專利名稱：表面固定有蛋白酶的帶氨基的納米磁性微球及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生化分析技術領域，具體涉及一種表面固定有蛋白酶的帶氨基的納米磁性微球上及其制備方法和在蛋白酶解中的應用。
背景技術：
在蛋白質的鑒定分析中，蛋白質的酶解是關鍵的一步。傳統(tǒng)的溶液酶解方法步驟煩瑣、耗時長，不利于實現自動化操作。隨著目前全球對生物體中蛋白質組學研究的大規(guī)模展開，迫切需要發(fā)展更有效、更簡單的蛋白酶解技術。
固定化酶來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的溶液酶解具有許多優(yōu)點(1)提高酶穩(wěn)定性，可重復使用；(2)提高單位體積的酶濃度，從而增加酶使用效率，減少酶解時間；(3)易于將固定化酶和底物、產物分離，肽譜中不出現酶的自水解峰；(4)可用于構造酶反應器，反復分批反應和連續(xù)反應，有利于實現通量化和自動化。磁性微球近年來吸引了越來越多地關注，將其作為固定化酶的載體，具有方便操作和重復性好的優(yōu)點。納米磁性微球是在以前的磁性微球的基礎上誕生的。磁性微球指的是一種殼/核結構的微球，核由金屬氧化物(如鐵、鈷、鎳的氧化物)組成，殼由高分子材料組成，根據應用需要在磁性納米核外包被不同的高分子材料。利用傳統(tǒng)的方法制得的納米磁性微球具有較好的單分散性和結晶度，然而，在經過表面修飾之前，這些采用熱分解技術制得的納米磁性微球僅在非極性溶劑里具有很好的分散性，這大大阻礙了它們在生物技術領域的應用。最近，有文獻報道了一種一步合成帶氨基的納米磁性微球的方法，所制得的磁性微球粒徑分布廣；具有超順磁性；并在水中具有良好的單分散性；在生物技術領域具有廣闊的應用前景。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種表面固定有蛋白酶帶氨基的納米磁性微球及其制備方法和在蛋白酶解中應用。
本發(fā)明提出的在帶氨基的納米磁性微球上固定蛋白酶的方法，具體步驟如下(1)將干燥的粒徑在15-200納米間的帶氨基磁性微球分散于50mM醋酸胺緩沖液(記為CB，其組成NH4OAc為50mM，CaCl21mM，MnCl21mM，pH 8.0-8.5)中，磁性微球在溶液中的含量為1-10mg/mL；(2)用磁鐵吸住納米磁性微球，移去CB，將其重新分散于戊二醛(GA)的CB溶液中(該溶液中，GA的重量含量為5％-10％，pH 6.5-7.0)，并在室溫下活化1-3小時；
(3)將被GA活化的納米磁性微球分散于蛋白酶的CB溶液中并在室溫下浸泡3-5小時以固定酶，其中CB溶液中蛋白酶的含量為2-5mg/mL，NaCNBH3的重量含量為0.8-1.2％；(4)將固定了蛋白酶的納米磁性微球分散于甘氨酸的CB溶液中并在室溫下浸泡1-2小時以封閉磁性微球上未固定酶的醛基，其中CB溶液中甘氨酸的含量為0.5％-1.0％，NaCNBH3的重量含量為0.8-1.2％。
由上述方法制備的固定酶的納米磁性微球具有超順磁性，即磁粒只有在外磁場作用下才表現出強的磁性，而當外磁場撤去后，則不再有磁性，其飽和磁化強度高，剩磁和矯頑力小。一般近似球形，粒度大小可根據需要的不同在15-200nm范圍內選擇，制得的納米磁性微球粒徑比較均勻，粒度分布范圍比較窄，在±10％之內。納米磁性微球可較好地分散于水溶液中，不易沉淀與相互凝絮。蛋白酶的固定量為50-100μg/mg。
本發(fā)明中，所述納米磁性微球為通常指的殼/核結構的納米微球，其核由金屬氧化物(如鐵、鈷、鎳等的氧化物)組成，殼由高分子材料組成。
本發(fā)明制備的納米磁性微球可應用于蛋白酶解，包括蛋白質溶液酶解、蛋白質芯片酶解和蛋白質靶上酶解等。
本發(fā)明的固定有蛋白酶的納米磁性微球在蛋白質溶液酶解中的應用，具體包括如下步驟(1)待酶解的蛋白質溶液在90-100℃下熱變性15-30分鐘；(2)將表面固定有蛋白酶的納米磁性微球分散于CB中，加入已變性的蛋白質，在30-40℃下酶解0.5-2小時，其中磁性微球在CB溶液中的含量為1-3mg/mL；(3)用磁鐵吸住磁性微球后，將上清液點到靶板上；(4)再將含有α-氰基-4-羥基肉硅酸(CHCA)的乙腈溶液點在樣品靶上，干燥后送入質譜儀進行分析。
