專利名稱：抗IgA1抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單克隆抗體或該抗體片段，其特異性識別并結(jié)合由免疫球蛋白Al的重鏈基因編碼的多肽的鉸鏈區(qū)，所述鉸鏈區(qū)包含未結(jié)合半乳糖的絲氨酸蘇氨酸連接型糖鏈；并且涉及產(chǎn)生該抗體的雜交瘤、編碼該抗體的DNA、含有該DNA的載體、對該載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化而得到的轉(zhuǎn)化體、使用該雜交瘤或轉(zhuǎn)化體的抗體或該抗體片段的制造方法、使用該抗體或抗體片段的診斷劑以及含有該抗體或抗體片段作為有效成分的治療劑。
背景技術(shù)：
近年來，報道了如下實(shí)例伴隨著各種疾病的發(fā)病和病情的發(fā)展，附加在與該疾病和病情相關(guān)的細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)上的糖鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。該實(shí)例中，具有代表性的是在超過80%的人類癌癥種類中觀察到表達(dá)的、作為O連接型(絲氨酸蘇氨酸型)糖鏈抗原之一的Tn抗原(湯姆森(Thomsen)抗原、CD 175抗原)和在該Tn抗原上附加有涎酸的涎酸化Tn抗原(CD175s抗原)的表達(dá)(非專利文獻(xiàn)2)。已知這些糖鏈抗原在正常細(xì)胞中幾乎觀察不到表達(dá)，并且正在進(jìn)行將其作為癌特異性疫苗療法的靶分子應(yīng)用于醫(yī)療的研究(非專利文獻(xiàn)I)。這些癌特異性糖鏈抗原的表達(dá)通過生物體內(nèi)存在的構(gòu)成復(fù)雜的糖鏈生物合成途徑和糖鏈代謝途徑的酶活性來進(jìn)行調(diào)控。作為其中一例，已知如下例子在癌細(xì)胞中，編碼參與糖鏈生物合成途徑的蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)方式發(fā)生變化，結(jié)果，糖鏈生物合成途徑在中途被阻斷；等。Tn抗原作為正常細(xì)胞中的O連接型糖鏈的生物合成途徑的中間產(chǎn)物而已知，其具有在蛋白質(zhì)氨基酸序列中的特定的絲氨酸(Ser)殘基或蘇氨酸(Thr)殘基的側(cè)鏈中存在的羥基上具有α連接的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的結(jié)構(gòu)(GalNAc a-Ser/Thr)。利用核心I β 3半乳糖轉(zhuǎn)移酶(corel β 3Gal_T, T-合成酶)的活性在該Tn抗原的非還原末端側(cè)附加一分子半乳糖，由此進(jìn)行TF抗原(湯姆森-弗里登雷克(Thomsen-Friedenreich)抗原、CD176抗原)等正常型O連接型糖鏈的生物合成。認(rèn)為在多種癌細(xì)胞系中，細(xì)胞內(nèi)的核心I β 3半乳糖轉(zhuǎn)移酶的活性降低，結(jié)果，糖鏈的生物合成途徑被阻斷，從而表達(dá)Tn抗原或涎酸化Tn抗原。癌細(xì)胞內(nèi)核心I β 3半乳糖轉(zhuǎn)移酶的活性降低的機(jī)制較復(fù)雜，直到目前也沒有完全弄清楚。但是，作為其機(jī)制之一，推測為如下機(jī)制編碼核心I β 3半乳糖轉(zhuǎn)移酶的活性表達(dá)所需的特定的伴侶蛋白(Cosmc)的基因發(fā)生了突變，結(jié)果，細(xì)胞內(nèi)的核心1β3半乳糖轉(zhuǎn)移酶活性大幅度降低(非專利文獻(xiàn)6)。由于在多個癌癥種類中共同地觀察到Tn抗原的表達(dá)，因此認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)的糖鏈生物合成途徑和糖鏈代謝途徑中的異常是使附加在該細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的大量不同糖蛋白質(zhì)上的糖鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)生共同變化的主要原因。已知糖鏈結(jié)構(gòu)的變化與病情的發(fā)展密切相關(guān)的代表性的疾病為癌癥。此外，除了癌癥以外，作為已知糖鏈結(jié)構(gòu)的變化與病情的發(fā)展密切相關(guān)的疾病，已知有IgA腎病。IgA腎病是以作為免疫球蛋白之一的免疫球蛋白A(IgA)顆粒狀沉積在腎小球的系膜區(qū)的病理 所見為特征的慢性腎小球腎炎，于1968年由Berger首次報道(非專利文獻(xiàn)2)。該疾病是在日本國內(nèi)的慢性腎小球腎炎患者中約占半數(shù)的代表性的腎炎。據(jù)稱約四成被診斷為IgA腎病的患者在隨后20年以內(nèi)發(fā)展成晚期腎衰竭，因而不得不進(jìn)行人工透析或腎移植。由此可見，雖然IgA腎病普遍被認(rèn)為是預(yù)后不良的疾病，但在臨床上尚未建立有效性得到證明的治療方法。在IgA腎病的患者體內(nèi)，已知兩種IgA同種型(IgAl和IgA2)中主要是IgAl沉積于腎臟。此外，作為該沉積的原因之一，有如下報道人IgAl分子中特異性存在的、附加于鉸鏈區(qū)的O連接型糖鏈的結(jié)構(gòu)從正常型變成Tn抗原或涎酸化Tn抗原(非專利文獻(xiàn)3、非專利文獻(xiàn)4)。已證明，當(dāng)附加于IgAl鉸鏈區(qū)的O連接型糖鏈缺失半乳糖而變成Tn抗原或涎酸化Tn抗原時，IgAl分子的自身凝集能力亢進(jìn)，與特異性識別該糖鏈缺陷型IgAl的自身抗體結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，并且，形成凝集體或免疫復(fù)合物后的IgAl分子避開通常的循環(huán)血液中的清除機(jī)制而沉積在腎系膜區(qū)(非專利文獻(xiàn)5)。進(jìn)而報道了 在從IgA腎病患者分離出的產(chǎn)生IgA的細(xì)胞中，因Cosmc的表達(dá)量降低而導(dǎo)致核心I β 3半乳糖轉(zhuǎn)移酶活性降低(非專利文獻(xiàn)6)。即，在IgA腎病患者體內(nèi)的產(chǎn)生IgA的細(xì)胞中，糖鏈生物合成途徑在中途被阻斷，結(jié)果，不能產(chǎn)生具有正常型糖鏈的IgAl，取而代之，產(chǎn)生糖鏈缺陷型IgAl。作為IgA腎病的發(fā)病機(jī)制之一，提出了如下機(jī)制包含該糖鏈缺陷型IgAl的復(fù)合物沉積在腎小球上，結(jié)果引發(fā)腎組織的炎癥。一般而言，IgA由血液中或組織內(nèi)的B細(xì)胞或由B細(xì)胞分化成的漿細(xì)胞產(chǎn)生。已知漿細(xì)胞是B細(xì)胞分化的最終階段，分布于次級淋巴組織、全身的粘膜組織、骨髓等中并產(chǎn)生大量的抗體，而產(chǎn)生IgA的漿細(xì)胞主要分布于粘膜組織。另一方面還已知，在次級淋巴組織的生發(fā)中心，由獲得高親和性IgA抗體產(chǎn)生能力的B細(xì)胞克隆分化出記憶B細(xì)胞或漿細(xì)胞，并分布于全身的靶器官而長期持續(xù)地產(chǎn)生抗體。但尚未明確產(chǎn)生與IgA腎病的發(fā)病相關(guān)的糖鏈缺陷型IgA的細(xì)胞在B細(xì)胞分化過程的哪個階段中產(chǎn)生以及產(chǎn)生糖鏈缺陷IgA的B細(xì)胞或漿細(xì)胞分布于體內(nèi)的何種組織。已知約半數(shù)的IgA腎病患者的血中IgA值升高(非專利文獻(xiàn)7)。而且已知，作為在IgA腎病患者中共同觀察到的現(xiàn)象，在末梢血或尿液等體液以及腎小球中檢測到一般在健康人中觀察不到的糖鏈缺陷型IgAl (非專利文獻(xiàn)8)。如上所述，該糖鏈缺陷型IgAl即半乳糖缺失型IgAl是促進(jìn)IgA腎病的病情發(fā)展的因素，但近年來查明，在除IgA腎病以外的幾種人類疾病例如作為過敏性疾病的過敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、作為自身免疫疾病的系統(tǒng)性紅斑狼瘡或作為癌癥的IgAl型骨髓瘤的一部分疾病中，該糖鏈缺陷型IgAl的出現(xiàn)和在腎臟的蓄積也導(dǎo)致腎功能的降低(非專利文獻(xiàn)8)。基于上述背景，糖鏈缺陷型IgAl作為以IgA腎病為代表的特定的人類疾病的生物標(biāo)志物例如診斷生物標(biāo)志物、預(yù)測生物標(biāo)志物或藥效動力學(xué)生物標(biāo)志物正逐漸被人們所認(rèn)識。人IgAl的鉸鏈區(qū)很難以IgAl重鏈多肽的氨基酸序列號的形式來嚴(yán)格地定義。一般是指構(gòu)成IgAl分子的重鏈多肽中位于CHl結(jié)構(gòu)域與CH2結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)域。在構(gòu)成普通的分泌型人IgAl分子的重鏈多肽(序列號2)中，多指從N末端起第223位的脯氨酸開始至第240位的絲氨酸或第241位的半胱氨酸為止的區(qū)域。該區(qū)域也稱為IgAl鉸鏈區(qū)核心肽。在迄今為止的研究中，已鑒定出該區(qū)域中附加有O連接型糖鏈的氨基酸殘基，已知有 第225位的蘇氨酸、第228位的蘇氨酸、第230位的絲氨酸、第232位的絲氨酸、第236位的蘇氨酸共五處。另外，已知N連接型糖鏈不與鉸鏈區(qū)結(jié)合，而與構(gòu)成IgAl分子的重鏈多肽中第263位的天冬酰胺和第459位的天冬酰胺結(jié)合。作為現(xiàn)行的IgA腎病確診法的腎活檢(活組織檢查)是給患者帶來精神上的痛苦、腎周圍出血的風(fēng)險以及住院數(shù)天所產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的方法。到目前為止，已研究了幾種以直接檢測糖鏈缺陷型IgAl并進(jìn)行分析為目的的實(shí)驗(yàn)方法。使用識別并結(jié)合Tn型糖鏈或涎酸化Tn型糖鏈的凝集素例如長柔毛野豌豆(Vicia villosa)來源的凝集素、大果瓦泰豆(Vatairea macrocarpa)來源的凝集素、大豆來源的凝集素、散大蝸牛(Helix aspersa)來源的凝集素或樹錦雞兒(Caragana arborescens)來源的凝集素等的ELISA法或蛋白免疫印跡法等免疫學(xué)方法是簡易的方法之一(非專利文獻(xiàn)9)，但由于這些凝集素具有僅識別糖鏈結(jié)構(gòu)并與其并結(jié)合的性質(zhì)，因此，存在與人來源試樣等樣品中含有的、IgAl以外的具有O連接型糖鏈的糖蛋白(粘蛋白類、補(bǔ)體Cl抑制物等)也非選擇性地進(jìn)行結(jié)合的問題。另外，使用抗Tn單克隆抗體例如MLS128、22-1-1、HBTnl或Briclll等的ELISA或免疫蛋白印跡等免疫學(xué)方法也是簡易的方法之一，但與上述凝集素法同樣地存在特異性低的問題(非專利文獻(xiàn)10)。另一方面，將利用聚糖酶或肽酶等各種酶對從人來源試樣等樣品中純化提取出的IgAl進(jìn)行處理而得到的糖鏈和糖肽的混合物通過基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS)等進(jìn)行分析的方法具有特異性和檢測靈敏度較高的優(yōu)點(diǎn)(非專利文獻(xiàn)11)。但是，該方法需要蛋白質(zhì)的純化、酶處理、裝置分析的工序，因而難以稱其為簡易，而且存在定量性差的問題。由此可見，尚未獲知能夠特異性地、簡易且定量性地檢測或測定人來源試樣等樣品中含有的糖鏈缺陷IgAl的方法。另外，雖然認(rèn)為上述產(chǎn)生糖鏈缺陷型IgAl的細(xì)胞在其細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表面表達(dá)或蓄積糖鏈缺陷型IgAl，但尚未獲知能夠特異 性地且簡易地檢測這種細(xì)胞的方法。比企等人的方法(專利文獻(xiàn)I)中，首先，在固定有識別作為正常型O連接型糖鏈的TF抗原(湯姆森-弗里登雷克(Thomsen-Friedenreich)抗原、⑶176抗原)的植物凝集素木菠蘿凝集素的ELISA板上捕獲正常型IgAl，制作ELISA板。接著，從患者來源的試樣中純化出IgAl，將其用生物素等標(biāo)記后添加到該ELISA板上，利用與預(yù)先捕獲在板上的正常型IgAl的自身凝集反應(yīng)而使糖鏈缺陷型IgAl結(jié)合到板上。該方法的問題在于定量性差。這是因?yàn)?，尚未明確IgAl鉸鏈區(qū)的糖鏈缺陷的程度與自身凝集性的強(qiáng)度之間的相關(guān)性，而且不能排除由標(biāo)記引起的患者來源的IgAl的變性給凝集性帶來的影響。另外，由于需要從試樣中純化出IgAl，因此，不得不說是在簡易性方面也存在問題的方法。成田等人的方法(專利文獻(xiàn)2)無需對患者來源的IgAl進(jìn)行純化分離，因此是比上述方法更簡易的方法。該方法為如下方法制作固定有鏈球菌來源的IgA結(jié)合肽SAP的ELISA板，向該板上添加患者來源的試樣，從而將IgA捕獲到板上；然后，添加識別N-乙酰半乳糖胺的植物凝集素(長柔毛野豌豆B4凝集素；VVL)的標(biāo)記物，由此檢測糖鏈缺陷型IgAl0但是，VVL除了與絲氨酸/蘇氨酸上α連接的N-乙酰半乳糖胺結(jié)合以外，還與N連接型糖鏈中含有的半乳糖的非還原末端上β連接的N-乙酰半乳糖胺結(jié)合，因此，該成田等人的方法不是特異性檢測IgAl鉸鏈區(qū)的O連接型糖鏈的結(jié)構(gòu)變化的方法。比企等人的另一方法(專利文獻(xiàn)3)為如下方法使患者來源的血清在填充有木菠蘿凝集素瓊脂糖的層析柱上通過而分離出IgAl，然后將該IgAl固定在ELISA板上，接著，向該ELISA板上添加針對具有IgAl鉸鏈區(qū)的氨基酸序列的合成肽(PVPSTPPTPSPSTPPTPSPS)的兔來源多克隆抗體，最后，使用標(biāo)記的抗兔IgG抗體進(jìn)行檢測。該方法是對患者來源的血清中含有的、完全缺失鉸鏈區(qū)的O型糖鏈的IgAl進(jìn)行檢測的方法，而不是對鉸鏈區(qū)具有Tn型糖鏈的糖鏈缺陷型IgAl進(jìn)行特異性檢測的方法。另外，由于IgAl的純化中使用作為TF抗原特異性凝集素的木菠蘿凝集素，因此，使患者血清中含有的糖鏈缺陷型IgAl的回收不完全。
雖然不是直接檢測糖鏈缺陷型IgAl的方法，但也進(jìn)行了嘗試?yán)肊LISA法分析患者來源的試樣來診斷IgA腎病的研究。日本專利第4197393號中記載的方法為如下方法制作固定有將具有IgAl鉸鏈區(qū)的氨基酸序列的合成肽(PVPSTPPTPSPSTPPTPSPSC)與牛血清白蛋白連接而制成的蛋白質(zhì)的ELISA板,并向該ELISA板上添加患者來源的試樣。該方法中，通過將與IgAl鉸鏈區(qū)特異性結(jié)合的自身抗體(IgG型)捕獲到板上并最后添加抗人IgG抗體的標(biāo)記物，能夠檢測該自身抗體。但是，該方法中，僅能檢測不與鉸鏈區(qū)具有Tn型糖鏈的IgAl結(jié)合而與完全缺失鉸鏈區(qū)的O型糖鏈的IgAl結(jié)合的IgG型自身抗體。作為特異性識別IgAl的單克隆抗體，報道了 通過對小鼠進(jìn)行人IgAl重鏈蛋白質(zhì)免疫而得到的B3506B4抗體或者通過對小鼠進(jìn)行人母乳來源的IgAl免疫而得到的3C10抗體等(非專利文獻(xiàn)12)。B3506B4抗體或3C10抗體對正常糖鏈型IgAl也具有親和性。到目前為止，尚未獲 知特異性識別包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl分子的抗體。普遍已知在對人施用非人抗體例如小鼠抗體等時，其作為異物而被識別，由此在人體內(nèi)誘導(dǎo)出抗小鼠抗體的人抗體(人抗小鼠抗體，Human Anti Mouse Antibody ;HAMA)。已知HAMA與所施用的小鼠抗體反應(yīng)而引起副作用(非專利文獻(xiàn)13 16)，或者，加快小鼠抗體在體內(nèi)的消失(非專利文獻(xiàn)17 19)，降低小鼠抗體的治療效果(非專利文獻(xiàn)20、21)。為了解決上述問題，正在嘗試?yán)没蛑亟M技術(shù)由非人抗體制作人嵌合抗體和人源化抗體。人源化抗體與小鼠抗體等非人抗體相比，在對人進(jìn)行施用的方面具有多個優(yōu)點(diǎn)。例如，據(jù)報道，在使用猴進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，與小鼠抗體相比，其免疫原性降低，血中半衰期延長(非專利文獻(xiàn)22、非專利文獻(xiàn)23)。即，人源化抗體與非人抗體相比，對人產(chǎn)生的副作用少，并可以期待其治療效果長期持續(xù)。另外，由于人源化抗體利用基因重組技術(shù)來制作，因此，能夠制作成多種形式的分子。例如，使用YI亞類作為人抗體的重鏈(以下記為H鏈)恒定區(qū)(以下記為C區(qū))(將H鏈C區(qū)記為CH)時，能夠制作抗體依賴性細(xì)胞毒活性(以下記為ADCC活性)等效應(yīng)功能高的人源化抗體(非專利文獻(xiàn)24)，并且，可以期待其血中半衰期比小鼠抗體延長(非專利文獻(xiàn)25)。特別是在將細(xì)胞表面上表達(dá)Tn抗原型IgAl的產(chǎn)生Tn抗原型IgAl的細(xì)胞從人體內(nèi)除去的治療中，為了通過抗體使效應(yīng)細(xì)胞蓄積在靶細(xì)胞的附近而對靶細(xì)胞進(jìn)行特異性殺傷，抗體的Fe段(抗體重鏈的鉸鏈區(qū)以后的區(qū)域)介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒活性(以下記為CDC活性)或ADCC活性等細(xì)胞毒活性是很重要的。在人的治療中，為了發(fā)揮細(xì)胞毒活性，優(yōu)選使用人嵌合抗體、人源化抗體或人源化抗體(非專利文獻(xiàn)26、27)。而且，隨著近來蛋白質(zhì)工程、基因工程的進(jìn)步，人源化抗體也可以制作成Fab、Fab’、F(ab’)2、單鏈抗體(以下記為scFv)(非專利文獻(xiàn)28)、二聚體化V區(qū)片段(以下記為雙價抗體(Diabody))(非專利文獻(xiàn)29)、二硫鍵穩(wěn)定的V區(qū)片段(以下記為dsFv)(非專利文獻(xiàn)30)、包含⑶R的肽(非專利文獻(xiàn)31)等小分子量的抗體片段，這些抗體片段與完整的抗體分子相比，向靶組織的移行性更優(yōu)良(非專利文獻(xiàn)32)。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :日本特開平9-311132號公報
專利文獻(xiàn)2 :日本特開2007-24661號公報專利文獻(xiàn)3 :日本特開平10-111290號公報非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I Crit Rev Oncog.，6，57(1995)非專利文獻(xiàn)2 J Urol Nephrol.，74，694(1968)非專利文獻(xiàn)3:Clin Exp Immunol. , 100, 470 (1995)非專利文獻(xiàn)4 J Am Soc Neph.，7，955 (1996)非專利文獻(xiàn)5 :Nephrol Dial Transplant. , 17, 50(2002) 非專利文獻(xiàn)6 J Intern Med.，258，467 (2005)非專利文獻(xiàn)7 :日本腎臟學(xué)會誌，44(7)，514-523(2002)非專利文獻(xiàn)8 :Seminars in Nephrolog, 28 (I), 78 (2008)非專利文獻(xiàn)9 JBC 282，28256，2007; Kidney Int.，1997，52:509非專利文獻(xiàn)10 Chem Bio Chem, 6, 22292005非專利文獻(xiàn)11 Carbohydrate Research, 339 (13), 2329-2355 (2004)非專利文獻(xiàn)12 Clinical&Experimental Immunology, 79 (I), 35-40 (1990)非專利文獻(xiàn)13 Hum. Pathol.，38，564 (2007)非專利文獻(xiàn)14 Hum. Pathol.，36，886 (2005)非專利文獻(xiàn)15 FEBS Lett.，579，6179 (2005)非專利文獻(xiàn)16 =Cancer Res.，65，7378 (2005)非專利文獻(xiàn)17 Hum. Pathol.，36，886 (2005)非專利文獻(xiàn) I8 0ncogene, 13, 2328 (2006)非專利文獻(xiàn)19 =Virchows Arch.，448，52 (2006)非專利文獻(xiàn)20 J. Immunol.，135，1530 (1985)非專利文獻(xiàn)21 =Cancer Res.，46，6489 (1986)非專利文獻(xiàn)22 =Cancer Res. , 56, 1118 (1996)非專利文獻(xiàn)23 :Immunol.，85, 668(1995)非專利文獻(xiàn)24 =CancerRes. , 56, 1118 (1996)非專利文獻(xiàn)25 Jmmunol.，85, 668(1995)非專利文獻(xiàn)26 J. Immunol.，144，1382 (1990)非專利文獻(xiàn)27 =Nature, 322, 323 (1988)非專利文獻(xiàn)28 Science, 242, 423(1988)非專利文獻(xiàn)29 =Nature Biotechnol.，15，629 (1997)非專利文獻(xiàn)30 :Molecular Immunol. , 32, 249 (1995)非專利文獻(xiàn)31 J. Biol. Chem.，271，2966 (1996)非專利文獻(xiàn)32 =Cancer Res.，52，3402 (1992)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問題本發(fā)明的目的在于提供特異性識別并結(jié)合包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl的單克隆抗體或該單克隆抗體的使用方法。需要特異性識別并結(jié)合包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl的單克隆抗體或該單克隆抗體的使用方法。用于解決問題的手段本發(fā)明涉及下述(1Γ(32)項(xiàng)。(I) 一種單克隆抗體或該抗體片段，其特異性識別并結(jié)合由免疫球蛋白Al的重鏈基因編碼的多肽(以下稱為IgAl重鏈)的鉸鏈區(qū)，所述鉸鏈區(qū)包含未結(jié)合半乳糖的絲氨酸/蘇氨酸連接型糖鏈(以下稱為O連接型糖鏈)。(2) 一種單克隆抗體或該抗體片段，其不識別結(jié)合有O連接型糖鏈的由IgAl重鏈基因編碼的多肽的鉸鏈區(qū)中包含結(jié)合有半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl重鏈的鉸鏈區(qū)，而識別并結(jié)合包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl重鏈的鉸鏈區(qū)。(3)如⑴或⑵所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈為選自α -N-乙酰半乳糖胺-絲氨酸/蘇氨酸(以下稱為Tn抗原)或涎酸化Tn抗原中的至少一種O連接型糖鏈。(4)如(3)所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈為Tn抗原。(5)如(1Γ(4)中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，單克隆抗體為特異性識別并結(jié)合包含序列號I表示的氨基酸序列的IgAl重鏈的鉸鏈區(qū)的抗體。(6)如(1Γ(4)中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，單克隆抗體為特異性識別并結(jié)合包含序列號I表示的氨基酸序列的IgAl重鏈的鉸鏈區(qū)多肽的抗體，并且，所述鉸鏈區(qū)多肽是在選自從該多肽的氨基末端起第3位的蘇氨酸、第6位的蘇氨酸、第8位的絲氨酸、第10位的絲氨酸、第14位的蘇氨酸中的至少一個氨基酸殘基上結(jié)合有不具有半乳糖的N-乙酰半乳糖胺的糖肽。(7)如(1) (4)中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，單克隆抗體是對包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的補(bǔ)體Cl抑制物不顯示交叉反應(yīng)性的單克隆抗體。(8)如(1Γ(4)中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，單克隆抗體是在向包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl重鏈的鉸鏈區(qū)上結(jié)合時與選自單克隆抗體ΚΜ4137、ΚΜ4140、ΚΜ4144中的至少一種單克隆抗體發(fā)生競爭反應(yīng)的單克隆抗體。(9)如(1Γ(4)中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，單克隆抗體是與選自單克隆抗體中的至少一種單克隆抗體所結(jié)合的、存在于包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl重鏈的鉸鏈區(qū)的表位進(jìn)行結(jié)合的單克隆抗體。(10)如(1) (9)中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或抗體片段，其中，單克隆抗體是由選自雜交瘤KM4137(FERM BP-11214)、KM4140 (FERM BP-11215)、KM4144 (FERM BP-11216)中的至少一種雜交瘤生產(chǎn)的單克隆抗體。(11)如(1) (9)中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，單克隆抗體為
