專利名稱：可逆性修飾的熱穩(wěn)定酶組合物及其制備方法和使用方法
交叉引用
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背景技術(shù)：
核酸檢測(cè)技術(shù)例如靶擴(kuò)增和信號(hào)擴(kuò)增，廣泛用于臨床微生物學(xué)、血液篩查、食品安全、基因疾病診斷和預(yù)后、環(huán)境微生物學(xué)、藥物靶的發(fā)現(xiàn)和證實(shí)、法醫(yī)學(xué)(forensics)和其它生物醫(yī)學(xué)研究。由此，核酸檢測(cè)日益成為新出現(xiàn)的藥物基因組學(xué)、產(chǎn)前診斷和基于分子的癌癥診斷和治療的基本組成要素。因此，核酸檢測(cè)的穩(wěn)定性、特異性、靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度的可信性、和可用性是非常重要的。
核酸序列的特異性擴(kuò)增可靈敏地檢測(cè)是否存在特異性靶核酸序列?；跓嵫h(huán)的靶擴(kuò)增示例性方法包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和連接酶鏈反應(yīng)(LCR)。與熱循環(huán)方法不同，在基本恒定溫度時(shí)進(jìn)行的等溫?cái)U(kuò)增方法還可用于核酸序列特異性擴(kuò)增。示例性等溫?cái)U(kuò)增方法包括轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、鏈替代擴(kuò)增反應(yīng)(SDA)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、單引物等溫?cái)U(kuò)增(SPIATM)和指數(shù)式單引物等溫?cái)U(kuò)增(X-SPIATM)、自主序列復(fù)制系統(tǒng)(3SR)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)。
不管其熱穩(wěn)定性如何，所有酶在一個(gè)溫度范圍內(nèi)具有活性，因而這種特性會(huì)在特異性、靈敏度和信/噪比等方面對(duì)檢測(cè)核酸造成不良影響。這一點(diǎn)已在PCR過程中清楚地得到證實(shí)。熱穩(wěn)定DNA聚合酶對(duì)于PCR是必不可少的。雖然熱穩(wěn)定DNA聚合酶的催化活性的最佳溫度為大約60～75℃，但DNA聚合酶在較低溫度下也具有活性。因此，DNA聚合酶甚至在室溫時(shí)還保留顯著的活性水平。由此，DNA聚合酶在較低溫度下的活性是非特異性擴(kuò)增和降低檢測(cè)靈敏的原因。
“熱啟動(dòng)”是指在低溫下滅活熱穩(wěn)定酶如DNA聚合酶而在升高的溫度時(shí)恢復(fù)酶的活性的方法。已開發(fā)了多種熱啟動(dòng)方法以改進(jìn)核酸檢測(cè)方法，包括使用物理屏障將酶從反應(yīng)的其它成分中隔離的方法和在較低溫度下滅活酶的化學(xué)修飾方法。
美國(guó)專利5,677,152和5,773,258中描述了一種使用二羧酸酐在低溫時(shí)抑制DNA聚合酶活性的可逆性化學(xué)修飾。另外，美國(guó)專利6,183,998的公開文本中描述了另一種使用醛類化合物對(duì)DNA聚合酶進(jìn)行可逆性修飾的方法。酐和醛介導(dǎo)的修飾均在修飾劑化合物和DNA聚合酶間形成共價(jià)鍵。通過高溫下溫育在適當(dāng)?shù)木彌_液中的修飾酶來恢復(fù)酶的活性。
然而，使這類方法的修飾作用逆轉(zhuǎn)的條件通常對(duì)DNA聚合酶非?？量?。例如，對(duì)于醛修飾的DNA聚合酶而言，醛與DNA聚合酶中的胺基形成希夫堿(Schiff base)。對(duì)于PCR，為了適當(dāng)?shù)卦俅渭せ蠲?，該酶必須?5℃溫育15分鐘。在95℃下的該溫育時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)酶活性非常有害并且導(dǎo)致活性顯著喪失。
另外，酐修飾的DNA聚合酶的激活對(duì)酶的要求也很苛刻。具體來說，酐修飾的DNA聚合酶的推薦激活條件為95℃時(shí)溫育10分鐘。除了酶的激活所要求的條件苛刻外，用酐分子修飾酶的過程也很困難，因?yàn)轸肿油ǔＴ谒詶l件下非常不穩(wěn)定并迅速發(fā)生水解，水解作用破壞了酐與胺基反應(yīng)從而修飾靶酶的能力。已有人提出嘗試解決水解問題，例如在美國(guó)專利No.6,479,264中公開的在有機(jī)溶劑中進(jìn)行修飾。但這種修飾過程較長(zhǎng)、繁冗而且效率低。更重要一點(diǎn)，不是所有的蛋白質(zhì)都適應(yīng)處理?xiàng)l件。
因此，需要開發(fā)用于改善可逆性修飾的酶的更好的化學(xué)修飾方法，使該酶的敏感性和特異性得到改善。
相關(guān)文獻(xiàn)
相關(guān)的美國(guó)專利包括5,338,671，5,411,876，5,413,924，5,427,930，5,565,339，5,643,764，5,677,152，5,773,258，6,183,967，6,183,998，6,274,981，6,403,341，6,479,264，6,511,810，6,528,254，6,548,250，6,667,165，6,191,278，6,465,644和6,699,981。相關(guān)文獻(xiàn)包括Bae et al.，1999，Mol.Cells9(1)45-48；Barnes WM.，1992，Gene 11229-35；Coleman et al.，1990，J.Chromatogr.512345-363；Hoare et al.，1967，J.Biol.Chem.2422447-2453；Hall et al.，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97(15)8272-8277；Harrington et al.，1994，EMBO J.13(5)1235-1246；Henricksen et al.，2000，J.Biol.Chem.275(22)16420-16427；Hosfield et al.，1998，J.Biol.Chem.273(42)27154-17161；Kaiser et al.，1999，J.Biol.Chem.274(30)21387-21394；Lawyer et al.，1989，J Biol Chem.1989 264(11)6427-37；Lawyer et al.，1993，PCR Methods Appl.2(4)275-87；Leoneet al.，1998，Nucleic Acids Res.26(9)2150-2155；Matsui et al.，1999，J.Biol.Chem.274(26)18297-18309；Murante et al.，1995，J.Biol.Chem.270(51)30377-30383；Nadeau et al.，1999，Anal.Biochem.276177-187；Nieto et al.，1983，Biochim Biophys Acta.749204-10；Nilsson et al.，2002，Nucleic Acids Res.30(14)e66；Palacian et al.，1990，Mol.Cell.Biochem.97101-1 11；Rao etal.，1998，J.Bacteriol.180(20)5406-5412；Rumbaugh et al.，1999，J.Biol.Chem.274(21)14602-14608；Spears et al.，1997，Anal.Biochem.247130-137；Staros et al.，1986，Anal.Biochem.156220-222；Walker et al.，1996，Nucleic Acids Res.24(2)348-353；and Wu et al.，1996，Nucleic Acids Res.24(11)2036-2043。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供可逆性修飾的熱穩(wěn)定酶(例如熱穩(wěn)定DNA聚合酶、熱穩(wěn)定RNA聚合酶、熱穩(wěn)定核酸酶例如熱穩(wěn)定內(nèi)切核酸酶、熱穩(wěn)定連接酶、熱穩(wěn)定RNA酶H、熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶、熱穩(wěn)定解旋酶、熱穩(wěn)定RecA等)的組合物。本發(fā)明還提供使用羧酸修飾劑生產(chǎn)主題組合物的方法。本發(fā)明還提供使用可逆性修飾的熱穩(wěn)定酶組合物的方法以及包含可逆性修飾的熱穩(wěn)定酶組合物的試劑盒和系統(tǒng)。
本發(fā)明提供一種熱穩(wěn)定酶組合物，其中熱穩(wěn)定酶組合物包括熱穩(wěn)定酶，所述熱穩(wěn)定酶已被共價(jià)修飾而導(dǎo)致酶活性基本完全失活，其中所述修飾的熱穩(wěn)定酶組合物在所配制的25℃時(shí)約pH7至約pH9的水性緩沖液中在約50℃以上溫度時(shí)的溫育，使得組合物活性在約20min以內(nèi)至少增加兩倍。在某些實(shí)施方案中，所述的熱穩(wěn)定酶組合物在所配制的25℃時(shí)約pH7至約pH8的水性緩沖液中在約50℃以上溫度時(shí)的溫育，使得組合物活性在約20min以內(nèi)至少增加兩倍。
在某些實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定酶為熱穩(wěn)定聚合酶如熱穩(wěn)定DNA聚合酶或熱穩(wěn)定RNA聚合酶、熱穩(wěn)定RNA酶H、熱穩(wěn)定DNA核酸酶如熱穩(wěn)定DNA內(nèi)切核酸酶、熱穩(wěn)定DNA連接酶、熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶、熱穩(wěn)定解旋酶、熱穩(wěn)定Rec A等。在某些實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定酶為熱穩(wěn)定聚合酶。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定聚合酶為熱穩(wěn)定DNA聚合酶。在其它實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定聚合酶為熱穩(wěn)定RNA聚合酶。在另外實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定酶為熱穩(wěn)定DNA核酸酶例如熱穩(wěn)定DNA內(nèi)切核酸酶。在其它實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定酶源于水生棲熱菌(Thermusacquaticus)、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)、海棲熱袍菌(Thermatoga maritime)、敏捷氣熱菌(Aeropyrum pernix)、風(fēng)產(chǎn)液菌(Aquifex aeolicus)、閃爍古生球菌(Archaeglobus fulgidus)、熱堅(jiān)芽孢桿菌(Bacillus caldotenax)、生氫氧化碳嗜熱菌(Carboxydothermus hydrogenformans)、熱自養(yǎng)甲烷桿菌△H(Methanobacterium thermoautotrophicum △H)、詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、熾熱甲烷嗜熱菌(Methanothermusfervidus)、冰島熱棒菌(Pyrobaculum islandicum)、Pyrococcusendeavori、激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)、Pyrococcushorihoshii、Pyrococcus profundus、伍斯氏火球菌(Pyrococcuswoesei)、隱蔽熱網(wǎng)菌(Pyrodictium occultum)、嗜酸熱硫化葉菌(Sulfolobus acidocaidarius)、硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)、熱硫化氫熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterthermohydrosulfuricus)、速生熱球菌(Thermococcus celer)、Thermococcus fumicolans、Thermococcus gorgonarius、Thermococcuskodakaraensis KOD1、Thermococcus litoralis、Thermococcuspeptonophilus、90N-7熱球菌(Thermococcus sp.90N-7)、TY熱球菌(Thermococcus sp.TY)、斯氏熱球菌(Thermococcus stetteri)、Thermococcus zilligii、嗜酸熱原體(Thermoplasma acidophilum)、Thermus brokianus，Thermus caldophilus GK24，黃棲熱菌(Thermusflavus)、紅色棲熱菌(Thermus rubens)或者它們的突變體。
在某些實(shí)施方案中，熱穩(wěn)定酶已被下式所示的羧酸修飾劑修飾，
其中R為氫、取代或未取代的苯基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的雜芳基、或者取代或未取代的烷基。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，羧酸修飾劑為檸康酸或順烏頭酸。
本發(fā)明還提供可逆地滅活熱穩(wěn)定酶的方法，包括將下式羧酸修飾劑
和零長(zhǎng)(zero-length)交聯(lián)劑化合物反應(yīng)以產(chǎn)生活化的羧酸修飾劑，并將熱穩(wěn)定酶與所述活化的羧酸修飾劑反應(yīng)以可逆地滅活熱穩(wěn)定酶，其中R為氫、取代或未取代的苯基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的雜芳基、或者取代或未取代的烷基。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，羧酸修飾劑為檸康酸或順烏頭酸。
