專利名稱：：新的乳酸桿菌菌株、藥物組合物及其用途、以及制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新的乳酸桿菌(Z^/wmmww)菌株、其制備方法以及在治療抗生素和化療引起的腹瀉及其相關(guān)病癥的新用途。
背景技術(shù)：
：正常情況下，腸道菌群、宿主和外部環(huán)境建立起一個動態(tài)的生態(tài)平衡，該生態(tài)平衡對人體的健康起著重要作用。但是，目前由于多種原因(如抗生素的不合理使用、長期慢性病患者、創(chuàng)傷或手術(shù)、免疫抑制劑、激素、化療藥、放療等醫(yī)療措施以及環(huán)境因素)破壞了這種生態(tài)平衡，從而造成菌群紊亂并導(dǎo)致腹瀉等癥狀。在上述原因中，抗生素和化療藥的使用目前日益突出。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，抗生素相關(guān)性腹瀉(AAD)日益受到關(guān)注。抗生素在抑制或殺死致病菌的同時，也會同時損傷正常菌群，而腸道球菌或真菌則會過度生長。幾乎所有的抗生素(包括萬古霉素和甲硝唑)均可誘發(fā)AAD，且以廣譜青霉素最為常見，其次是克林霉素、頭孢菌素、氨基糖甙類等。另外抗腫瘤的化療藥物也會造成腸道菌群紊亂，從而導(dǎo)致腹瀉。研究表明，臨床長期應(yīng)用廣譜抗生素和化療藥物會導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)、腸道黏膜形態(tài)學(xué)改變以及腸道屏障功能損害，從而使腸腔中的大量細(xì)菌及其內(nèi)毒素由腸系膜淋巴結(jié)進入內(nèi)臟器官及體循環(huán)，引起菌血癥、膿毒血癥等重癥感染。這種腸源性感染依靠常規(guī)的抗生素治療不但難以治愈，而且會導(dǎo)致病情的惡化和蔓延。一旦真菌感染引起腹瀉，由于水和電解質(zhì)紊亂，病死率高。近年來微生態(tài)學(xué)的興起和微生態(tài)療法的應(yīng)用為抗生素和化療引起的腹瀉和相關(guān)癥狀的防治提供了新思路。微生態(tài)調(diào)節(jié)劑益生菌是一群通過提高腸道菌群平衡性而對宿主起益生作用的細(xì)菌，主要有乳酸桿菌、乳酸鏈球菌、雙岐桿菌等。這些細(xì)菌是健康人腸道的正常菌群。乳酸桿菌在腸道菌群中的重要性已在許多不同研究中得到證實。經(jīng)發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳酸桿菌大量口服給于哺乳動物有助于維持和增進該動物的健康。攝入后，鼠李糖乳桿菌會暫時定植在腸黏膜上，并抑制致病菌和輪狀病毒等生長，抑制過敏反應(yīng)，從而減輕腹瀉癥狀。另外關(guān)于鼠李糖乳桿菌的安全性評價已經(jīng)有許多報道，例如SafetyassessmentofpotentialprobioticlacticacidbacterialstrainsLactobacillusrhamnosusHNOOl，Lb.acidophilusHN017,禾卩BifidobacteriumlactisHN019inBALB/cmice,InternationalJournalofMicrobiology56:87-96。但是，目前報道的微生態(tài)制劑的穩(wěn)定性并不能令人滿意。因此，目前需要一種能長期保存的微生態(tài)制劑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種新的鼠李糖乳酸桿菌菌株，它能長期保存且能有效治療抗生素和化療藥物引起的腹瀉和相關(guān)癥狀。本發(fā)明所述的鼠李糖乳酸桿菌菌株被命名為SLR0406，已經(jīng)于2006年3月17日保藏于武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為CCTCC-M206023。本發(fā)明提供了一種鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406，其在37'C存活30-60天，且糖發(fā)酵特征如下阿纖果半葡乳麥甘松密棉鼠核海七拉維糖乳萄糖芽露二一子李糖藻葉伯糖糖糖糖醇糖糖糖糖糖靈糖—+++++±++——++++在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述的鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406是活的菌株或滅活菌株。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它包含本發(fā)明所述的鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406、保護劑和藥物上可接受的載體。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述藥物組合物的劑型選自口服液、片劑、膠囊和其它口服固體制劑、以及凍干粉制劑。