基因重組抗體。(12)如(11)所述的基因重組抗體或該抗體片段，其中，基因重組抗體為選自人嵌合抗體、人源化抗體和人抗體中的抗體。(13)如(1) (12)中任一項(xiàng)所述的抗體片段，其中，抗體片段為選自Fab、Fab’、F(ab’)2、單鏈抗體(scFv)、二聚體化V區(qū)(雙價抗體)、二硫鍵穩(wěn)定的V區(qū)(dsFv)和包含CDR的肽中的抗體片段。(14) 一種雜交瘤，其生產(chǎn)(1Γ(9)中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體。(15) 一種DNA，其編碼(I廣(13)中任一項(xiàng)所述的抗體或該抗體片段。(16) 一種重組載體，其含有(15)所述的DNA。(17) 一種轉(zhuǎn)化株，其通過將(16)所述的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中而得到。(18) 一種抗體或該抗體片段的制造方法，用于制造(I廣(13)中任一項(xiàng)所述的抗體或該抗體片段，其特征在于，將(14)所述的雜交瘤或(17)所述的轉(zhuǎn)化株在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)物中生成并蓄積(I廣(13)中任一項(xiàng)所述的抗體或該抗體片段，并從該培養(yǎng)物中收集抗體或該抗體片段。 (19) 一種IgAl的免疫學(xué)檢測或測定方法，所述IgAl具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)，所述方法中，使用(I廣(13)中任一項(xiàng)所述的抗體或該抗體片段。(20) 一種IgAl的檢測試劑，所述IgAl具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)，所述檢測試劑中，使用(I廣(13)中任一項(xiàng)所述的抗體或該抗體片段。(21) 一種IgAl相關(guān)疾病的診斷劑，所述IgAl具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)，所述診斷劑中，使用(I廣(13)中任一項(xiàng)所述的抗體或該抗體片段。(22)如(21)所述的診斷劑，其中，與具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)的IgAl相關(guān)的疾病為自身免疫疾病。(23)如(21)所述的診斷劑，其中，與具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)的IgAl相關(guān)的疾病為IgA腎病。(24) 一種IgAl相關(guān)疾病的治療劑，所述IgAl具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)，所述治療劑中，含有(I廣(13)中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段作為有效成分。(25)如(24)所述的治療劑，其中，與具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)的IgAl相關(guān)的疾病為自身免疫疾病。(26)如(24)所述的治療劑，其中，與具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)的IgAl相關(guān)的疾病為IgA腎病。(27) 一種IgAl相關(guān)疾病的診斷方法，所述IgAl具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)，所述診斷方法包括使用(I廣(13)中任一項(xiàng)所述的抗體或該抗體片段，對具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)的IgAl進(jìn)行檢測或測定。(28)如(27)所述的診斷方法，其中，與具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)的IgAl相關(guān)的疾病為自身免疫疾病。(29)如(27)所述的診斷方法，其中，與具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)的IgAl相關(guān)的疾病為IgA腎病。(30) (I廣(13)中任一項(xiàng)所述的抗體或該抗體片段在制造IgAl相關(guān)疾病的治療劑中的應(yīng)用，所述IgAl具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)。(31)如(30)所述的抗體或該抗體片段的應(yīng)用，其中，與具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)的IgAl相關(guān)的疾病為自身免疫疾病。(32)如(30)所述的抗體或該抗體片段的應(yīng)用，其中，與具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)的IgAl相關(guān)的疾病為IgA腎病。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種單克隆抗體，其特異性識別并結(jié)合由免疫球蛋白Al的重鏈基因編碼的多肽的鉸鏈區(qū)，所述鉸鏈區(qū)包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈。另外，根據(jù)本發(fā)明，能夠提供與包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的、由免疫球蛋白Al的重鏈基因編碼的多肽的鉸鏈區(qū)相關(guān)的各種疾病的治療劑或診斷劑。


圖I是表示質(zhì)粒pCR2B8PVH的構(gòu)建流程的圖。圖2是表示質(zhì)粒pCRIgA的構(gòu)建流程的圖。 圖3是表示質(zhì)粒pCRmlgA的構(gòu)建流程的圖。圖4是表示質(zhì)粒pCR2B8PmIgA的構(gòu)建流程的圖。圖5是表示質(zhì)粒pKAN932B8PVHmIgA的構(gòu)建流程的圖。圖6是表示mlgAl-Fc的SDS聚丙烯酰胺電泳的圖。圖7是通過ELISA法對mIgAl_Fc的O連接型糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析而得到的圖?？v軸表示樣品波長415nm、參比波長490nm下的平均熒光強(qiáng)度(0D415-0D490)，凡例中的值表示競爭物質(zhì)濃度(μ g/ml)。圖8是通過ELISA法對建立的單克隆抗體的結(jié)合特異性進(jìn)行分析而得到的圖?？v軸為ELISA的吸光度，表示對欄外示出的各固定化抗原的結(jié)合性。圖9是通過競爭ELISA法對建立的單克隆抗體的結(jié)合特異性進(jìn)行分析而得到的圖。上段中,Tn抗原型人IgAl為競爭物質(zhì)，下段中，人血漿來源的IgAl為競爭物質(zhì)?？v軸表不吸光度，橫軸表不競爭物質(zhì)的濃度(μ g/ml)。圖10是通過流式細(xì)胞術(shù)對建立的單克隆抗體的結(jié)合特異性進(jìn)行分析而得到的圖，上段為確認(rèn)與表達(dá)mlgAl的DG44細(xì)胞株結(jié)合的圖，下段為確認(rèn)與表達(dá)mlgAl的Lec8細(xì)胞株結(jié)合的圖?？v軸表不細(xì)胞數(shù)，橫軸表不突光強(qiáng)度。圖11表示通過使用建立的單克隆抗體而構(gòu)建的夾心ELISA法對糖鏈缺陷型IgAl進(jìn)行定量而得到的結(jié)果。縱軸表示吸光度，橫軸表示抗原的濃度(μ g/ml)。圖12 表示通過流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測定 KM4137( ^),1^4140(^)和 ΚΜ4144(·)對生物素標(biāo)記的抗附加有Tn抗原的mlgA鉸鏈肽單克隆抗體KM4137(a)、KM4140 (b)或KM4144(c)與Tn抗原型人IgAl的結(jié)合的競爭抑制活性而得到的結(jié)果?？v軸表示樣品波長415nm、參比波長490nm下的平均熒光強(qiáng)度(0D415-0D490)，橫軸表示競爭物質(zhì)濃度(μ g/ml) ο
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，其特異性識別并結(jié)合由免疫球蛋白Al的重鏈基因編碼的多肽的鉸鏈區(qū)，所述鉸鏈區(qū)包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈。作為免疫球蛋白Al的重鏈基因，只要是編碼免疫球蛋白Al的重鏈的基因則均可，作為一例，可以列舉包含編碼分泌型免疫球蛋白Al重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列(序列號2)的堿基序列(序列號3)的基因。另外，在嚴(yán)格條件下與包含序列號3表示的堿基序列的DNA雜交并且編碼具有IgAl重鏈功能的多肽的基因等也包括在本發(fā)明的IgAl重鏈基因中。在嚴(yán)格條件下雜交的DNA是指以具有序列號3表不的喊基序列的DNA為探針,通過集落雜交法、噬菌斑雜交法、DNA印跡雜交法、DNA微陣列法等而得到的能夠雜交的DNA，具體而言，可以列舉通過如下方法進(jìn)行鑒定的DNA:使用固定有來源于雜交的集落或噬菌斑的DNA、或者具有該序列的PCR產(chǎn)物或寡聚DNA的過濾器或載玻片，在O. 7 I. O摩爾/升的氯化鈉存在下在65°C下進(jìn)行雜交，然后，使用O. Γ2倍濃度的SSC溶液(I倍濃度的SSC溶液的組成包括150毫摩爾/升的氯化鈉、15毫摩爾/升的檸檬酸鈉)，在65°C的條件下清洗過濾器或載玻片，由此進(jìn)行鑒定。雜交可以依據(jù)[Molecular Cloning, A LaboratoryManual (分子克隆實(shí)驗(yàn)指南)，第二版(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)、Current Protocols inMolecular Biology (最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法)(約翰威立父子出版公司，1987-1997)、DNACloning I: CoreTechniques, A Practical Approach (DNA 克隆 I :核心技術(shù)與實(shí)用方法)，第二版(牛津大學(xué)，1995)]等中記載的方法來進(jìn)行。作為能夠雜交的DNA，可以列舉與序列號3表不的喊基序列具有至少60%以上的同源性的DNA,優(yōu)選與序列號3表不的喊基序列具 有80%以上的同源性的DNA，更優(yōu)選與序列號3表示的堿基序列具有95%以上的同源性的DNA。編碼真核生物的蛋白質(zhì)的基因的堿基序列常?？梢杂^察到基因的多態(tài)性。本發(fā)明中使用的IgAl重鏈基因也包括堿基序列因基因的多態(tài)性而稍有突變的基因。作為IgAl重鏈，可以列舉具有序列號2表示的氨基酸序列的多肽；包含在序列號2表示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一個以上的氨基酸而成的氨基酸序列且具有IgAl重鏈的功能的多肽；以及包含與序列號2表不的氨基酸序列具有60%以上、優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選90%以上、最優(yōu)選95%以上的同源性的氨基酸序列且具有IgAl重鏈的功能的多妝等。具有在序列號2表示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一個以上的氨基酸而成的氨基酸序列的多肽可以通過如下方法得到使用[Molecular Cloning, A LaboratoryManual,第二版(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)、Current Protocols in MolecularBiology (約翰威立父子出版公司，1987-1997)、Nucleic Acids Research, 10,6487(1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79，6409 (1982)、Gene, 34，315 (1985)、Nucleic AcidsResearch, 13，4431 (1985) ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82，488 (1985)]等中記載的定點(diǎn)誘變法，在例如編碼具有序列號2表示的氨基酸序列的多肽的DNA中導(dǎo)入定點(diǎn)突變。缺失、取代或添加的氨基酸數(shù)沒有特別限定，優(yōu)選為一個至數(shù)十個、例如廣20個的氨基酸，更優(yōu)選為一個至數(shù)個、例如I飛個的氨基酸。在沒有特別說明的情況下，本發(fā)明中記載的同源性的數(shù)值可以是使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的同源性檢索程序而計算出的數(shù)值，對于堿基序列而言，可以列舉使用BLAST [J. Mol. Biol. ,215,403(1990)]中默認(rèn)的參數(shù)而計算出的數(shù)值等，對于氨基酸序列而言，可以列舉使用 BLAST2 [Nucleic AcidsRes. , 25, 3389 (1997) ; GenomeRes. , 7,649(1997) ;http ://www. ncb i. nlm. nih. gov/Education/BLASTinfo/informations, html]中默認(rèn)的參數(shù)而計算出的數(shù)值等。作為默認(rèn)的參數(shù)，G(起始空位罰分，Cost to open gap)在堿基序列的情況下為5,在氨基酸序列的情況下為11 ;_E(空位延伸罰分，Cost to extend gap)在堿基序列的情況下為2,在氨基酸序列的情況下為I ;_q(核苷酸錯配罰分，Penalty for nucleotidemismatch)為-3 ;-r(核苷酸匹配得分，reward for nucleotide match)為 I ;-e(期望值，expect value)為10 ;_W(字長大小，word size)在堿基序列的情況下為11個殘基，在氨基酸序列的情況下為3個殘基；-y (非空位延伸下降的閾值，Dropoff (X) for blastextensions in bits)在blastn中為20,在blastn以外的程序中為7 ;-X(空位比對的下降閾值，X dropoff value for gapped alignment in bits)為 15 ;_Z(最終空位比對的下降值，final X dropoff value for gapped alignment in bits)在 blastn 中為 50,在blastn 以外的程序中為 25 (http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/html/blastcgihe 1ρ·html)。包含序列號2表示的氨基酸序列的部分序列的多肽可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來制作，例如，可以通過使編碼序列號2表示的氨基酸序列的DNA的一部分缺失并對導(dǎo)入有包含上述DNA的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)來制作。另外，基于這樣制作的多肽或DNA，通過與上述同樣的方法，可以得到具有在序列號2表示的氨基酸序列的部分序列中 缺失、取代或添加一個以上的氨基酸而成的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明中，包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的、由IgAl重鏈基因編碼的多肽，只要是包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl重鏈則均可，具體而言，可以列舉包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的、由序列號3表示的堿基序列編碼的IgAl重鏈多肽。作為IgAl的鉸鏈區(qū),具體而言,可以列舉與文獻(xiàn)[Biochemical and BiophysicalResearch Communication]中公開的IgAl重鏈多肽的第223 240位相當(dāng)?shù)膮^(qū)域等。本發(fā)明中，包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的、由IgAl重鏈基因編碼的多肽的鉸鏈區(qū)，只要是包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl重鏈多肽的鉸鏈區(qū)則均可，具體而言，可以列舉在包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的由序列號3表示的堿基序列編碼的IgAl重鏈多肽中共同含有的、由序列號I表不的氨基酸序列。O連接型糖鏈?zhǔn)侵冈诘鞍踪|(zhì)的絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr)的氨基酸殘基中借助各氨基酸側(cè)鏈所含的-OH基而結(jié)合有糖鏈的結(jié)構(gòu)。在O連接型糖鏈中，將多肽上的Ser或Thr氨基酸側(cè)鏈的-OH基上結(jié)合有N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的O連接型糖鏈稱為粘蛋白型糖鏈。作為O連接型糖鏈的具體例，可以列舉T抗原(TF抗原)、涎酸化T抗原、Tn抗原或涎酸化Tn抗原等(表I)。[表I]
糖鏈抗原名稱糖鏈結(jié)構(gòu)
Tn 抗原GalNAcl α — Ser/Thr
誕酸化 Tn 抗原 NeuNAc α 2 — 6GalNAcl α — Ser/Thr
T 抗原Gal β I — 3GalNAcl α — Ser/Thr
誕酸化 T 抗原 NeuNAc α 2 — 3Gal β I — 3GalNAcl α — Ser/Thr(NeuNAc Ν-乙酰神經(jīng)氨酸)