在某些實(shí)施方案中，零長(zhǎng)交聯(lián)劑為酯提供羧酸修飾劑。在某些實(shí)施方案中，零長(zhǎng)交聯(lián)劑化合物為碳二亞胺化合物、伍德瓦德氏試劑K(Woodward’s Reagent K)、N，N’-羰基二咪唑、TSTU(O-(N-琥珀酰亞胺基)-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸鹽)、BTU((O-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸鹽)、TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽)、TFFH(N，N’，N”，N’”-四甲基脲2-氟-六氟磷酸鹽)、PyBOP(苯并三唑-1-基-氧-三吡咯烷-磷六氟磷酸鹽)、EEDQ(2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氫喹啉)、DIPCDI(二異丙基碳二亞胺)、MSNT(1-(均三甲基苯-2-磺酰基)-3-硝基-1H-1，2，4-三唑)或者三異丙基苯磺酰氯。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，碳二亞胺化合物為1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉乙基)碳二亞胺(CMC)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或二異丙基碳二亞胺(DIC)。
在某些實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定酶為熱穩(wěn)定聚合酶，例如熱穩(wěn)定DNA聚合酶或熱穩(wěn)定RNA聚合酶、熱穩(wěn)定RNA酶H、熱穩(wěn)定DNA核酸酶例如熱穩(wěn)定DNA內(nèi)切核酸酶、熱穩(wěn)定DNA連接酶、熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶、熱穩(wěn)定解旋酶、熱穩(wěn)定Rec A等。在某些實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定酶為熱穩(wěn)定聚合酶。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定聚合酶為熱穩(wěn)定DNA聚合酶。在其它實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定聚合酶為熱穩(wěn)定RNA聚合酶。另外的實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定酶為熱穩(wěn)定DNA核酸酶例如熱穩(wěn)定DNA內(nèi)切核酸酶。在其它實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定酶源于水生棲熱菌、嗜熱棲熱菌、海棲熱袍菌、敏捷氣熱菌、風(fēng)產(chǎn)液菌、閃爍古生球菌、熱堅(jiān)芽孢桿菌、生氫氧化碳嗜熱菌、熱自養(yǎng)甲烷桿菌△H、詹氏甲烷球菌、熾熱甲烷嗜熱菌、冰島熱棒菌、Pyrococcus endeavori、激烈熱球菌、Pyrococcus horihoshii、Pyrococcus profundus、伍斯氏火球菌、隱蔽熱網(wǎng)菌、嗜酸熱硫化葉菌、硫磺礦硫化葉菌、熱硫化氫熱厭氧桿菌、速生熱球菌、Thermococcus fumicolans、Thermococcus gorgonarius、Thermococcus kodakaraensis KOD1、Thermococcus litoralis、Thermococcus peptonophilus、90N-7熱球菌、TY熱球菌、斯氏熱球菌、Thermococcus zilligii、嗜酸熱原體、Thermus brokianus、Thermuscaldophilus GK24、黃棲熱菌、紅色棲熱菌或者它們的突變體。
本發(fā)明還提供一種延伸引物的方法通過制備由下述物質(zhì)——包含靶核酸的樣品、與靶核酸互補(bǔ)的第一引物、熱穩(wěn)定聚合酶組合物——混合得到的引物延伸反應(yīng)混合物，并在約50℃以上的溫度下溫育所述引物延伸反應(yīng)混合物一段時(shí)間，該時(shí)間足以使所述熱穩(wěn)定DNA聚合酶組合物激活，以便所述聚合酶產(chǎn)生由所述第一引物和所述靶核酸而得的引物延伸產(chǎn)物。
在某些實(shí)施方案中，引物延伸反應(yīng)混合物還包括與靶核酸互補(bǔ)的第二引物。在某些實(shí)施方案中，該方法為擴(kuò)增所述靶核酸的方法。在某些實(shí)施方案中，熱穩(wěn)定聚合酶為熱穩(wěn)定DNA聚合酶。在其它實(shí)施方案中，熱穩(wěn)定聚合酶為熱穩(wěn)定RNA聚合酶。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，熱穩(wěn)定聚合酶源于水生棲熱菌、嗜熱棲熱菌、海棲熱袍菌、敏捷氣熱菌、風(fēng)產(chǎn)液菌、閃爍古生球菌、熱堅(jiān)芽孢桿菌、生氫氧化碳嗜熱菌、熱自養(yǎng)甲烷桿菌△H、詹氏甲烷球菌、熾熱甲烷嗜熱菌、冰島熱棒菌、Pyrococcusendeavori、激烈熱球菌、Pyrococcus horihoshii、Pyrococcusprofundus、伍斯氏火球菌、隱蔽熱網(wǎng)菌、嗜酸熱硫化葉菌、硫磺礦硫化葉菌、熱硫化氫熱厭氧桿菌、速生熱球菌、Thermococcus fumicolans、Thermococcus gorgonarius、Thermococcus kodakaraensis KOD1、Thermococcus litoralis、Thermococcus peptonophilus、90N-7熱球菌、TY熱球菌、斯氏熱球菌、Thermococcus zilligii、嗜酸熱原體、Thermus brokianus、Thermus caldophilus GK24、黃棲熱菌、紅色棲熱菌或者它們的突變體。
本發(fā)明還提供引物延伸反應(yīng)混合物，該混合物包括第一引物、核苷酸、和熱穩(wěn)定酶組合物。在某些實(shí)施方案中，該混合物還包括第二引物。在某些實(shí)施方案中，核苷酸為核糖核苷酸。在其它實(shí)施方案中，核苷酸為脫氧核糖核苷酸。在某些實(shí)施方案中，熱穩(wěn)定聚合酶為熱穩(wěn)定DNA聚合酶。在其它實(shí)施方案中，熱穩(wěn)定聚合酶為熱穩(wěn)定RNA聚合酶。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，熱穩(wěn)定聚合酶源于水生棲熱菌、嗜熱棲熱菌、海棲熱袍菌、敏捷氣熱菌、風(fēng)產(chǎn)液菌、閃爍古生球菌、熱堅(jiān)芽孢桿菌、生氫氧化碳嗜熱菌、熱自養(yǎng)甲烷桿菌△H、詹氏甲烷球菌、熾熱甲烷嗜熱菌、冰島熱棒菌、Pyrococcus endeavori、激烈熱球菌、Pyrococcushorihoshii、Pyrococcus profundus、伍斯氏火球菌、隱蔽熱網(wǎng)菌、嗜酸熱硫化葉菌、硫磺礦硫化葉菌、熱硫化氫熱厭氧桿菌、速生熱球菌、Thermococcus fumicolans、Thermococcus gorgonarius、Thermococcuskodakaraensis KOD1、Thermococcus litoralis、Thermococcuspeptonophilus、90N-7熱球菌、TY熱球菌、斯氏熱球菌、Thermococcuszilligii、嗜酸熱原體、Thermus brokianus、Thermus caldophilusGK24、黃棲熱菌、紅色棲熱菌或者它們的突變體。
本發(fā)明還提供包含熱穩(wěn)定酶組合物的試劑盒。在某些實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定酶為熱穩(wěn)定聚合酶，例如熱穩(wěn)定DNA聚合酶或熱穩(wěn)定RNA聚合酶、熱穩(wěn)定RNA酶H、熱穩(wěn)定DNA核酸酶如熱穩(wěn)定DNA內(nèi)切核酸酶、熱穩(wěn)定DNA連接酶、熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶、熱穩(wěn)定解旋酶、熱穩(wěn)定RecA等。在某些實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定酶為熱穩(wěn)定聚合酶。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定聚合酶為熱穩(wěn)定DNA聚合酶。在其它實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定聚合酶為熱穩(wěn)定RNA聚合酶。在另外的實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定酶為熱穩(wěn)定DNA核酸酶，例如熱穩(wěn)定DNA內(nèi)切核酸酶。在其它實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定酶源于水生棲熱菌、嗜熱棲熱菌、海棲熱袍菌、敏捷氣熱菌、風(fēng)產(chǎn)液菌、閃爍古生球菌、熱堅(jiān)芽孢桿菌、生氫氧化碳嗜熱菌、熱自養(yǎng)甲烷桿菌△H、詹氏甲烷球菌、熾熱甲烷嗜熱菌、冰島熱棒菌、Pyrococcus endeavori、激烈熱球菌、Pyrococcus horihoshii、Pyrococcus profundus、伍斯氏火球菌、隱蔽熱網(wǎng)菌、嗜酸熱硫化葉菌、硫磺礦硫化葉菌、熱硫化氫熱厭氧桿菌、速生熱球菌、Thermococcusfumicolans、Thermococcus gorgonarius、Thermococcuskodakaraensis KOD1、Thermococcus litoralis、Thermococcuspeptonophilus、90N-7熱球菌、TY熱球菌、斯氏熱球菌、Thermococcuszilligii、嗜酸熱原體、Thermus brokianus、Thermus caldophilusGK24、黃棲熱菌、紅色棲熱菌或者它們的突變體。
對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言在閱讀本發(fā)明下文更充分描述的詳細(xì)內(nèi)容后，本發(fā)明的上述及其它目的、優(yōu)點(diǎn)和特征將顯而易見。



結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明，通過下文的詳細(xì)說明，使本發(fā)明得到最佳理解。強(qiáng)調(diào)一點(diǎn)，根據(jù)通常的做法，附圖的各種特征曲線圖不是按比例的。相反，為了清晰明了，各種特征曲線圖的尺寸被人為地?cái)U(kuò)大或縮小。附圖包括以下圖示 圖1是表示修飾的Afu活瓣(Flap)內(nèi)切核酸酶-1(FEN-1)的活性測(cè)定結(jié)果的曲線圖。結(jié)果表明Afu FEN-1在激活前未顯示可觀察到的活性。X軸表示循環(huán)數(shù)。每個(gè)循環(huán)持續(xù)30秒。Y軸為6FAM的信號(hào)強(qiáng)度。當(dāng)Afu FEN-1為活性的，6Fam探針裂解。因此，不發(fā)生通過BHQ1的6FAM的淬滅。當(dāng)酶不存在或完全失活，6FAM信號(hào)應(yīng)仍保持平坦。
圖2是表示在95℃的溫育部分恢復(fù)化學(xué)修飾的Afu FEN-1的內(nèi)切核酸酶活性的曲線圖。X軸表示循環(huán)數(shù)。每個(gè)循環(huán)持續(xù)30秒。Y軸為6FAM信號(hào)強(qiáng)度。
圖3是表示檸康酸和順烏頭酸修飾的Afu FEN-1間的比較的曲線圖。該曲線圖表明順烏頭酸修飾的酶和檸康酸修飾的酶都不具有顯著的內(nèi)切核酸酶活性。X軸表示循環(huán)數(shù)。每個(gè)循環(huán)持續(xù)30秒。Y軸為6FAM的信號(hào)強(qiáng)度。
圖4是表示在95℃溫育10分鐘可激活順烏頭酸修飾的酶以及檸康酸修飾的酶的曲線圖。如圖所示，檸康酸修飾的Afu FEN-1的內(nèi)切核酸酶活性的恢復(fù)比順烏頭酸修飾的Afu FEN-1多60-70％。X軸表示循環(huán)數(shù)。每個(gè)循環(huán)持續(xù)30秒。Y軸為6FAM的信號(hào)強(qiáng)度。
圖5是表示在pH8.0和pH8.7使用未修飾的酶進(jìn)行擴(kuò)增的曲線圖。結(jié)果表明閾值循環(huán)數(shù)(Ct)和△Rn均不受pH的顯著影響。X軸為PCR循環(huán)數(shù)，Y軸表示SYBR

綠熒光染料信號(hào)強(qiáng)度的增加。SYBR

綠熒光染料特異地使雙鏈DNA著色，靶核酸成功擴(kuò)增后得到更多的雙鏈DNA，導(dǎo)致信號(hào)增強(qiáng)。
圖6是表示在pH8.0和pH8.7使用修飾的Taq DNA聚合酶擴(kuò)增的曲線圖。與未修飾的Taq DNA聚合酶相比，用修飾的Taq DNA聚合酶擴(kuò)增受pH影響很大。例如，pH8.7系統(tǒng)的Ct比pH8.0系統(tǒng)高10個(gè)循環(huán)。X軸為PCR循環(huán)數(shù)，Y軸表示SYBR

綠熒光染料信號(hào)強(qiáng)度的增加。
圖7是表示使用DNA聚合酶和6ng未修飾的Afu FEN-1內(nèi)切核酸酶或可逆性化學(xué)修飾的Afu FEN-1內(nèi)切核酸酶擴(kuò)增靶核酸的曲線圖。結(jié)果表明用6ng未修飾的Afu FEN-1進(jìn)行PCR可成功檢測(cè)靶核酸，但反應(yīng)產(chǎn)生的信號(hào)比含有可逆性修飾的內(nèi)切核酸酶的反應(yīng)產(chǎn)生的信號(hào)明顯更弱。X軸表示循環(huán)數(shù)，Y軸為6FAM的信號(hào)強(qiáng)度。
圖8是表示用DNA聚合酶和10ng未修飾的Afu FEN-1內(nèi)切核酸酶或可逆性化學(xué)修飾的Afu FEN-1內(nèi)切核酸酶擴(kuò)增靶核酸的曲線圖。結(jié)果表明，10ng未修飾的Afu FEN-1完全無法檢測(cè)靶核酸，與它不同的是10ng修飾的Afu FEN-1能成功檢測(cè)。X軸表示循環(huán)數(shù)，Y軸為6FAM信號(hào)強(qiáng)度。
圖9是表示在如實(shí)施例部分所述的快速熱循環(huán)條件下，使用本發(fā)明修飾的DNA聚合酶(表示為c.酸修飾的)和使用酐修飾的熱穩(wěn)定DNA聚合酶擴(kuò)增靶3序列(見表6)間的比較曲線圖。X軸為PCR循環(huán)數(shù)，Y軸表示熒光染料信號(hào)強(qiáng)度的增加。各種酶的多重線表示重復(fù)的實(shí)驗(yàn)。
圖10是表示在如實(shí)施例部分所述的快速熱循環(huán)條件下，使用本發(fā)明修飾的DNA聚合酶(表示為c.酸修飾的)和使用酐修飾的熱穩(wěn)定DNA聚合酶擴(kuò)增靶5序列(見表6)間的比較曲線圖。X軸為PCR循環(huán)數(shù)，Y軸表示熒光染料信號(hào)強(qiáng)度的增加。各種酶的多重線表示重復(fù)的實(shí)驗(yàn)。
圖11是表示在如實(shí)施例部分所述的快速熱循環(huán)條件下，使用本發(fā)明修飾的DNA聚合酶(表示為c.酸修飾的)和使用酐修飾的熱穩(wěn)定DNA聚合酶擴(kuò)增靶8序列(見表6)間的比較曲線圖。X軸為PCR循環(huán)數(shù)，Y軸表示熒光染料信號(hào)強(qiáng)度的增加。各種酶的多重線表示重復(fù)的實(shí)驗(yàn)。