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023的含量為0.1—99.9重量份，優(yōu)選為10—80重量份，更優(yōu)選為20—70重量份、最優(yōu)選為40—60重量份；所述保護劑的用量為O.l—99.9重量份，優(yōu)選為20—90重量份，更優(yōu)選為30—80重量份，最優(yōu)選為40—60重量份。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述保護劑包含脫脂奶粉1020重量份，海藻酸鈉1020重量份，異乳糖1020重量份，淀粉620重量份，谷氨酸鈉0.012重量份，維生素C-鈉0.01-0.2重量份，優(yōu)選地，所述保護劑含脫脂奶粉1218重量份，異乳糖1218重量份，淀粉10~16重量份，谷氨酸鈉0.051.5重量份，維生素C-鈉0.050.15重量份，更優(yōu)選地，所述含脫脂奶粉1416重量份，異乳糖1416重量份，淀粉1214重量份，谷氨酸鈉0.51.0重量份，維生素C-鈉0.1~0.12重量份。；本發(fā)明還提供了一種制備本發(fā)明所述的凍干粉制劑的方法，所述方法包括(a)配制培養(yǎng)基并消毒；(b)將步驟(a)所得培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐中接種鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206030，并發(fā)酵；(C)發(fā)酵所得產(chǎn)物進行離心得到菌泥；(d)在所得菌泥中加入保護劑，并進行冷凍干燥得凍干粉；(e)在步驟(d)所得凍干粉中加入賦形劑，過篩得到凍干粉制劑。本發(fā)明還提供了所述鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023在治療抗生素和化療引起的腹瀉及其相關(guān)病癥特別是腸道菌群紊亂、肝病輔助治療和降低血氨濃度中中的用途。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述相關(guān)病癥包括急性腹瀉、慢性腹瀉、腸易激綜合癥和便秘。本發(fā)明所述的鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023能長期保存，且能有效地治療抗生素和化療藥物引起的腹瀉和相關(guān)癥狀，特別是腸道菌群紊亂。具體實施例方式本發(fā)明所述的鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023是通過如下方法獲得的(a)將市售多株鼠李糖乳桿菌菌株(購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)在37°C、pH為4.0~7.0的條件下有氧發(fā)酵12—36小時，后置于三角瓶內(nèi)，并在0'C-5(TC保存；(b)將三角瓶內(nèi)的菌株每天涂平板測菌落數(shù)，并進行鏡檢觀察，同時進行無菌試驗，待菌落數(shù)降低至20個菌落以下時將全部菌落挑至庖肉管復(fù)蘇，進行生理生化鑒定，鑒定結(jié)果符合其生理生化特性(即下述的糖發(fā)酵指標(biāo))后擴增復(fù)壯(c)將步驟(b)中所得菌株重復(fù)進行步驟(a)-(b)，直到得到在37'C存活30-60天的菌株，即鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023。本發(fā)明所述的鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023的培養(yǎng)特征和菌體形態(tài)如下兼性厭氧菌，最適生長溫度為37'C4(TC，最適pH值為5.5-7.0，在MRS培養(yǎng)基上培養(yǎng)48小時長出乳白色菌落，菌落圓形隆起光滑，革蘭氏染色陽性，無芽孢、無夾膜、無鞭毛，菌體呈兩端圓的短桿、球桿狀，單個或雙排列。本發(fā)明的鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406能在37'C存活至少30天，例如30一60天，30—50天，30—40天。使用API50CHL試劑盒(購自BioMerieux，Lyon，F(xiàn)rance)按試劑盒說明書對本發(fā)明所述的鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023以及市售鼠李糖乳酸桿菌(購自北京普通微生物中心)進行發(fā)酵方式測定，結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>i糖發(fā)酵實驗結(jié)果表明馴化前后僅纖維糖發(fā)酵結(jié)果有差異，因此鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023符合鼠李糖乳桿菌特征。