本發(fā)明中，未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈?zhǔn)侵冈诮柚鞍踪|(zhì)的Ser或Thr的氨基酸殘基的-OH基結(jié)合的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)上未結(jié)合半乳糖(Gal)的O連接型糖鏈，具體而言，可以列舉上述的Tn抗原和涎酸化Tn抗原。未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈?zhǔn)钦連接型糖鏈的合成途徑中的中間體，通常在正常細(xì)胞的糖蛋白質(zhì)中幾乎不存在，而在癌癥和腎病等某些特定的疾病中觀察到表達(dá)。以下，本發(fā)明中，有時將未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈記為異常糖鏈，將結(jié)合有異常糖鏈的蛋白質(zhì)記為糖鏈缺陷型蛋白質(zhì)，將結(jié)合有異常糖鏈的IgAl記為糖鏈缺陷型IgAl。作為O連接型糖鏈所結(jié)合的多肽中的氨基酸殘基，可以列舉IgAl重鏈多肽的鉸鏈區(qū)的氨基酸序列中的絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr)的氨基酸殘基。另外，對于O連接型糖鏈所結(jié)合的多肽中的氨基酸殘基，可以通過使用 Net0Glyc3. I Server (http: //www. cbs. dtu. dk/services/NetOGlyc/)等序列檢索軟件來確認(rèn)結(jié)合O連接型糖鏈的共有序列。或者，可以通過對具有O連接型糖鏈的糖蛋白進(jìn)行質(zhì)譜(MS)分析來確定具體的糖鏈結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明中，作為IgAl重鏈多肽上的O連接型糖鏈所結(jié)合的鉸鏈區(qū)多肽中的氨基酸殘基，在IgAl重鏈多肽的鉸鏈區(qū)氨基酸序列中任意一個Ser或Thr殘基上均可以結(jié)合O連接型糖鏈，優(yōu)選列舉包含選自人IgAl重鏈多肽的氨基酸序列中第225位的蘇氨酸、第228位的蘇氨酸、第230位的絲氨酸、第232位的絲氨酸、第236位的蘇氨酸中的至少一個氨基酸殘基的糖鏈結(jié)合位點(diǎn)。作為每一分子IgAl重鏈多肽的重鏈鉸鏈區(qū)上結(jié)合的O連接型糖鏈數(shù)，只要在至少一個Ser殘基或Thr殘基上結(jié)合有O連接型糖鏈即可，O連接型糖鏈數(shù)沒有限定。作為獲取表達(dá)本發(fā)明的包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl(以下記為糖鏈缺陷型IgAl)的細(xì)胞的方法，可以通過如下方法制作表達(dá)糖鏈缺陷型IgAl的細(xì)胞在O連接型糖鏈合成過程中，向在多肽上的Ser/Thr上結(jié)合的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)上附加Gal的酶、與該酶的活性相關(guān)的蛋白質(zhì)或與尿苷5’ - 二磷酸半乳糖(UDP-半乳糖)的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白質(zhì)等的活性降低或缺失的細(xì)胞株中導(dǎo)入編碼IgAl重鏈的DNA和編碼IgAl輕鏈的DNA，由此制作表達(dá)糖鏈缺陷型IgAl的細(xì)胞。另外，也可以通過使涎酶和半乳糖苷酶等糖鏈切割酶對表達(dá)包含正常O型糖鏈的IgAl的細(xì)胞起作用來制作表達(dá)具有未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl的細(xì)胞。作為向多肽上的Ser或Thr上結(jié)合的GalNAc上附加Gal的酶的具體例，可以列舉β 1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶[The Journal of Biological Chemistry, 277, 178-186(2002)]等。另外，作為與向多肽上的Ser或Thr上結(jié)合的GalNAc上附加Gal的酶的活性相關(guān)的蛋白質(zhì)，可以列舉與該酶的蛋白質(zhì)折疊相關(guān)的伴侶Cosmc[Procedings of the NationalAcademy of Sciences of the UnitedStates of America, 99, 16613-16618(2002)]等。IgA腎病患者來源的IgAl表達(dá)細(xì)胞，由于編碼向多肽上的Ser/Thr上結(jié)合的GalNAc上附加Gal的酶、與該酶的活性相關(guān)的蛋白質(zhì)或與UDP-半乳糖的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白質(zhì)等的DNA上發(fā)生了添加、缺失或取代等而使酶的活性降低或缺失，因此，可以作為表達(dá)糖鏈缺陷型IgAl的細(xì)胞來利用。作為與UDP-半乳糖的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白質(zhì)，可以列舉UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等。作為UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性降低或缺失的細(xì)胞系，可以列舉LecS細(xì)胞[Glycobiology. , I, 307-14 (1991)]等。本發(fā)明中，作為表達(dá)糖鏈缺陷型IgAl的細(xì)胞，可以列舉在人體中內(nèi)源性存在的細(xì)胞、由人體中內(nèi)源性存在的細(xì)胞建立的細(xì)胞系或通過基因重組技術(shù)得到的細(xì)胞等。優(yōu)選列舉使在如上所述的O連接型糖鏈合成過程中向多肽上的Ser/Thr上結(jié)合的GalNAc上附加Gal的酶、與該酶的活性相關(guān)的蛋白質(zhì)或與UDP-半乳糖的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白質(zhì)等的活性降低或缺失的細(xì)胞系、具有相同的性質(zhì)并且在人體中內(nèi)源性存在的細(xì)胞等。作為在人體中內(nèi)源性存在的細(xì)胞，優(yōu)選在O連接型糖鏈合成過程中向多肽上的Ser/Thr上結(jié)合的GalNAc上附加Gal的酶、與該酶的活性相關(guān)的蛋白質(zhì)或與UDP-半乳糖的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白質(zhì)等的活性降低或缺失的細(xì)胞系，具體而言，可以列舉在IgA腎病患者體內(nèi)或癌癥患者體內(nèi)表達(dá)IgAl重鏈多肽的細(xì)胞，例如，可以列舉通過活組織檢查等得到的免疫相關(guān)細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞中表達(dá)IgAl重鏈多肽的細(xì)胞。 作為通過基因重組技術(shù)得到的細(xì)胞，可以列舉如下細(xì)胞制作使O連接型糖鏈合成過程中向多肽上的Ser/Thr上結(jié)合的GalNAc上附加Gal的酶、與該酶的活性相關(guān)的蛋白質(zhì)或與UDP-半乳糖的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白質(zhì)等的活性降低或缺失的宿主細(xì)胞，將包含編碼目標(biāo)多肽的cDNA的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，由此表達(dá)糖鏈缺陷型IgAl。作為宿主細(xì)胞，具體而言，可以列舉UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性降低的LecS細(xì)胞，或者，因β 1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶或與該酶活性相關(guān)的Comsc伴侶蛋白的異常而使酶的活性降低或缺失的IgA腎病患者來源的IgAl表達(dá)細(xì)胞等。此外，作為制作糖鏈缺陷型IgAl蛋白的方法，可以列舉使用上述的IgAl表達(dá)細(xì)胞來表達(dá)糖鏈缺陷型IgAl蛋白并進(jìn)行純化的方法等。作為獲取糖鏈缺陷型IgAl蛋白的方法，可以通過以IgAl蛋白與其他物質(zhì)的融合蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)和純化來獲取。作為與IgAl蛋白融合的物質(zhì)，可以列舉抗體恒定區(qū)、抗體Fe段、GST標(biāo)簽、組氨酸標(biāo)簽(也稱為His標(biāo)簽)或Myc標(biāo)簽等多肽等。該融合蛋白可以通過使用蛋白A、鎳柱、特異性抗體柱等親和層析柱來分離純化。本發(fā)明的單克隆抗體或該抗體片段對如上得到的糖鏈缺陷型IgAl細(xì)胞或糖鏈缺陷型IgAl具有結(jié)合活性。本發(fā)明的抗體或該抗體片段與糖鏈缺陷型IgAl蛋白的結(jié)合例如可以通過以下方法確認(rèn)使用公知的免疫學(xué)檢測方法、優(yōu)選熒光細(xì)胞染色法等來確認(rèn)表達(dá)特定抗原的細(xì)胞與抗特定抗原的抗體的結(jié)合性的方法。另外，也可以將公知的免疫學(xué)檢測方法[MonoclonalAntibodies-Principles and practice (單克隆抗體的原則與實(shí)踐)，第三版,美國學(xué)術(shù)出版社(1996) ；Antibodies-A Laboratory Manual (抗體實(shí)驗(yàn)指南)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1988)；単夕口 - >抗體実験^ 二二 7 > (單克隆抗體實(shí)驗(yàn)指南)、講談社寸λ r λ V λ V > (1987)]等組合來進(jìn)行確認(rèn)。作為本發(fā)明的單克隆抗體，可以列舉由雜交瘤生產(chǎn)的抗體、以及由利用包含抗體基因的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化而得到的轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)的基因重組抗體。雜交瘤例如可以通過如下方法制備制備表達(dá)上述糖鏈缺陷型IgAl的細(xì)胞等作為抗原，利用經(jīng)該抗原免疫后的動物誘導(dǎo)出具有抗原特異性的抗體生產(chǎn)細(xì)胞，進(jìn)而，使該抗體生產(chǎn)細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合。通過對該雜交瘤進(jìn)行培養(yǎng)或者對動物施用該雜交瘤細(xì)胞而使該動物產(chǎn)生癌性腹水并對該培養(yǎng)液或腹水進(jìn)行分離、純化，可以獲得抗糖鏈缺陷型IgAl抗體。作為進(jìn)行抗原免疫的動物，只要能夠制作雜交瘤則均可以使用，優(yōu)選使用小鼠、大鼠、倉鼠、兔等。另外，由如下制作的雜交瘤生產(chǎn)的抗體等也包括在本發(fā)明的抗體中從上述動物中獲取具有抗體產(chǎn)生能力的細(xì)胞，在體外對該細(xì)胞實(shí)施免疫，然后與骨髓瘤細(xì)胞融合而制作雜交瘤。單克隆抗體是指單一克隆的抗體產(chǎn)生細(xì)胞所分泌的抗體,該抗體僅識別一個表位(也稱為抗原決定簇)，并且構(gòu)成單克隆抗體的氨基酸序列(一級結(jié)構(gòu))一致。表位可以列舉單克隆抗體所識別并結(jié)合的單一氨基酸序列、由氨基酸序列構(gòu)成的立體結(jié)構(gòu)、結(jié)合有糖鏈的氨基酸序列以及由結(jié)合有糖鏈的氨基酸序列構(gòu)成的立體結(jié)構(gòu)等。作為本發(fā)明的單克隆抗體的表位，可以列舉糖鏈缺陷型IgAl蛋白的立體結(jié)構(gòu)。作為本發(fā)明的單克隆抗體，只要是識別并結(jié)合糖鏈缺陷型IgAl的重鏈鉸鏈區(qū)的 單克隆抗體，則可以是任意一種抗體，具體而言，可以列舉單克隆抗體KM4137、KM4138、KM4139、KM4140 和 KM4144 等。更具體而言，可以列舉由雜交瘤KM4137生產(chǎn)的單克隆抗體KM4137、與單克隆抗體KM4137競爭地與糖鏈缺陷型IgAl的重鏈鉸鏈區(qū)結(jié)合的單克隆抗體以及與單克隆抗體KM4137所結(jié)合的存在于糖鏈缺陷型IgAl重鏈鉸鏈區(qū)的表位進(jìn)行結(jié)合的單克隆抗體。作為本發(fā)明的單克隆抗體，還可以列舉由雜交瘤KM4138生產(chǎn)的單克隆抗體KM4138、與單克隆抗體KM4138競爭地與糖鏈缺陷型IgAl的重鏈鉸鏈區(qū)結(jié)合的單克隆抗體以及與單克隆抗體KM4138所結(jié)合的存在于糖鏈缺陷型IgAl重鏈鉸鏈區(qū)的表位進(jìn)行結(jié)合的單克隆抗體。作為本發(fā)明的單克隆抗體，還可以列舉由雜交瘤KM4139生產(chǎn)的單克隆抗體KM4139、與單克隆抗體KM4139競爭地與糖鏈缺陷型IgAl的重鏈鉸鏈區(qū)結(jié)合的單克隆抗體以及與單克隆抗體KM4139所結(jié)合的存在于糖鏈缺陷型IgAl重鏈鉸鏈區(qū)的表位進(jìn)行結(jié)合的單克隆抗體。另外，作為本發(fā)明的單克隆抗體，還可以列舉由雜交瘤KM4140生產(chǎn)的單克隆抗體KM4140、與單克隆抗體KM4140競爭地與糖鏈缺陷型IgAl的重鏈鉸鏈區(qū)結(jié)合的單克隆抗體以及與單克隆抗體KM4140所結(jié)合的存在于糖鏈缺陷型IgAl重鏈鉸鏈區(qū)的表位進(jìn)行結(jié)合的單克隆抗體。此外，作為本發(fā)明的單克隆抗體，還可以列舉由雜交瘤KM4144生產(chǎn)的單克隆抗體KM4144、與單克隆抗體KM4144競爭地與糖鏈缺陷型IgAl的重鏈鉸鏈區(qū)結(jié)合的單克隆抗體以及與單克隆抗體KM4144所結(jié)合的存在于糖鏈缺陷型IgAl重鏈鉸鏈區(qū)的表位進(jìn)行結(jié)合的單克隆抗體等。作為與本發(fā)明的單克隆抗體發(fā)生競爭反應(yīng)的單克隆抗體，具體而言，可以列舉如上所述對各種單克隆抗體和存在于糖鏈缺陷型IgAl的重鏈鉸鏈區(qū)的表位具有競爭反應(yīng)的單克隆抗體。與單克隆抗體發(fā)生競爭反應(yīng)是指，以與本發(fā)明的單克隆抗體相同或部分相同的表位作為抗原并與該表位結(jié)合的抗體。另外，作為與本發(fā)明的單克隆抗體所結(jié)合的表位進(jìn)行結(jié)合的單克隆抗體，具體可以列舉如上所述與各種單克隆抗體所識別的存在于糖鏈缺陷型IgAl重鏈鉸鏈區(qū)的表位結(jié)合的單克隆抗體。雜交瘤KM4137、KM4140、KM4144于2009年12月18日依照布達(dá)佩斯條約保藏于日本獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(305-856，日本茨城縣筑波市東I丁目 I 番地 I 中央第 6)，保藏編號分別為 FERM BP-11214.FERM BP_11215、FERM BP-11216。作為基因重組抗體，包括人嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或該抗體片段等通過基因重組技術(shù)制造的抗體。基因重組抗體中，具有抗原結(jié)合活性、抗原性低且血中半衰期延長的基因重組抗體優(yōu)選作為治療劑。人嵌合抗體是指包含非人抗體的重鏈可變區(qū)(以下記為VH)和輕鏈可變區(qū)(以下記為VL)與人抗體的重鏈恒定區(qū)(以下記為CH)和輕鏈恒定區(qū)(以下記為CL)的抗體。本發(fā)明的人嵌合抗體可以如下進(jìn)行制造。S卩，由本發(fā)明的特異性識別糖鏈缺陷型IgAl并與該重鏈鉸鏈區(qū)結(jié)合的單克隆抗體或者產(chǎn)生特異性識別糖鏈缺陷型IgAl并與該重鏈鉸鏈區(qū)結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤獲取編碼VH和VL的cDNA，將它們插入到具有編碼人抗體的CH和CL的基因的動物細(xì)胞用表達(dá)載體中，構(gòu)建人嵌合抗體表達(dá)載體，將其導(dǎo)入動物細(xì)胞中而對抗體進(jìn)行表達(dá)，從而制作人嵌合抗體。作為人嵌合抗體的CH，只要屬于人免疫球蛋白(以下記為hlg)則均可以使用，優(yōu)選hlgG類的CH,而且可以使用屬于hlgG類的hIgGl、hIgG2、hIgG3、hIgG4等亞類中的任意一種。另外，作為人嵌合抗體的CL，可以是屬于hlg的任意一種CL，可以使用K類或λ類的CL。 人源化抗體是指將非人抗體的VH和VL的CDR的氨基酸序列移植到人抗體的VH和VL的適當(dāng)位置而得到的抗體,也稱為人⑶R移植抗體、重構(gòu)抗體(reshaped antibody)。本發(fā)明的人源化抗體可以如下制造構(gòu)建編碼抗體可變區(qū)的cDNA，所述抗體可變區(qū)是將由產(chǎn)生本發(fā)明的特異性識別糖鏈缺陷型IgAl蛋白并與該重鏈鉸鏈區(qū)結(jié)合的單克隆抗體的雜交瘤產(chǎn)生的非人抗體的VH和VL的CDR的氨基酸序列移植到任意的人抗體的VH和VL的框架(以下記為FR)中而形成的抗體可變區(qū)(以下記為V區(qū))，將上述cDNA插入到具有編碼人抗體的CH和CL的基因的動物細(xì)胞用表達(dá)載體中，構(gòu)建人源化抗體表達(dá)載體，并將其導(dǎo)入動物細(xì)胞中，由此進(jìn)行表達(dá)，從而制造人源化抗體。人抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列只要是人抗體來源的VH和VL的FR的氨基酸序列，則均可以使用?？梢允褂美绲鞍讛?shù)據(jù)庫(Protein Data Bank)等數(shù)據(jù)庫中登記的人抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列或者Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, US Dept. Health and Human Services (1991)等中記載的人抗體的 VH 和 VL 的FR的各亞類的共有氨基酸序列等。作為人源化抗體的CH，只要屬于hlg則均可以使用，優(yōu)選hlgG類的CH，而且可以使用屬于hlgG類的hlgGl、hIgG2、hIgG3、hIgG4等亞類中的任意一種。另外，作為人源化抗體的CL，只要屬于hlg則可以為任意一種，可以使用K類或λ類的CL。人抗體原本是指人體中內(nèi)源性存在的抗體，也包括從利用最近的基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)育工程的技術(shù)進(jìn)步制作的人抗體噬菌體文庫和產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動物而得到的抗體等。人體中內(nèi)源性存在的抗體例如可以如下獲得分離出人末梢血淋巴細(xì)胞，使其感染EB病毒等而永生化，并進(jìn)行克隆，由此可以培養(yǎng)產(chǎn)生該抗體的淋巴細(xì)胞，并可以從培養(yǎng)上清中純化出該抗體。人抗體噬菌體文庫是通過將由人B細(xì)胞制備的抗體基因插入到噬菌體基因中而使Fab、scFv等抗體片段在噬菌體表面進(jìn)行表達(dá)而得到的文庫。可以以抗體片段對固定有抗原的底物的結(jié)合活性為指標(biāo)，從該文庫中回收在表面表達(dá)具有期望的抗原結(jié)合活性的抗體片段的噬菌體。該抗體片段還可以進(jìn)一步通過基因工程方法轉(zhuǎn)化為包含兩條完整的H鏈和L鏈的人抗體分子。產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動物是指細(xì)胞內(nèi)重組有人抗體基因的動物。具體而言，例如，向小鼠ES細(xì)胞中導(dǎo)入人抗體基因，將該ES細(xì)胞移植入小鼠的早期胚胎中，然后使其發(fā)育，由此可以制作產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠。由產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動物制作人抗體的方法中，通過通常的在人以外的動物中實(shí)施的雜交瘤制作方法獲取產(chǎn)生人抗體的雜交瘤，并進(jìn)行培養(yǎng)，由此，可以在培養(yǎng)上清中產(chǎn)生并蓄積人抗體。在構(gòu)成上述抗體或抗體片段的氨基酸序列中缺失、添加、取代或插入一個以上的 氨基酸并且具有與上述抗體或其抗體片段相同的活性的抗體或其抗體片段也包括在本發(fā)明的抗體或其抗體片段中。缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸數(shù)為一個以上，其數(shù)量沒有特別限定，可以是利用分子克隆第二版、最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法、NucleicAcids Research, 10，6487 (1982)、Proc.Natl.Acad. Sci. , USA, 79，6409 (1982)、Gene,34, 315(1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc.Natl. Acad. SciUSA, 82，488(1985)等中記載的定點(diǎn)誘變法等公知的技術(shù)能夠缺失、取代或添加的程度的數(shù)量。例如為一個至數(shù)十個，優(yōu)選為廣20個，更優(yōu)選為f 10個，進(jìn)一步優(yōu)選為I飛個。在上述抗體的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加一個以上的氨基酸殘基表示如下含義。即，意味著在同一序列中的任意且一個或多個氨基酸序列中，存在一個或多個氨基酸殘基的缺失、取代、插入和/或添加。另外，既存在同時發(fā)生缺失、取代、插入和/或添加的情況，也存在被取代、插入或添加的氨基酸殘基為天然型和非天然型中的任意一種的情況。作為天然型氨基酸殘基，可以列舉L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸和L-半胱氨酸等。以下示出可相互取代的氨基酸殘基的優(yōu)選例。同一組中所含的氨基酸殘基可以相互取代。A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基絲氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸B組天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸C組天冬酰胺、谷氨酰胺D組賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、2，4- 二氨基丁酸、2，3_ 二氨基丙酸E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸F組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸G組苯丙氨酸、酪氨酸作為本抗體的效應(yīng)活性，可以列舉ADCC活性、CDC活性、抗體依賴性吞噬活性(antibody dependent cellular phagocytosis, ADCP)、調(diào)理作用等，可以通過各種方法進(jìn)行調(diào)控。作為調(diào)控效應(yīng)活性的方法，可以列舉對結(jié)合于抗體的Fe段的糖鏈進(jìn)行調(diào)控的方法、對抗體的Fe段的氨基酸殘基進(jìn)行氨基酸改變的方法等。作為對結(jié)合于抗體的Fe段的糖鏈進(jìn)行調(diào)控的方法，可以列舉通過將IgG抗體的第297位的糖鏈除去而降低ADCC、⑶C活性的方法[MolecularImmunology, 32，1311，(1995)，W02008/030564];使半乳糖與抗體的Fe段的結(jié)合減少而降低CDC活性的方法等。
另外，作為對結(jié)合于抗體的Fe段的糖鏈進(jìn)行調(diào)控的方法，可以列舉如下方法生產(chǎn)在IgG抗體的Fe段的第297位的天冬酰胺上結(jié)合的N連接型糖鏈中包含在糖鏈所結(jié)合的基部的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)上未結(jié)合巖藻糖的糖鏈的抗體的方法(US7，214，775、US6, 946, 292);生產(chǎn)包含結(jié)合有平分型(bisecting)GlcNAc的糖鏈的抗體的方法[NatureBiotechnology, 17, 176, (1999)];生產(chǎn)具有結(jié)合有與非還原末端結(jié)合的半乳糖(Gal)的糖鏈的抗體的方法[Hum. Antibod. Hybridomas, 5, 143-151，(1994)];等。作為對抗體的Fe段的氨基酸殘基進(jìn)行氨基酸改變的方法，可以列舉如下方法通過進(jìn)行抗體的Fe段的氨基酸改變來調(diào)控效應(yīng)活性的方法(J.B.C.，277,26733-26740, 2002、US6, 737, 056、US7, 297, 775、US2007/0020260,W02005/070963)；以及通過進(jìn)行抗體的Fe段的各亞類之間的結(jié)構(gòu)域交換來調(diào)控效應(yīng)活性的方法(W02007/011041)等。作為本發(fā)明的抗體片段，可以列舉Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、雙價抗體、dsFv等。作為本發(fā)明的抗體片段，可以列舉Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、雙價抗體、dsFv和包含⑶R的肽等。Fab是將IgG用蛋白分解酶木瓜蛋白酶進(jìn)行處理而得到的片段中(在H鏈的第224位的氨基酸殘基處切斷)、N末端側(cè)約一半的H鏈與整個L鏈通過二硫鍵結(jié)合而成的分子量約為5萬的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。本發(fā)明的Fab可以通過將本發(fā)明的特異性識別糖鏈缺陷型IgAl蛋白且與該重鏈鉸鏈區(qū)結(jié)合的單克隆抗體用蛋白分解酶木瓜蛋白酶進(jìn)行處理而得到?；蛘?，可以通過將編碼該抗體的Fab的DNA插入原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體中并將該載體導(dǎo)入原核生物或真核生物中使其進(jìn)行表達(dá)來制造。F(ab’ )2是將IgG的鉸鏈區(qū)的兩個二硫鍵的下部用胃蛋白酶分解而得到的、兩個Fab區(qū)在鉸鏈部分結(jié)合而構(gòu)成的、分子量約為10萬的具有抗原結(jié)合活性的片段。本發(fā)明的F(ab’)2可以通過將本發(fā)明的特異性識別糖鏈缺陷型IgAl蛋白且與該重鏈鉸鏈區(qū)結(jié)合的單克隆抗體用蛋白分解酶胃蛋白酶進(jìn)行處理而得到。或者，可以通過使下述Fab’以硫醚鍵結(jié)合或以二硫鍵結(jié)合來制作。Fab’是將上述F(ab’ )2的鉸鏈區(qū)的二硫鍵切斷而得到的分子量約為5萬的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。本發(fā)明的Fab’可以通過將本發(fā)明的特異性識別糖鏈缺陷型IgAl蛋白且與該重鏈鉸鏈區(qū)結(jié)合的F(ab’)2用還原劑二硫蘇糖醇進(jìn)行處理而得到。或者，可以通過將編碼該抗體的Fab’片段的DNA插入原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體中并將該載體導(dǎo)入原核生物或真核生物中使其進(jìn)行表達(dá)來制造。