圖12為用由羧酸和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)——一種水溶性碳二亞胺形成的活性酯修飾熱穩(wěn)定酶的示例性反應(yīng)路線。將羧酸和EDC混合形成活性酯O-?；愲?。該活性酯加至包含熱穩(wěn)定酶的酶組合物中時(shí)，主要通過酶的賴氨酸殘基的ε-氨基形成酰胺鍵來修飾熱穩(wěn)定酶。加熱修飾酶導(dǎo)致酰胺鍵的水解和酶的激活。
圖13為用由羧酸和N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)形成的活性酯修飾熱穩(wěn)定酶的示例性反應(yīng)路線。DCC是在水和有機(jī)溶劑中可溶的碳二亞胺。將羧酸和DCC混合形成活性酯——O-?；愲濉Ｔ摶钚怎ゼ又涟瑹岱€(wěn)定酶的酶組合物中時(shí)，主要通過酶的賴氨酸殘基的ε-氨基形成酰胺鍵來修飾熱穩(wěn)定酶。加熱修飾酶導(dǎo)致酰胺鍵的水解和酶的激活。
圖14為用由羧酸和N-乙基-3-苯基異噁唑-3’-磺酸鹽(伍德沃德氏試劑K)形成的活性酯修飾熱穩(wěn)定酶的示例性反應(yīng)路線。在堿性條件下伍德沃德氏試劑K轉(zhuǎn)變成反應(yīng)性的酮式烯酮亞胺(ketoketeneimine)。該反應(yīng)中間體與羧酸形成烯醇酯。烯醇酯加至酶溶液中時(shí)很容易受到親核攻擊。烯醇酯與氨基例如熱穩(wěn)定酶的賴氨酸殘基的ε-氨基，反應(yīng)形成酰胺鍵。加熱修飾酶導(dǎo)致酰胺鍵的水解和酶的激活。
圖15為用N-酰基咪唑修飾熱穩(wěn)定酶的示例性反應(yīng)路線。N-?；溥蛴婶人岷蚇，N’-羰基二咪唑(CDI)形成。由于二氧化碳和咪唑的釋放，由該反應(yīng)得到的N-?；溥虍a(chǎn)量較高。N-?；溥蚺c熱穩(wěn)定酶的氨基在合適的緩沖水溶液中高度反應(yīng)形成酰胺鍵。加熱修飾酶導(dǎo)致酰胺鍵的水解和酶的激活。
圖16為用N-羥基磺基琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)酯修飾熱穩(wěn)定酶的示例性反應(yīng)路線。sulfo-NHS酯由羧酸、碳二亞胺和sulfo-NHS形成。將羧酸和EDC混合得到活性酯O-酰基異脲。該活性酯進(jìn)一步與sulfo-NHS反應(yīng)形成更穩(wěn)定的sulfo-NHS酯?；钚詓ulfo-NHS酯加至包含熱穩(wěn)定酶的酶組合物中時(shí)，主要通過酶的賴氨酸殘基的ε-氨基形成酰胺鍵來修飾熱穩(wěn)定酶。加熱修飾酶導(dǎo)致酰胺鍵的水解和酶的激活。
圖17為用N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯修飾酶的示例性反應(yīng)路線。NHS酯由羧酸、碳二亞胺和NHS形成。將羧酸和EDC混合得到活性酯——O-酰基異脲。該活性酯進(jìn)一步與NHS反應(yīng)形成更穩(wěn)定的NHS酯?；钚訬HS酯加至包含熱穩(wěn)定酶的組合物中時(shí)，主要通過由酶的賴氨酸殘基的ε-氨基形成酰胺鍵來修飾熱穩(wěn)定酶。加熱修飾酶導(dǎo)致酰胺鍵的水解和酶的激活。
圖18表示當(dāng)DCC用作零長(zhǎng)交聯(lián)劑時(shí)的可能的副反應(yīng)。具體地說就是發(fā)生O-?；愲逑騈-?；愲宓淖园l(fā)重排。O-?；愲鍨榛钚孕问剑鳱-?；愲鍨榉腔钚孕问?。
圖19表示當(dāng)DCC用作零長(zhǎng)交聯(lián)劑時(shí)的第二種可能的副反應(yīng)。具體地說就是在氨基酸的存在下形成二氫唑酮。盡管二氫唑酮與氨基反應(yīng)，但它并不作為零長(zhǎng)交聯(lián)劑發(fā)揮作用。取而代之地是開環(huán)酰胺鍵的形成產(chǎn)生不同的分子。
定義 術(shù)語“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中可互換使用以包含核苷酸的聚合形式，所述核苷酸是核糖核苷酸，或者是脫氧核糖核苷酸。該術(shù)語僅指分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)。因此該術(shù)語包括三鏈、雙鏈和單鏈DNA，以及三鏈、雙鏈和單鏈RNA。它還包括多核苷酸的例如經(jīng)甲基化和/或加帽的修飾和未修飾形式。更具體地說，術(shù)語“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括多脫氧核糖核苷酸(含2-脫氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含D-核糖)、嘌呤或嘧啶堿基的N-或C-糖苷的任意其它種類的多核苷酸，和含非核苷酸骨架例如聚酰胺(如肽核酸(PNA)和聚嗎啉(polymorpholino)(以Neugene的形式，可購自Anti-Virals，Inc.，Corvallis，Oreg.，)聚合物的其它聚合物，以及其它合成的序列特異的核酸聚合物，條件是聚合物在構(gòu)型中含有核堿基(nucleobase)，所述構(gòu)型可使堿基配對(duì)和堿基層疊，這種情形存在于DNA和RNA中。
除非特別另外說明，術(shù)語“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”并不應(yīng)以長(zhǎng)度來區(qū)分，這些術(shù)語將互換使用。這些術(shù)語僅指分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)。因此這些術(shù)語包括，例如3’-脫氧-2’，5’-DNA，寡脫氧核糖核苷酸N3’P5’磷酰胺、2’-O-烷基取代的RNA、雙鏈和單鏈DNA以及雙鏈和單鏈RNA，DNA:RNA雜交型和PNA與DNA或RNA的雜交型，還包括已知類型的修飾，例如本領(lǐng)域已知的標(biāo)記、甲基化、“加帽”，類似物對(duì)一個(gè)或多個(gè)天然存在的核苷酸的取代、核苷酸間(internucleotide)修飾例如以不帶電的鍵(甲基磷酸酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)、以帶負(fù)電的鍵(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、和以帶正電的鍵的修飾(如氨基烷基磷酰胺、氨基烷基磷酸三酯)，含側(cè)鏈部分例如蛋白質(zhì)(包括核酸酶、毒素、抗體、信號(hào)肽、聚-L-賴氨酸等)的修飾，嵌入劑(如吖啶、補(bǔ)骨脂內(nèi)酯等)的修飾、含螯合劑(如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的修飾、含烷化劑(alkylator)的修飾、以修飾的鍵(如α-異頭核酸等)修飾，以及多核苷酸或寡核苷酸的未修飾形式。具體而言，DNA為脫氧核糖核酸。
說明書全文中，使用縮寫來指代核苷酸(也指代堿基)，包括指代多種核苷酸的縮寫。如本文所使用，G＝鳥嘌呤、A＝腺嘌呤、T＝胸腺嘧啶、C＝胞嘧啶，以及U＝尿嘧啶。另外，R＝嘌呤核苷酸(A或G)、Y＝嘧啶核苷酸(C或T(U))、S＝C或G、W＝A或T(U)、M＝A或C、K＝G或T(U)、V＝A、C或G、以及N＝任意核苷酸(A、T(U)、C或G)。全文可使用小寫或大寫字母來指代核苷酸。還應(yīng)理解的是，說明書中提供的DNA的核苷酸序列也代表RNA的核苷酸序列，其中T被U替換。
本文所使用的術(shù)語“脫氧核糖核酸”和“DNA”是指由脫氧核糖核苷酸組成的聚合物。
本文所使用的術(shù)語“核糖核酸”和“RNA”是指由核糖核苷酸組成的聚合物。當(dāng)使用DNA序列的核苷酸提供核酸序列時(shí)，應(yīng)理解為該序列包括互補(bǔ)的DNA序列，還進(jìn)一步包括基于給定的DNA序列或其互補(bǔ)序列的RNA序列，其中尿嘧啶(U)替換了DNA序列或其互補(bǔ)序列中的胸腺嘧啶(T)。
兩個(gè)核苷酸序列彼此“互補(bǔ)”是指這些分子共享堿基對(duì)組成的同源性。“互補(bǔ)”的核苷酸序列在合適的雜交條件下特異地結(jié)合，形成穩(wěn)定的雙鏈。例如當(dāng)其中一序列的一片段以反平行意義結(jié)合到另一序列的一片段上，其中各序列的3’末端與另一序列的5’末端結(jié)合，并且一個(gè)序列的每個(gè)A、T(U)、G和C分別與另一序列的T(U)、A、C和G匹配，那么這兩條序列就是互補(bǔ)的。RNA序列還可包括互補(bǔ)的G＝U或U＝G堿基對(duì)。因此，本發(fā)明中不需要完全的同源性來“互補(bǔ)”。通常當(dāng)確定長(zhǎng)度的分子至少有約85％(優(yōu)選至少約90％，更優(yōu)選至少約95％)核苷酸共享堿基對(duì)組成，兩序列就足以互補(bǔ)。
本文所使用的術(shù)語“分離的”，在分離的化合物的內(nèi)容中使用時(shí)，是指在不同于化合物天然存在環(huán)境的環(huán)境中的目標(biāo)化合物?！胺蛛x的”意在包括樣品中的化合物，所述樣品為基本富集了目標(biāo)化合物和/或其中目標(biāo)化合物被部分或基本純化的樣品。術(shù)語“分離的”包括這樣一種情況，即所列出的物質(zhì)不伴有至少一些它在天然狀態(tài)下通常伴有的物質(zhì)，優(yōu)選地，在給定的樣品中，所列出的物質(zhì)以重量計(jì)占總蛋白的至少約0.5％，更優(yōu)選更少約5％。例如，就多核苷酸而言，術(shù)語“分離的”通常是指完全或部分缺乏天然狀態(tài)下通常與其結(jié)合的序列，或者如同它天然存在形式但有異源序列與之結(jié)合的序列，或者從染色體解離的分子。
本文所使用的術(shù)語“純化的”是指列舉的物質(zhì)構(gòu)成蛋白質(zhì)總重的至少大約75％，優(yōu)選至少大約80％，尤其優(yōu)選至少大約90％。如本文所使用的，術(shù)語“基本純”是指從其天然環(huán)境中移出的化合物至少60％不含，優(yōu)選75％不含，最優(yōu)選90％不含它天然結(jié)合的其它成分。
多核苷酸“源于”或“特異于”指定序列，例如靶核酸的靶序列，是指與指定的核苷酸序列相應(yīng)(即相同或互補(bǔ))的、含至少大約6個(gè)核苷酸連續(xù)序列的多核苷酸序列，優(yōu)選至少有大約8個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少有大約10-12個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少有大約15-20個(gè)核苷酸。所得的多核苷酸不一定以物理方式來源于目標(biāo)核苷酸序列，而可以任何方式產(chǎn)生，包括但不限于化學(xué)合成、復(fù)制、逆轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄方式，這基于多核苷酸所“源于”或“所特異于”的區(qū)域的堿基序列所提供的信息?！霸从凇被颉疤禺愑凇敝付ㄐ蛄械亩嗪塑账岚ㄏ鄬?duì)于原始多核苷酸而言的有義或反義方向。
本文所使用的用于描述核酸分子的術(shù)語“重組”是指基因組、cDNA、哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、病毒、半合成、合成的或其他來源的多核苷酸，根據(jù)其來源、操作手段、或兩者的結(jié)合，它與其天然狀態(tài)時(shí)所結(jié)合的所有或部分多核苷酸不結(jié)合。對(duì)蛋白質(zhì)或多肽而言，所使用的術(shù)語“重組”是指通過重組多核苷酸表達(dá)產(chǎn)生的多肽。
“DNA依賴的DNA聚合酶”是根據(jù)DNA模板合成互補(bǔ)的DNA拷貝的酶。實(shí)例包括源于大腸桿菌(E.coli)的DNA聚合酶I和噬菌體T7DNA聚合酶。所有已知的DNA依賴的DNA聚合酶需要互補(bǔ)的引物以啟動(dòng)合成。但合適的條件下，DNA依賴的DNA聚合酶可由RNA模板合成互補(bǔ)的DNA拷貝。
“DNA依賴的RNA聚合酶”或“轉(zhuǎn)錄酶”是由具有(通常雙鏈)啟動(dòng)子序列的雙鏈或部分雙鏈DNA分子合成RNA多拷貝的酶。在啟動(dòng)子附近的下游特定位置開始以5’至3’方向合成RNA分子(“轉(zhuǎn)錄物”)。轉(zhuǎn)錄酶的實(shí)例為來自大腸桿菌和噬菌體T7、T3和SP6的DNA依賴的RNA聚合酶。
“RNA依賴的DNA聚合酶”或“逆轉(zhuǎn)錄酶”是由RNA模板合成互補(bǔ)的DNA拷貝的酶。所有已知的逆轉(zhuǎn)錄酶也具有由DNA模板獲得互補(bǔ)DNA拷貝的能力；因此，它們既是RNA依賴的DNA聚合酶又是DNA依賴的DNA聚合酶。在RNA模板和DNA模板上啟動(dòng)合成時(shí)均需要引物。
“RNA酶H”為降解RNA:DNA雙鏈的RNA部分的酶。該酶可以是內(nèi)切核酸酶或者外切核酸酶。通常大多逆轉(zhuǎn)錄酶除了它們的聚合酶活性外還包含RNA酶H的活性。然而，可獲得無相關(guān)聚合酶活性的其它來源的RNA酶H。由RNA酶H介導(dǎo)的RNA的降解可導(dǎo)致RNA脫離于RNA:DNA復(fù)合體，或者RNA酶H可在多個(gè)位置切割RNA從而使部分RNA解鏈或者允許酶使部分RNA解旋。
本文所使用的術(shù)語“靶核酸區(qū)域”或“靶核酸”或“靶分子”是指具有待檢測(cè)(如通過擴(kuò)增)的“靶序列”的核酸分子。靶核酸可以是單鏈或雙鏈，除了靶序列外可以包括或不包括其它序列(例如靶核酸可以包括或不包括上游核酸序列或5’側(cè)翼序列，可以包括或不包括上游或3’側(cè)翼序列，在某些實(shí)施方案中可以不包括相對(duì)于靶序列的上游(5’)或下游(3’)核酸序列。)。經(jīng)擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)，這些除了靶序列以外的其它序列可以隨著或不隨靶序列擴(kuò)增。
術(shù)語“靶序列”是指待檢測(cè)(如通過擴(kuò)增)的靶核酸的特定核苷酸序列。靶序列可包括靶分子內(nèi)所含的探針雜交區(qū)域，探針將在所需的條件下與其形成穩(wěn)定的雜交體?！鞍行蛄小边€可包括寡核苷酸引物所復(fù)合的并且可用靶序列作模板而延伸的復(fù)合序列。當(dāng)靶核酸原本為單鏈，術(shù)語“靶序列”還指與靶核酸中存在的“靶序列”互補(bǔ)的序列。如果“靶核酸”原本為雙鏈，術(shù)語“靶序列”是指正鏈(+)和負(fù)鏈(-)。而且，當(dāng)“靶序列”的序列是本文所提供的，應(yīng)理解的是該序列可以是DNA或RNA。因此，當(dāng)提供的是DNA序列時(shí)，也要考慮RNA序列，RNA序列很容易通過將“U”替換DNA序列的“T”獲得。