遺傳學(xué)鑒定由北京微生物研究所進行SLR0406的16SrDNA序列分析，所得序列如SEQIDNO:l所示。結(jié)果顯示SLR0406CCTCC-M206023與其它鼠李糖乳桿菌高度同源，相似性超過99%。本發(fā)明所述的鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023可以本領(lǐng)域中常規(guī)劑型進行給藥。例如，上述鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023可以制成口服液、片劑、膠囊和其它口服固體制劑、以及凍干粉制劑等。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023可以制成凍干粉制劑。本發(fā)明還提供了一種凍干粉制劑，它包含鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023冷凍干燥菌粉和保護劑。在上述制劑中，所述鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023的含量是常規(guī)的，只要能起到預(yù)期效果即可。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023的用量為0.1—99.9重量份，優(yōu)選為10—80重量份，更優(yōu)選為20-70重量份、最優(yōu)選為40—60重量份。在上述制劑中，所述保護劑是本領(lǐng)域中的常規(guī)保護劑。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述保護劑包含脫脂奶粉10~20重量份，海藻酸鈉10-20重量份、異乳糖1020重量份，淀粉620重量份，谷氨酸鈉0.0卜2重量份，維生素C-鈉0.010.2重量份。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實例中，所述保護劑含脫脂奶粉1218重量份，異乳糖12~18重量份，淀粉1016重量份，谷氨酸鈉0.051.5重量份，維生素C-鈉0.05~0.15簞量份。在本發(fā)明的還有一個優(yōu)選實例中，所述含脫脂奶粉14~16重量份，異乳糖1416重量份，淀粉1214重量份，谷氨酸鈉0.51.0重量份，維生素C-鈉0.1~0.12重量份。在上述制劑中，所述保護劑的用量是常規(guī)的。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述保護劑的用量為O.l—99.9重量份，優(yōu)選為20—90重量份，更優(yōu)選為30—80重量份，最優(yōu)選為40—60重量份。在上述凍干粉制劑中，還可包含藥學(xué)上可接受的載體。所述藥學(xué)上可接受的載體在本領(lǐng)域中是常規(guī)的，它可以是例如藥學(xué)可接受的填料、賦形劑、調(diào)味劑等。本發(fā)明還提供了上述凍干粉制劑的制備方法，該方法包含下列步驟(a)配制培養(yǎng)基并消毒；(b)將步驟(a)所得培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐中接種鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023，并發(fā)酵；(C)發(fā)酵所得產(chǎn)物進行離心得到菌泥；(d)在所得菌泥中加入保護劑，并進行冷凍干燥得凍干粉；(e)在步驟(d)所得凍干粉中加入賦形劑，過篩得到凍干粉制劑。在上述方法中，所述培養(yǎng)基在本領(lǐng)域中是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在閱讀本發(fā)明的基礎(chǔ)上結(jié)合其專業(yè)知識可以直接得到哪些培養(yǎng)基可用于本發(fā)明的。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述培養(yǎng)基包括氮源、碳源和特殊成分。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實例中，所述氮源選自脫脂奶粉、蛋白胨、胰胨、銨鹽、牛肉膏、和/或植物胴；所述碳源選自葡萄糖、乳糖、異乳糖、半乳糖、甘油、山梨醇、海藻糖和/或麥芽糖；所述特殊成分選自酵母粉、西紅柿汁、泡菜汁、半胱氨酸和/或土溫80。在上述方法，所述配制培養(yǎng)基并進行消毒的步驟在本領(lǐng)域中是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在閱讀本發(fā)明的基礎(chǔ)上結(jié)合其專業(yè)知識可以直接得到怎樣配制培養(yǎng)基并進行消毒。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述配制培養(yǎng)基并進行消毒的步驟包括將脫脂奶粉、葡萄糖以及酵母膏充分溶解在水中，并將pH值調(diào)節(jié)到6.5—7.5，并所得水溶液置于高壓鍋內(nèi)于100—20(TC滅菌5—60分鐘，隨后冷卻至37~38°C。