scFv是使用適當(dāng)?shù)碾慕宇^(以下記為P)將一條VH與一條VL連接而形成的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，并且是具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。本發(fā)明的scFv可以通過如下方法制造獲取編碼本發(fā)明的特異性識別糖鏈缺陷型IgAl蛋白且與該重鏈鉸鏈區(qū)結(jié) 合的單克隆抗體的VH和VL的cDNA，構(gòu)建編碼scFv的DNA，將該DNA插入原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體中，并將該表達(dá)載體導(dǎo)入原核生物或真核生物中，由此進(jìn)行表達(dá)。雙價抗體為scFv 二聚體化而得到的抗體片段，并且是具有二價抗原結(jié)合活性的抗體片段。二價抗原結(jié)合活性可以相同，也可以使其中一者具有不同的抗原結(jié)合活性。本發(fā)明的雙價抗體可以通過如下方法制造獲取本發(fā)明的特異性識別糖鏈缺陷型IgAl蛋白且與該重鏈鉸鏈區(qū)結(jié)合的單克隆抗體，以P的氨基酸序列長度為8個殘基以下的方式構(gòu)建編碼scFv的DNA，將該DNA插入原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體中，并將該表達(dá)載體導(dǎo)入原核生物或真核生物中，由此進(jìn)行表達(dá)。dsFv是指使VH和VL中各一個氨基酸殘基取代為半胱氨酸殘基的多肽借助該半胱氨酸殘基之間的二硫鍵結(jié)合而得到的抗體片段。取代為半胱氨酸殘基的氨基酸殘基可以根據(jù)Reiter等人公開的方法[Protein Engineering, 7，697 (1994)]基于抗體的立體結(jié)構(gòu)預(yù)測來進(jìn)行選擇。本發(fā)明的dsFv可以通過如下方法制造獲取編碼本發(fā)明的特異性識別糖鏈缺陷型IgAl蛋白且與該重鏈鉸鏈區(qū)結(jié)合的單克隆抗體的VH和VL的cDNA，構(gòu)建編碼dsFv的DNA，將該DNA插入原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體中，并將該表達(dá)載體導(dǎo)入原核生物或真核生物中，由此進(jìn)行表達(dá)。包含⑶R的肽可以包含VH或VL的⑶R中的至少一個區(qū)域以上而構(gòu)成。包含多個CDR的肽可以直接進(jìn)行結(jié)合或者借助肽接頭而進(jìn)行結(jié)合。本發(fā)明的包含CDR的肽可以通過如下方法制造構(gòu)建編碼本發(fā)明的特異性識別糖鏈缺陷型IgAl蛋白且與該重鏈鉸鏈區(qū)結(jié)合的單克隆抗體的VH和VL的⑶R的DNA，將該DNA插入原核生物用表達(dá)載體或真核生物用表達(dá)載體中，并將該表達(dá)載體導(dǎo)入原核生物或真核生物中，由此進(jìn)行表達(dá)。另外，包含⑶R的肽也可以通過Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化學(xué)合成法來制造。本發(fā)明中包括利用化學(xué)或基因工程方法在本發(fā)明的特異性識別糖鏈缺陷型IgAl蛋白且與該重鏈鉸鏈區(qū)結(jié)合的單克隆抗體或抗體片段上結(jié)合藥劑、蛋白質(zhì)、放射性同位素等而得到的與抗體的結(jié)合物。本發(fā)明的結(jié)合物通過利用化學(xué)方法[抗體工學(xué)入門(抗體工程入門)，金光修著，地人書館(1994)]在本發(fā)明的特異性識別糖鏈缺陷型IgAl蛋白且與該重鏈鉸鏈區(qū)結(jié)合的單克隆抗體或其抗體片段的H鏈或L鏈的N末端側(cè)或C末端側(cè)、抗體或其抗體片段中的適當(dāng)?shù)娜〈騻?cè)鏈以及抗體或其抗體片段中的糖鏈等上結(jié)合藥劑、蛋白質(zhì)、放射性同位素等來制造。另外，也可以通過基因工程方法來制造，S卩，使編碼本發(fā)明的特異性識別糖鏈缺陷型IgAl蛋白且與該重鏈鉸鏈區(qū)結(jié)合的單克隆抗體或其抗體片段的DNA與編碼要結(jié)合的蛋白質(zhì)的DNA連接后插入表達(dá)載體中，并將該表達(dá)載體導(dǎo)入原核生物或真核生物的宿主細(xì)胞中。作為藥劑，可以列舉化療劑、抗體藥品、免疫刺激劑、高分子藥劑等。作為蛋白質(zhì)，可以列舉細(xì)胞因子、增殖因子、毒蛋白等。此外，與抗體或該抗體片段結(jié)合的藥劑可以為前藥的形式。本發(fā)明中的前藥是指利用存在于腫瘤環(huán)境中的酶等進(jìn)行化學(xué)修飾而轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袣┘?xì)胞的作用的物質(zhì)的藥劑。作為化療劑，包括烷化劑、亞硝基脲劑、代謝拮抗劑、抗癌性抗生素、植物來源的生物堿、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、激素療法制劑、激素拮抗劑、芳香化酶抑制劑、P糖蛋白抑制劑、鉬絡(luò)合物衍生物、M期抑制劑、激酶抑制劑等任何的化療劑。作為化療劑，可以列舉阿米福汀(氨磷汀)、順鉬、達(dá)卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、二氯甲基二乙胺(氮芥)、鏈脲霉素、環(huán) 磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(阿霉素)、阿霉素脂質(zhì)體(多喜)、表柔比星、吉西他濱(健擇)、柔紅霉素、柔紅霉素脂質(zhì)體(DaunoXome)、丙卡巴肼、絲裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、長春堿、長春新堿、博來霉素、道諾霉素、培洛霉素、雌莫司汀、紫杉醇(泰素)、多西紫杉醇(多西他奇)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡鉬、奧沙利鉬、奈達(dá)鉬、克拉屈濱、喜樹堿、CPT-IlUO-羥基-7-乙基-喜樹堿(SN38)、5_氟脫氧尿苷、氟達(dá)拉濱、羥基脲、異環(huán)磷酰胺、伊達(dá)比星、美司那、依立替康、拓?fù)涮婵?V < f力 >)、米托蒽醌、托泊替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、羥基脲、普卡霉素、密妥坦、培門冬酶、噴司他丁、哌泊溴烷、鏈脲霉素、他莫昔芬、戈舍瑞林、亮丙瑞林、氟他胺、替尼泊苷、睪內(nèi)酯、硫鳥嘌呤、塞替派、烏拉莫司汀、長春瑞濱、苯丁酸氮芥、氫化可的松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、長春地辛、尼莫司汀、司莫司汀、卡培他濱、雷替曲塞、氮胞苷、UFT、奧沙利鉬、吉非替尼(易瑞沙)、伊馬替尼(STI571)、厄洛替尼、Flt3抑制劑、血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)抑制劑、成纖維細(xì)胞生長因子受體(FGFR)抑制劑、表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑(易瑞沙、特羅凱等)、根赤殼菌素、17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格爾德霉素、雷帕霉素、安吖啶、全反式維甲酸、沙利度胺、阿那曲唑、法曲唑、來曲唑、依西美坦、硫代蘋果酸金、D-青霉胺、布西拉明、硫唑嘌呤、咪唑立賓、環(huán)孢素、雷帕霉素、氫化可的松、蓓薩羅丁(塔革雷汀)、他莫昔芬、地寒米松、孕激素類、雌激素類、阿那曲唑(瑞寧德)、利普安、阿司匹林、吲哚美辛、塞來昔布、硫唑嘌呤、青霉胺、硫代蘋果酸金、馬來酸氯苯那敏、氯苯那敏、氯馬斯汀、維甲酸、蓓薩羅丁、砷、硼替佐米、別嘌呤醇、吉妥單抗、替伊莫單抗、131托西莫單抗、塔革雷汀、奧唑米星、克拉霉素、瘤可維、異環(huán)磷酰胺、酮康唑、氨魯米特、蘇拉明、甲氨蝶呤、類美登醇(Maytansinoid)及其衍生物等。作為使化療劑與抗體結(jié)合的方法，可以列舉通過戊二醛使化療劑與抗體的氨基之間結(jié)合的方法、通過水溶性碳二亞胺使化療劑的氨基與抗體的羧基結(jié)合的方法等。作為抗體藥品，可以列舉對通過抗體的結(jié)合誘導(dǎo)凋亡的抗原、與腫瘤的病態(tài)形成相關(guān)的抗原或調(diào)節(jié)免疫功能的抗原、與病變部位的血管新生相關(guān)的抗原具有抗性的抗體。作為通過抗體的結(jié)合誘導(dǎo)凋亡的抗原，可以列舉分化抗原(Cluster ofdifferentiation,以下記為 CD) 19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80(B7. I)、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86(B7. 2)、人類白細(xì)胞抗原(HLA)II類、EGFR等。作為與腫瘤的病態(tài)形成相關(guān)的抗原或調(diào)節(jié)免疫功能的抗原，可以列舉CD4、CD40、CD40 配體、B7 家族分子(CD80、CD86、CD274、B7-DC、B7-H2、B7-H3、B7-H4)、B7 家族分子的配體(CD28、CTLA-4、IC0S、PD-1、BTLA)、0X-40、0X-40 配體、CD137、腫瘤壞死因子(TNF)受體家族分子(DR4、DR5、TNFRU TNFR2)、TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體受體(TRAIL)家族分子、TRAIL家族分子的受體家族(TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4)、核因子κ B受體活化因子配體(RANK)、RANK配體、CD25、葉酸受體4、細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素-I α (以下將白細(xì)胞介素記為 IL)、IL-I β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF) β、TNF α等]、上述細(xì)胞因子的受體、趨化因子(SLC、ELC、1-309、TARC, MDC、CTACK等)、上述趨化因子的受體。作為抑制病變部位的血管新生的抗體的抗原，可以列舉血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管生成素、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、EGF、血小板源性生長因子(I3DGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、促紅細(xì)胞生成素(EP0)、TGFi3、IL-8、Ephilin、SDF-l等以及它們的受體。作為免疫刺激劑,可以是作為免疫佐劑已知的天然物,作為具體例，使免疫亢進(jìn)的 藥劑可以列舉β -I, 3-葡聚糖(香菇多糖、西佐糖)、α -半乳糖神經(jīng)酰胺(KRN7000)、菌體粉末(溶鏈菌、BCG)、菌體提取物(云芝多糖)。作為高分子藥劑，可以列舉聚乙二醇(以下記為PEG)、白蛋白、右旋糖酐、聚環(huán)氧乙烷、苯乙烯馬來酸共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、羥丙基甲基丙烯酰胺等。通過使這些高分子藥劑與抗體或抗體片段結(jié)合，可以期待發(fā)揮如下效果(I)提高對化學(xué)性、物理性或生物性的各種因素的穩(wěn)定性；(2)顯著延長血中半衰期；(3)抑制免疫原性消失并抑制抗體產(chǎn)生；等[才-卜醫(yī)薬品，廣川書店(1993)]。例如，作為使PEG與抗體結(jié)合的方法，可以列舉與PEG化修飾試劑進(jìn)行反應(yīng)的方法等[廣M才-卜醫(yī)薬品，廣川書店(1993)]。作為PEG化修飾試劑，可以列舉賴氨酸的氨基的修飾劑(日本特開昭61-178926)、天冬氨酸和谷氨酸的羧基的修飾劑(日本特開昭56-23587)、精氨酸的胍基的修飾劑(日本特開平2-117920)等。作為細(xì)胞因子或增殖因子，只要是使NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞等細(xì)胞亢進(jìn)的細(xì)胞因子或增殖因子則均可，可以列舉例如干擾素(以下記為IFN)-a、INF-β、INF- y、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)等。作為毒蛋白，可以列舉蓖麻毒素、白喉毒素、ONTAK等，還包括為調(diào)節(jié)毒性而向蛋白質(zhì)中引入突變而得到的蛋白毒素。作為放射性同位素，可以列舉:131I、125I、90Y、64Cu、199Tc、77Lu、211At、Rel86、Rel88、Inlll等。放射性同位素可以通過氯胺T法等直接與抗體進(jìn)行結(jié)合。另外，也可以在抗體結(jié)合用于螯合放射性同位素的物質(zhì)。作為螯合劑，可以列舉甲基苯基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)等。本發(fā)明中，可以將本發(fā)明中使用的抗體與一種以上的其他藥劑組合來施用，或者也可以與放射線照射組合。作為其他藥劑，可以列舉上述的化療劑、抗體藥品、免疫刺激齊U、細(xì)胞因子或增殖因子等。作為放射線照射，包括X射線、Y射線等光子(電磁波)照射；電子束、質(zhì)子束、重離子束等粒子束照射等。
作為組合施用的方法，可以與本發(fā)明中使用的抗體同時施用，或者也可以在施用本發(fā)明中使用的抗體前后施用。本發(fā)明的檢測方法、定量方法、檢測試劑、定量試劑或診斷劑中，可以列舉將特定的標(biāo)記物標(biāo)記到本發(fā)明的抗體上來使用的方法。作為標(biāo)記物，可以列舉通常的免疫學(xué)檢測或測定方法中使用的標(biāo)記物，可以列舉堿性磷酸酶、過氧化物酶、熒光素酶等酶；吖啶德酯、洛酚堿等發(fā)光物質(zhì)；異硫氰酸熒光素(FITC)、三甲基羅丹明(RITC)等熒光物質(zhì)；等。以下，對本發(fā)明的抗體的制造方法進(jìn)行具體說明。I.單克隆抗體的制造方法(I)抗原的制備通過下述中記載的方法，將包含編碼全長或部分長度IgAl重鏈的cDNA的表達(dá)載體導(dǎo)入在O連接型糖鏈合成過程中向多肽上的Ser/Thr上結(jié)合的GalNAc上附加Gal的酶、與該酶的活性相關(guān)的蛋白質(zhì)或與UDP-半乳糖的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白質(zhì)等的活性降低或缺失的酵母、昆蟲細(xì)胞、動物細(xì)胞等中，由此，能夠得到作為抗原的糖鏈缺陷型IgAl蛋白或表達(dá)糖鏈缺陷型IgAl的細(xì)胞。另外，也可以使用通過從在細(xì)胞膜上或培養(yǎng)液中大量表達(dá)糖鏈缺陷型IgAl的各種人來源的培養(yǎng)細(xì)胞、人組織等中純化出糖鏈缺陷型IgAl來制備抗原的方法，或者，制備具有糖鏈缺陷型IgAl的部分序列的合成肽并作為抗原使用。此外，可以通過在試管內(nèi)向使用不具有糖鏈附加能力的大腸桿菌等原核生物進(jìn)行表達(dá)、純化而得到的IgAl蛋白上附加糖鏈來得到糖鏈缺陷型IgAl。另外，同樣地操作，向具有正常的O連接型糖鏈合成過程的酵母、昆蟲細(xì)胞、動物細(xì)胞等宿主細(xì)胞中導(dǎo)入包含編碼全長或部分長度IgAl重鏈的cDNA的表達(dá)載體，由此可以獲得表達(dá)具有正常O連接型糖鏈的IgAl重鏈的細(xì)胞，并可以從該細(xì)胞中純化出具有正常O連接型糖鏈的IgAl重鏈蛋白。如上得到的糖鏈缺陷型IgAl蛋白、具有正常O連接型糖鏈的IgAl蛋白或它們的表達(dá)細(xì)胞可以用于目標(biāo)抗體的篩選、確認(rèn)所獲得的抗體對抗原的反應(yīng)性。作為本發(fā)明中使用的多肽，可以通過使用Molecular Cloning, A LaboratoryManual,第二 版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989)或 Current Protocols INMolecularBiology，約翰威立父子出版公司(1987-1997)等中記載的方法等，例如利用以下的方法，使編碼該多肽的DNA在宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)來制造。首先，將編碼全長多肽的cDNA插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體的啟動子的下游，由此制作重組載體。此時若有需要，也可以基于全長cDNA來制備包含編碼多肽的部分的適當(dāng)長度的DNA片段，并使用該DNA片段來代替上述全長cDNA。接著，將該重組載體導(dǎo)入適合于該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞中，由此可以得到生產(chǎn)多肽的轉(zhuǎn)化體。作為宿主細(xì)胞，只要是大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、動物細(xì)胞等具有附加O連接型糖鏈的能力并且能夠表達(dá)目的基因的宿主細(xì)胞，則均可以使用。作為表達(dá)載體，使用能夠在所使用的宿主細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制或者能夠整合到染色體中并且在能夠轉(zhuǎn)錄編碼多肽的DNA的位置含有適當(dāng)?shù)膯幼拥谋磉_(dá)載體。在使用大腸桿菌等原核生物作為宿主細(xì)胞的情況下，含有編碼本發(fā)明中使用的多肽的DNA而構(gòu)成的重組載體優(yōu)選為在原核生物中能夠進(jìn)行自主復(fù)制并且包含啟動子、核糖體結(jié)合序列、本發(fā)明中使用的DNA和轉(zhuǎn)錄終止序列的載體。該重組載體可以進(jìn)一步含有調(diào)控啟動子的基因。作為表達(dá)載體，可以列舉例如pBTrp2、pBTacl、pBTac2(均為羅氏診斷公司制造)、pKK233_2 (Pharmacia 公司制造)、pSE280 (Invitrogen 公司制造)、pGEMEX_l (Promega公司制造)、pQE-8 (QIAGEN公司制造)、pKYP10(日本特開昭58-110600)、pKYP200[Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984) ] > pLSAl[Agric.Biol. Chem.，53，277 (1989) ]、pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82，4306 (1985)]、pBlue scriptll SK(-) (Stratagene 公司制造)、pTrs30[由大腸桿菌 JM109/pTrS30 (FERMBP-5407)制備]、pTrs32[由大腸桿菌 JM109/pTrS32 (FERM BP-5408)制備]、pGHA2[由大腸桿菌IGHA2 (FERMBP-400)制備，日本特開昭60-221091]、pGKA2 [由大腸桿M IGKA2 (FERM BP-6798)制備，日本特開昭 60-221091]、pTerm2 (US4686191, US4939094,US5160735)、pSupex、pUBllO、pTP5、pC194、pEG400 [J. Bacteriol.，172,2392(1990)]、pGEX (Pharmacia 公司制造)、pET 系統(tǒng)(Novagen 公司制造)、pME18SFL3 等。作為啟動子，只要是能夠在所使用的宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動子則均可使用?？梢粤信e例如trp啟動子(Ptrp)、Iac啟動子、PL啟動子、PR啟動子、T7啟動子等來源于大腸桿菌或噬菌體等的啟動子。另外，也可以使用兩個Ptrp串聯(lián)而成的串聯(lián)啟動子、tac啟動子、lac T7啟動子、let I啟動子等經(jīng)過人為設(shè)計改變而得到的啟動子等。另外，作為上述重組載體，優(yōu)選使用將作為核糖體結(jié)合序列的夏因-達(dá)爾加諾(Shine-Dalgarno)序列與起始密碼子的間隔調(diào)節(jié)至適當(dāng)距離(例如6 18個堿基)而得到的質(zhì)粒。編碼本發(fā)明中使用的多肽的DNA的堿基序列中，可以對堿基進(jìn)行取代，以形成最適于在宿主內(nèi)表達(dá)的密碼子，由此，能夠提高目標(biāo)多肽的生產(chǎn)率。此外，上述重組載體中的基因的表達(dá)不一定需要轉(zhuǎn)錄終止序列，但優(yōu)選在緊鄰結(jié)構(gòu)基因的下游配置轉(zhuǎn)錄終止序列。作為宿主細(xì)胞，可以列舉屬于埃希氏菌屬等的微生物，可以列舉例如大腸桿菌XLl-Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HBlOI、大腸桿菌No. 49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49、大腸桿菌DH5a等。作為重組載體的導(dǎo)入方法，只要是向上述宿主細(xì)胞中導(dǎo)入DNA的方法則均可以使用，可以列舉例如使用鈣離子的方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69，2110 (1972)]、Gene, 17, 107(1982)或 Molecular&General Genetics, 168, 111 (1979)中記載的方法等。在使用動物細(xì)胞作為宿主的情況下，作為表達(dá)載體，可以列舉例如pcDNAI、pcDM8 (由 7 t ^ '> 公司銷售)、pAGE107[日本特開平 3-22979 ；Cytotechnology, 3,13 3, (1990)], pAS3-3(日本特開平 2-227075)、pCDM8 [Nature, 329，840，(1987)]> pcDNAI/Amp(Invitrogen 公司制造)、pcDNA3. I (Invitrogen 公司制造)、pREP4 (Invitrogen 公司制造)、pAGE103[J.Biochemistry, 101，1307(1987) ]、pAGE210、pME18SFL3、pKANTEX93[W097/10354]等。作為啟動子，只要是能夠在動物細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動子則均可以使用，可以列舉例如巨細(xì)胞病毒(CMV)的IE (即刻早期)基因的啟動子、SV40的早期啟動子、逆轉(zhuǎn)錄 病毒的啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、SR α啟動子、莫洛尼小鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus)的啟動子和增強(qiáng)子等。另外，也可以將人CMV的IE基因的增強(qiáng)子與啟動子一同使用。