本文所使用的術(shù)語“引物”或“寡核苷酸引物”是指將其置于誘導(dǎo)引物延伸產(chǎn)物合成的條件下時(shí)，發(fā)揮啟動(dòng)互補(bǔ)核酸鏈合成作用的寡核苷酸，所述誘導(dǎo)引物延伸產(chǎn)物合成的條件為例如，在核苷酸和聚合作用誘導(dǎo)物例如DNA或RNA聚合酶的存在下，并且在合適的溫度、pH、金屬濃度、和鹽濃度時(shí)。通常引物長(zhǎng)度與它們?cè)诤铣梢镅由飚a(chǎn)物中的用途相適應(yīng)，通常引物長(zhǎng)度范圍在8至100個(gè)核苷酸，如10至75、15至60、15至40、18至30、20至40、21至50、22至45、25至40等，更典型的范圍在18-40、20-35、21-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度、以及在所述范圍之間的任何長(zhǎng)度。典型的引物范圍可為10-50個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，例如15-45、18-40、20-30、21-25等，以及在所述范圍之間的任何長(zhǎng)度。在某些實(shí)施方案中，通常引物不超過大約10、12、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65或70個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，更通常地不超過大約10、12、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，更通常地不超過大約10、12、15、20、21、22、23、24或25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。
為了擴(kuò)增中的最大效率，引物通常為單鏈，但也可為雙鏈。如果為雙鏈，在用于制備延伸產(chǎn)物之前，通常首先處理引物使之解鏈。一般通過加熱來作用于該變性步驟，但也可使用堿來進(jìn)行，然后中和。因此，“引物”與模板互補(bǔ)，并且通過與模板以氫鍵結(jié)合或雜交得到引物/模版復(fù)合物，使聚合酶啟動(dòng)合成，在DNA合成過程中通過加入在其與模板互補(bǔ)的3’末端連接的共價(jià)結(jié)合的堿基來延長(zhǎng)上述復(fù)合物。
本文所使用的術(shù)語“引物對(duì)”是指第一和第二引物，它們具有適合基于核酸的靶核酸擴(kuò)增的核酸序列。該引物對(duì)通常包括具有與靶核酸的前一部分序列相同或類似序列的第一引物和具有與靶核酸的第二部分互補(bǔ)的第二引物，用以擴(kuò)增靶核酸或其片段。除非另外特別指出，此處“第一”和“第二”引物的提出是任意的。例如，第一引物可以指定為“正向引物”(該引物自靶核酸的5’末端開始合成核酸)或者指定為“反向引物”(該引物從由正向引物開始合成的延伸產(chǎn)物的5’末端開始合成核酸)。同樣，第二引物可指定為正向引物或反向引物。
本文所使用的術(shù)語“引物延伸”既指使用引物作為起始點(diǎn)通過單個(gè)三磷酸核苷的聚合而得的DNA的合成，也指向引物中加入其它的寡核苷酸來延伸引物。本文所使用的術(shù)語“引物延伸”意在包括連接兩個(gè)寡核苷酸以形成更長(zhǎng)的產(chǎn)物，該產(chǎn)物可在將來的擴(kuò)增循環(huán)中用作靶。本文所使用的術(shù)語“引物”意在包括連接所介導(dǎo)的擴(kuò)增過程中所使用的寡核苷酸，該寡核苷酸通過在鄰近位點(diǎn)雜交的另外的寡核苷酸的連接得到延長(zhǎng)。
引物可包含能檢測(cè)或固定引物但不改變對(duì)引物啟動(dòng)DNA合成很重要的引物基本特性的其它特征。例如，引物在5’末端可包含不與靶核酸雜交但促進(jìn)擴(kuò)增產(chǎn)物克隆的其它核酸序列。與模板足夠互補(bǔ)可以發(fā)生雜交的引物區(qū)域在本文中稱為雜交區(qū)域。
術(shù)語“非特異性擴(kuò)增”是指使得引物與非靶序列的序列雜交，而后用作引物延伸的底物的非靶序列的核酸序列擴(kuò)增。引物與非靶序列的雜交稱為“非特異性雜交”，它可在較低溫度、預(yù)反應(yīng)條件的嚴(yán)格性降低時(shí)發(fā)生。
術(shù)語“反應(yīng)混合物”是指含有進(jìn)行既定反應(yīng)所必需的試劑的溶液。“擴(kuò)增反應(yīng)混合物”是指含有進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)所必需的試劑的溶液，它通常包括在合適的緩沖液中的寡核苷酸引物和DNA聚合酶或連接酶?！癙CR反應(yīng)混合物”通常含有在合適的緩沖液中的寡核苷酸引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、dNTP和二價(jià)金屬陽離子。若反應(yīng)混合物包括進(jìn)行反應(yīng)所需要的所有試劑，則反應(yīng)混合物稱為完全的反應(yīng)混合物，若它只含有部分所需要的試劑，則稱為不完全的反應(yīng)混合物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)知道，為了方便、儲(chǔ)存穩(wěn)定性的原因，以及為了根據(jù)用途而獨(dú)立調(diào)整組分濃度，反應(yīng)組分通常以各自的溶液儲(chǔ)存，每種溶液含有所有組分的一部分，而且應(yīng)知道，在反應(yīng)前將反應(yīng)組分混合得到完全的反應(yīng)混合物。
如本文所使用，在本文中互換使用的術(shù)語“探針”或“寡核苷酸探針”是指由多核苷酸組成的結(jié)構(gòu)，如上述定義，該結(jié)構(gòu)含有與存在于靶核酸分析物(如核酸擴(kuò)增產(chǎn)物)中的核酸序列互補(bǔ)的核酸序列。探針的多核苷酸區(qū)域可由DNA和/或RNA和/或合成的核苷酸類似物組成。探針長(zhǎng)度通常與其在靶核酸的所有靶序列或部分靶序列的特異檢測(cè)中的用途相適應(yīng)，通常長(zhǎng)度范圍在8至100個(gè)核苷酸之間，如8至75、10至74、12至72、15至60、15至40、18至30、20至40、21至50、22至45、25至40等，更通常地，范圍在18-40、20-35、21-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，以及所述范圍間的任意長(zhǎng)度。通常探針范圍在10-15個(gè)核苷酸長(zhǎng)，如15-45、18-40、20-30、21-28、22-25等，以及所述范圍間的任意長(zhǎng)度。在某些實(shí)施方案中，通常探針不超過大約10、12、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65或70個(gè)核苷酸長(zhǎng)，更通常地，不超過大約10、12、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35或40個(gè)核苷酸長(zhǎng)，更通常地不超過大約10、12、15、20、21、22、23、24或25個(gè)核苷酸長(zhǎng)。
本文所考慮的探針包括含有可檢測(cè)標(biāo)記的探針。例如，“寡核苷酸探針”用于5’核酸酶檢測(cè)如TaqManTM檢測(cè)時(shí)，探針包括至少一種熒光劑和至少一種猝滅劑，該探針可被反應(yīng)中使用的聚合酶的5’內(nèi)切核酸酶活性消化，以檢測(cè)任何擴(kuò)增的靶寡核苷酸序列。在此情況下，寡核苷酸探針在其5’末端附近應(yīng)具有足夠數(shù)目的磷酸二酯鍵，以便所使用的5’至3’核酸酶活性可有效地降解結(jié)合的探針從而分離熒光劑和猝滅劑。在TMA技術(shù)中使用寡核苷酸探針時(shí)，如以下所述，它應(yīng)被適當(dāng)?shù)貥?biāo)記。
本文所使用的術(shù)語“標(biāo)記”和“可檢測(cè)的標(biāo)記”是指能檢測(cè)的分子，包括但不限于，放射性同位素、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、生色團(tuán)、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑、生色團(tuán)、染料、金屬離子、金屬溶膠、配體(如生物素、抗生物素蛋白、鏈霉菌抗生物素蛋白或半抗原)等。術(shù)語“熒光劑”是指能在可檢測(cè)的范圍內(nèi)顯示熒光的物質(zhì)或物質(zhì)的一部分。
術(shù)語“進(jìn)行雜交”和“雜交”是指在足以通過沃森-克里克(watson-crick)堿基對(duì)互補(bǔ)形成復(fù)合物的核苷酸序列間形成復(fù)合物。引物與靶(模板)“雜交”時(shí)，該復(fù)合物(或雜交體)對(duì)于滿足例如DNA聚合酶為啟動(dòng)DNA合成所需的引導(dǎo)功能而言足夠穩(wěn)定。
術(shù)語“嚴(yán)格的條件”是指引物優(yōu)先與互補(bǔ)結(jié)合的匹配部分雜交或與其特異結(jié)合，并且較低程度地或完全不與其它序列雜交或結(jié)合的條件。另一種表達(dá)，本文所使用的術(shù)語“嚴(yán)格的雜交條件”是指在互補(bǔ)結(jié)合的成員間產(chǎn)生雙鏈的相適應(yīng)的條件，例如在探針與樣品的互補(bǔ)靶之間，例如雙鏈核酸探針如DNA探針和存在于樣品中的它們相應(yīng)的核酸靶如存在于樣品中的相應(yīng)的mRNA分析物之間。
本文所使用的術(shù)語“結(jié)合對(duì)”是指彼此特異結(jié)合的第一和第二分子，例如能形成核酸雙鏈的互補(bǔ)的多核苷酸對(duì)。樣品中結(jié)合對(duì)的第一成員與結(jié)合對(duì)的第二成員“特異性結(jié)合”的證據(jù)是第一成員與第二成員(反之亦然)結(jié)合的親合性和特異性要大于與樣品中的其他組分結(jié)合。結(jié)合對(duì)成員間的結(jié)合一般為非共價(jià)結(jié)合。
“選擇性結(jié)合”是指分子優(yōu)選與目標(biāo)靶結(jié)合或者以較強(qiáng)的親合性與靶而非其它分子結(jié)合。例如，DNA分子與基本互補(bǔ)的序列結(jié)合，而不與不相關(guān)的序列結(jié)合。
在核酸雜交內(nèi)容中(例如在陣列、Sourthern或Northern雜交中)，“嚴(yán)格的雜交”和“嚴(yán)格的雜交洗滌條件”是序列依賴性的，并且在不同的環(huán)境參數(shù)下不同。用于在本發(fā)明范圍內(nèi)鑒定核酸的嚴(yán)格的雜交條件可包括，例如42℃時(shí)在含50％甲酰胺、5×SSC和1％ SDS的緩沖液中雜交，或者65℃時(shí)在含5×SSC和1％ SDS的緩沖液中雜交，兩者均在65℃時(shí)用0.2×SSC和0.1％ SDS洗滌。示例的嚴(yán)格的雜交條件還可包括37℃時(shí)在40％甲酰胺、1M NaCl和1％SDS的緩沖液中雜交，并在45℃時(shí)在1×SSC中洗滌?；蛘撸捎迷?5℃下，0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mnM EDTA中與濾膜結(jié)合的DNA雜交，并在68℃下，0.1×SSC/0.1％ SDS中洗滌。其它嚴(yán)格的雜交條件還包括在60℃或以上，3×SSC(450mM氯化鈉/45mM檸檬酸鈉)中雜交，或者在42℃在含30％甲酰胺、1M NaCl、0.5％肌氨酸鈉、50mM MES、pH6.5的溶液中溫育。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很容易認(rèn)識(shí)到，備選的但等同的雜交和洗滌條件可用于提供類似嚴(yán)格的條件。
在某些實(shí)施方案中，洗滌條件的嚴(yán)格性決定了確定核酸是否與探針特異結(jié)合的條件。用于鑒定核酸的洗滌條件包括例如在pH7的鹽濃度約0.02摩爾，溫度為至少約50℃或約55℃至約60℃；或者鹽濃度大約為0.15M NaCl，72℃約15min；或者鹽濃度大約為0.2×SSC，溫度至少在約50℃或約55℃至約60℃，約15至約20分鐘；或者，雜交復(fù)合物用含有0.1％SDS的鹽濃度約2×SSC的溶液室溫洗滌15min兩次；然后用含0.1％ SDS的0.1×SSC在68℃洗滌15min兩次；或者等效條件。嚴(yán)格的洗滌條件還可以是例如42℃下0.2×SSC/0.1％ SDS。在核酸分子為脫氧寡核苷酸(“寡聚物(oligo)”)的情況下，嚴(yán)格的條件可包括在6×SSC/0.05％焦磷酸鈉中在37℃(對(duì)于14個(gè)堿基寡聚物而言)、48℃(對(duì)于17個(gè)堿基寡聚物而言)、55℃(對(duì)于20個(gè)堿基寡聚物而言)、以及60℃(對(duì)于23個(gè)堿基寡聚物而言)洗滌。參見Sambrook、Ausubel或Tijssen(以下引用)的等效的雜交和洗滌條件的詳細(xì)說明和試劑與緩沖液，例如SSC緩沖液和等效試劑和條件。
嚴(yán)格的雜交條件為至少與上述代表性條件一樣嚴(yán)格的雜交條件，其中如果條件的嚴(yán)格程度達(dá)到上述特定嚴(yán)格條件的至少約80％，典型地至少約90％，就認(rèn)為條件至少與上述條件一樣嚴(yán)格。其它嚴(yán)格雜交條件在本領(lǐng)域是已知的，也可以被適宜地使用。
雙鏈DNA的“解鏈溫度”或“Tm”定義為由于加熱或者其它的堿基對(duì)間氫鍵離解例如經(jīng)酸或堿處理等，DNA喪失一半螺旋結(jié)構(gòu)的溫度。DNA分子的Tm取決于它的長(zhǎng)度和它的堿基組成。GC堿基對(duì)豐富的DNA分子具有的Tm比AT堿基對(duì)豐富的分子高。當(dāng)溫度降低到低于Tm，分離的互補(bǔ)的DNA鏈自發(fā)地再結(jié)合或退火而形成雙鏈DNA。最高核酸雜交率在低于Tm的大約25℃發(fā)生。Tm可用以下關(guān)系估算Tm＝69.3+0.41(GC)％(Marmur et al.(1962)J.Mol.Biol.5109-118)。
本文所使用的術(shù)語“有機(jī)基團(tuán)”和“有機(jī)根”意為任何含碳基團(tuán)，包括可分為脂基(aliphatic group)、環(huán)基、芳基、及其官能化衍生物和/或其各種組合的烴基。術(shù)語“脂基”是指飽和或不飽和的線型或分支烴基，包括例如烷基、烯基和炔基。術(shù)語“烷基”是指取代的或未取代的、飽和線性或分支的烴基或烴鏈(如C1至C8)包括，例如甲基、乙基、異丙基、叔丁基、庚基、異丙基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基等。合適的取代基包括羧基、保護(hù)的羧基、氨基、保護(hù)的氨基、鹵素、羥基、保護(hù)的羥基、硝基、氰基、單取代氨基、保護(hù)的單取代氨基、二取代氨基、C1至C7烷氧基、C1至C7?；1至C7酰氧基等。術(shù)語“取代的烷基”是指上述定義的烷基被以下基團(tuán)取代一至三次，所述基團(tuán)為羥基、保護(hù)的羥基、氨基、保護(hù)的氨基、氰基、鹵素、三氟甲基、單取代氨基、二取代氨基、低級(jí)烷氧基、低級(jí)烷基硫代、羧基、保護(hù)的羧基或者羧基、氨基和/或羥基鹽。與雜芳環(huán)的取代基一起使用的術(shù)語“取代的(環(huán)烷基)烷基”和“取代的環(huán)烷基”，如下文定義，被“取代的烷基”所列的相同的基團(tuán)取代。術(shù)語“烯基”是指含一個(gè)或多個(gè)碳-碳雙鍵的不飽和線型或分支烴基，如乙烯基。術(shù)語“炔基”是指含一個(gè)或多個(gè)碳-碳叁鍵的不飽和線型或分支烴基。術(shù)語“環(huán)基”是指閉環(huán)烴基，分為脂環(huán)基、芳基或雜環(huán)基。術(shù)語“脂環(huán)基”是指具有與那些脂基相似性質(zhì)的環(huán)烴基。術(shù)語“芳香基”或“芳基”是指單或多環(huán)芳香烴基，可包括一個(gè)或多個(gè)雜原子，下文將進(jìn)一步定義。術(shù)語“雜環(huán)基”是指其中環(huán)上一個(gè)或多個(gè)原子為非碳元素(如氮、氧、硫等)的閉環(huán)烴基，下文將進(jìn)一步定義。