在上述方法中，所述接種鼠宇糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023并進行發(fā)酵的步驟在本領(lǐng)域中是常規(guī)的，只不過使用本發(fā)明的鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023代替其它常規(guī)菌株而已，因此本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述再結(jié)合其專業(yè)知識可以直接得到怎樣進行接種和發(fā)酵。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述接種鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023并進行發(fā)酵的步驟包括將步驟(a)所得產(chǎn)物置于發(fā)酵罐內(nèi)并在無菌條件下接種5—30體積％(以步驟(a)中所得產(chǎn)物的體積計)的鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023，然后在3738。C、罐內(nèi)壓為0.30.6公斤/平方厘米的條件下通入無菌空氣發(fā)酵12小時~24小時。在上述方法中，所述冷凍干燥得到凍干粉的步驟在本領(lǐng)域中是常規(guī)的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述再結(jié)合其專業(yè)知識可以直接得知怎樣進行冷凍干燥。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實例中，所述冷凍干燥得到凍干粉的步驟包括以所得菌泥的重量計，在菌泥中加入5—30重量％的保護劑，并進行冷凍干燥，得凍干粉。在上述配制培養(yǎng)基并進行消毒的步驟中，對于脫脂奶粉、葡萄糖以及酵母膏的用量并沒有具體的限制，只要形成能形成接種鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023的培養(yǎng)基即可。在本發(fā)明的一個實例中，所述脫脂奶粉的用量為5—15千克，優(yōu)選為6—10千克，更優(yōu)選為7—9千克。在本發(fā)明的一個實例中，所述葡萄糖的用量為0.5—5千克，優(yōu)選為1一3千克，更優(yōu)選為1.2—2千克，最優(yōu)選為1.3""^1.8千克。在本發(fā)明的一個實例中，所述酵母膏的用量為0.5—5千克，優(yōu)選為.0.6—3千克，更優(yōu)選為0.7—2千克，最優(yōu)選為0.8—1.5千克。在上述配制培養(yǎng)基并進行消毒的步驟中，所述滅菌溫度優(yōu)選為110—150°C,更優(yōu)選為120—130°C。在上述配制培養(yǎng)基并進行消毒的步驟中，所述滅菌時間優(yōu)選為6—40分鐘，更優(yōu)選為7—20分鐘，最優(yōu)選為8—15分鐘。在上述接種鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023并進行發(fā)酵中，鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206030的用量優(yōu)選為6—20體積%，更優(yōu)選為7—15體積％，最優(yōu)選為8—12體積％。在上述接種鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023并進行發(fā)酵中，發(fā)酵罐內(nèi)壓優(yōu)選為0.4—0.5公斤/平方厘米。在上述冷凍干燥得到凍干粉的步驟中，所述保護劑的用量優(yōu)選為6—20重量％，更優(yōu)選為7—15重量％，最優(yōu)選為8—12重量％。在上述冷凍干燥得到凍干粉的步驟中，所述冷凍干燥優(yōu)選在-5(TC到30°C進行，更優(yōu)選在-4CTC到l(TC進行。在上述步驟(e)中，所述賦形劑優(yōu)選為淀粉或預(yù)膠化淀粉。本發(fā)明所述的鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023使用簡單，例如可通過口服進行給藥。本發(fā)明所述的鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023能長期保存，且能有效地治療抗生素和化療藥物引起的腹瀉和相關(guān)癥狀。下面結(jié)合實施例細(xì)說明本發(fā)明，這些實施例只是用于舉例說明的目的，并沒有限制本發(fā)明的范圍。