作為宿主細(xì)胞，只要是在糖鏈合成途徑中向多肽上的Ser/Thr上結(jié)合的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)上附加Gal的酶、與該酶的活性相關(guān)的蛋白質(zhì)或與尿苷5’-二磷酸半乳糖(UDP-半乳糖)的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白質(zhì)等的活性降低或缺失的細(xì)胞系，則均可以使用。具體而言，可以列舉作為Μ)Ρ-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CH0細(xì)胞)的Lec8突變體[ACSSymp. Ser. 128，214(1980)]。此外，可以使用在與糖鏈合成途徑相關(guān)的酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性未缺失的細(xì)胞中使UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(別名UDP-半乳糖轉(zhuǎn)位蛋白，UGALT)或者核心I合酶即糖蛋白-N-乙酰半乳糖胺3-β -半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(C1GALT1，別名核心1_β -3-gal-t，t合酶)或C1GALT1-特異伴侶蛋白Kclgaltlcl，別名核心I β _3_半乳糖基轉(zhuǎn)移酶-特異分子伴侶(COSMC)，C1GALT2)等酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能降低或缺失的細(xì)胞系。作為與糖鏈合成途徑相關(guān)的酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性未缺失的細(xì)胞，可以列舉例如那馬瓦(Namalwa)細(xì)胞、作為猴細(xì)胞的COS細(xì)胞、作為中國倉鼠來源的細(xì)胞的CHO細(xì)胞、ΗΒΤ5637 (日本特開昭63-299)等。作為降低基因功能的方法，可以列舉反義法、核酶法[Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A.，96，1886 (1999)]、同源重組法[Manipulating the Mouse Embryo A LaboratoryManual (小鼠胚胎操作實(shí)驗(yàn)指南)，第二版,冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1994)、Gene Targeting, APractical Approach (基因?qū)れ雽?shí)踐探討)，牛津大學(xué)出版社旗下的IRL出版社(1993)]、RNA-DNA 寡核苷酸(RDO)法、RNA 干擾(RNAi)法[Nature, 391，806, (1998)、Proc. Natl.Acad. Sci. USA 95, 15502, (1998)、Nature, 395, 854, (1998)、Proc. Natl. Acad. Sci.USA)，96，5049，(1999)、Cell, 95，1017，(1998)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96，1451，(1999)roc. Natl. Acad. Sci. USA, 95，13959，(1998)、Nature Cell Biol.，2，70，(2000)]、使用逆轉(zhuǎn)錄病毒的方法、使用轉(zhuǎn)座子的方法[Nature Genetics, 25, 35, (2000)]等。作為載體的導(dǎo)入方法，只要是向動物細(xì)胞中導(dǎo)入DNA的方法則均可以使用，可以列舉例如電穿孔法[Cytotechnology, 3，133 (1990)]、磷酸I丐法(日本特開平2-227075)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84，7413 (1987)]等。作為基因的表達(dá)方法，除了直接表達(dá)以外，還可以根據(jù)Molecular Cloning, ALaboratory Manual,第二版,冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989)中記載的方法等進(jìn)行分泌生產(chǎn)、融合蛋白表達(dá)等。在真核生物來源的細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的情況下，可以得到附加有糖或糖鏈的多肽。將如上得到的轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)物中生成并蓄積該多肽，并從該培養(yǎng)物中進(jìn)行收集，由此可以制造多肽。將該轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的方法可以根據(jù)宿主的培養(yǎng)中使用的通常的方法來進(jìn)行。對利用使用誘導(dǎo)性啟動子作為啟動子的重組載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化后的微生物進(jìn)行培養(yǎng)時，可以根據(jù)需要向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物。例如，對利用使用Iac啟動子的重組載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化后的微生物進(jìn)行培養(yǎng)時，可以向培養(yǎng)基中添加異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷等，對利用使用trp啟動子的重組載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化后的微生物進(jìn)行培養(yǎng)時，可以向培養(yǎng)基中添加吲哚丙烯酸等。
作為用于培養(yǎng)以動物細(xì)胞為宿主而得到的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基，可以使用普遍使用的 RPMI 1640 培養(yǎng)基[The Journal of the American MedicalAssociation, 199，519 (1967)]、伊戈爾(Eagle)的 MEM 培養(yǎng)基[Science, 122，501 (1952)]、杜爾貝科改良 MEM 培養(yǎng)基[Virology, 8，396 (1959) ]、199 培養(yǎng)基[Proc. Soc. Exp. Biol.Med.，73，1(1950)]或者向這些培養(yǎng)基中添加FCS等而得到的培養(yǎng)基等。培養(yǎng)通常在pH6 8、3(T40°C、5%C02存在下等條件下進(jìn)行廣7天。另外，在培養(yǎng)中，可以根據(jù)需要向培養(yǎng)基中添加卡那霉素、青霉素等抗生素。如上所述，將包含重組有編碼本發(fā)明中使用的多肽的DNA的重組載體的來源于微生物、動物細(xì)胞等的轉(zhuǎn)化體根據(jù)通常的培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，生成并蓄積該多肽，并從該培養(yǎng)物進(jìn)行收集，由此可以制造本發(fā)明中使用的多肽。作為基因的表達(dá)方法，除了直接表達(dá)以夕卜，還可以根據(jù)MolecularCloning, Alaboratory Manual,第二版,冷泉 港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989)中記載的方法等進(jìn)行分泌生產(chǎn)、融合蛋白表達(dá)等。作為多肽的生產(chǎn)方法，有如下方法在宿主細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)的方法、分泌到宿主細(xì)胞外的方法以及在宿主細(xì)胞外膜上生產(chǎn)的方法，通過改變使用的宿主細(xì)胞或者所生產(chǎn)的多肽的結(jié)構(gòu)，可以選擇適當(dāng)?shù)姆椒?。在宿主?xì)胞內(nèi)或宿主細(xì)胞外膜上生產(chǎn)多肽的情況下，通過使用鮑爾森等人的方法[J. Biol. Chem. ,264，17619(1989)]、羅等人的方法[Proc. Natl. Acad.Sci.，USA, 86，8227 (1989)、Genes Develop.，4，1288 (1990)]或者日本特開平 05-336963、W094/23021等中記載的方法，可以使該基因產(chǎn)物分泌到宿主細(xì)胞外。另外，還可以根據(jù)日本特開平2-227075中記載的方法，利用使用二氫葉酸還原酶基因等的基因擴(kuò)增系統(tǒng)來提高生產(chǎn)量。多肽可以以例如如下所述的方式進(jìn)行分離和純化。多肽在細(xì)胞內(nèi)以溶解狀態(tài)進(jìn)行表達(dá)的情況下，培養(yǎng)結(jié)束后通過離心分離來回收細(xì)胞，懸濁于水性緩沖液中后，利用超聲波破碎機(jī)、法式壓濾壺、MANT0N-GULIN勻漿器、臥式砂磨機(jī)等將細(xì)胞破碎，從而得到無細(xì)胞提取液。將該無細(xì)胞提取液進(jìn)行離心分離，從所得到的上清中利用通常的酶的分離純化法得到純化制備品，即，單獨(dú)或組合使用溶劑提取法、利用硫酸銨等的鹽析法、脫鹽法、利用有機(jī)溶劑的沉淀法、使用二乙氨基乙基(DEAE)-瓊脂糖、DIAION HPA-75(三菱化學(xué)公司制造)等樹脂的陰離子交換層析法、使用S-S印haroseFF(Pharmacia公司制造)等樹脂的陽離子交換層析法、使用丁基瓊脂糖、苯基瓊脂糖等樹脂的疏水層析法、使用分子篩的凝膠過濾法、親和層析法、聚焦層析法、等電點(diǎn)電泳等電泳法等方法。另外，多肽在細(xì)胞內(nèi)形成包涵體而進(jìn)行表達(dá)的情況下，同樣地將細(xì)胞回收后進(jìn)行破碎，并進(jìn)行離心分離，由此，以沉淀級分的形式回收該多肽的包涵體。利用蛋白變性劑使回收的該多肽的包涵體可溶化。通過對該可溶化液進(jìn)行稀釋或透析，使該多肽恢復(fù)至正常的立體結(jié)構(gòu)，然后，通過與上述同樣的分離純化方法得到多肽的純化制備品。另外,本發(fā)明中使用的多肽也可以通過Fmoc法(荷甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化學(xué)合成法來制造。另外，還可以利用Advanced ChemTech公司、/、° -々> · 二卟-公司、Pharmacia 公司、Protein Technology Instrument 公司、Synthecel 1-Vega 公司、PerSeptive公司、島津制作所等的肽合成儀進(jìn)行化學(xué)合成。(2)動物的免疫和抗體產(chǎn)生細(xì)胞的制備
對3 20周齡的小鼠、大鼠或倉鼠進(jìn)行如上制備的抗原的免疫，收集該動物的脾臟、淋巴結(jié)、末梢血中的抗體產(chǎn)生細(xì)胞。另外，在免疫原性低因而在上述動物中未觀察到充分的抗體效價升高的情況下，還有使用CD27敲除動物作為被免疫動物的方法。免疫通過將抗原連同適當(dāng)?shù)淖魟例如，完全弗氏佐劑(Complete Freund’ sAdjuvant)或氫氧化鋁凝膠和百日咳菌疫苗等]一同施用到動物的皮下、靜脈內(nèi)或腹腔內(nèi)來進(jìn)行。在抗原為部分肽的情況下，與BSA(牛血清白蛋白)或KLH(鑰孔蜮血藍(lán)蛋白，Keyhole Limpet Hemocyanin)等載體蛋白制成結(jié)合物,將其作為免疫原使用。關(guān)于抗原的施用，在第一次施用之后，每隔f 2周施用5 10次。每次施用后第3 7天從眼底靜脈叢采血，利用酶免疫測定法[Antibodies-A Laboratory Manual,冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1988]等考察其血清與抗原的反應(yīng)。將其血清對免疫所用的抗原顯示出充分的抗體效價的小鼠、大鼠或倉鼠供作脾臟細(xì)胞的供給源。 在供于脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合時，在抗原物質(zhì)的末次施用后第3 7天從免疫后的小鼠、大鼠或倉鼠中摘除脾臟，收集脾臟細(xì)胞。將脾臟在MEM培養(yǎng)基(日水制藥公司制造)中細(xì)細(xì)切碎，用鑷子攪散，并離心分離(1200rpm、5分鐘)，然后，棄去上清，用Tris-氯化銨緩沖液(pH7. 65)處理f 2分鐘以除去紅細(xì)胞，并用MEM培養(yǎng)基洗滌3次，從而提供融合用脾臟細(xì)胞。(3)骨髓瘤細(xì)胞的制備作為骨髓瘤細(xì)胞，使用由小鼠得到的確立細(xì)胞系?？梢允褂美?-氮雜鳥嘌呤抗性小鼠(BALB/c來源)骨髓瘤細(xì)胞系P3-X63Ag8-Ul (P3-U1) [CurrentTopicsin Microbiology and Immunology, 18，I (1978)]、P3_NSl/l_Ag41(NS-1)[European J. Immunology, 6，511(1976)]、SP2/0_Ag 14 (SP-2)[Nature, 276, 269(1978)],P3-X63-Ag8653 (653) [J. Immunology, 123，1548 (1979)]、P3_X6 3_Ag8 (X63)[Nature, 256，495 (1975)]等。這些細(xì)胞系在8-氮雜鳥嘌呤培養(yǎng)基[向在RPMI-1640培養(yǎng)基中添加有谷氨酰胺(I. 5mM)、2_巰基乙醇(5X I(T5M)、慶大霉素(10 μ g/mL)和胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)基(以下稱為正常培養(yǎng)基)中進(jìn)一步添加8-氮雜鳥嘌呤(lSyg/mL)而得到的培養(yǎng)基]中傳代培養(yǎng)，在細(xì)胞融合的3 4天之前傳代到正常培養(yǎng)基中，以確保融合當(dāng)天達(dá)到2X IO7個以上的細(xì)胞數(shù)。(4)細(xì)胞融合將上述抗體產(chǎn)生細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞用MEM培養(yǎng)基或PBS (磷酸氫二鈉I. 83g、磷酸二氫鉀O. 21g、食鹽7. 65g、蒸餾水I升、pH7. 2)充分洗滌，以使細(xì)胞數(shù)達(dá)到抗體產(chǎn)生細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞=5 10:1的方式進(jìn)行混合，離心分離(1200rpm、5分鐘)后，棄去上清，將沉淀的細(xì)胞群充分?jǐn)嚿⒑?，在攪拌的同時在37°C下以O(shè). 2 lmL/ΙΟ8個抗體產(chǎn)生細(xì)胞的量加入2g聚乙二醇-1000 (PEG-1000)、2mL MEM和0. 7mL 二甲亞砜的混合溶液，并每隔2分鐘加入r2mL的MEM培養(yǎng)基，重復(fù)數(shù)次后，加入MEM培養(yǎng)基至總量達(dá)到50mL。離心分離(900rpm、5分鐘)后，棄去上清，輕輕地將細(xì)胞攪散后，通過用刻度吸管吸入并吹出，輕輕地將細(xì)胞懸浮于IOOmL HAT培養(yǎng)基[在正常培養(yǎng)基中添加有次黃嘌呤(10_4摩爾/升)、胸腺嘧啶核苷(1·5Χ10_5摩爾/升)和氨基蝶呤(4Χ10_7摩爾/升)的培養(yǎng)基]中。將該懸浮液以100 μ L/孔分注到96孔培養(yǎng)板中，在5%C02的培養(yǎng)箱中在37°C下培養(yǎng)7 14天。培養(yǎng)后，取一部分培養(yǎng)上清，通過后述的結(jié)合分析等選出與包含本發(fā)明中使用的多肽的抗原發(fā)生反應(yīng)而不與不含多肽的抗原發(fā)生反應(yīng)的細(xì)胞。然后，利用有限稀釋法重復(fù)進(jìn)行兩次克隆[第一次使用HT培養(yǎng)基(從HAT培養(yǎng)基中除去氨基蝶呤而得到的培養(yǎng)基)，第 二次使用正常培養(yǎng)基]，選出穩(wěn)定地觀察到強(qiáng)抗體效價的細(xì)胞作為產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤株。(5)單克隆抗體的制備對姥鮫烷處理[腹腔內(nèi)施用O. 5mL的2，6，10，14-四甲基十五碳烷(姥鮫烷)，飼養(yǎng)2周]后的8 10周齡的小鼠或裸鼠以2X106飛XlO7細(xì)胞/只的量腹腔內(nèi)注射(4)中得到的產(chǎn)生抗CD27單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。在1(Γ21天內(nèi)雜交瘤產(chǎn)生癌性腹水。從該小鼠中收集腹水，離心分離(3000rpm、5分鐘)除去固體成分后，用40 50%的硫酸銨進(jìn)行鹽析，然后，利用辛酸沉淀法、DEAE-瓊脂糖柱、蛋白A柱或凝膠過濾柱進(jìn)行純化，收集IgG或IgM級分，作為純化的單克隆抗體。抗體亞類的確定使用亞類分型試劑盒通過酶免疫測定法來進(jìn)行。蛋白量的定量通過勞里法和280nm下的吸光度來計算。(6)結(jié)合分析作為抗原，使用通過本項(xiàng)(I)中記載的方法將包含編碼本發(fā)明中使用的⑶27多肽的cDNA的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、動物細(xì)胞等中而得到的基因?qū)爰?xì)胞或重組蛋白、或者由人組織得到的純化多肽或部分肽。在抗原為部分肽的情況下，與BSA(牛血清白蛋白)或KLH(鑰孔誠血藍(lán)蛋白，Keyhole Limpet Hemocyanin)等載體蛋白制成結(jié)合物，并使用該結(jié)合物。將上述抗原分注到96孔板中并使其固相化，然后，分注被免疫動物血清、產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤的培養(yǎng)上清或純化抗體作為第一抗體，并使其發(fā)生反應(yīng)。用PBS或PBS-0. 05%吐溫充分洗滌后，分注由生物素、酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或放射線化合物等標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體作為第二抗體，并使其發(fā)生反應(yīng)。用PBS-吐溫充分洗滌后，進(jìn)行與第二抗體的標(biāo)記物質(zhì)對應(yīng)的反應(yīng)。與識別包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的CD27且與該重鏈鉸鏈區(qū)結(jié)合的單克隆抗體產(chǎn)生競爭的抗體,可以通過向上述結(jié)合分析系統(tǒng)中添加受試抗體并使其反應(yīng)來獲得。即，篩選出在加入受試抗體時單克隆抗體的結(jié)合受到抑制的抗體，由此可以獲得在向糖鏈缺陷型IgAl的重鏈鉸鏈區(qū)上結(jié)合時與獲得的單克隆抗體產(chǎn)生競爭的單克隆抗體。另外，與識別糖鏈缺陷型IgAl且與該重鏈鉸鏈區(qū)結(jié)合的單克隆抗體所識別的表位結(jié)合的抗體，可以通過如下方法獲得對在上述結(jié)合分析系統(tǒng)中獲得的抗體的表位進(jìn)行鑒定，制作所鑒定出的表位的部分糖鏈結(jié)合肽或者模擬表位的立體結(jié)構(gòu)的糖鏈結(jié)合肽等，并進(jìn)行免疫。2.基因重組抗體的制作作為基因重組抗體的制作例，以下示出人嵌合抗體和人源化抗體的制作方法。(I)基因重組抗體表達(dá)用載體的構(gòu)建基因重組抗體表達(dá)用載體是指重組有編碼人抗體的CH和CL的DNA的動物細(xì)胞用表達(dá)載體，可以通過將編碼人抗體的CH和CL的DNA分別克隆到動物細(xì)胞用表達(dá)載體中來進(jìn)行構(gòu)建。人抗體的C區(qū)可以使用任意的人抗體的CH和CL?？梢粤信e例如人抗體的Y I亞類的CH和K類的CL等。作為編碼人抗體的CH和CL的DNA，可以使用包含外顯子和內(nèi)含子的染色體DNA，也可以使用cDNA，優(yōu)選使用cDNA。作為動物細(xì)胞用表達(dá)載體，只要是能夠重組并表達(dá)編碼人抗體的C區(qū)的基因的載體則均可以使用?？梢粤信e例如pAGE107 [Cytotechnol.，3，133 (1990) ]、pAGE103 [J. Biochem. , 101, 1307 (1987)]、pHSG274[Gene, 27，223 (1984) ]、pKCR[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78，1527(1981) ]、pSGlbd2-4[Cytotechnol.,4，173(1990)]、pSElUKlSedl-3[Cytotechnol.，13, 79(1993)〕等。作為動物細(xì)胞用表達(dá)載體中使用的啟動子和增強(qiáng)子，可以列舉SV40的早期啟動子[J. Biochem. , 101, 1307 (1987)]、莫洛尼小鼠白血病病毒的 LTR[Biochem. Biophys. Res.Commun.，149，960 (1987)]、免疫球蛋白 H 鏈的啟動子[Cell, 41，479 (1985)]和增強(qiáng)子[Cell, 33，717(1983)]等?；蛑亟M抗體表達(dá)用載體可以使用抗體H鏈和L鏈存在于不同載體上的類型或者存在于同一載體上的類型(串聯(lián)型)中的任意一種，從基因重組抗體表達(dá)載體的構(gòu)建的容易度、向動物細(xì)胞中導(dǎo)入的容易度、抗體H鏈與L鏈在動物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量的平衡均衡等觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選串聯(lián)型基因重組抗體表達(dá)用載體[J. Immunol. Methods, 167，271(1994)]。作為串聯(lián)型基因重組抗體表達(dá)用載體，可以列舉pKANTEX93[W097/10354]、 pEE18[Hybridoma, 17，559(1998)]等。(2)編碼人以外的動物來源的抗體的V區(qū)的cDNA的獲得和氨基酸序列的分析編碼非人抗體的VH和VL的cDNA可以如下獲得。從產(chǎn)生非人抗體的雜交瘤細(xì)胞中提取mRNA，并合成cDNA。將合成的cDNA克隆到噬菌體或質(zhì)粒等載體中，制作cDNA文庫。使用編碼小鼠抗體的C區(qū)部分或V區(qū)部分的DNA作為探針，從該文庫中分別分離出具有編碼VH或VL的cDNA的重組噬菌體或重組質(zhì)粒。分別確定重組噬菌體或重組質(zhì)粒上的目標(biāo)小鼠抗體的VH或VL的全長堿基序列，由堿基序列分別推測出VH或VL的全長氨基酸序列。作為人以外的動物，只要能夠制作小鼠、大鼠、倉鼠、兔等的雜交瘤細(xì)胞則均可以使用。