“有機(jī)基團(tuán)”可官能化或者另包括其它與保護(hù)或未保護(hù)的羧基、氨基、羥基等有機(jī)基團(tuán)結(jié)合的其它官能度(functionality)。例如詞組“烷基”意在不僅包括單純的開鏈飽和的烴烷基取代基如甲基、乙基、丙基、叔丁基等，還包括這樣一些烷基取代基，它們帶有本領(lǐng)域已知的其他取代基，如羥基、烷氧基、烷基磺酰基、鹵素原子、氰基、硝基、氨基、羧基等。因此“烷基”包括醚、酯、鹵代烷基、硝基烷基、羧基烷基、羥基烷基、磺烷基等。
術(shù)語“鹵”和“鹵素”是指氟、氯、溴或碘基團(tuán)?？梢杂幸粋€(gè)或多個(gè)相同或不同的鹵素。特別關(guān)注的鹵素包括氯和溴基團(tuán)。
術(shù)語“鹵代烷基”是指被一個(gè)或多個(gè)鹵原子取代的上述定義的烷基。鹵原子可以相同或者不同。術(shù)語“二鹵代烷基”是指被兩個(gè)可以相同或不同的鹵原子取代的上述定義的烷基。術(shù)語“三鹵代烷基”是指被三個(gè)可以相同或不同的鹵素基團(tuán)取代的上述定義的烷基。術(shù)語“全鹵代烷基”是指其中烷基的每個(gè)氫原子已被鹵原子替換的上述定義的鹵代烷基。術(shù)語“全氟代烷基”是指其中烷基的每個(gè)氫原子已被氟替換的上述定義的鹵代烷基。
術(shù)語“環(huán)烷基”是指單、二或三環(huán)的飽和環(huán)，該飽和環(huán)完全飽和或部分不飽和。所述基團(tuán)的實(shí)例包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、金剛烷基(adamantyl)、環(huán)辛基、順式-或反式-萘烷、二環(huán)[2.2.1]庚-2-烯、環(huán)己-1-烯基、環(huán)戊-1-烯基、1，4-環(huán)辛二烯基等。
術(shù)語“(環(huán)烷基)烷基”意為取代上述一個(gè)環(huán)烷基環(huán)的上述定義的烷基基團(tuán)。所述基團(tuán)的實(shí)例包括(環(huán)己基)甲基、3-(環(huán)丙基)-正丙基、5-(環(huán)戊基)己基、6-(金剛烷基)己基等。
術(shù)語“取代的苯基”是指一個(gè)或多個(gè)部分取代，在某些實(shí)例中被一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)部分取代的苯基，所述部分選自鹵素、羥基、保護(hù)的羥基、氰基、硝基、三氟甲基、C1至C7烷基、C1至C7烷氧基、C1至C7酰基、C1至C7酰氧基、羧基、氧羧基、保護(hù)的羧基、羧甲基、保護(hù)的羧甲基、羥甲基、保護(hù)的羥甲基、氨基、保護(hù)的氨基、(單取代)氨基、保護(hù)的(單取代)氨基、(二取代)氨基、氨甲酰基(carboxamide)、保護(hù)的氨甲?；?、N-(C1至C6烷基)氨甲?；?、保護(hù)的N-(C1至C6烷基)氨甲酰基、N，N-二(C1至C6烷基)氨甲?；?、三氟甲基、N-((C1至C6烷基)磺酰)氨基、N-(苯磺酰)氨基或取代或未取代的苯基，得到例如聯(lián)苯基或萘基。
術(shù)語“取代的苯基”的實(shí)例包括單或二(鹵代)苯基，例如2，3或4-氯苯基、2，6-二氯苯基、2，5-二氯苯基、3，4-二氯苯基、2，3或4-溴苯基、3，4-二溴苯基、3-氯-4-氟苯基、2，3或4-氟苯基等；單或二(羥基)苯基，例如2，3或4-羥苯基、2，4-二羥苯基、其保護(hù)的羥基衍生物等；硝基苯基，例如2，3或4-硝基苯基；氰基苯基，例如2，3或4-氰基苯基；單或二(烷基)苯基，例如2，3或4-甲苯基、2，4-二甲苯基、2，3或4-(異丙基)苯基、2，3或4-乙苯基、2，3或4-(正丙基)苯基等；單或二(烷氧基)苯基，例如2，6-二甲氧苯基、2，3或4-(異丙氧)苯基、2，3或4-(叔丁氧)苯基、3-乙氧-4-甲氧苯基等；2，3或4-三氟甲基苯基；單或二羧基苯基或(保護(hù)的羧基)苯基，例如2，3或4-羧基苯基或2，4-二(保護(hù)的羧基)苯基；單或二(羥甲基)苯基或(保護(hù)的羥甲基)苯基，例如2，3或4-(保護(hù)的羥甲基)苯基或3，4-二(羥甲基)苯基；單或二(氨甲基)苯基或(保護(hù)的氨甲基)苯基，例如2，3或4-(氨甲基)苯基或2，4-(保護(hù)的氨甲基)苯基；或者單或二(N-(甲磺酰氨基))苯基，例如2，3或4-(N-(甲磺酰氨基))苯基。術(shù)語“取代的苯基”還表示其中取代基不同的二取代苯基，例如3-甲基-4-羥苯基、3-氯-4-羥苯基、2-甲氧基-4-溴苯基、4-乙基-2-羥苯基、3-羥基-4-硝基苯基、2-羥基-4-氯苯基等。
術(shù)語“(取代的苯基)烷基”是指與上述烷基相連的上述取代的苯基。所述基團(tuán)包括的實(shí)例，例如2-苯基-1-氯乙基、2-(4’-甲氧苯基)乙基、4-(2’，6’-二羥苯基)正己基、2-(5’-氰基-3’-甲氧苯基)正戊基、3-(2’，6’-二甲苯基)正丙基、4-氯-3-氨芐基、6-(4’-甲氧苯基)-3-羧基(正己基)、5-(4’-氨甲基苯基)-3-(氨甲基)正戊基、5-苯基-3-氧代-正戊-1-基、(4-羥萘-2-基)甲基等。
以上所指出的術(shù)語“芳香的”或“芳基”是指六元碳環(huán)。也是以上所指出的，術(shù)語“雜芳基”表示具有1至4個(gè)雜原子的任選取代的五元或六元環(huán)，所述雜原子例如氧、硫和/或氮原子，尤其是氮，單獨(dú)為環(huán)原子或者與硫或氧共同為環(huán)原子。
而且，上述任選取代的五元或六元環(huán)可任選與芳香五元或六元環(huán)系統(tǒng)稠合。例如，環(huán)可任選地與例如吡啶或三唑系統(tǒng)等芳香的五元或六元環(huán)系統(tǒng)稠合，優(yōu)選與苯環(huán)稠合。
以下環(huán)系統(tǒng)為以術(shù)語“雜芳基”表示的雜環(huán)(取代或未取代的)基的實(shí)例噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡咯烷基、咪唑基、異噁唑基、三唑基、噻二唑基(thiadiazolyl)、噁二唑基(oxadiazolyl)、四唑基、噻三唑基、噁三唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、噁嗪基、三嗪基、噻二嗪基(thiadiazolyl)、四唑并、1，5-[b]噠嗪基和嘌呤基(purinyl)，以及苯并稠合的衍生物例如苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基和吲哚基。
上述任選取代的雜環(huán)的取代基為一至三個(gè)鹵素、三鹵代甲基、氨基、保護(hù)的氨基、氨基鹽、單取代氨基、二取代氨基、羧基、保護(hù)的羧基、羧化物鹽、羥基、保護(hù)的羥基、羥基的鹽、低級(jí)烷氧基、低級(jí)烷基硫代、烷基、取代的烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、(環(huán)烷基)烷基、取代的(環(huán)烷基)烷基、苯基、取代的苯基、苯基烷基、和(取代的苯基)烷基。雜芳基的取代基同前文所定義，或者當(dāng)為三鹵甲基時(shí)可以是三氟甲基、三氯甲基、三溴甲基或三碘甲基。與上述雜芳環(huán)取代基一起使用的，“低級(jí)烷氧基”是指C1至C4烷氧基、類似地，“低級(jí)烷基硫代”是指C1至C4烷基硫代基團(tuán)。
術(shù)語“(單取代)氨基”是指含一個(gè)取代基的氨基，所述取代基選自苯基、取代的苯基、烷基、取代的烷基、C1至C4酰基、C2至C7烯基、C2至C7取代的烯基、C2至C7炔基、C7至C16烷基芳基、C7至C16取代的烷基芳基和雜芳基。(單取代)氨基還可擁有包括在術(shù)語“保護(hù)的(單取代)氨基”中的氨基保護(hù)基團(tuán)。術(shù)語“(二取代)氨基”是指含兩個(gè)取代基的氨基，所述取代基選自苯基、取代的苯基、烷基、取代的烷基、C1至C7酰基、C2至C7烯基、C2至C7炔基、C7至C16烷基芳基、C7至C16取代的烷基芳基和雜芳基。這兩個(gè)取代基可以相同或者不同。
術(shù)語“雜芳基(烷基)”表示在任何位置被以上所述的雜芳基取代的上述定義的烷基。
術(shù)語“評(píng)價(jià)”包括任何形式的測(cè)量，包括確定某要素存在或不存在。術(shù)語“測(cè)定”、“測(cè)量”、“評(píng)估”、“評(píng)價(jià)”和“檢測(cè)”可互換使用，包括定量和定性測(cè)定。評(píng)價(jià)可以是相對(duì)的或者絕對(duì)的。“評(píng)價(jià)......存在”包括確定某要素存在的量，和/或測(cè)定它是否存在。如本文所使用的，術(shù)語“測(cè)定”、“測(cè)量”、“評(píng)估”、“評(píng)價(jià)”和“檢測(cè)”可互換使用，包括定量測(cè)定和定性測(cè)定。
“精密度”是指對(duì)于給定的樣品，一項(xiàng)檢測(cè)重復(fù)給出相同或相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果的能力。
“準(zhǔn)確度”是指在同時(shí)含陽性和陰性樣品的盲組中，一項(xiàng)檢測(cè)正確檢測(cè)靶分子的能力。

具體實(shí)施例方式 本發(fā)明提供可逆性修飾的熱穩(wěn)定酶組合物。還提供制備主題組合物的方法，例如通過用羧酸修飾劑修飾熱穩(wěn)定酶。本發(fā)明還提供使用可逆性修飾的熱穩(wěn)定酶組合物的方法，以及包含可逆性修飾的熱穩(wěn)定酶組合物的試劑盒和系統(tǒng)。
在進(jìn)一步描述本發(fā)明之前，應(yīng)該理解的是因?yàn)閷?shí)施方案當(dāng)然是可以變化的，所以本發(fā)明不限于具體所述的實(shí)施方案。還應(yīng)理解的是本文所使用的命名法是只是為了描述具體的實(shí)施方案，而不應(yīng)認(rèn)為是限制本發(fā)明，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍只受隨附權(quán)利要求的限制。
當(dāng)給定一個(gè)數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解為在該范圍的上限和下限之間的所有中間數(shù)值(以下限為單位隔十分之一取值)也具體公開，除非上下文另有明確說明。在所述范圍中的任何所述值或中間值和所述范圍中的任何其它所述值或中間值之間的每個(gè)較小的范圍包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。這些較小的范圍的上限和下限可獨(dú)立地包括在范圍內(nèi)或排除在范圍外，任一界限、兩界限均不或兩界限均包括在較小范圍內(nèi)的每個(gè)范圍，也包括在本發(fā)明內(nèi)，除非任何界限被明確排除在所述范圍之外。所述范圍包括一個(gè)或兩個(gè)界限的，排除所包括的一個(gè)或兩個(gè)界限的范圍也包括在本發(fā)明中。
除非另外定義，本文所使用的技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義。盡管任何與本發(fā)明所述的方法和材料類似或相當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧峡捎糜趯?shí)施或測(cè)試本發(fā)明，但在此優(yōu)選的方法和材料得到描述。本文所提及的所有出版物通過引用的方式納入本文用以公開和描述引用出版物所相關(guān)的方法和/或材料。應(yīng)該理解，在出現(xiàn)矛盾的情況下，本發(fā)明的公開內(nèi)容應(yīng)取代所引用的出版物的任何公開內(nèi)容。
必須注意的是，除非本文另外清楚地指明，在本文和隨附的權(quán)利要求中所使用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該”包括所提及物的復(fù)數(shù)形式。因此，例如提及“一種酶”，則包括很多種此類酶，提及“該引物”則包括指一個(gè)或多個(gè)引物，以及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其等同物等。還應(yīng)注意的是，權(quán)利要求可撰寫成排除任何可選要素。因此，本聲明意在作為使用如“只”、“僅僅”等與敘述權(quán)利要求有關(guān)的排除性措辭或作為使用“否定性”限制的先行基礎(chǔ)。
本文所論述的出版物只是在本申請(qǐng)?zhí)峤蝗找郧肮_的。本文沒有任何內(nèi)容可解釋為承認(rèn)本發(fā)明無權(quán)根據(jù)現(xiàn)有發(fā)明標(biāo)注早于這些出版物的日期。而且，所給的出版日期可能與實(shí)際出版日期不同，該實(shí)際出版日期可能需要獨(dú)立地予以證實(shí)。
可逆地滅活熱穩(wěn)定酶組合物 如上述所指出的，本發(fā)明提供可逆性修飾的熱穩(wěn)定酶組合物。本發(fā)明所使用的術(shù)語“熱穩(wěn)定酶”是指對(duì)熱相對(duì)穩(wěn)定的酶。熱穩(wěn)定酶可經(jīng)受用于除去修飾劑基團(tuán)的高溫——通常在50℃以上——溫育，而不遭受不可逆地活性喪失。本發(fā)明方法中可用的修飾的熱穩(wěn)定酶包括，例如，熱穩(wěn)定聚合酶例如熱穩(wěn)定DNA聚合酶或熱穩(wěn)定RNA聚合酶、熱穩(wěn)定RNA酶H、熱穩(wěn)定DNA核酸酶例如熱穩(wěn)定DNA內(nèi)切核酸酶、熱穩(wěn)定DNA連接酶、熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶、熱穩(wěn)定解旋酶、熱穩(wěn)定RecA等。
在某些實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定酶為熱穩(wěn)定DNA聚合酶。術(shù)語“熱穩(wěn)定DNA聚合酶”是指對(duì)熱相對(duì)穩(wěn)定、并且催化三磷酸核苷聚合以形成與靶序列的一條核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的酶。該酶從引物的3’末端啟動(dòng)合成反應(yīng)，并沿著朝向模板的5’末端的方向繼續(xù)直至合成終止。美國(guó)專利4,889,818、美國(guó)專利5,352,600、美國(guó)專利5,079,352、PCT/US90/07639、PCT/US91/05753、PCT/US91/0703、PCT/US91/07076、共同未決的美國(guó)專利申請(qǐng)08/062,368、WO 92/09689和美國(guó)專利5,210,036中描述了純化的熱穩(wěn)定DNA聚合酶，各篇通過引用的方式納入本文。