實施例1:制備鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023如下制備鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023:(a)將市售多株鼠李糖乳桿菌菌株(購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)在37。C的條件下有氧發(fā)酵24小時，后置于三角瓶內(nèi)，并在37"保存，發(fā)酵起始pH為7.0，結(jié)束時pH為3.8~4.2;(b)將三角瓶內(nèi)的菌液每天涂平板測菌落數(shù)，并進行鏡檢觀察，同時進行無菌試驗，待菌落數(shù)降低至20個菌落以下時將全部菌落挑至庖肉管復(fù)蘇，進行生理生化鑒定，鑒定結(jié)果符合其生理生化特性(本文所述的糖發(fā)酵指標(biāo))后擴增復(fù)壯；(c)將步驟(b)中所得菌株重復(fù)進行步驟(a)-(b)，直到得到在37'C能存活30-60天的菌株，即鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023。實施例2—5如實施例1相同的方法制備鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023，不同的是步驟(a)的保存溫度分別是4°C、25°C、4(TC和45。C。實施例6:制備凍干粉膠囊在500L發(fā)酵罐中分別加入脫脂奶粉(新西蘭進口脫脂奶粉)8千克，葡萄糖(上海葡糖糖廠)1.5千克，酵母粉(英國OXOID丄TD)l千克，充分溶于350L水中，用40。/。氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)到7.0。所得水溶液于121。C在高壓鍋中滅菌10分鐘，得到無菌產(chǎn)物。在上述無菌產(chǎn)物中按10體積％(以上述無菌產(chǎn)物的體積計)的接種量接種實施例1所得鼠李糖乳桿菌SLR0406CCTCC-M206023，并在有氧、37。C條件下培養(yǎng)20小時后冷卻，離心得菌泥3千克。在上述菌泥中加入3千克保護劑混勻，在-4(TC冷凍干燥，得菌粉2千克。在上述菌粉中加入預(yù)膠化淀粉8千克，過40目篩，直接灌裝膠囊。保護劑配方脫脂奶粉(新西蘭進口脫脂奶粉)2千克，異乳糖2.5千克，谷氨酸鈉(廣州味精食品廠)0.4千克，維生素C-鈉(江蘇靖江制藥廠)0.05千克，上述組分溶于12千克水中，并于12rC滅菌15分鐘。實施例7:制備凍干粉膠囊在500L發(fā)酵罐中分別加入脫脂奶粉(新西蘭進口脫脂奶粉)8千克，葡萄糖(上海葡糖糖廠)1.5千克，酵母粉(英國OXOID丄TD)l千克，充分溶于350L水中，用40。/。氫氧化鈉溶液將,pH調(diào)節(jié)到7.0。所得水溶液于12rC在高壓鍋中滅菌10分鐘，得到無菌產(chǎn)物。在上述無菌產(chǎn)物中按10體積％(以上述無菌產(chǎn)物的體積計)的接種量接種實施例2所得鼠李糖乳桿菌SLR0406CCTCC-M206023，并在有氧、37'C條件下培養(yǎng)20小時后冷卻，離心得菌泥3千克。在上述菌泥中加入3千克保護劑混勻，在-4(TC冷凍干燥，得菌粉2千克。在上述菌粉中加入預(yù)膠化淀粉8千克，過40目篩，直接灌裝膠囊。保護劑配方脫脂奶粉(新西蘭進口脫脂奶粉)2千克，異乳糖2.5千克，谷氨酸鈉(廣州味精食品廠)0.4千克，維生素C-鈉(江蘇靖江制藥廠)0.05千克，上述組分溶于12千克水中，并于121'C滅菌15分鐘。實施例8:制備凍干粉膠囊在500L發(fā)酵罐中分別加入脫脂奶粉(新西蘭進口脫脂奶粉)8千克，葡萄糖(上海葡糖糖廠)1.5千克，酵母粉(英國OXOID丄TD)l千克，充分溶于350L水中，用40%氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)到7.0。所得水溶液于121。C在高壓鍋中滅菌10分鐘，得到無菌產(chǎn)物。在上述無菌產(chǎn)物中按10體積％(以上述無菌產(chǎn)物的體積計)的接種量接種實施例3所得鼠李糖乳桿菌SLR0406CCTCC-M206023，并在有氧、37'C條件下培養(yǎng)20小時后冷卻，離心得菌泥3千克。在上述菌泥中加入3千克保護劑混勻，在-40。C冷凍干燥，得菌粉2千克。在上述菌粉中加入預(yù)膠化淀粉8千克，過40目篩，直接灌裝膠囊。保護劑配方脫脂奶粉(新西蘭進口脫脂奶粉)2千克，異乳糖2.5千克，谷氨酸鈉(廣州味精食品廠)0.4千克，維生素C-鈉(江蘇靖江制藥廠)0.05千克，上述組分溶于12千克水中，并于121'C滅菌15分鐘。實施例9:制備凍干粉膠囊在500L發(fā)酵罐中分別加入脫脂奶粉(新西蘭進口脫脂奶粉)8千克，葡萄糖(上海葡糖糖廠)1.5千克，酵母粉(英國OXOID丄TD)l千克，充分溶于350L水中，用40。/。氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)到7.0。所得水溶液于121'C在高壓鍋中滅菌10分鐘，得到無菌產(chǎn)物。在上述無菌產(chǎn)物中按10體積>/。