作為由雜交瘤細(xì)胞制備總RNA的方法，可以列舉異硫氰酸胍三氟乙酸銫法[Methods in Enzymol. , 154, 3 (1987)]等，另外，作為試劑盒，可以列舉RNAeasy試劑盒(QIAGEN公司制造)等。作為由總RNA制備mRNA的方法,可以列舉固定有寡聚(dT)的纖維素柱法[Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第二版(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)]等，另外，作為試劑盒，可以列舉01igoTM-dT30〈Super>mRNA純化試劑盒(Takara公司制造)等。作為由雜交瘤細(xì)胞制備mRNA的試劑盒,可以列舉FastTrack mRNA分離試劑盒(Invitrogen公司制造)、QuickPrepm RNA純化試劑盒(Pharmacia公司制造)等。作為cDNA的合成和cDNA文庫的制作方法，可以列舉常規(guī)方法[MolecularCloning, A Laboratory Manual,第二版(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989) ; Current Protocolsin Molecular Biology,副刊1_34]或者使用市售試劑盒例如用于cDNA合成和質(zhì)?？寺〉腟uperScript 質(zhì)粒系統(tǒng)(Invitrogen公司制造)或ZAP-cDNA合成試劑盒(Stratagene公司制造)的方法等。在制作cDNA文庫時，用于重組以由雜交瘤細(xì)胞提取出的mRNA為模板而合成的cDNA的載體只要是能夠重組該cDNA的載體則均可以使用?？梢允褂美鏩APExpress [Strategies, 5, 58(1992)]>pBluescript IISK(+)[Nucleic Acids Research, 17, 9494(1989)]>λ ZAPII (Stratagene 公司制造)、λ gtlO> Xgtll [DNA Cloning: A PracticalApproach, I, 49 (1985) ]、λ BlueMid (Clontech 公司制造)、λ ExCell、pT7T318U (Pharmacia公司制造)、pcD2 [Mol. Cell. Biol.，3，280 (1983)]和 pUC18 [Gene, 33，103 (1985)]等。作為用于導(dǎo)入由噬菌體或質(zhì)粒載體構(gòu)建的cDNA文庫的大腸桿菌，只要是能夠?qū)?、表達(dá)和保持該cDNA文庫的大腸桿菌 則均可以使用。可以使用例如XLl-Blue MRF，[Strategies, 5，81 (1992)]、C600 [Genetics, 39，440(1954)]、Y1088、Y1090[Science, 222，778(1983)]、NM522[J. Mol. Biol.，166，I (1983)]、K802[J. Mol.Biol.，16，118(1966)]和 JM105[Gene, 38，275(1985)]等。作為從cDNA文庫中篩選編碼非人抗體的VH或VL的cDNA克隆的方法，可以通過使用同位素或突光標(biāo)記的探針的克隆雜交法或曬菌斑雜交法[Molecular Cloning, ALaboratory Manual,第二版(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)]來進(jìn)行篩選。另外，也可以制備引物，將由mRNA合成的cDNA或cDNA文庫作為模板，通過聚合酶鏈反應(yīng)[以下記為PCR法；Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第二版、冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989) ; CurrentProtocolsin Molecular Biology,副刊 1-34]來制備編碼 VH 或 VL 的 cDNA。將通過上述方法篩選出的cDNA利用適當(dāng)?shù)南拗菩悦傅冗M(jìn)行切割后，克隆到pBluescript SK(-) (Stratagene公司制造)等質(zhì)粒中，進(jìn)行通常使用的堿基序列分析方法例如桑格(Sanger, F.)等人的雙脫氧法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)]等的反應(yīng)，并使用堿基序列自動分析裝置例如A. L. F. DNA測序儀(Pharmacia公司制造)等進(jìn)行分析，由此，可以確定該cDNA的堿基序列。由確定出的堿基序列分別推測VH和VL的全長氨基酸序列，與已知的抗體的VH和VL 的全長氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept.Health and Human Services (1991)]進(jìn)行比較，由此,可以分別確認(rèn)所獲得的cDNA是否編碼包含分泌信號序列的抗體的VH和VL的完整氨基酸序列。關(guān)于包含分泌信號序列的抗體的VH和VL的完整氨基酸序列，通過與已知的抗體的VH和VL的全長氨基酸序列[Sequencesof Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]進(jìn)行比較，可以推測出分泌信號序列的長度和N末端氨基酸序列，進(jìn)而可以獲知它們所屬的亞類。另外，VH和VL的各⑶R的氨基酸序列也通過與已知的抗體的VH和VL的氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and HumanServices (1991)]進(jìn)行比較來找出。進(jìn)而，使用VH和VL的完整氨基酸序列，利用任意的數(shù)據(jù)庫例如對于SWISS-PR0T或PIR-蛋白等利用BLAST法[J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)]等進(jìn)行序列同源性檢索，從而可以確認(rèn)使用的氨基酸序列是否是新的氨基酸序列。(3)人嵌合抗體表達(dá)載體的構(gòu)建將編碼非人抗體的VH或VL的cDNA分別克隆到本項(xiàng)2的(I)中記載的基因重組抗體表達(dá)用載體的編碼人抗體的CH或CL的各基因的上游，從而可以構(gòu)建人嵌合抗體表達(dá)載體。例如，為了使編碼非人抗體的VH或VL的cDNA的3’末端側(cè)與人抗體的CH或CL的5’末端側(cè)連接，制作以如下方式設(shè)計的VH和VL的cDNA :連接部分的堿基序列編碼適當(dāng)?shù)陌被岵⑶覟檫m當(dāng)?shù)南拗菩悦缸R別序列。將所制作的VH和VL的cDNA分別克隆到本項(xiàng)2的(I)中記載的人源化抗體表達(dá)用載體的編碼人抗體的CH或CL的各基因的上游，以使它們以適當(dāng)?shù)男问竭M(jìn)行表達(dá)，從而可以構(gòu)建人嵌合抗體表達(dá)載體。另外，也可以使用在兩端具有適當(dāng)?shù)南拗菩悦傅淖R別序列的合成DNA，通過PCR法對編碼非人抗體VH或VL的cDNA分別進(jìn)行擴(kuò)增，并將它們分別克隆到本項(xiàng)2的(I)中記載的基因重組抗體表達(dá)用載體中。(4)編碼人源化抗體的V區(qū)的cDNA的構(gòu)建編碼人源化抗體的VH或VL的cDNA可以如下構(gòu)建。首先，分別選擇用于移植非人抗體的VH或VL的CDR的氨基酸序列的人抗體的VH或VL的框架區(qū)(以下記為FR)的氨基酸序列。作為選擇的FR的氨基酸序列，只要是人抗體來源的氨基酸序列則均可以使用?？梢粤信e例如蛋白數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank)等數(shù)據(jù)庫中登記的人抗體的FR的氨基酸序列、人抗體的FR的各亞類的共有氨基酸序列[Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, US Dept. Health and Human Services (1991)]等。為了抑制抗體的結(jié)合活性的降低，選擇與原來的抗體的VH或VL的FR的氨基酸序列具有盡量高的同源性(至少60%以上)的FR的氨基酸序列。接著，向選擇好的人抗體的VH或VL的FR的氨基酸序列中分別移植原抗體的CDR的氨基酸序列，從而分別設(shè)計出人源化抗體的VH或VL的氨基酸序 列?？紤]在抗體基因的堿基序列中出現(xiàn)的密碼子的使用頻率[Sequences of Proteins ofImmunological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)],將設(shè)計好的氨基酸序列轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA序列，從而分別設(shè)計出編碼人源化抗體的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列?；谠O(shè)計好的DNA序列，合成多條包含約100個堿基的長度的合成DNA，使用這些合成DNA進(jìn)行PCR法。這種情況下，從PCR中的反應(yīng)效率和能夠合成的DNA的長度考慮，優(yōu)選對于H鏈、L鏈均設(shè)計6條合成DNA。另外，通過在位于兩端的合成DNA的5’末端導(dǎo)入適當(dāng)?shù)南拗菩悦傅淖R別序列，可以容易地將編碼人源化抗體的VH或VL的cDNA克隆到本項(xiàng)2的(I)中構(gòu)建的人源化抗體表達(dá)用載體中。PCR反應(yīng)后,將擴(kuò)增產(chǎn)物分別克隆到pBluescript SK(-) (Stratagene公司制造)等質(zhì)粒中，通過本項(xiàng)2的(2)中記載的方法來確定堿基序列，從而獲得具有編碼期望的人源化抗體的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列的質(zhì)粒。(5)人源化抗體的V區(qū)的氨基酸序列的改變已知僅將非人抗體的VH和VL的⑶R移植到人抗體的VH和VL的FR中時，人源化抗體的抗原結(jié)合活性與原來的非人抗體相比降低[BI0/TECHN0L0GY，9，266(1991)]。認(rèn)為其原因在于，原來的非人抗體的VH和VL中，不僅CDR與抗原結(jié)合活性相關(guān)，而且FR內(nèi)的氨基酸殘基也直接或間接地與抗原結(jié)合活性相關(guān)，因此，通過人源化使非人抗體的FR的氨基酸殘基取代為人抗體的FR的氨基酸殘基時，抗原結(jié)合活性降低。為了解決該問題，在人源化抗體中，鑒定出人抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列中直接與抗原的結(jié)合相關(guān)的氨基酸殘基、與CDR的氨基酸殘基相互作用的氨基酸殘基以及維持抗體的立體結(jié)構(gòu)并間接與抗原的結(jié)合相關(guān)的氨基酸殘基，將這些氨基酸殘基取代為原來的非人抗體的氨基酸殘基，由此使降低的抗原結(jié)合活性升高[BI0/TECHN0L0GY，9，266(1991)]。人源化抗體的制作中，為了解決如何能夠有效地鑒定出這些與抗原結(jié)合活性相關(guān)的FR的氨基酸殘基的問題，利用X射線晶體分析[J. Mol. Biol.，112，535(1977)]或計算機(jī)模擬分析[ProteinEngineering, 7, 1501 (1994)]等進(jìn)行抗體的立體結(jié)構(gòu)的構(gòu)建和分析。上述抗體的立體結(jié)構(gòu)的信息給人源化抗體的制作帶來很多有益的信息，而另一方面，尚未建立能夠適用于所有抗體的人源化抗體的制作方法，就現(xiàn)狀而言，需要進(jìn)行針對各個抗體制作多種改變體并研究它們與抗原結(jié)合活性的相關(guān)性等各種嘗試。人抗體的VH和VL的FR的氨基酸殘基可以通過使用改變用合成DNA進(jìn)行本項(xiàng)2的(4)中記載的PCR法來進(jìn)行改變。對于PCR后的擴(kuò)增產(chǎn)物，通過本項(xiàng)2的(2)中記載的方法來確定堿基序列，從而確認(rèn)已實(shí)施了目標(biāo)改變。(6)人源化抗體表達(dá)載體的構(gòu)建將構(gòu)建好的編碼基因重組抗體的VH或VL的cDNA分別 克隆到本項(xiàng)2的(I)中記載的基因重組抗體表達(dá)用載體的編碼人抗體的CH或CL的各基因的上游，從而可以構(gòu)建人源化抗體表達(dá)載體。例如，通過向本項(xiàng)2的(4)和(5)中構(gòu)建人源化抗體的VH或VL時使用的合成DNA中、位于兩端的合成DNA的5’末端導(dǎo)入適當(dāng)?shù)南拗菩悦傅淖R別序列，可以將構(gòu)建好的VH或VL的cDNA分別克隆到本項(xiàng)2的(I)中記載的人源化抗體表達(dá)用載體的編碼人抗體的CH或CL的各基因的上游，以使它們以適當(dāng)?shù)男问竭M(jìn)行表達(dá)。(7)基因重組抗體的瞬時表達(dá)為了有效地評價制作的多種人源化抗體的抗原結(jié)合活性，可以使用本項(xiàng)2的(3)和(6)中記載的基因重組抗體表達(dá)載體或者對上述載體進(jìn)行改變后的表達(dá)載體，進(jìn)行基因重組抗體的瞬時表達(dá)。作為用于導(dǎo)入表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，只要是能夠表達(dá)基因重組抗體的宿主細(xì)胞則可以使用任何細(xì)胞，從表達(dá)量高的觀點(diǎn)出發(fā)，一般使用C0S-7細(xì)胞(ATCCCRL1651) [Methods in Nucleic Acids Res. , CRC press, 283 (1991)]。作為將表達(dá)載體導(dǎo)入C0S-7細(xì)胞的方法,可以列舉DEAE-右旋糖酐法[Methods in Nucleic Acids Res. , CRCpress, 283 (1991)]、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84，7413 (1987)]等。導(dǎo)入表達(dá)載體后，培養(yǎng)上清中的基因重組抗體的表達(dá)量和抗原結(jié)合活性可以通過酶聯(lián)免疫吸附法[以下記為ELISA法；Monoclonal Antibodies-Principles andpractice,第三版,美國學(xué)術(shù)出版社(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual,冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1988)、単夕口 - >抗體実験7 二二 7 >、講談社寸4工 > 于4 7 4、y夕(1987)]等來測定。(8)基因重組抗體的穩(wěn)定表達(dá)通過將本項(xiàng)2的(3)和(6)中記載的基因重組抗體表達(dá)載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，可以得到穩(wěn)定表達(dá)基因重組抗體的轉(zhuǎn)化株。作為將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法，可以列舉電穿孔法[日本特開平2-257891、Cytotechnology, 3，133(1990)]等。作為用于導(dǎo)入基因重組抗體表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，只要是能夠表達(dá)基因重組抗體的宿主細(xì)胞則可以使用任何細(xì)胞?？梢粤信e例如小鼠SP2/0-Agl4細(xì)胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8. 653細(xì)胞(ATCC CRL1580)、兩種中國倉鼠卵巢細(xì)胞CHO/dhfr-細(xì)胞(ATCCCRL9096)和 CH0/DG44 細(xì)胞[Somatic Cell and Molecular Genetics, 12，555 (1986)]、獲得了凝集素抗性的 Lecl3 細(xì)胞[Somatic Cell and Molecular genetics, 12，55 (1986)]、a 1,6-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因缺失的CHO細(xì)胞(W005/35586、W002/31140)、大鼠YB2/3HL.P2. Gil. 16Ag. 20 細(xì)胞(ATCC CRL1662)等。除了上述宿主細(xì)胞以外，還可以使用與細(xì)胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖的合成相關(guān)的酶等蛋白質(zhì)、與在N-糖苷鍵復(fù)合型糖鏈的還原末端的N-乙酰葡糖胺的6位上使巖藻糖的I位進(jìn)行α連接的糖鏈修飾相關(guān)的酶等蛋白質(zhì)或與細(xì)胞內(nèi)糖核苷酸GDP-巖藻糖向高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白質(zhì)等的活性降低或缺失的宿主細(xì)胞，優(yōu)選使用W005/35586、W002/31140等中記載的α I, 6_巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因缺失的CHO細(xì)胞等。導(dǎo)入表達(dá)載體后，根據(jù)日本特開平2-257891中公開的方法，在含有G418硫酸鹽(以下記為G418，SIGMA公司制造)等藥劑的動物細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，由此可以篩選穩(wěn)定表達(dá)基因重組抗體的轉(zhuǎn)化株。作為動物細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基，可以使用RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司制造)、GIT培養(yǎng)基(日本制藥公司制造)、EX-CELL301培養(yǎng)基(JRH公司制造)、IMDM培養(yǎng)基(Invitrogen公司制造)、雜交瘤-SFM培養(yǎng)基(Invitrogen公司制造)或者在這些培養(yǎng)基中添加有胎牛血清(以下記為FCS)等各種添加物的培養(yǎng)基等。通過將所得到的轉(zhuǎn)化株在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，可以在培養(yǎng)上清中表達(dá)并蓄積基因重組抗體。培養(yǎng)上清中的基因重組抗體的表達(dá)量和抗原結(jié)合活性可以通過ELISA法等來測定。另外，可以根據(jù)日本特開平2-257891中公開的方法，利用DHFR擴(kuò)增系統(tǒng)等，使轉(zhuǎn)化株的基 因重組抗體的表達(dá)量升高?；蛑亟M抗體可以使用蛋白A層析柱從轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)上清中進(jìn)行純化[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,第三版，美國學(xué)術(shù)出版社(1996)；Antibodies-ALaboratory Manual,冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1988)]。另外，除此以外,可以使用蛋白純化中通常使用的純化方法。例如，可以將凝膠過濾、離子交換層析和超濾等組合來進(jìn)行純化。純化后的基因重組抗體的H鏈、L鏈或整個抗體分子的分子量可以通過聚丙烯酰胺凝膠電泳[以下記為SDS-PAGE ；Nature, 227,680(1970)]或蛋白免疫印跡法[MonoclonalAntibodies-Principles and practice,第三版，美國學(xué)術(shù)出版社(1996) ；Antibodies-ALaboratory Manual,冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1988)]等來測定。3.本發(fā)明的抗體或抗體片段的活性評價 純化后的本發(fā)明的抗體或抗體片段的反應(yīng)特異性可以如下進(jìn)行評價。將表達(dá)正常型糖鏈的細(xì)胞和在O連接型糖鏈合成過程中向多肽上的Ser/Thr上結(jié)合的GalNAc上附加Gal的酶、與該酶的活性相關(guān)的蛋白質(zhì)或與尿苷5’ - 二磷酸半乳糖(UDP-半乳糖)的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白質(zhì)等的活性降低或缺失的細(xì)胞系作為宿主，可以分別制作表達(dá)編碼IgAl重鏈的堿基序列(3)的IgAl表達(dá)細(xì)胞。這樣，可以制作出表達(dá)具有正常O連接型糖鏈的IgAl的細(xì)胞、表達(dá)糖鏈缺陷型IgAl的細(xì)胞，并通過ELISA法和熒光抗體法[Cancer Immunol. Immunother. , 36, 373(1993)]等測定表達(dá)各IgAl的細(xì)胞系與純化抗體的反應(yīng)性。另外，通過將膜型IgAl的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域以融合蛋白等可溶物的形式分別在上述宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)并在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行純化，可以分別制作保持了立體結(jié)構(gòu)的可溶型IgAl蛋白。作為融合蛋白，可以列舉使IgAl蛋白與抗體恒定區(qū)(也稱為Fe)、GST標(biāo)簽、組氨酸標(biāo)簽(也稱為His標(biāo)簽)或Myc標(biāo)簽等其他多肽融合而得到的蛋白。該融合蛋白可以通過使用蛋白A、鎳柱、特異性抗體柱等親和層析柱來進(jìn)行分離純化。也可以通過利用表面等離子體共振(SPR)的BIAcore 、ELISA法或免疫沉淀法等來測定這些純化的可溶型CD27蛋白與純化抗體的反應(yīng)性[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,第三版，美國學(xué)術(shù)出版社(1996) ；Antibodies-A Laboratory Manual,冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1988)]。
