗雄激素或促性激素釋放素激動(dòng)劑；iii.拓樸異構(gòu)酶I抑制劑或拓樸異構(gòu)酶II抑制劑；iv.微管活性劑、烷化劑、抗肺瘤的抗代謝物或鉑化合物；v.靶向/減少蛋白質(zhì)或脂質(zhì)激酶活性，或蛋白質(zhì)或脂質(zhì)磷酸酶活性的化合物，其他抗血管生成的化合物或誘導(dǎo)細(xì)胞分化過程的化合物；vi.單克隆抗體；vii.環(huán)加氧酶抑制劑、二磷酸鹽、類肝素酶抑制劑、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑；viii.Ras致瘤同種型的抑制劑；ix.端粒末端轉(zhuǎn)移酶抑制劑；x.蛋白酶抑制劑、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、甲硫氨酸氨肽酶抑制劑或蛋白酶體抑制劑；xi.用于治療血液性惡性腫瘤的物質(zhì)，或靶向、降低或抑制Flt-3活性的化合物；xii.HSP90抑制劑；xiii.抗增殖抗體；xiv.組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑；xv.耙向、降低或抑制絲氨^/蘇氨酸mTOR激酶的活性/功能的化合物；生長(zhǎng)素抑制素受體拮抗劑；xvii.抗白血病的化合物；xviii.肺瘤細(xì)胞損傷方式；xix.EDG結(jié)合劑；xx.核苷酸還原酶抑制劑；　xxi.S-腺苷曱硫氨酸脫羧酶抑制劑；xxii.VEGF或VEGFR的單克隆抗體；xxiii.光動(dòng)力學(xué)治療；xxiv.血管穩(wěn)定類固醇；xxv，包含皮質(zhì)類固醇的植入物；xxvi.ATI受體拮抗劑；和xxvii.ACE抑制劑。51.抗體，其以10-s或更小的親和力(KD)結(jié)合DKKl，并與權(quán)利要求1中的任意抗體竟?fàn)帯?2.權(quán)利要求51的抗體，其與DKK2或DKK3無可檢測(cè)的結(jié)合。53.權(quán)利要求52的抗體，其中所述抗體以l(T3或更高的(KD)結(jié)合DKK1或DKK4。全文摘要本發(fā)明提供結(jié)合到蛋白質(zhì)靶標(biāo)Dickkopf(DKK1)的抗體和片段，也提供了處理靶標(biāo)細(xì)胞(特別是與骨質(zhì)溶解性病癥相關(guān)的細(xì)胞)的使用方法和試劑盒。文檔編號(hào)A61P19/08GK101400406SQ200780009135公開日2009年4月1日申請(qǐng)日期2007年1月12日優(yōu)先權(quán)日2006年1月13日發(fā)明者F·從,J·舒洛克,M·東佐,M·巴德羅夫,M·費(fèi)什曼,S·厄林格,S·埃滕伯格申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司