(以上述無菌產(chǎn)物的體積計)的接種量接種實施例4所得鼠李糖乳桿菌SLR0406CCTCC-M206023，并在有氧、37"C條件下培養(yǎng)20小時后冷卻，離心得菌泥3千克。在上述菌泥中加入3千克保護劑混勻，在-4(TC冷凍干燥，得菌粉2千克。在上述菌粉中加入預(yù)膠化淀粉8千克，過40目篩，直接灌裝膠囊。保護劑配方脫脂奶粉(新西蘭進口脫脂奶粉)2千克，異乳糖2.5千克，谷氨酸鈉(廣州味精食品廠)0.4千克，維生素C-鈉(江蘇靖江制藥廠)0.05千克，上述組分溶于12千克水中，并于121。C滅菌15分鐘。實施例10:制備凍干粉膠囊在500L發(fā)酵罐中分別加入脫脂奶粉(新西蘭進口脫脂奶粉)8千克，葡萄糖(上海葡糖糖廠)1.5千克，酵母粉(英國OXOID丄TD)l千克，充分溶于350L水中，用40。/。氫氧化鈉溶液將pH調(diào)節(jié)到7.0。所得水溶液于121。C在高壓鍋中滅菌10分鐘，得到無菌產(chǎn)物。在上述無菌產(chǎn)物中按10體積％(以上述無菌產(chǎn)物的體積計)的接種量接種實施例5所得鼠李糖乳桿菌SLR0406CCTCC-M206023，并在有氧、37。C條件下培養(yǎng)20小時后冷卻，離心得菌泥3千克。在上述菌泥中加入3千克保護劑混勻，在-4(TC冷凍干燥，得菌粉2千克。在上述菌粉中加入預(yù)膠化淀粉8千克，過40目篩，直接裝膠囊。保護劑配方脫脂奶粉(新西蘭進口脫脂奶粉)2千克，異乳糖2.5千克，谷氨酸鈉(廣州味精食品廠)0.4千克，維生素C-鈉(江蘇靖江制藥廠)0.05千克，上述組分溶于12千克水中，并于12rC滅菌15分鐘。實施例11一15:制備活菌片劑如實施例6—10得到2千克菌粉，并在其中分別加入e-環(huán)糊精0.5千克，粉碎得到粉末。在所得粉末加入8千克預(yù)膠化淀粉和1千克乳糖，充分混合后過24目篩，并用壓片機(上海遠東制藥機械廠)壓片得到片劑。實施例16:急性毒性實驗選擇Wistar大鼠和beagle犬作為研究對象，研究實施例11一15中所得活菌片劑的毒性。挑選Wistar大鼠60只(雌雄各半)，beagle犬10只(雌雄各半)。將Wistar大鼠10只(雌雄各半)加beagle犬2只(雌雄各半)分成1組(實驗組1—5)，將單獨Wistar大鼠10只(雌雄各半)分成一組(對照組)將實施例11一15制得的500mg片劑分散在12.5ml無菌生理鹽水稀釋成懸浮液，以2克片劑/千克體重的標(biāo)準(zhǔn)分別一次性服實驗組l一5。觀察動物出現(xiàn)的反應(yīng)，連續(xù)觀察14天。實驗組和對照組動物的一般指標(biāo)(動物外觀、行為、排泄物等)均正常，體重?zé)o明顯差異，未發(fā)生中毒現(xiàn)象和死亡現(xiàn)象。實施例17:急性毒性實驗選擇昆明小白鼠60只，將其分成IO只一組(實驗組l一5以及對照組)。將實施例11一15所得的500mg片劑分散在12.5ml無菌生理鹽水稀釋成懸浮液，將所得懸浮液腹腔注射到實驗組1—5的動物中，每只0.5毫升。對照組腹腔注射生理鹽水0.5毫升。觀察動物出現(xiàn)的反應(yīng)，連續(xù)觀察14天。實驗組和對照組動物的一般指標(biāo)(動物外觀、行為、排泄物等)均正常，體重?zé)o明顯差異，未發(fā)生中毒現(xiàn)象和死亡現(xiàn)象。實施例18:長期毒性實驗如實施例17進行實驗，不同的是連續(xù)給藥時間為3個月，給藥期間動物自由攝食、飲水。給藥期間觀察動物。根據(jù)觀察，給藥組和對照組行為正常，體重增長正常且無明顯差異，各項生化和病理指標(biāo)均未出現(xiàn)異常改變。實施例16—18的結(jié)果表明由本發(fā)明所述鼠李糖乳桿菌SLR0406CCTCC-M206023制成的制劑對Wistar大鼠、昆明小白鼠和beagle犬無急性毒性和蓄積毒性，可以安全服用。實施例19選擇雌性SPF級的BALB/c小鼠(18g士2g)30只，并將其分成2組，模型組為20只，對照組為10只。用抗生素氨芐西林鈉作為造模藥物，采用飲水+胃的方式對模型組進行造模。氨芐西林鈉胃劑量300毫克/天。氨芐西林鈉處理時間為3天，觀察糞便變化并記錄。以出現(xiàn)稀便(濾紙上有無污跡為標(biāo)準(zhǔn))判定有無腹瀉。①腹瀉率-組中排稀便的動物數(shù)/該組動物總數(shù)腹瀉指數(shù)=稀便率*稀便級，其中稀便率=每只動物的稀便數(shù)/總便數(shù)；稀便級表示稀便的程度，以稀便污染濾紙形成污跡面積的大小定級。分為4級，標(biāo)準(zhǔn)如下級數(shù)1234污跡直徑(cm)<11-1.92-3>3氨芐西林鈉300mg/天對模型組進行給藥，導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)水樣便，均腹瀉，即腹瀉率為100%，腹瀉指數(shù)為0.93±0.12，而對照組正常進食，所得2項指標(biāo)均為0。對照組與模型組小鼠腸道菌群均值比較(log值)<table>complextableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>將用抗生素氨芐西林鈉如上述處理過的60只小鼠平均分成6組(實驗組1—5和對照組)。