4.使用特異性識別本發(fā)明的糖鏈缺陷型IgAl且與該重鏈鉸鏈區(qū)結(jié)合的單克隆抗體或其抗體片段的疾病診斷方法通過使用本發(fā)明的抗體或該抗體片段對糖鏈缺陷型IgAl或表達(dá)、蓄積該多肽的細(xì)胞進(jìn)行檢測或定量，可以診斷糖鏈缺陷型IgAl相關(guān)疾病。作為與糖鏈缺陷型IgAl蛋白或表達(dá)糖鏈缺陷型IgAl的細(xì)胞相關(guān)的疾病，只要是在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)包含糖鏈缺陷型IgAl多肽的蛋白或者表達(dá)糖鏈缺陷型IgAl多肽的細(xì)胞的疾病則均包括在內(nèi)。優(yōu)選為與健康人相比時與糖鏈缺陷型IgAl蛋白或表達(dá)糖鏈缺陷型IgAl的細(xì)胞相關(guān)的疾病的患者的該多肽的表達(dá)量增加的疾病。具體而言，可以列舉自身免疫疾病或癌癥。作為自身免疫疾病，可以列舉以IgA腎病為主的慢性腎小球腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、過敏性紫癜等。另外，作為癌癥，可以列舉來源于漿細(xì)胞的癌癥，具體而言，可以列舉漿細(xì)胞瘤、IgA型骨髓瘤套細(xì)胞淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、小淋巴細(xì)胞性白血病、伯基特卜)淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤、彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤、漿細(xì)胞瘤等。本發(fā)明中，作為糖鏈缺陷型IgAl多肽的檢測或測定對象的生物試樣，只要是組織細(xì)胞、血液、血漿、血清、胰液、尿液、糞便、組織液、培養(yǎng)液等可能包含該多肽的試樣則沒有特別限定。與糖鏈缺陷型IgAl相關(guān)的疾病中，例如，IgA腎病的診斷可以如下進(jìn)行。對于從多名健康人的體內(nèi)收集的生物試樣，使用本發(fā)明的抗體或該抗體片段或者它們的衍生物，利用下述的免疫學(xué)方法，進(jìn)行糖鏈缺陷型IgAl多肽的檢測或測定，從而確認(rèn)健康人的生物試樣中的該多肽的表達(dá)量。對受試者的生物試樣也同樣考察該多肽的表達(dá)量，將其表達(dá)量與健康人的表達(dá)量進(jìn)行比較。在受試者的該多肽的表達(dá)量與健康人相比增加的情況下，可以判斷為IgA腎病或者將來患IgA腎病的可能性高。與糖鏈缺陷型IgAl相關(guān)的疾病中，例如癌癥的診斷可以如下進(jìn)行。對于從多名健康人的生物體內(nèi)收集的生物試樣，使用本發(fā)明的抗體或該抗體片段或者它們的衍生物，利用下述的免疫學(xué)方法，進(jìn)行糖鏈缺陷型IgAl多肽的檢測或測定，從而確認(rèn)健康人的生物試樣中的該多肽的表達(dá)量。對受試者的生物試樣也同樣考察該多肽的表達(dá)量，將其表達(dá)量與健康人的表達(dá)量進(jìn)行比較。在受試者的該多肽的表達(dá)量與健康人相比增加的情況下，可以判斷癌癥為陽性。含有本發(fā)明的抗體或該抗體片段或者它們的衍生物的診斷劑中，根據(jù)目標(biāo)的診斷方法，可以含有用于進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的試劑、該反應(yīng)的檢測用試劑。作為用于進(jìn)行抗原抗 體反應(yīng)的試劑，可以列舉緩沖劑、鹽等。作為檢測用試劑，可以列舉抗體或該抗體片段、或者它們的衍生物、或者識別它們的衍生物的標(biāo)記的二次抗體、標(biāo)記物的底物等通常的免疫學(xué)檢測或測定方法中使用的試劑。作為本發(fā)明中檢測或測定糖鏈缺陷型IgAl的量的方法，可以列舉任意的公知方法。例如，可以列舉免疫學(xué)檢測或測定方法等。免疫學(xué)檢測或測定方法是指使用實(shí)施過標(biāo)記的抗原或抗體來檢測或測定抗體量或抗原量的方法。作為免疫學(xué)檢測或測定方法，可以列舉放射免疫測定法(RIA)、酶免疫測定法(EIA或ELISA)、熒光免疫測定法(FIA)、發(fā)光免疫測定法(luminescentimmunoassay)、蛋白免疫印跡法和物理化學(xué)方法(TIA、LAPIA、PCIA)等。
作為放射免疫測定法(RIA)，例如可以列舉下述方法使本發(fā)明的抗體或該抗體片段與抗原或表達(dá)抗原的細(xì)胞等反應(yīng)，進(jìn)而使實(shí)施過放射線標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體或結(jié)合片段進(jìn)行反應(yīng)，然后，利用閃爍計數(shù)儀等進(jìn)行測定。作為酶免疫測定法(EIA或ELISA)，例如可以列舉下述方法使本發(fā)明的抗體或該抗體片段與抗原或表達(dá)抗原的細(xì)胞等反應(yīng)，進(jìn)而使實(shí)施過標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體或結(jié)合片段進(jìn)行反應(yīng)，然后，利用吸光光度計來測定發(fā)光色素；可以使用例如夾心ELISA法等。作為酶免疫測定法中使用的標(biāo)記物，可以使用如上所述的任意的公知(石川榮次等編，酶免疫測定法，醫(yī)學(xué)書院)的酶標(biāo)記?？梢允褂美鐗A性磷酸酶標(biāo)記、過氧化物酶標(biāo)記、熒光素酶標(biāo)記、生物素標(biāo)記等。夾心ELISA法為如下方法將抗體結(jié)合在固相上后，使其捕獲要檢測或測定的抗原，并使第二抗體與被捕獲的抗原反應(yīng)。該ELISA法中，準(zhǔn)備兩種識別要檢測或測定的抗原的抗體或抗體片段，其抗原識別部位不同，預(yù)先使其中一種抗體或抗體片段吸附到板(例如，96孔板)上，將第二抗體或抗體片段用FITC等熒光物質(zhì)、過氧化物酶等酶、生物素等預(yù) 先進(jìn)行標(biāo)記。在吸附有上述抗體的板上，使從生物體內(nèi)分離出的細(xì)胞或其破碎液、組織或其破碎液、細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、胸水、腹水、眼液等進(jìn)行反應(yīng)，然后，使標(biāo)記后的單克隆抗體或抗體片段反應(yīng)，并進(jìn)行與標(biāo)記物質(zhì)相對應(yīng)的檢測反應(yīng)。在利用該方法測定受試樣品中的抗原濃度的情況下，可以由將濃度已知的抗原進(jìn)行梯度稀釋而制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出受試樣品中的抗原濃度。作為夾心ELISA法中使用的抗體，可以使用多克隆抗體、單克隆抗體中的任意一種，也可以使用Fab、Fab’、F(ab’)2等抗體片段。作為夾心ELISA法中使用的兩種抗體的組合，可以是識別不同表位的單克隆抗體或抗體片段的組合，也可以是為多克隆抗體與單克隆抗體或抗體片段的組合。作為突光免疫測定法(FIA)，可以列舉文獻(xiàn)[Monoclonal Antibodies-Principlesand practice,第三版,美國學(xué)術(shù)出版社(1996);単夕口 - >抗體実験二工 >、講談社
a r λ V AV >7 (1987)]等中記載的方法。作為熒光免疫測定法中使用的標(biāo)記物，可以使用如上所述的任意的公知(川生明著，熒光抗體法，〃 7卜寸47公司)的熒光標(biāo)記。例如，可以使用FITC標(biāo)記、RITC標(biāo)記等。作為發(fā)光免疫測定法(luminescentimmunoassay)，可以使用[MonoclonalAntibodies-Principles and practice,第三版，美國學(xué)術(shù)出版社(1996);単夕口 - >抗體実験二二 7 >、講談社寸^ > r 7 ^ ^ (1987)]等中記載的方法來進(jìn)行。作為發(fā)光免疫測定法中使用的標(biāo)記物，可以列舉如上所述的任意的公知[今井一洋編，生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光，廣川書店；臨床檢查42(1998)]的發(fā)光體標(biāo)記。例如，可以使用吖啶鐵酯標(biāo)記、洛酚堿標(biāo)記等。蛋白免疫印跡法為如下方法將抗原或表達(dá)抗原的細(xì)胞等用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳[Antibodies-A Laboratory Manual (冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1988)]使級分分離后,將該凝膠印跡到PVDF膜或硝酸纖維素膜上，使識別抗原的抗體或抗體片段與該膜進(jìn)行反應(yīng)，進(jìn)而使實(shí)施過FITC等熒光物質(zhì)、過氧化物酶等酶標(biāo)記、生物素標(biāo)記等的抗小鼠IgG抗體或結(jié)合片段進(jìn)行反應(yīng)，然后，使該標(biāo)記可見化，由此來進(jìn)行確認(rèn)。以下示出蛋白免疫印跡法的一例。使表達(dá)具有序列號2表示的氨基酸序列的多肽的細(xì)胞或組織溶解，在還原條件下使每個泳道的蛋白量為O. f 30 μ g，通過SDS-PAGE法進(jìn)行電泳。將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，在含有1%BSA的PBS(以下記為BSA-PBS)中在室溫下反應(yīng)30分鐘，進(jìn)行封閉操作。在此，使本發(fā)明的單克隆抗體進(jìn)行反應(yīng)，用含有O. 05%的吐溫-20的PBS(以下記為吐溫-PBS)進(jìn)行洗滌，并使過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG在室溫下反應(yīng)2小時。用吐溫-PBS洗滌，使用ECLTM蛋白免疫印跡檢測試劑(Amersham公司制造)等對結(jié)合有單克隆抗體的條帶進(jìn)行檢測，由此，可以檢測出具有序列號2表示的氨基酸序列的多肽。作為蛋白免疫印跡法的檢測中使用的抗體，可以使用能夠與未保持天然型的立體結(jié)構(gòu)的多肽結(jié)合的抗體。物理化學(xué)方法具體而言可以如下進(jìn)行使用本發(fā)明的抗體或該抗體片段，使作為抗原的結(jié)合半乳糖缺失的O型糖鏈的CD27與本發(fā)明的抗體或該抗體片段結(jié)合，由此形成凝集體，并對該凝集體進(jìn)行檢測。除此以外，作為物理化學(xué)方法，可以列舉毛細(xì)管法、一維免疫擴(kuò)散法、免疫比濁法或乳膠免疫比濁法等[臨床檢查法提要，金原出版，499 (1998)]。例如，乳膠免疫比濁法中，使用敏化抗體或抗原的粒徑約O. I μ πΓ約I μ m的聚苯 乙烯乳膠等載體，利用對應(yīng)的抗原或抗體引起抗原抗體反應(yīng)時，反應(yīng)液中的散射光增加，透射光減少。將該變化以吸光度或積分球濁度的形式進(jìn)行檢測，由此可以測定受試樣品中的抗原濃度等。由于本發(fā)明的抗體或該抗體片段能夠與糖鏈缺陷型IgAl多肽的重鏈鉸鏈區(qū)結(jié)合，因此，可以適合用于檢測表達(dá)該多肽的細(xì)胞。在表達(dá)該多肽的細(xì)胞的檢測中，可以使用公知的免疫學(xué)檢測方法，優(yōu)選使用免疫沉淀法、免疫細(xì)胞染色法和免疫組織染色法等。另外，也可以應(yīng)用使用FMAT8100HTS系統(tǒng)
八F 才^ f ^公司制造)的熒光抗體染色法等。免疫沉淀法為如下方法使表達(dá)該多肽的細(xì)胞等與本發(fā)明的單克隆抗體或抗體片段反應(yīng)后，加入對蛋白G-瓊脂糖等免疫球蛋白具有特異性結(jié)合能力的載體而使抗原抗體復(fù)合物沉淀?；蛘撸部梢酝ㄟ^如下方法來進(jìn)行。使上述本發(fā)明的抗體或該抗體片段固相化于ELISA用96孔板上，然后，利用BSA-PBS進(jìn)行封閉。在抗體為未純化的狀態(tài)例如雜交瘤培養(yǎng)上清等未純化的狀態(tài)下，使抗小鼠免疫球蛋白或大鼠免疫球蛋白或蛋白A或G等預(yù)先固相化于ELISA用96孔板上，用BSA-PBS封閉后，分注雜交瘤培養(yǎng)上清而使其進(jìn)行結(jié)合。棄去BSA-PBS，用PBS充分洗滌后，使表達(dá)具有序列號2表示的氨基酸序列的多肽的細(xì)胞或組織的溶解液進(jìn)行反應(yīng)。用SDS-PAGE用樣品緩沖液從充分洗滌后的板上提取出免疫沉淀物，通過上述蛋白免疫印跡法進(jìn)行檢測。免疫細(xì)胞染色法和免疫組織染色法是指如下的熒光抗體染色法(流式細(xì)胞術(shù))將表達(dá)抗原的細(xì)胞或組織等根據(jù)需要用表面活性劑或甲醇等進(jìn)行處理，以增加抗體的通過性，然后使本發(fā)明的抗體進(jìn)行反應(yīng)，進(jìn)而，使實(shí)施過FITC等熒光標(biāo)記、過氧化物酶等酶標(biāo)記、生物素標(biāo)記等的抗免疫球蛋白抗體或結(jié)合片段進(jìn)行反應(yīng)，然后，使該標(biāo)記可見化并利用顯微鏡進(jìn)行顯微觀察，或者使細(xì)胞與熒光標(biāo)記的抗體反應(yīng)并利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。例如，可以使用文獻(xiàn)[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,第三版，美國學(xué)術(shù)出版社(1996);単夕口 - >抗體実験7 二二 7 >、講談社寸(1987)]等中記載的方法來進(jìn)行。特別是，由于本發(fā)明的抗體或該抗體片段能夠與糖鏈缺陷型IgAl的重鏈鉸鏈區(qū)結(jié)合，因此，可以優(yōu)選用于對細(xì)胞膜上保持天然型立體結(jié)構(gòu)而表達(dá)的CD27進(jìn)行檢測的流式細(xì)胞術(shù)的分析。另外，通過使用利用熒光抗體染色法原理的FMAT8100HTS系統(tǒng)(7:/94 K八4t A公司制造)，可以在不對所形成的抗體-抗原復(fù)合物與未參與抗體-抗原復(fù)合物形成的游離抗體或抗原進(jìn)行分離的情況下測定抗原量或抗體量。5.使用特異性識別并結(jié)合本發(fā)明的糖鏈缺陷型IgAl多肽的單克隆抗體或該抗體片段的疾病治療方法本發(fā)明的特異性識別糖鏈缺陷型IgAl多肽且與該重鏈鉸鏈區(qū)結(jié)合的單克隆抗體或其抗體片段可以用于治療與糖鏈缺陷型IgAl多肽相關(guān)的疾病。作為與糖鏈缺陷型IgAl多肽相關(guān)的疾病，只要是在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)表達(dá)該多肽的細(xì)胞的疾病則可以為任何疾病，可以列舉例如IgA腎病或癌癥等。
此外，作為疾病，還可以列舉患有IgA腎病并表現(xiàn)腎病綜合征的疾病或表現(xiàn)腎衰竭的疾病。作為癌癥，可以列舉造血器官起源的腫瘤(也稱為血液癌)或上皮起源的實(shí)體癌。作為血液癌，具體而言，可以列舉白血病、淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤)、多發(fā)性骨髓瘤等。作為具體的非霍奇金淋巴瘤，可以列舉套細(xì)胞淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、小淋巴細(xì)胞性白血病、伯基特淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤、彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤、漿細(xì)胞瘤等。作為實(shí)體癌，具體而言，可以列舉乳腺癌、子宮癌、大腸癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、腎癌、直腸癌、甲狀腺癌、子宮頸癌、小腸癌、前列腺癌或胰腺癌等。作為本發(fā)明的治療劑，可以列舉以本發(fā)明的抗體或該抗體片段作為有效成分的癌治療劑。具有ADCC活性或CDC活性等效應(yīng)活性的癌治療劑或者利用凋亡誘導(dǎo)作用的癌治療劑等也包括在本發(fā)明的治療劑內(nèi)。本發(fā)明的抗體或該抗體片段能夠識別在細(xì)胞膜上表達(dá)的糖鏈缺陷型IgAl多肽，因此，能夠識別生物體內(nèi)存在的表達(dá)糖鏈缺陷型IgAl多肽的細(xì)胞。因此，屬于本發(fā)明的抗體或該抗體片段且具有效應(yīng)活性的抗體或該抗體片段能夠在體內(nèi)和體外殺傷表達(dá)糖鏈缺陷型IgAl多肽的細(xì)胞。另外，上述本發(fā)明的抗體或該抗體片段能夠殺傷生物體內(nèi)的表達(dá)糖鏈缺陷型IgAl多肽的細(xì)胞而使其減少，因此，可以作為治療劑特別有效地使用。含有本發(fā)明的抗體或該抗體片段或者它們的衍生物的治療劑可以僅含有作為有效成分的該抗體或該抗體片段或者它們的衍生物，通常優(yōu)選以與藥理學(xué)上可容許的一種以上的載體一同混合并通過制劑學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域中公知的任意方法制造而成的醫(yī)藥制劑的形式來提供。施用途徑優(yōu)選使用治療時最有效的途徑，可以列舉經(jīng)口施用或者口腔內(nèi)、氣管內(nèi)、直腸內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)和靜脈內(nèi)等非經(jīng)口施用，在抗體或肽制劑的情況下，可以優(yōu)選列舉靜脈內(nèi)施用。作為施用形式，可以列舉噴霧劑、膠囊劑、片劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏、膠帶劑等。作為適于經(jīng)口施用的制劑，可以列舉乳劑、糖漿劑、膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑等。乳劑和糖漿劑這樣的液體制備物可以使用如下成分作為添加劑來制造水、蔗糖、山梨
醇、果糖等糖類，聚乙二醇、聚丙二醇等二醇類，芝麻油、橄欖油、大豆油等油類，對羥基苯甲酸酯等防腐劑，草莓香料、薄荷等香料類。膠囊劑、片劑、散劑、顆粒劑等可以使用如下成分作為添加劑來制造乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇等賦形劑，淀粉、海藻酸鈉等崩解劑，硬脂酸鎂、滑石等潤滑劑，聚乙烯醇、羥丙基纖維素、明膠等粘結(jié)劑、脂肪酸酯等表面活性劑、甘油等增塑劑等。作為適于非經(jīng)口施用的制劑，可以列舉注射劑、栓劑、噴霧劑等。注射劑使用包含鹽溶液、葡萄糖溶液或者兩者的混合物的載體等來制備。栓劑使用可可脂、氫化脂肪或羧酸等載體來制備。另外，噴霧劑使用該抗體或抗體片段本身以及不刺激接受者的口腔和氣管粘膜并且使該抗體或抗體片段分散為微細(xì)粒子而容易吸收的載體等來制備。作為載體，具體可以例示例如乳糖、甘油等。根據(jù)該抗體或抗體片段和使用的載體的性質(zhì)，可以為氣溶膠、干粉等制劑。另外，也可以向這些非經(jīng)口劑中添加在經(jīng)口劑中作為添加劑而例示的成分。施用量或施用次數(shù)根據(jù)目標(biāo)治療效果、施用方法、治療時間、年齡、體重等而不同，通常成人每天為10 μ g/kg、mg/kg。 以下，通過實(shí)施例更具體地對本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限定。實(shí)施例I在細(xì)胞膜上高表達(dá)糖鏈缺陷型IgAl的CHO細(xì)胞株的制作(I)膜型 IgA 表達(dá)質(zhì)粒 pKAN932B8PVHmIgA 的構(gòu)建按照以下順序制作用于在細(xì)胞膜上表達(dá)膜型免疫球蛋白A的載體pKAN932B8PVHmIgA。本質(zhì)粒是記載在專利W003/085107中的表達(dá)使抗CD20抗體2B8P的重鏈Fab部分與膜型免疫球蛋白的恒定區(qū)連接而成的蛋白質(zhì)的質(zhì)粒載體。I. pCR2B8PVH 的制作以專利W003/085107中記載的質(zhì)粒載體pKANTEX932B8P為模板，通過以下所示的PCR反應(yīng)對包含抗⑶20抗體2B8P的重鏈可變區(qū)的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增。在含有O. 2毫摩爾/升dNTPs、l毫摩爾/升氯化鎂的反應(yīng)液中使用Ing的pKANTEX932B8P、l微摩爾/升RitNotNheIfw (序列號4)、I微摩爾/升RitNotNheIrv (序列號5)和2. 5單位的KOD聚合酶(東洋紡公司制造)，調(diào)節(jié)至總計50 μ L，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為以98°C下15秒、65°C下2秒、74°C下30秒為I次循環(huán)，進(jìn)行25次循環(huán)。將該反應(yīng)液利用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，然后，使用Zero Blunt PCR克隆試劑盒(4 > '卜口夕工 >公司制造)，依照附帶的使用說明書將約450bp的PCR產(chǎn)物導(dǎo)入pCR-Blunt載體中，從而獲得具有序列號6所示的DNA序列的pCR2B8PVH(圖I)。2. pCRIgA 的制作接著，以作為人源cDNA克隆FLJ46724登記在基因庫(Genebank)中的質(zhì)粒(由NEDO人類cDNA測序項(xiàng)目分售)為模板，使用以下所示的PCR對包含免疫球蛋白A的恒定區(qū)的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。在含有O. 2毫摩爾/升dNTPs、l毫摩爾/升氯化鎂的反應(yīng)液中使用Ing包含F(xiàn)LJ46724的質(zhì)粒、I微摩爾/升Ig-a_NheI (序列號7)、1微摩爾/升Ig-b-BamHI (序列號8)和2. 5單位的KOD聚合酶(東洋紡公司制造)，調(diào)節(jié)至總計50 μ L，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為以98°C下15秒、68°C下30秒為I次循環(huán)，進(jìn)行25次循環(huán)。將該反應(yīng)液利用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，然后，使用Zero Blunt PCR克隆試劑盒( >
卜口夕工 >公司制造)，依照附帶的使用說明書將約IOOObp的PCR產(chǎn)物導(dǎo)入pCR-Blunt載體中，從而獲得具有序列號9所不的DNA序列的pCRIgA (圖2)。