本發(fā)明的固定有蛋白酶的納米磁性微球在蛋白質芯片酶解中的應用，具體包括如下步驟(1)將磁鐵置于芯片微通道的下方；(2)表面固定酶的磁性微球分散液在泵的推動下流過芯片微通道；(3)磁性微球在磁場作用下被固定于芯片微通道內，形成1-3mm的填充床。
(4)待酶解的蛋白質溶液在90-100℃下熱變性15-30分鐘；(5)將蛋白溶液用泵推入基于功能化磁性微球的芯片酶反應器中，兩端密封，在20-60℃下酶解2-10分鐘；(6)將基于功能化磁性微球的芯片酶反應器中的酶解產物用泵推出，收集后點在靶板上；(7)再將含有α-氰基-4-羥基肉硅酸(CHCA)的乙腈溶液點在樣品靶上，干燥后送入質譜儀進行分析。
本發(fā)明的固定有蛋白酶的納米磁性微球在蛋白質靶上酶解中的應用，具體包括如下步驟(1)待酶解的蛋白質溶液在90-100℃下熱變性15-30分鐘；(2)將1μL表面固定有蛋白酶的磁性微球分散液點到MALDI靶板上；(3)將1μL待酶解的蛋白溶液點到同一個靶點上；(4)在20-60℃下酶解2-10分鐘；(5)用磁鐵吸走納米磁性微球；(6)再將含有α-氰基-4-羥基肉硅酸(CHCA)的乙腈溶液點在樣品靶上，干燥后送入質譜儀進行分析。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發(fā)明作進一步具體描述。
實施例1.在帶氨基的納米磁性微球表面固定蛋白酶(1)將1mg干燥的粒徑為500nm的帶氨基的納米磁性微球分散于200μL 50mM醋酸胺緩沖液(CB，CaCl21mM，MnCl21mM，pH 8.3)中；(2)用磁鐵吸住納米磁性微球，移去CB，將其重新分散于200μL戊二醛(GA)的CB溶液中(GA 5％-10％，pH 6.8)，并在室溫下活化1.5小時；(3)將被GA活化的納米磁性微球分散于200μL蛋白酶的CB溶液中并在室溫下浸泡3h以固定酶，其中CB溶液中蛋白酶的含量為5mg/mL，NaCNBH3的含量為1％；(4)將固定了蛋白酶的納米磁性微球分散于200μL甘氨酸的CB溶液中并在室溫下浸泡1小時以封閉磁性微球上未固定酶的醛基，其中CB溶液中甘氨酸的含量為0.5％-1.0％，NaCNBH3的含量為1％。
經測試，每毫克帶氨基的納米磁性材料上固定的蛋白酶的量為50-100微克。
實施例2.將固定了蛋白酶的納米磁性微球應用于蛋白質溶液酶解(1)0.2mg/mL的細胞色素C的CB溶液在95℃下熱變性15分鐘；(2)1mg固定了蛋白酶的納米磁性微球分散于1mLCB中，去10μL磁性微球分散液加入10μL已變性的細胞色素C溶液，在37℃下酶解1小時，其中磁性微球在CB溶液中的含量為1-3mg/mL；(3)用磁鐵吸住磁性微球后，將上清液點到靶板上；
(4)再將含有α-氰基-4-羥基肉硅酸(CHCA)的乙腈溶液點在樣品靶上，干燥后送入質譜儀進行分析。
質譜分析的結果與傳統(tǒng)溶液酶解得到的結果相似，細胞色素C匹配上的肽段個數為12，氨基酸個數為81，肽段覆蓋率為77％。
實施例3.將固定了蛋白酶的納米磁性微球應用于蛋白質芯片酶解(1)將磁鐵置于芯片微通道的下方；(2)固定酶的磁性微球分散液在泵的推動下流過芯片微通道；(3)磁性微球在磁場作用下被固定于芯片微通道內，形成1-3mm的填充床。
(4)0.2mg/mL的細胞色素C的CB溶液在95℃下熱變性15分鐘；(5)將0.5μL已變性的細胞色素C溶液用泵推入基于功能化磁性微球的芯片酶反應器中，兩端密封，在50℃下酶解5分鐘；(6)將基于功能化磁性微球的芯片酶反應器中的酶解產物用泵推出，收集后點在靶板上；(7)再將含有α-氰基-4-羥基肉硅酸(CHCA)的乙腈溶液點在樣品靶上，干燥后送入質譜儀進行分析。
質譜分析的結果顯示，細胞色素C匹配上的肽段個數為9，氨基酸個數為81，肽段覆蓋率為77％。
實施例4.將固定了蛋白酶的納米磁性微球應用于蛋白質靶上酶解(1)將1μL固定了蛋白酶的磁性微球分散液點到MALDI靶板上；(2)0.2mg/mL的細胞色素C的CB溶液在95℃下熱變性15分鐘；(3)將1μL已變性的細胞色素C溶液點到同一個靶點上；(4)在50℃下酶解5分鐘；(5)用磁鐵吸走納米磁性微球；(6)再將含有α-氰基-4-羥基肉硅酸(CHCA)的乙腈溶液點在樣品靶上，干燥后送入質譜儀進行分析。
質譜分析的結果顯示，細胞色素C匹配上的肽段個數為13，氨基酸個數為80，肽段覆蓋率為76％。