將實施例11—15所得片劑以每天108CFU的劑量分別口服胃給實驗組1一5，自然恢復(fù)組服無活菌的對照品生理鹽水。連續(xù)服7天，第八天處死小鼠，并在無菌條件下進行解剖，各小鼠的腸道取樣物培養(yǎng)后進行活菌計數(shù)。各組實驗小鼠處理i周后腸道菌群定量分析結(jié)果(log值)<table>complextableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注實驗組的數(shù)值取平均值結(jié)果顯示連續(xù)服抗生素后引起小鼠腹瀉，此后連續(xù)服本發(fā)明的產(chǎn)品，和自然恢復(fù)組相比試驗組腹瀉癥狀明顯改善，腸道益生菌數(shù)量迅速恢復(fù)到正常水平。實施例20:儲存穩(wěn)定性將實施例l一5中所得鼠李糖乳桿菌(即SLR0406CCTCC-M206023)和原始菌株(購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)發(fā)酵液于37t:條件下儲存，比較其穩(wěn)定性。由下表可以看出在相同保存條件下馴化菌株的活菌數(shù)比原始菌株高一個數(shù)量級，因此經(jīng)馴化的菌株更為穩(wěn)定。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>由上表可知，本發(fā)明所得鼠李糖乳桿菌在37'C至少能夠穩(wěn)定地保存30天。而且，將實施例1中所得鼠李糖乳桿菌保存到第60天，其存活的活菌數(shù)也能達到約100。序列表〈110〉信誼藥廠<〗20>新的乳酸桿菌菌株、藥物組合物及其用途、以及制造方法<130〉060350<160>1<170〉Patentlnversion3.3〈210>1<211〉1426〈212>DNA<213〉鼠李糖乳酸桿菌SLR0406的16SrDNA<400〉1gctccctaaaagggttacgccaccggcttcgggtgttacaaactctcatggtgtgacggg60cggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagcg120attccgacttcgtgtaggcgagttgcagcctacagtccgaactgagaatggctttaagag180attagcttgacctcgcggtctcgcaactcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagc240ccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccg300gcagtcttactagagtgcccaactaaatgctggcaactagtcataagggttgcgctcgtt3G0gcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcat420tttgcccccgaaggggaaacctgatctctcaggtgatcaaaagatgtcaagacctggtaa480ggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtca540attcctttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagc600tgcggcactgaagggcggaaaccctccaacacctagcattcatcgtttacggcatggact660accagggtatctaatcctgttcgctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttacagac720cagacagccgccUcgccactggtgttcttccatatatctacgcatttcaccgctacaca780tggagttccactgtcctcttctgcactcaagtttcccagtttccgatgcacttcctcggt840taagccgagggctttcacatcagacttaaaaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaata900aatccggataacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtg960gctttctggttggataccgtcacgccgacaacagttactctgccgaccattcttctccaa1020caacagagttttacgacccgaaagccttcttcactcacgcggcgttgctccatcagactt1080gcgtccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcag1140tcccaatgtggccgatcaacctctcagttcggctacgtatcattgccttggtgagccgtt1200acctcaccaactagctaatacgccgcgggtccatccaaaagcgatagcttacgccatctt1260tcagccaagaaccatgcggttcttggattta.tgcggtattagcatctgtttccaaatgtt1320atcccccacttaag'ggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccactcgttcaaaa1380ttaaatcaagatgcaagcacctttcaataatcagaactcgttcgac1426(SEQIDNO:1)權(quán)利要求1.