3. pCRmlgA 的制作接著，在含有O. 2毫 摩爾/升dNTPs、l毫摩爾/升氯化鎂的反應(yīng)液中使用O. 02微摩爾/升的AMD-A(序列號10)、0. 02微摩爾/升的AMD-B (序列號11)、I微摩爾/升的AMDBamHIfw (序列號12)、I微摩爾/升的AMDSpeIrv (序列號13)和2. 5單位的KOD聚合酶(東洋紡公司制造)，調(diào)節(jié)至總計50 μ L，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為以98°C下15秒、65°C下2秒、74°C下30秒為I次循環(huán)，進(jìn)行25次循環(huán)。將該反應(yīng)液利用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，然后，使用Zero Blunt PCR克隆試劑盒(4 > '卜口夕工 >公司制造)，依照附帶的使用說明書將約450bp的PCR產(chǎn)物導(dǎo)入pCR-Blunt載體中，從而獲得具有序列號14所示的DNA序列的pCRmIgA(圖3)。4. pCR 2B8P mlgA 的制作使將上述I項(xiàng)中制作的pCR2B8PVH用限制性酶NotI和限制性酶NheI消化而得到的約450bp的DNA片段和將上述2項(xiàng)中制作的pCRIgA用限制性酶NheI和限制性酶BamHI消化而得到的約IOOObp的DNA片段與將上述3項(xiàng)中制作的pCRmlgA用限制性酶NotI和限制性酶BamHI消化而得到的約3. 5Kbp的質(zhì)粒DNA連接，由此，構(gòu)建編碼抗⑶20抗體2B8P的重鏈可變區(qū)與膜型免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)連接而成的DNA的質(zhì)粒pCR 2B8P mlgA(圖4)。將本質(zhì)粒所編碼的膜型IgAl序列(重鏈)示于序列號15。5. pKAN932B8PVHmIgA 的構(gòu)建使將上述4項(xiàng)中制作的pCR 2B8P mlgA用限制性酶NotI和限制性酶SpeI消化而得到的1580bp的DNA片段和將KANTEX932B8P用限制性酶EcoRI和限制性酶NotI消化而得到的2845bp的DNA片段與同樣將pKANTEX932B8P用限制性酶EcoRI和限制性酶SpeI消化而得到的約13. 5Kbp的DNA片段連接，由此，制作表達(dá)抗⑶20抗體2B8P的恒定區(qū)為膜型免疫球蛋白A的蛋白的質(zhì)粒pKAN932B8PVHmIgA(圖5)。將使用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌接種到IOOmL的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜后，回收菌體，使用Qiafilter質(zhì)粒中量純化試劑盒(Qiafilter Plasmid midi kit) ( ^ 7 ^ >公司制造)，依照附帶的規(guī)程對質(zhì)粒進(jìn)行純化。純化后，將30μ g的質(zhì)粒載體用限制性酶AatII進(jìn)行消化，由此進(jìn)行線性化。線性化之后，進(jìn)行苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀，溶解于1/10濃度的TE緩沖液(ImM TrisHCl, O. ImM EDTA)后，測定濃度，并供于基因?qū)搿?2)膜型免疫球蛋白A表達(dá)質(zhì)粒pKAN932B8PVHmIgA的導(dǎo)入將pKAN932B8PVHmIgA基因?qū)胱鳛橹饕磉_(dá)Tn型糖鏈的突變CHO細(xì)胞的Lec8細(xì)胞和主要表達(dá)正常型糖鏈的CH0/DG44細(xì)胞中，由此，建立表達(dá)膜型免疫球蛋白A的Lec8細(xì)胞和DG44細(xì)胞。膜型免疫球蛋白A表達(dá)質(zhì)粒pKAN932B8PVHmIgA向CH0/DG44細(xì)胞(以下記為DG44)或Lec8細(xì)胞中的導(dǎo)入可以依據(jù)電穿孔法[寸4卜f7 口夕-，3，133(1990)]按照以下順序進(jìn)行。首先，將在基本培養(yǎng)基[添加有10%胎牛透析血清(4 > if卜口 - 工>公司)、50μ g/mL慶大霉素(于力9 4 f 7夕公司)和IXHT添加劑(4 >匕' 卜口 -夕工>公司制造)的伊思考夫改良的杜爾貝科培養(yǎng)基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)(4 卜口 — 二 >公司)]中傳代的DG44細(xì)胞懸浮于K-PBS緩沖液[137毫摩爾/升KCl >2. 7暈?zāi)?升NaCl、8. I暈?zāi)?升Na2HPO4^ I. 5暈?zāi)?升KH2PO4^4. O暈?zāi)?升MgCl2]中，使其達(dá)到8 X IO6個/mL，制備細(xì)胞懸浮液。將200 μ L (I. 8 X IO6個)制備好的細(xì)胞懸浮液與10 μ g上述(I)中制備的線性化質(zhì)粒pKAN932B8PVHmIgA混合。但是，Lec8細(xì)胞的傳代在未添加I XHT添加劑的基本培養(yǎng)基(以下記為HT-培養(yǎng)基)中進(jìn)行。將該細(xì)胞DNA混合液轉(zhuǎn)移到Gene Pulser的電擊杯(電極之間的距離為2mm) (BIO-RAD公司)中，然后，使用基因?qū)胙b置Gene Pulser(BIO-RAD公司)，在脈沖電壓為O. 35KV、電容為250 μ F的條件下進(jìn)行基因?qū)?。將該?xì)胞懸浮液混合到30mL的HT-培養(yǎng)基[添加有10%胎牛透析血清(4 >匕' 卜口 -夕工 >公司制造)和5O μ g/mL慶大霉素(f力9 4 f 7夕公司)的伊思考夫改良的杜爾貝科培養(yǎng)基^ ^卜口 - ^工 >公司制造)]中，以100 μ L/孔接種到3塊96孔板上。接種2天后，更換為含有500 μ g/mL G418的傳代用培養(yǎng)基，培養(yǎng)10天。10天后，更換為含有50nM MTX (Sigma aldrich公司制造)的HT-培養(yǎng)基，獲得MTX抗性株。將Lec8株來源的膜型免疫球蛋白表達(dá)株命名為mIgA/Lec8，另一方面，將DG44細(xì)胞來源的膜型免疫球蛋白A表達(dá)細(xì)胞命名為mIgA/DG44。實(shí)施例2糖鏈缺陷型IgAl-Fc融合蛋白的制備為了獲得可溶性mlgAl蛋白，設(shè)計了使mlgAl細(xì)胞外區(qū)部分與人IgG4Fc連接而成的Fe融合蛋白mlgAl-Fc。具體而言,利用PCR法制作使mlgAl細(xì)胞外區(qū)的一部分與人IgG4Fc連接而成的基因片段，將其插入實(shí)施例I中得到的pKAN932B8PVHmIgA中，由此，制備Fe融合mlgAl表達(dá)載體pKANTEX-mlgAl-Fc。將該表達(dá)載體導(dǎo)入CH0/DG44細(xì)胞株和Lec8細(xì)胞株中，向培養(yǎng)基中添加500μ g/mL的G418，由此篩選基因?qū)爰?xì)胞。將篩選出的基因?qū)爰?xì)胞在無血清培養(yǎng)基Excell-302 (SAFC公司)中培養(yǎng)一周，得到含有mlgAl-Fc的培養(yǎng)上清。使用Mabselect (GE Healthcare公司)柱,依照附帶的說明書從約I升的培養(yǎng)上清中進(jìn)行純化，獲得各自約為5mg的DG44來源mlgAl-Fc和Lec8來源mlgAl-Fc。將所得到的各mlgAl-Fc供于SDS-PAGE分析，考察分子量和純化度(圖6)。另外，為了確認(rèn)純化蛋白的修飾糖鏈，實(shí)施以下的酶免疫測定法。向96孔的EIA用板(Greiner公司)中以50 μ L/孔分注I μ g/mL的DG44來源的mlgAl-Fc或Lec8來源的mlgAl-Fc或者人IgG4(SIGMA公司)，在4°C下放置過夜使其進(jìn)行吸附。洗滌后，以100 μ L/孔加入1%BSA-PBS，在室溫下反應(yīng)I小時，對殘余的活性基團(tuán)進(jìn)行封閉。棄去1%BSA-PBS，以50 μ L/孔分注用PBS稀釋的小鼠抗人IgAl單克隆抗體Β3506Β4 (Beckman Coulter公司)或小鼠抗Tn抗原抗體22_1_1 (MBL公司)作為一次抗體，使其反應(yīng)2小時。用O. 05%吐溫-PBS洗滌后，以50 μ L/孔加入稀釋后的過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠免疫球蛋白(DAK0公司)作為二次抗體，在室溫下反應(yīng)I小時，用O. 05%吐溫-PBS洗滌后，使用ABTS [2. 2-連氮基雙(3-乙基苯并噻唑_6_磺酸)銨]底物液[I毫摩爾/升ABTS、0· I摩爾/升檸檬酸緩沖液(ρΗ4· 2)、0· 1%_進(jìn)行顯色，使用酶標(biāo)儀(MULTISKAN SPECTRUM, Thermo公司)測定樣品波長415nm、參比波長490nm下的吸光度(0D415-0D490)。結(jié)果，確認(rèn)到抗IgAl抗體與DG44來源的mlgAl-Fc和Lec8來源的mlgAl-Fc結(jié)合,而另一方面,確認(rèn)到抗Tn抗原抗體僅與Lec8來源mlgAl-Fc結(jié)合(圖7)。由以上確認(rèn)，Lec8來源的mlgAl-Fc具有Tn抗原型O連接型糖鏈。實(shí)施例3抗Tn抗原附加型IgAl的鉸鏈區(qū)的單克隆抗體的制作(I)作為免疫原的糖肽的制備
使用自動合成計(島津制作所)，合成如下的肽(Tn附加型IgAl鉸鏈肽，序列號16):在人IgAl (IgAl)鉸鏈區(qū)氨基酸序列(從氨基末端數(shù)第223位至第240位的氨基酸)的第230位和第232位的絲氨酸(Ser)以及第225位、第228位和第236位的蘇氨酸(Thr)上通過α連接附加有N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，進(jìn)而為了與載體蛋白結(jié)合而在氨基末端附加有半胱氨酸(Cys)。為了提高免疫原性，通過以下的方法制作與KLH(和光純藥公司)的結(jié)合物，作為免疫原。即，將KLH溶解于PBS中并調(diào)節(jié)至10mg/mL，滴加1/10體積的25mg/mL的MBS [N-馬來酰亞胺基苯甲酸琥珀酰亞胺酯](于力^ ^ >夕公司)，攪拌30分鐘使其反應(yīng)。利用預(yù)先用PBS平衡化的七7 7 r'y G-25柱等凝膠過濾柱除去游離的MBS，將2. 5mg所得到的KLH-MBS與溶解在O. IM磷酸鈉緩沖液(pH7. O)中的Img肽混合，在室溫下攪拌3小時使其反應(yīng)。反應(yīng)后，將用PBS透析而得到的物質(zhì)作為免疫原。(2)動物的免疫和抗體產(chǎn)生細(xì)胞的制備將100 μ g通過⑴所示的方法制備的Tn抗原附加型IgAl鉸鏈肽-KLH結(jié)合物連同2mg鋁凝膠和I X IO9個細(xì)胞的百日咳疫苗(千葉縣血清研究所制造)一起施用給4周
齡的雌性SD大鼠(日本工^ ^ V -公司)，從2周后開始每周施用一次IOOyg的結(jié)合物，共計4次。從尾靜脈采血，通過以下所示的酶免疫測定法考察對來源于人血漿的Tn抗原附加IgAl的反應(yīng)性，在末次免疫3天后從顯示充分抗體效價的大鼠中摘除脾臟。將脾臟在MEM培養(yǎng)基(日水制藥公司)中細(xì)細(xì)切碎，用鑷子攪散，離心分離(1200rpm，5分鐘)后，棄去上清，用Tris-氯化銨緩沖液(pH7. 65)處理廣2分鐘以除去紅細(xì)胞，用MEM培養(yǎng)基洗滌3次，用于細(xì)胞融合。(3)酶免疫測定法使用人血漿來源IgAl (BI0PUR公司)作為分析用的陰性對照抗原，使用Tn抗原型人IgAl作為陽性對照抗原。Tn抗原型人IgAl通過如下方法得到使5U/mL的β -半乳糖苷酶(ProZyme公司，GKX-5013)、lU/mL的神經(jīng)氨酸酶(于力7 4公司，24229-61)在37°C下與人血漿來源IgAl作用過夜，將正常糖鏈轉(zhuǎn)換為Tn抗原。另外，為了排除僅識別Tn抗原的抗體，與IgAl同樣地對人血漿來源的Cl抑制物蛋白(ZLB -<-')> 7，商品名夂V于-卜)進(jìn)行酶處理，將所得到的Tn抗原型Cl抑制物也作為陰性對照抗原使用。向96孔的EIA用板(々'' 9 4 f -公司)中以50 μ L/孔分別分注2. 5 μ g/mL的各抗原，在4°C下放置過夜使其進(jìn)行吸附。洗滌后，以100 μ L/孔加入1%BSA-PBS，在室溫下使其反應(yīng)I小時，對殘余的活性基團(tuán)進(jìn)行封閉。棄去1%BSA-PBS，以50 μ L/孔分注雜交瘤的培養(yǎng)上清或被免疫大鼠抗血清作為一次抗體，使其反應(yīng)2小時。用O. 05%吐溫-PBS洗滌后，以50 μ L/孔加入稀釋后的過氧化物酶標(biāo)記抗大鼠免疫球蛋白(夕' -公司)作為二次抗體，在室溫下使其反應(yīng)I小時，用O. 05%吐溫-PBS洗滌后，使用ABTS[2. 2-連氮基雙(3-乙基苯并噻唑_6_磺酸)銨]底物液[I毫摩爾/升ABTS、0· I摩爾/升檸檬酸緩沖液(ρΗ4· 2)、0· 1%_進(jìn)行顯色，使用酶標(biāo)儀(Emax ；Molecular Devices公司)測定樣品波長415nm、參比波長490nm下的吸光度(0D415-0D490)。(4)小鼠骨髓瘤細(xì)胞的制備將8-氮雜鳥嘌呤抗性小鼠骨髓瘤細(xì)胞系P3-U1在正常培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，確保細(xì)胞融合時達(dá)到2 X IO7以上的細(xì)胞，作為親本株供于細(xì)胞融合。(5)雜交瘤的制作將⑵中得到的大鼠脾細(xì)胞與⑷中得到的骨髓瘤細(xì)胞以10:1的比例進(jìn)行混合，離心分離(1200rpm、5分鐘)后，棄去上清，將沉淀的細(xì)胞群充分?jǐn)嚿?，然后，在攪拌的同時在37°C下以每IO8個小鼠脾細(xì)胞為O. 5mL的量加入Ig聚乙二醇-1000 (PEG-1000)、ImL MEM培養(yǎng)基和O. 35mL 二甲亞砜的混合溶液，并每隔f 2分鐘向該懸浮液中加入ImLMEM培養(yǎng)基，重復(fù)數(shù)次后，加入MEM培養(yǎng)基至總量達(dá)到50mL。離心分離(900rpm、5分鐘)后，棄去上清，輕輕地將細(xì)胞攪散后，通過用刻度吸管吸入并吹出，輕輕地將細(xì)胞懸浮于IOOmL HAT培養(yǎng)基[在添加有10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中加入HAT培養(yǎng)基添加劑(Invitrogen公司)而得到的培養(yǎng)基]中。將該懸浮液以200 μ L/孔分注到96孔培養(yǎng)用板中，在5%C02的培養(yǎng)箱中在37°C下培養(yǎng)1(Γ14天。通過(3)中記載的酶免疫測定法對該培養(yǎng)上清進(jìn)行考察，選出與Tn抗原型人IgAl特異性反應(yīng)的孔，重復(fù)克隆兩次，從而建立生產(chǎn)抗Tn抗原附加mlgA鉸鏈肽單克隆抗體的雜交瘤株KM4137、4138、4139、4140、4144。通過使用亞類特異性的二次抗體的酶免疫測定法對抗體類別進(jìn)行考察，確定KM4137、KM4138、KM4139、KM4144為大鼠IgG2a，KM4140為大鼠IgG2b。它們的抗體類別示于表2中。[表2]
權(quán)利要求
1.一種單克隆抗體或該抗體片段，其特異性識別并結(jié)合由免疫球蛋白Al的重鏈基因編碼的多肽(以下稱為IgAl重鏈)的鉸鏈區(qū)，所述鉸鏈區(qū)包含未結(jié)合半乳糖的絲氨酸/蘇氨酸連接型糖鏈(以下稱為O連接型糖鏈)。
2.一種單克隆抗體或該抗體片段，其不識別結(jié)合有O連接型糖鏈的由IgAl重鏈基因編碼的多肽的鉸鏈區(qū)中包含結(jié)合有半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl重鏈的鉸鏈區(qū)，而識別并結(jié)合包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl重鏈的鉸鏈區(qū)。
3.如權(quán)利要求I或2所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈為選自a -N-乙酰半乳糖胺-絲氨酸/蘇氨酸(以下稱為Tn抗原)或涎酸化Tn抗原中的至少一種O連接型糖鏈。
4.如權(quán)利要求3所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈為Tn抗原。
5.如權(quán)利要求廣4中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，單克隆抗體為特異性識別并結(jié)合包含序列號I表示的氨基酸序列的IgAl重鏈的鉸鏈區(qū)的抗體。
6.如權(quán)利要求廣4中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，單克隆抗體為特異性識別并結(jié)合包含序列號I表示的氨基酸序列的IgAl重鏈的鉸鏈區(qū)多肽的抗體，并且，所述鉸鏈區(qū)多肽是在選自從該多肽的氨基末端起第3位的蘇氨酸、第6位的蘇氨酸、第8位的絲氨酸、第10位的絲氨酸、第14位的蘇氨酸中的至少一個氨基酸殘基上結(jié)合有不具有半乳糖的N-乙酰半乳糖胺的糖肽。
7.如權(quán)利要求廣4中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，單克隆抗體是對包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的補(bǔ)體Cl抑制物不顯示交叉反應(yīng)性的單克隆抗體。
8.如權(quán)利要求r4中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，單克隆抗體是在向包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl重鏈的鉸鏈區(qū)上結(jié)合時與選自單克隆抗體KM4137、KM4140、KM4144中的至少一種單克隆抗體發(fā)生競爭反應(yīng)的單克隆抗體。
9.如權(quán)利要求廣4中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或該抗體片段，其中，單克隆抗體是與選自單克隆抗體KM4137、KM4140、KM4144中的至少一種單克隆抗體所結(jié)合的、存在于包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的IgAl重鏈的鉸鏈區(qū)的表位進(jìn)行結(jié)合的單克隆抗體。
10.如權(quán)利要求I、中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段，其中，單克隆抗體是由選自雜交瘤KM4137(FERM BP-11214)、KM4140 (FERM BP-11215)、KM4144 (FERM BP-11216)中的至少一種雜交瘤生產(chǎn)的單克隆抗體。
11.如權(quán)利要求I、中任一項(xiàng)所述的抗體或該抗體片段，其中，單克隆抗體為基因重組抗體。
12.如權(quán)利要求11所述的基因重組抗體或該抗體片段，其中，基因重組抗體為選自人嵌合抗體、人源化抗體和人抗體中的抗體。
13.如權(quán)利要求f12中任一項(xiàng)所述的抗體片段，其中，抗體片段為選自Fab、Fab’、F(ab’)2、單鏈抗體(scFv)、二聚體化V區(qū)(雙價抗體)、二硫鍵穩(wěn)定的V區(qū)(dsFv)和包含CDR的肽中的抗體片段。
14.一種雜交瘤,其生產(chǎn)權(quán)利要求廣9中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體。
15.一種DNA，其編碼權(quán)利要求f 13中任一項(xiàng)所述的抗體或該抗體片段。
16.—種重組載體,其含有權(quán)利要求15所述的DNA。
17.一種轉(zhuǎn)化株，其通過將權(quán)利要求16所述的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中而得到。
18.一種抗體或該抗體片段的制造方法，用于制造權(quán)利要求廣13中任一項(xiàng)所述的抗體或該抗體片段，其特征在于，將權(quán)利要求14所述的雜交瘤或權(quán)利要求17所述的轉(zhuǎn)化株在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)物中生成并蓄積權(quán)利要求廣13中任一項(xiàng)所述的抗體或該抗體片段，并從該培養(yǎng)物中收集抗體或該抗體片段。
19.一種IgAl的免疫學(xué)檢測或測定方法，所述IgAl具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)，所述方法中，使用權(quán)利要求廣13中任一項(xiàng)所述的抗體或該抗體片段。
20.一種IgAl的檢測試劑，所述IgAl具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)，所述檢測試劑中，使用權(quán)利要求廣13中任一項(xiàng)所述的抗體或該抗體片段。
21.—種IgAl相關(guān)疾病的診斷劑，所述IgAl具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)，所述診斷劑中，使用權(quán)利要求廣13中任一項(xiàng)所述的抗體或該抗體片段。
22.如權(quán)利要求21所述的診斷劑，其中，與具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)的IgAl相關(guān)的疾病為自身免疫疾病。
23.如權(quán)利要求21所述的診斷劑，其中，與具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)的IgAl相關(guān)的疾病為IgA腎病。
24.一種IgAl相關(guān)疾病的治療劑，所述IgAl具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)，所述治療劑中，含有權(quán)利要求廣13中任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段作為有效成分。
25.如權(quán)利要求24所述的治療劑，其中，與具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)的IgAl相關(guān)的疾病為自身免疫疾病。
26.如權(quán)利要求24所述的治療劑，其中，與具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)的IgAl相關(guān)的疾病為IgA腎病。
27.—種IgAl相關(guān)疾病的診斷方法，所述IgAl具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)，所述診斷方法包括使用權(quán)利要求廣13中任一項(xiàng)所述的抗體或該抗體片段，對具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)的IgAl進(jìn)行檢測或測定。
28.如權(quán)利要求27所述的診斷方法，其中，與具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)的IgAl相關(guān)的疾病為自身免疫疾病。
29.如權(quán)利要求27所述的診斷方法，其中，與具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)的IgAl相關(guān)的疾病為IgA腎病。
30.權(quán)利要求f13中任一項(xiàng)所述的抗體或該抗體片段在制造IgAl相關(guān)疾病的治療劑中的應(yīng)用，所述IgAl具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)。
31.如權(quán)利要求30所述的抗體或該抗體片段的應(yīng)用，其中，與具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)的IgAl相關(guān)的疾病為自身免疫疾病。
32.如權(quán)利要求30所述的抗體或該抗體片段的應(yīng)用，其中，與具有包含未結(jié)合半乳糖的O連接型糖鏈的鉸鏈區(qū)的IgAl相關(guān)的疾病為IgA腎病。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種對IgA腎病的診斷有效的單克隆抗體，其特異性識別并結(jié)合由免疫球蛋白A1的重鏈基因編碼的多肽的鉸鏈區(qū)，所述鉸鏈區(qū)包含未結(jié)合半乳糖的絲氨酸蘇氨酸連接型糖鏈。根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種單克隆抗體或該抗體片段，其特異性識別并結(jié)合由免疫球蛋白A1的重鏈基因編碼的多肽的鉸鏈區(qū)，所述鉸鏈區(qū)包含未結(jié)合半乳糖的絲氨酸蘇氨酸連接型糖鏈；并且能夠提供使用該抗體或抗體片段的診斷劑以及含有該抗體或抗體片段作為有效成分的治療劑。
文檔編號C12N1/15GK102712923SQ20108005984
公開日2012年10月3日 申請日期2010年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月28日
發(fā)明者佐佐木由香, 佐藤光男, 森勝弘, 神田豐, 金子悅士 申請人:協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會社