權利要求
1.一種表面固定有蛋白酶的帶氨基的納米磁性微球，其特征在于所述微米磁性微球帶有氨基且固定有蛋白酶，蛋白酶的固定量為50-100μg/mg，粒徑為15-200nm。
2.一種如權利要求1所述的表面固定有蛋白酶的帶氨基的納米磁性微球的制備方法，其特征在于具體步驟如下(1)將粒徑為15-200納米的帶氨基磁性微球分散于醋酸銨緩沖液中，記該緩沖液為CB，磁性微球在CB中的含量為1-10mg/mL(2)用磁鐵吸住納米磁性微球，移去CB，將其重新分散于戊二醛的CB溶液中，并在室溫下活化1-3小時，所述戊二醛的CB溶液中戊二醛的含量為5％-10％，pH值為6.5-7.0；活化時間為1-3小時；(3)將被戊二醛活化的納米磁性微球分散于含蛋白酶的CB溶液中并在室溫下浸泡3-5小時以固定酶，其中，所述蛋白酶的CB溶液中，蛋白酶的含量為2-5mg/mL，NaCNBH3的含量為0.8-1.2％；浸泡時間為3-5小時；(4)將固定了蛋白酶的納米磁性微球分散于甘氨酸的CB溶液中，并在室溫下浸泡1-2小時以封閉磁性微球上未固定酶的醛基；所述甘氨酸的CB溶液中，甘氨酸的含量為0.5％-1.0％，NaCNBH3的含量為0.8-1.2％；浸泡時間為1-2小時。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述醋酸銨緩沖液的組成為NH4OAc為50mM，CaCl2為1mM，MnCl2為1mM，pH值為8.0-8.5。
4.一種如權利要求1所述的表面固定有蛋白酶的帶氨基的納米磁性微球在蛋白質溶液酶解、蛋白質芯片酶解或蛋白質靶上酶解中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于應用于蛋白質溶液酶解的具體步驟如下(1)待酶解的蛋白質溶液在90-100℃下熱變性15-30分鐘；(2)固定有蛋白酶的納米磁性微球分散于CB中，加入已經熱變性的蛋白質，在30-40℃下酶解0.5-2小時，其中，磁性微球在CB溶液中的含量為1-3mg/ml；(3)用磁鐵吸住磁性微球后，將上清液點到靶板上；(4)再將含有α-氰基-4-羥基肉硅酸的乙腈溶液點在樣品靶上，干燥后送入質譜儀進行分析。
6.根據權利要求4所述的應用，其特征在于應用于蛋白質芯片酶解的具體步驟如下(1)將磁鐵置于芯片微通道的下方；(2)表面固定酶的磁性微球分散液在泵的推動下流過芯片微通道；(3)磁性微球在磁場作用下被固定于芯片微通道內，形成1-3mm的填充床；(4)待酶解的蛋白質溶液在90-100℃下熱變性15-30分鐘；(5)將蛋白溶液用泵推入基于功能化磁性微球的芯片酶反應器中，兩端密封，在20-60℃下酶解2-10分鐘；(6)將基于功能化磁性微球的芯片酶反應器中的酶解產物用泵推出，收集后點在靶板上；(7)再將含有α-氰基-4-羥基肉硅酸的乙腈溶液點在樣品靶上，干燥后送入質譜儀進行分析。
7.根據權利要求4所述的應用，其特征在于應用于蛋白質靶上酶解的具體步驟如下(1)待酶解的蛋白質溶液在90-100℃下熱變性15-30分鐘；(2)將1μL表面固定有蛋白酶的磁性微球分散液點到MALDI靶板上；(3)將1μL待酶解的蛋白溶液點到同一個靶點上；(4)在20-60℃溫度下酶解2-10分鐘；(5)用磁鐵吸走納米磁性微球；(6)再將含有α-氰基-4-羥基肉硅酸的乙腈溶液點在樣品靶上，干燥后送入質譜儀進行分析。
全文摘要
本發(fā)明屬生化分析技術領域，具體為一種表面固定有蛋白酶的帶氨基的納米磁性微球及其制備方法和在蛋白質酶解中的應用。所述磁性納米微球經一步水熱法合成，表面帶有氨基，具有超順磁性，平均粒徑大小為15－200nm。使用戊二醛作為交聯(lián)劑，在所得的帶氨基的納米磁性微球表面固定了蛋白酶，并利用其對蛋白質進行了溶液酶解、芯片酶解和靶上酶解。本發(fā)明使用的帶氨基的納米磁性微球固定酶的方法簡單，固定酶后酶解效率高、酶解速度快，十分適合應用于復雜生物樣品中蛋白的快速分離鑒定，在蛋白質組學研究等領域有良好的實用價值和應用前景。
文檔編號C12Q1/00GK1975429SQ200610147250
公開日2007年6月6日 申請日期2006年12月14日 優(yōu)先權日2006年12月14日
發(fā)明者鄧春暉, 李嫣, 張祥民, 徐秀青 申請人:復旦大學