在某些實(shí)施方案中，熱穩(wěn)定酶源于水生棲熱菌、嗜熱棲熱菌、海棲熱袍菌、敏捷氣熱菌、風(fēng)產(chǎn)液菌、閃爍古生球菌、熱堅(jiān)芽孢桿菌、生氫氧化碳嗜熱菌、熱自養(yǎng)甲烷桿菌△H、詹氏甲烷球菌、熾熱甲烷嗜熱菌、冰島熱棒菌、Pyrococcus endeavori、激烈熱球菌、Pyrococcushorihoshii、Pyrococcus profundus、伍斯氏火球菌、隱蔽熱網(wǎng)菌、嗜酸熱硫化葉菌、硫磺礦硫化葉菌、熱硫化氫熱厭氧桿菌、速生熱球菌、Thermococcus fumicolans、Thermococcus gorgonarius、Thermococcuskodakaraensis KOD1、Thermococcus litoralis、Thermococcuspeptonophilus、90N-7熱球菌、TY熱球菌、斯氏熱球菌、Thermococcuszilligii、嗜酸熱原體、Thermus brokianus、Thermus caldophilusGK24、黃棲熱菌、紅色棲熱菌或者它們的突變體。
在某些實(shí)施方案中，熱穩(wěn)定酶為熱穩(wěn)定核酸酶，例如熱穩(wěn)定DNA內(nèi)切核酸酶。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，熱穩(wěn)定核酸酶是來源于閃爍古生球菌的熱穩(wěn)定DNA核酸酶。術(shù)語“熱穩(wěn)定內(nèi)切核酸酶”是指對(duì)熱相對(duì)穩(wěn)定、并催化DNA分子或RNA分子中核酸間磷酸二酯鍵水解的酶。
因此，本發(fā)明提供已被可逆地滅活的熱穩(wěn)定酶的酶組合物。本文所使用的術(shù)語“可逆地滅活”是指通過與導(dǎo)致酶共價(jià)修飾(也稱化學(xué)修飾)的化合物反應(yīng)而已被滅活的酶，其中修飾劑化合物在適宜的條件下可被除去。
主題酶組合物的一個(gè)特征為，修飾的熱穩(wěn)定酶組合物在水性緩沖液中在大約50℃以上的溫度溫育，包括從約55℃至約100℃，例如約60℃至約95℃、約65℃至約90℃、約70℃至約85℃，包括約80℃以上的溫度，使得酶活性至少增加兩倍，包括至少增加約三倍、增加約五倍、增加約7倍、增加約10倍，增加約15倍、增加約20倍或更多。緩沖液可配成25℃時(shí)約pH7至約pH9，包括約pH7.25至約pH8.75、約pH7.5至約pH8.8、約pH7.75至約pH8.25以及大約pH8.0。
在某些實(shí)施方案中，在配制的25℃時(shí)約pH7至約pH9的水性緩沖液中，在約50℃以上的溫度溫育修飾的熱穩(wěn)定酶組合物，使酶活性在約20分鐘以內(nèi)至少增加兩倍。在其它實(shí)施方案中，在配制的25℃時(shí)約pH7至約pH8的水性緩沖液中，在約50℃以上的溫度溫育修飾的熱穩(wěn)定酶組合物，使酶活性在約20分鐘以內(nèi)至少增加兩倍。
制備主題酶組合物的方法 可使用任何便利的方法制備主題組合物。在典型的實(shí)施方案中，如上文所述，通過在足以產(chǎn)生所需酶組合物的條件下，用羧酸修飾劑修飾起始的熱穩(wěn)定酶組合物來制備組合物。
導(dǎo)致修飾劑化合物去除的反應(yīng)不一定是修飾反應(yīng)的逆向反應(yīng)。只要該反應(yīng)使修飾劑化合物去除，且恢復(fù)酶的功能，就可認(rèn)為該酶是被可逆地滅活的。
根據(jù)本發(fā)明，用活化的羧酸修飾試劑修飾熱穩(wěn)定酶，其中試劑與酶的反應(yīng)使得至少一個(gè)羧酸基團(tuán)與熱穩(wěn)定酶的至少一個(gè)胺基例如賴氨酸殘基的ε-胺基共價(jià)連接。在某些實(shí)施方案中用零長(zhǎng)交聯(lián)劑或其與sulfo-NHS或NHS化合物聯(lián)合處理活化羧酸。適用于本發(fā)明的羧酸可以是任何可被零長(zhǎng)交聯(lián)劑單獨(dú)或與其sulfo-NHS或NHS聯(lián)合活化的，并與熱穩(wěn)定酶形成共價(jià)鍵，而導(dǎo)致熱穩(wěn)定酶滅活的羧酸。
合適的羧酸試劑包括以下通式
其中R為H、取代或未取代的苯基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的雜芳基、或者取代或未取代的烷基例如取代或未取代的飽和線型或分支烴基或烴鏈(例如C1至C8)，包括例如甲基、乙基、異丙基、叔丁基、庚基、正辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基。
示例的羧酸試劑包括以下物質(zhì)
3-羧基-戊-2-烯二酸2-甲基-丁-2-烯二酸 (順式-烏頭酸) (檸康酸)
2，3-二甲基馬來酸 馬來酸 3，4，5，6-四氫苯二甲酸
烯丙基丙二酸環(huán)丁烷-1，1-二甲酸順式-環(huán)丁烷-1，2-二甲酸
順式-環(huán)丁烷-1，2-二甲酸1，1-環(huán)己烷二甲酸順式-4-環(huán)己烷-1，2-二甲酸


(2-環(huán)戊烯-1-基)-馬來酸 1-環(huán)戊烯-1，2-二甲酸 環(huán)丙稀-1，2，3-三甲酸


3，4-呋喃二甲酸3-氧代-丁酸 甲酸 對(duì)修飾任意具體熱穩(wěn)定酶的羧酸試劑的選擇，取決于酶的熱穩(wěn)定性和核酸檢測(cè)步驟所需的溫度。具體而言，修飾的熱穩(wěn)定酶的激活作用不應(yīng)對(duì)反應(yīng)混合物所包含的成分例如模板核酸、dNTP、NAD，或者對(duì)用于核酸檢測(cè)的混合物中的其它蛋白分子例如可用于改進(jìn)檢測(cè)的載體蛋白如BSA或明膠造成顯著損害。羧酸修飾劑和熱穩(wěn)定酶間形成的共價(jià)鍵的穩(wěn)定性依賴于對(duì)羧酸試劑的選擇。
根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，羧酸試劑與熱穩(wěn)定酶的結(jié)合是由零長(zhǎng)交聯(lián)劑介導(dǎo)的。用零長(zhǎng)交聯(lián)劑進(jìn)行羧酸活化。零長(zhǎng)交聯(lián)劑是指介導(dǎo)羧酸和酶間共價(jià)鍵的形成而不在該鍵中增加其它原子的化合物。
合適的零長(zhǎng)交聯(lián)劑與羧酸反應(yīng)以形成-C(O)R1-OR2，其中R1為良好的離去基團(tuán)。良好的離去基團(tuán)的實(shí)例為氧琥珀酰亞胺基、氧磺酰琥珀酰亞胺基、1-氧苯并三唑基；R2選自(C4-C20)芳基、環(huán)烷基(例如環(huán)己烷)、雜環(huán)烷基、(C5-C20)芳基、(C5-C20)芳基、被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的吸電子基(例如-NO2、-F、-Cl、-CN、-CF3等)取代的(C5-C20)芳基、雜芳基、被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的吸電子基取代的雜芳基、正二烷基氨基烷基(例如3-二甲氨基丙基)和N-嗎啉甲基。合適的化合物的實(shí)例包括但不限于碳二亞胺試劑，例如二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，二異丙基碳二亞胺(DIC)，1-甲基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉乙基)碳二亞胺(CMC)，脲(uranium)試劑例如TSTU(O-(N-琥珀酰亞胺基)-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸鹽)、HBTU((O-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸鹽)，活化劑例如1-羥基苯三唑(HOBt)，為得到羧酸NHS的酯的N-羥基琥珀酰亞胺；碳二亞胺聯(lián)合NHS或sulfo-NHS；伍德沃德氏試劑K；N，N’-羰基二咪唑(CDI)；TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽)；TFFH(N，N’，N”，N’”-四甲基脲2-氟-六氟磷酸鹽)；PyBOP(苯并三唑-1-基-氧-三吡咯烷-磷六氟磷酸鹽)；EEDQ(2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氫喹啉)；DIPCDI(二異丙基碳二亞胺)；MSNT(1-(均三甲基苯-2-磺酰基)-3-硝基-1H-1，2，4-三唑)；以及芳基磺酰鹵化物如三異丙基苯磺酰氯。
在一個(gè)實(shí)施方案中，零長(zhǎng)交聯(lián)劑為碳二亞胺，例如EDC、CMC、DCC、DIC。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，羧酸試劑為順烏頭酸或者檸康酸。圖12中提供了使用EDC的示例反應(yīng)路線。圖13中提供了使用DCC的示例反應(yīng)路線。碳二亞胺與羧酸試劑形成活性酯。然后活性酯可與熱穩(wěn)定酶分子共價(jià)結(jié)合。該修飾作用使至少一個(gè)羧酸基團(tuán)和熱穩(wěn)定酶的至少一個(gè)胺基如ε-胺基共價(jià)結(jié)合。EDC和CMC為水溶性的，而DCC在水和有機(jī)溶劑中均可溶。DIC不溶于水但可溶于有機(jī)溶劑。由于許多羧酸在水和有機(jī)溶劑中均可溶，因此可在水性溶劑或有機(jī)溶劑或水性/有機(jī)混合溶劑中進(jìn)行羧酸活化。所有分子和反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)是穩(wěn)定的，并且沒有顯著例如結(jié)構(gòu)重排的副反應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，由于在水溶液中形成的活性酯可能會(huì)水解，因而在有機(jī)溶劑中進(jìn)行活化，所述有機(jī)溶劑例如DMF、DMSO、丙酮、二噁烷、乙腈、THF等。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，零長(zhǎng)交聯(lián)劑為N-乙基-3-苯基異噁唑鹽-3’-磺酸鹽(伍德沃德氏試劑K)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，羧酸試劑為順烏頭酸或者檸康酸。圖14中提供了使用伍德沃德氏試劑K的示例反應(yīng)路線。在堿性條件下，首先伍德沃德氏試劑K轉(zhuǎn)變?yōu)榉磻?yīng)性酮式烯酮亞胺，后者然后用于與羧酸試劑形成烯醇酯。烯醇酯對(duì)親核反應(yīng)高度敏感。當(dāng)親核基團(tuán)為胺基如賴氨酸的ε-胺基時(shí)，結(jié)果形成酰胺鍵。由于烯醇酯迅速水解，對(duì)于酶修飾反應(yīng)建議使用新鮮制備的烯醇酯。
又一個(gè)實(shí)施方案中，零長(zhǎng)交聯(lián)劑為N，N’-羰基二咪唑(CDI)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，羧酸試劑為順烏頭酸或檸康酸。在圖15中提供了使用CDI的示例反應(yīng)路線。CDI含有兩個(gè)?；溥蚧鶊F(tuán)，是活性很強(qiáng)的羰基化試劑。羧酸基團(tuán)與CDI反應(yīng)形成胺基高反應(yīng)性N-?；溥?。二氧化碳和咪唑的釋放使得該反應(yīng)不可逆，致使產(chǎn)率很高。當(dāng)胺基攻擊N-酰基咪唑時(shí)，N-?；溥蜥尫胚溥?。結(jié)果形成酰胺鍵。使用CDI激活羧酸應(yīng)在非水溶劑中進(jìn)行，這是由于即使是很小的比例，CDI也在水中迅速水解釋放二氧化碳和咪唑。無水有機(jī)溶劑是活化反應(yīng)的典型溶劑。
在某些實(shí)施方案中，用零長(zhǎng)交聯(lián)劑和可在修飾條件下形成具較高穩(wěn)定性的活性分子的另一分子進(jìn)行羧酸試劑活化。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二種分子為sulfo-NHS。圖16中提供了使用sulfo-NHS的示例反應(yīng)路線。第二種化合物例如sulfo-NHS的用途是在水溶液中反應(yīng)導(dǎo)致較少的sulfo-NHS酯水解，以及由此sulfo-NHS酯重排減少。EDC是廣泛使用的水溶性零長(zhǎng)交聯(lián)劑。它與羧酸試劑形成活性酯O-?；愲濉Ｈ欢?，O-?；愲寤衔镌谒芤褐胁环€(wěn)定并且迅速水解(Hoare，1967，JBC，2422447-2453)。這種快速水解使酶修飾效率較低。然而，sulfo-NHS存在時(shí)，O-?；愲迮csulfo-NHS反應(yīng)生成與胺基快速反應(yīng)的親水性分子sulfo-NHS酯(Staros et al.，1986，Anals.Biochem.，156220-222)。sulfo-NHS酯在水溶液中以較低的速率水解。它在水中非凡的穩(wěn)定性使其成為水環(huán)境中的酶修飾反應(yīng)的非常有效的中間體。除了它在穩(wěn)定性上的優(yōu)點(diǎn)外，sulfo-NHS酯沒有在某些其它活性酯上觀察到的副反應(yīng)。DCC是最頻繁使用的偶聯(lián)試劑之一。已有報(bào)道有至少兩個(gè)與DCC相關(guān)的副反應(yīng)，一個(gè)是活性O(shè)-?；愲遄园l(fā)重排形成非活性N-?；愲?圖18)，另一個(gè)是形成不再作為零長(zhǎng)交聯(lián)劑發(fā)揮作用的二氫唑酮(圖19)。另一個(gè)零長(zhǎng)交聯(lián)劑DIC，與DCC作用方式相似。DCC所發(fā)生的所有副反應(yīng)可能同樣在DIC上也會(huì)發(fā)生。相比而言，使用sulfo-NHS酯則與這類問題無關(guān)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述分子為NHS。圖16中提供了使用sulfo-NHS的示例反應(yīng)路線。使用NHS的好處與sulfo-NHS基本相同。主要不同是水溶性。與NHS相比，sulfo-NHS和其酯具有改善的水溶性。如果活性酯不在水溶液中形成，NHS可替換sulfo-NHS而不顯著影響修飾過程。
熱穩(wěn)定酶的修飾可在一步反應(yīng)中進(jìn)行，其中羧酸活化和熱穩(wěn)定酶的修飾同時(shí)發(fā)生。另外，熱穩(wěn)定酶的修飾可在兩步過程中進(jìn)行。第一步為羧酸試劑的活化，第二步為用預(yù)活化的羧酸修飾熱穩(wěn)定酶。為了完全避免零長(zhǎng)交聯(lián)劑和預(yù)活化羧酸試劑的水解，第一步可在有機(jī)溶劑中進(jìn)行。在該反應(yīng)路線中，預(yù)活化羧酸的產(chǎn)量可以非常高。不存在水分子時(shí)，預(yù)活化的羧酸試劑可儲(chǔ)存較長(zhǎng)時(shí)間而不被破壞。第二步是用預(yù)活化的羧酸試劑修飾熱穩(wěn)定酶。因?yàn)榛罨聂人嵩噭┦穷A(yù)先形成的，所以不需要使用高濃度的反應(yīng)物就可達(dá)到有效的修飾。這就使得使用具有較差水溶性的零長(zhǎng)交聯(lián)劑成為可能。這對(duì)控制對(duì)于修飾反應(yīng)很關(guān)鍵的反應(yīng)體系pH也更容易些。
用途 主題組合物可用于多種不同的用途中，下文對(duì)代表性用途作更詳細(xì)的評(píng)述。在代表性的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供使用可逆性修飾的熱穩(wěn)定酶進(jìn)行核酸檢測(cè)(如引物延伸)的方法，該方法是將包含靶核酸的樣品與一種反應(yīng)混合物接觸，所述反應(yīng)混合物包含與靶核酸互補(bǔ)的第一引物、修飾的熱穩(wěn)定酶例如修飾的熱穩(wěn)定聚合酶(例如修飾的熱穩(wěn)定DNA聚合酶或修飾的熱穩(wěn)定RNA聚合酶)和核苷酸(例如核糖核苷酸或者脫氧核糖核苷酸)，將得到的混合物在約50℃以上的溫度溫育一段時(shí)間，該時(shí)間內(nèi)修飾的熱穩(wěn)定聚合酶足以被激活，以便聚合酶由第一引物和靶核酸制得引物延伸產(chǎn)物。