一種鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406，其在37℃存活30-60天，且糖發(fā)酵特征如下阿纖果半葡乳麥甘松密棉鼠核海七拉維糖乳萄糖芽露三二子李糖藻葉伯糖糖糖糖醇糖糖糖糖糖靈糖-+++++±++--++++2.如權(quán)利要求1所述的鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406，其保藏號為CCTCC-M206023。3.如權(quán)利要求1所述的鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406，其特征在于它是活的菌株或滅活菌株。4.一種藥物組合物，它包含權(quán)利要求1所述的鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406、保護劑和藥物上可接受的載體。5.如權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物的劑型選自口服液、片劑、膠囊和其它口服固體制劑、以及凍干粉制劑。6.如權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于所述鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023的含量為0.1—99.9重量份，優(yōu)選為10—80重量份，更優(yōu)選為20—70重量份、最優(yōu)選為40—60重量份；所述保護劑的用量為0.1—99.9重量份，優(yōu)選為20—90重量份，更優(yōu)選為30—80重量份，最優(yōu)選為40—60重量份。7.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于所述保護劑包含脫脂奶粉1020重量份，海藻酸鈉1020重量份，異乳糖10~20重量份，淀粉620重量份，谷氨酸鈉0.01-2重量份，維生素C-鈉0.01~0.2重量份，優(yōu)選地，所述保護劑含脫脂奶粉12~18重量份，異乳糖1218重量份，淀粉1016重量份，谷氨酸鈉0.051.5重量份，維生素C-鈉0.050.15重量份，更優(yōu)選地，所述含脫脂奶粉1416重量份，異乳糖1416重量份，淀粉1214重量份，谷氨酸鈉0.51.0重量份，維生素C-鈉0.1~0.12重量份。8.—種制備權(quán)利要求4所述的凍千粉制劑的方法，所述方法包括(a)配制培養(yǎng)基并消毒；(b)將步驟(a)所得培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐中接種鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023，并發(fā)酵；(C)發(fā)酵所得產(chǎn)物進行離心得到菌泥；(d)在所得菌泥中加入保護劑，并進行冷凍干燥得凍干粉；(e)在步驟(d)所得凍干粉中加入賦形劑，過篩得到凍干粉制劑。9.鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023在治療抗生素和化療引起的腹瀉及其相關(guān)病癥特別是腸道菌群紊亂、肝病輔助治療和降低血氨濃度中的用途。10.如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于所述相關(guān)病癥包括急性腹瀉、慢性腹瀉、腸易激綜合癥和便秘。全文摘要本發(fā)明提供了一種鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406，其在37℃存活30-60天。本發(fā)明還提供了一種包含所述鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406的藥物組合物。本發(fā)明所述的鼠李糖乳酸桿菌菌株SLR0406CCTCC-M206023能長期保存，且能有效地治療抗生素和化療藥物引起的腹瀉和相關(guān)癥狀。文檔編號C12N1/20GK101173228SQ20061011782公開日2008年5月7日申請日期2006年11月1日優(yōu)先權(quán)日2006年11月1日發(fā)明者京劉,曦朱,邱立鈞,嬌陳,陳佳鳳申請人:信誼藥廠