同樣，本發(fā)明的方法包括含有可逆性修飾的熱穩(wěn)定酶的反應(yīng)混合物的使用和先于核酸檢測(cè)方法或作為核酸檢測(cè)方法的一部分，如擴(kuò)增反應(yīng)，使反應(yīng)混合物耐受高溫溫育。高溫溫育導(dǎo)致羧酸基團(tuán)的釋放和熱穩(wěn)定酶的激活。
溫度升高和伴隨的pH降低導(dǎo)致羧酸基團(tuán)從修飾的氨基釋放。擴(kuò)增反應(yīng)通常在室溫配制的pH7.0至約pH9.0的Tris-HCl緩沖液中進(jìn)行。室溫時(shí)，堿性反應(yīng)緩沖液條件對(duì)修飾形式的熱穩(wěn)定酶有利。盡管室溫時(shí)反應(yīng)緩沖液的pH被調(diào)到pH7.0至pH9.0，但Tris-HCl反應(yīng)緩沖液的pH隨著升高的溫度而降低。由于高溫反應(yīng)條件而發(fā)生的pH的改變?nèi)Q于所使用的緩沖液。在Good et al.，1966，Biochemistry 5(2)467-477中報(bào)道了對(duì)于生物反應(yīng)中所用的各種緩沖劑的pH的溫度依賴性，該內(nèi)容通過引用的方式納入本文。就Tris緩沖劑而言，pKa即緩沖范圍的中點(diǎn)pH的變化，與溫度的關(guān)系如下△pKa/℃＝-0.031。例如在25℃配制的Tris-HCl緩沖液在溫度升至95℃以使溫育激活時(shí)pKa下降2.17。
盡管引物延伸反應(yīng)(如擴(kuò)增反應(yīng))通常在Tris-HCl緩沖液中進(jìn)行，但延伸反應(yīng)可以在pH隨溫度而顯示較小或較大變化的緩沖液中進(jìn)行。根據(jù)所使用的緩沖劑，可能需要較穩(wěn)定或較不穩(wěn)定的修飾酶。例如，使用導(dǎo)致較不穩(wěn)定的修飾酶的修飾試劑，在緩沖液pH改變較小時(shí)可以使足夠的酶活性恢復(fù)。以上所提供的用各種試劑修飾的酶的相對(duì)穩(wěn)定性的經(jīng)驗(yàn)性比較，對(duì)適于在具體的緩沖液中使用的修飾酶的選擇作出指導(dǎo)。
在本發(fā)明的方法中，通過在等于或高于在引物延伸反應(yīng)中所使用的引物雜交(退火)溫度下進(jìn)行溫育，完成修飾酶的激活，以確保延伸特異性?；謴?fù)酶活性所需的溫育時(shí)間的長(zhǎng)度取決于溫度和反應(yīng)混合物的pH，取決于修飾的熱穩(wěn)定酶的穩(wěn)定性，所述穩(wěn)定性取決于制備修飾酶時(shí)所使用的修飾劑?？墒褂么蠓秶臏赜龡l件，對(duì)每個(gè)反應(yīng)憑經(jīng)驗(yàn)確定最佳條件。一般，在約50℃以上的溫度下在擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行溫育約10秒至約20分鐘。未舉例說明的酶復(fù)活的溫育條件的優(yōu)化，也未舉例說明的反應(yīng)混合物的溫育條件的優(yōu)化，可通過遵循本文所提供的教導(dǎo)的常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定。
顯而易見的是，對(duì)本文所述的檢測(cè)方法的設(shè)計(jì)可進(jìn)行多種變化，許多形式在本領(lǐng)域都是已知的。以下說明內(nèi)容僅作為指導(dǎo)內(nèi)容提供，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)可很容易地修改所述的方案。
侵入檢測(cè)法(Invader assay) 在某些實(shí)施方案中，可逆性修飾的熱穩(wěn)定酶是可逆性修飾的熱穩(wěn)定核酸酶，例如熱穩(wěn)定內(nèi)切核酸酶。在所述的實(shí)施方案中，可逆性修飾的熱穩(wěn)定核酸酶可用于核酸信號(hào)檢測(cè)分析，例如侵入檢測(cè)法。侵入檢測(cè)法是信號(hào)擴(kuò)增方法，公開于美國(guó)專利6,348,314、6,090,543、6,001,567、5,985,557、5,846,717和5,837,450中，其公開內(nèi)容通過引用的方式全文納入本說明書。它不涉及靶核酸序列擴(kuò)增或修飾。在它的線型形式中，部分重疊的兩個(gè)寡核苷酸與靶核酸分子雜交并形成可裂解的結(jié)構(gòu)。雜交探針的酶解產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。裂解本身也可在熱力學(xué)上促進(jìn)從靶序列除去裂解的探針。靶核酸序列存在時(shí)，探針經(jīng)歷雜交和裂解的循環(huán)。信號(hào)強(qiáng)度與樣品中存在的靶核酸序列的量成線性比例。在一系列裂解中，從第一個(gè)反應(yīng)裂解的產(chǎn)物又一次與兩個(gè)另外的寡核苷酸形成第二個(gè)裂解結(jié)構(gòu)。第二個(gè)裂解結(jié)構(gòu)的裂解進(jìn)一步放大信號(hào)(Hall etal，2000，PNAS，97(15)8272-8277)。實(shí)現(xiàn)雜交探針裂解的酶為熱穩(wěn)定活瓣內(nèi)切核酸酶。與其它熱穩(wěn)定酶一樣，活瓣內(nèi)切核酸酶在大范圍溫度內(nèi)時(shí)活性的，除了所需的裂解靶核酸結(jié)構(gòu)外還可裂解許多核酸結(jié)構(gòu)。存在于反應(yīng)體系中的寡核苷酸(有些為較高濃度)可形成大量分子內(nèi)結(jié)構(gòu)和分子間結(jié)構(gòu)。它們中的多數(shù)只在低溫穩(wěn)定。這些結(jié)構(gòu)的裂解要么導(dǎo)致背景較高，要么導(dǎo)致可檢測(cè)信號(hào)較低。減少或者完全消除這些不需要的裂解可顯著改善檢測(cè)分析的質(zhì)量。如本文所公開的活瓣內(nèi)切核酸酶的化學(xué)修飾是避免這類問題的好方法。盡管它不能防止寡核苷酸形成裂解結(jié)構(gòu)，但它可防止這些結(jié)構(gòu)裂解。在反應(yīng)溫度，這些結(jié)構(gòu)不可能足夠穩(wěn)定而不會(huì)引起上述檢測(cè)分析的任何問題。
RNA分子對(duì)熱敏感，尤其在二價(jià)金屬離子存在時(shí)。因此，使用可逆性修飾的(例如可逆地滅活的)熱穩(wěn)定內(nèi)切核酸酶是理想的。然而，當(dāng)前的方法需要在高溫例如95℃時(shí)延長(zhǎng)溫育時(shí)間以完成激活。這種條件增加了破壞RNA分子的機(jī)會(huì)，這將間接減小檢測(cè)的靈敏度。由此，本發(fā)明提供了使用多種修飾劑的化學(xué)修飾方法。所述的多種修飾劑使得有可能選擇可形成具有適當(dāng)穩(wěn)定性的酰胺鍵、從而可在溫和條件下進(jìn)行活化反應(yīng)的修飾劑。這表明了本發(fā)明優(yōu)于先前的化學(xué)修飾方法的重要有利之處。
環(huán)形探針檢測(cè)法(CPA) 如美國(guó)專利5,403,711、5,011,769中所公開的，在環(huán)形探針檢測(cè)中，將RNA酶H(優(yōu)選熱穩(wěn)定RNA酶H)和含核糖核苷酸的探針用于DNA序列檢測(cè)。RNA酶H是特異地裂解雜交到脫氧核糖核苷酸分子上的核糖核苷酸分子的酶。核糖核苷酸分子的裂解使得RNA分子從DNA分子解離。隨后新的完整的RNA探針將結(jié)合到靶序列上并被裂解。重復(fù)這個(gè)過程導(dǎo)致可檢測(cè)的信號(hào)的產(chǎn)生。雖然熱穩(wěn)定RNA酶H的活性的最佳溫度較高，但通常它在低溫具有顯著活性水平。含核糖核苷酸的探針的非特異性雜交將通過RNA酶H引起雜交探針的酶解，這樣要么導(dǎo)致高背景，要么導(dǎo)致假陽性的結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明可逆性修飾的熱穩(wěn)定RNA酶H將顯著改進(jìn)本檢測(cè)方法。
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 本發(fā)明的方法尤其適于減少PCR中的非特異性擴(kuò)增。然而，本發(fā)明不限于任何具體的擴(kuò)增系統(tǒng)。
在典型的實(shí)施方案中，使用可逆地滅活的熱穩(wěn)定DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增中所用的退火溫度一般為約55℃-75℃，預(yù)反應(yīng)的溫育在等于活高于退火溫度下進(jìn)行，優(yōu)選約90℃以上。擴(kuò)增反應(yīng)混合物優(yōu)選在約90℃-100℃時(shí)溫育最長(zhǎng)大約12分鐘，以在溫度循環(huán)前激活DNA聚合酶。時(shí)間長(zhǎng)度可以是約5秒至約12分鐘間的任意時(shí)間，包括約30秒至約11分鐘、約45秒至約10.5分鐘、約1分鐘至約10分鐘、約1.5分鐘至約9.4分鐘、約2分鐘至約9分鐘、約2.5分鐘至約8.5分鐘、約3分鐘至約8分鐘、約3.5分鐘至約7.5分鐘、約4分鐘至約7分鐘、約4.5分鐘至約6.5分鐘、約5分鐘至約6分鐘。對(duì)典型的PCR擴(kuò)增適宜的預(yù)反應(yīng)溫育條件，以及不同的預(yù)反應(yīng)溫育條件對(duì)擴(kuò)增的影響在實(shí)施例中進(jìn)行描述。
典型的PCR擴(kuò)增的第一步由靶核酸雙鏈的熱變性構(gòu)成。樣品核酸變性所需的確切條件根據(jù)樣品核酸的長(zhǎng)度和組成決定。通常在90℃-100℃溫育約10秒，最多至約4分鐘，對(duì)樣品核酸完全變性是有效的。開始的變性步驟可作為預(yù)反應(yīng)的溫育以激活可逆性修飾的熱穩(wěn)定DNA聚合酶。然而，根據(jù)起始變性步驟的時(shí)間和溫度，根據(jù)用于激活DNA聚合酶的修飾劑，DNA聚合酶活性的恢復(fù)可能是不完全的。如果需要最大程度地恢復(fù)酶活性，可延長(zhǎng)預(yù)反應(yīng)的溫育時(shí)間，或者，備選地，增加擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)。
在本發(fā)明某些實(shí)施方案中，選擇在起始溫育步驟中僅可恢復(fù)部分酶活性的修飾酶和起始變性條件。每個(gè)涉及高溫變性步驟的隨后的PCR循環(huán)使得酶活性進(jìn)一步恢復(fù)。因此酶活性的激活延遲到擴(kuò)增的起始循環(huán)以后。已觀察到這種DNA聚合酶活性的“馳豫時(shí)間”(“time release”)，從而進(jìn)一步降低非特異性擴(kuò)增。已知過量的DNA聚合酶有助于非特異型擴(kuò)增。在本發(fā)明方法中，DNA聚合酶活性量在擴(kuò)增起始階段(此時(shí)靶序列數(shù)量很少)較低，這就減少了形成的非特異型延伸產(chǎn)物的量。DNA聚合酶最大活性存在于擴(kuò)增后期，此時(shí)靶序列數(shù)量較多，存在的最大活性能產(chǎn)生較高的擴(kuò)增量。如果有必要，可增加擴(kuò)增循環(huán)數(shù)來補(bǔ)償在起始循環(huán)中存在的較低量的DNA聚合酶活性。改變擴(kuò)增循環(huán)數(shù)對(duì)擴(kuò)增的影響顯示于實(shí)施例中。
本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是該方法不需要在起初制備反應(yīng)混合物后處理反應(yīng)混合物。因此該方法對(duì)用于自動(dòng)擴(kuò)增系統(tǒng)，以及與原位擴(kuò)增方法一同使用是理想的，其中在起始變性步驟后加入試劑或者使用蠟壘是不方便的或者不實(shí)際的。
適于包括擴(kuò)增反應(yīng)的每種引物延伸反應(yīng)的樣品制備方法，在本領(lǐng)域中已有描述(參見例如Sambrook et al.，同上，以及以上引用的描述擴(kuò)增方法的參考文獻(xiàn))。制備用于靶序列的PCR擴(kuò)增的樣品的簡(jiǎn)單快速的方法在Higuchi，1989，PCR Technology(Erlich主編，StocktonPress，New York)和PCR Protocols，18-20章(Innis et al.，主編，Academic Press，1990)中有描述，通過引用的方式將兩篇文獻(xiàn)均納入本文。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可選擇并憑經(jīng)驗(yàn)優(yōu)化合適的方案。
檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法已廣泛描述于文獻(xiàn)中。標(biāo)準(zhǔn)方法包括通過凝膠電泳或者通過與寡核苷酸探針雜交的分析。探針和擴(kuò)增的核酸間所形成的雜交體的檢測(cè)可以多種形式進(jìn)行，包括斑點(diǎn)印跡檢測(cè)形式和反向斑點(diǎn)印跡檢測(cè)形式。參見Saiki et al，1986，Nature 324163-166；Saikiet al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 866230；PCT專利申請(qǐng)89/11548；美國(guó)專利5,008,182和5,176,775；PCR ProtocolsAGuide to Methods and Applications(Innis et al.主編，AcademicPress，San Diego，Calif.)337-347；每篇內(nèi)容通過引用的方式納入本文。使用微孔板的反向斑點(diǎn)印跡反方法在共同未決的美國(guó)申請(qǐng)141,355；美國(guó)專利5,232,829；Loeffelholz et al.，1992，J.Clin.Microbiol.30(11)2847-2851；Mulder et al.，1994，J.Clin.Microbiol.32(2)292-300；和Jackson et al.，1991，AIDS 51463-1467中有描述，每篇內(nèi)容通過引用的方式納入本文。
連接酶鏈反應(yīng)(LCR) 與PCR類似，LCR(Wu and Wallace，1989，Genomics 4560-569和Barany，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88189-193)為涉及熱循環(huán)的指數(shù)式靶擴(kuò)增方法。LCR相關(guān)的低靈敏度檢測(cè)至少部分歸因于熱穩(wěn)定酶在低于其反應(yīng)溫度的溫度時(shí)的剩余活性。在LCR中，不能區(qū)分非模板引導(dǎo)的擴(kuò)增和模板引導(dǎo)的擴(kuò)增。如本文公開的可逆性修飾的熱穩(wěn)定連接酶可消除低溫時(shí)非模板引導(dǎo)的連接。
滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、鏈替代擴(kuò)增反應(yīng)(SDA)、單引物等溫?cái)U(kuò)增(SPIA+)、指數(shù)式單引物等溫?cái)U(kuò)增(X-SPIA+)、環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增(LAMP) 可得益于本發(fā)明可逆性修飾的熱穩(wěn)定酶的其它擴(kuò)增方法包括但不限于以下方法滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)(美國(guó)專利5,854,033、6,183,960、6,210,884、6,344,329)、鏈替代擴(kuò)增反應(yīng)(SDA)(美國(guó)專利5,270,184)、單引物等溫?cái)U(kuò)增(SPIA+)(美國(guó)專利5,916,779)、指數(shù)式單引物等溫?cái)U(kuò)增(X-SPIA+)(美國(guó)專利6,251,639)、環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增(LAMP)(美國(guó)專利6,410,278)。上述等溫?cái)U(kuò)增步驟的一個(gè)共同組成部分是強(qiáng)鏈替代活性的DNA聚合酶的使用。在這些技術(shù)中使用最廣泛的DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶大片段。多數(shù)反應(yīng)在60～65℃溫度進(jìn)行。雖然熱啟動(dòng)應(yīng)能改善擴(kuò)增的特異性、靈敏度和定量化，但還沒有已經(jīng)報(bào)道的熱啟動(dòng)系統(tǒng)。
總之，還沒有熱啟動(dòng)技術(shù)已經(jīng)用于任何等溫檢測(cè)技術(shù)。這是部分因?yàn)楝F(xiàn)在的熱啟動(dòng)技術(shù)無法被這類檢測(cè)技術(shù)采用。激活過程要么是完成不充分，要么是對(duì)于該過程太苛刻。本發(fā)明提供了大量修飾劑。本發(fā)明的應(yīng)用可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增的熱啟動(dòng)，從而改善這些檢測(cè)方法。
依賴核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)和自主序列復(fù)制系統(tǒng)(3SR) 可得益于本發(fā)明的可逆性修飾的熱穩(wěn)定酶的其它核酸檢測(cè)方法包括下述等溫檢測(cè)方法，例如依賴核酸系列的擴(kuò)增(NASBA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、以及自主序列復(fù)制系統(tǒng)(3SR)。這些方法主要用于在恒溫下擴(kuò)增靶RNA分子。擴(kuò)增包括(i)RNA模板引導(dǎo)的互補(bǔ)DNA(cDNA)的酶合成，(ii)RNA/DNA異源雙鏈中的RNA鏈的RNA酶H降解，(iii)雙鏈DNA的合成，(iv)體外轉(zhuǎn)錄中單鏈RNA合成，以及(v)步驟(i)至(iv)的重復(fù)以擴(kuò)增靶核酸。
因?yàn)檫@些檢測(cè)術(shù)的靈敏度和定量結(jié)果不如PCR，所以熱啟動(dòng)酶的應(yīng)用將會(huì)大大有益于這類方法。例如，能在升高的溫度下激活的可逆性修飾的熱穩(wěn)定酶將有效較少和消除副反應(yīng)。這將改善檢測(cè)的靈敏度。沒有熱啟動(dòng)系統(tǒng)時(shí)，事實(shí)上擴(kuò)增反應(yīng)在所有組分混合后立即啟動(dòng)。由于樣品和標(biāo)準(zhǔn)品之間不同的擴(kuò)增開始時(shí)間，以及快速擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)，致使準(zhǔn)確和精確定量非常困難。使用能在升高的溫度下激活的可逆性修飾的熱穩(wěn)定酶，將使所有擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)間開始，從而改進(jìn)定量。
作為一般的可逆的蛋白修飾方法，本發(fā)明也可應(yīng)用于其它方法。例如美國(guó)專利6,274,981和6,699,981描述了用磷酸酶切除寡核苷酸的3’-磷酸的方法和它在PCR中的應(yīng)用。不存在可逆性修飾的熱穩(wěn)定酶時(shí)，磷酸酶與3’磷酸化的寡核苷酸混合后立即就發(fā)生去磷酸化。磷酸的切除可具有害作用。在上述方法中應(yīng)用本發(fā)明可有效控制所述反應(yīng)，改善效果。
因此，本發(fā)明不限于任何具體的核酸檢測(cè)系統(tǒng)。當(dāng)開發(fā)了其它的系統(tǒng)時(shí)，那些系統(tǒng)可受益于實(shí)施本發(fā)明。例如，Abramson and Myers，1993，Current Opinion in Biotechnology 441-47出版的一項(xiàng)有關(guān)擴(kuò)增系統(tǒng)的調(diào)查，其內(nèi)容通過引用的方式納入本文。
試劑盒 本發(fā)明還提供試劑盒即包含對(duì)實(shí)施本發(fā)明方法有益的組分的多容器單元。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包括可逆性修飾的熱穩(wěn)定酶。在某些實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定酶為熱穩(wěn)定聚合酶，例如熱穩(wěn)定DNA聚合酶或者熱穩(wěn)定RNA聚合酶、熱穩(wěn)定RNA酶H、熱穩(wěn)定DNA核酸酶如熱穩(wěn)定DNA內(nèi)切核酸酶、熱穩(wěn)定DNA連接酶、熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶、熱穩(wěn)定解旋酶、熱穩(wěn)定RecA等。在典型的實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定酶是熱穩(wěn)定DNA聚合酶。在其它實(shí)施方案中，熱穩(wěn)定酶為熱穩(wěn)定DNA核酸酶如熱穩(wěn)定DNA內(nèi)切核酸酶。在某些實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定酶源于水生棲熱菌、嗜熱棲熱菌、海棲熱袍菌、敏捷氣熱菌、風(fēng)產(chǎn)液菌、閃爍古生球菌、熱堅(jiān)芽孢桿菌、生氫氧化碳嗜熱菌、熱自養(yǎng)甲烷桿菌△H、詹氏甲烷球菌、熾熱甲烷嗜熱菌、冰島熱棒菌、Pyrococcus endeavori、激烈熱球菌、Pyrococcus horihoshii、Pyrococcus profundus、伍斯氏火球菌、隱蔽熱網(wǎng)菌、嗜酸熱硫化葉菌、硫磺礦硫化葉菌、熱硫化氫熱厭氧桿菌、速生熱球菌、Thermococcus fumicolans、Thermococcus gorgonarius、Thermococcus kodakaraensis KOD1、Thermococcus litoralis、Thermococcus peptonophilus、90N-7熱球菌、TY熱球菌、斯氏熱球菌、Thermococcus zilligii、嗜酸熱原體、Thermus brokianus，Thermuscaldophilus GK24，黃棲熱菌、紅色棲熱菌或者它們的突變體。
而且，方案中可以存在所要求的或者所需的與試劑盒組分一起使用的其它試劑，其它試劑包括但不限于補(bǔ)充的核酸對(duì)、單鏈結(jié)合蛋白和PCR擴(kuò)增試劑(例如核苷酸、緩沖劑、陽離子等)等。試劑盒的組分可存在于分離的容器中，或者一種或多種組分存在于相同的容器中，其中容器是儲(chǔ)存容器和/或在試劑盒被設(shè)計(jì)用于該檢測(cè)的檢測(cè)中使用的容器。
除了以上組分，主題試劑盒還可包括實(shí)施主題方法的用法說明。這些用法說明可以多種形式存在于主題試劑盒中，試劑盒中可存在一種或多種用法說明。這些用法說明可存在的一種形式是將信息印刷于合適的介質(zhì)或基底上，例如印有該信息的紙張、試劑盒包裝、包裝的插頁等。再一種形式是其上記錄了該信息的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，例如軟盤、CD等。又一種可存在的形式是在遠(yuǎn)端站點(diǎn)經(jīng)因特網(wǎng)訪問該信息的網(wǎng)絡(luò)地址。試劑盒中可存在任何便利的形式。
系統(tǒng) 如上所述，本發(fā)明還提供了用于實(shí)施主題方法的系統(tǒng)。例如，在某些實(shí)施例方案中，試劑盒包括可逆性修飾的熱穩(wěn)定酶。在某些實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定酶為熱穩(wěn)定聚合酶，例如熱穩(wěn)定DNA聚合酶或者熱穩(wěn)定RNA聚合酶、熱穩(wěn)定RNA酶H、熱穩(wěn)定DNA核酸酶如熱穩(wěn)定DNA內(nèi)切核酸酶、熱穩(wěn)定DNA連接酶、熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶、熱穩(wěn)定解旋酶、熱穩(wěn)定RecA等。在典型的實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定酶為熱穩(wěn)定DNA聚合酶。在其它實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定酶為熱穩(wěn)定核酸酶，例如熱穩(wěn)定DNA內(nèi)切核酸酶。在其它實(shí)施方案中，所述熱穩(wěn)定酶源于水生棲熱菌、嗜熱棲熱菌、海棲熱袍菌、敏捷氣熱菌、風(fēng)產(chǎn)液菌、閃爍古生球菌、熱堅(jiān)芽孢桿菌、生氫氧化碳嗜熱菌、熱自養(yǎng)甲烷桿菌△H、詹氏甲烷球菌、熾熱甲烷嗜熱菌、冰島熱棒菌、Pyrococcus endeavori、激烈熱球菌、Pyrococcus horihoshii、Pyrococcus profundus、伍斯氏火球菌、隱蔽熱網(wǎng)菌、嗜酸熱硫化葉菌、硫磺礦硫化葉菌、熱硫化氫熱厭氧桿菌、速生熱球菌、Thermococcus fumicolans、Thermococcus gorgonarius、Thermococcus kodakaraensis KOD1、Thermococcus litoralis、Thermococcus peptonophilus、90N-7熱球菌、TY熱球菌、斯氏熱球菌、Thermococcus zilligii、嗜酸熱原體、Thermus brokianus、Thermuscaldophilus GK24、黃棲熱菌、紅色棲熱菌或它們的突變體。
而且，方案中可以存在所要求的或者所需的與系統(tǒng)組分一起使用的其它試劑，其它試劑包括但不限于補(bǔ)充的核酸對(duì)、單鏈結(jié)合蛋白和PCR擴(kuò)增試劑(例如核苷酸、緩沖劑、陽離子等)等。
實(shí)施例 為了就如何實(shí)現(xiàn)和使用本發(fā)明向本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供完整的公開和說明，提出以下實(shí)施例，以下實(shí)施例并不意在限制發(fā)明人所認(rèn)為的他們的發(fā)明的內(nèi)容，也不意在表示以下實(shí)驗(yàn)為所有的或唯一的完成的實(shí)驗(yàn)。我們已努力確保所使用的數(shù)字的準(zhǔn)確性(例如，用量、溫度等)，但還應(yīng)對(duì)一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差作出解釋。除非另外指明，份數(shù)是重量份、分子量是均重分子量、溫度是攝氏度、壓力是大氣壓或接近大氣壓。
實(shí)施例1 活瓣內(nèi)切核酸酶-1和Taq DNA聚合酶的制備 閃爍古生球菌的DNA獲自ATCC(49558D)。如Hosfield et al.所述(Hosfield，1998，JBC 275(22)16420-16427)，經(jīng)PCR克隆編碼閃爍古生球菌的活瓣內(nèi)切核酸酶-1(Afu FEN-1)的基因?？寺〉男蛄型ㄟ^直接測(cè)序驗(yàn)證。將Afu FEN-1基因克隆到pET-28(Noragen)中。根據(jù)Hosfield et al.的方法并進(jìn)行少許修改，完成Afu FEN-1蛋白過量表達(dá)和純化。
水生棲熱菌株YT-1獲自ATCC(25104)。用來自GeneBank(AcessionNo.J04639)的序列經(jīng)PCR克隆水生棲熱菌(Taq)的DNA聚合酶基因。質(zhì)粒pET-28用于構(gòu)建表達(dá)載體。按照Lawyer et al.所述的方法(Lawyeret al.，1989，JBC 264(11)6427-37；Lawyer et al.1989，PCR Meth.Appl.2(4)275-87)進(jìn)行Taq DNA聚合酶純化。
實(shí)施例2 使用檸康酸修飾Afu FEN-1 使用檸康酸修飾Afu FEN-1在含有20mM MOPS、pH8.0和100mMKCl的緩沖液中進(jìn)行。將Afu FEN-1的濃度調(diào)至1mg/ml。
將檸康酸(Aldrich)和N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(Aldrich)溶于N，N’-二甲基-甲酰胺(DMF)(Fisher，測(cè)序級(jí))中，濃度為1M。在1.5ml Eppendorf管中混合100μl 1M的檸康酸和200μl 1M的DCC?；旌衔镌谑覝販赜?小時(shí)。然后混合物在室溫以12,000rpm離心20分鐘。棄去沉淀物，保留上清液用于修飾Afu FEN-1。
將一體積的活化的檸康酸與99體積的Afu FEN-1混合。然后混合物在室溫溫育1小時(shí)得到化學(xué)滅活的Afu FEN-1。
實(shí)施例3 修飾的Afu FEN-1的活性測(cè)定 測(cè)定修飾的Afu FEN-1的活瓣內(nèi)切核酸酶活性。不含酶的對(duì)照反應(yīng)混合物含有30mM Tris HCl pH8.0、3mM Mg2+，400nM 5-ROX(Sigma)，0.01％吐溫-20，以下核酸18SI、18SP、18ST(參見表1的序列信息)各100nM。18SI和18SP均由與18ST互補(bǔ)的序列組成。18SI位于18SP的上游，并與18SP重疊1個(gè)核苷酸。當(dāng)18SP是完整的，18SP的6Fam熒光被猝滅。在Afu FEN-1的存在下，含有18SI、18SP和18ST的復(fù)合物中的18SP被Afu FEN-1裂解。該裂解導(dǎo)致6FAM熒光增強(qiáng)。向25μ1的反應(yīng)中加入10ng化學(xué)修飾的Afu FEN-1。用相同量的未修飾酶作對(duì)照。
在ABI Prism 7000上進(jìn)行活性測(cè)定，以實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光強(qiáng)度的改變。溫育條件為以下條件的20個(gè)循環(huán)(59℃，1秒—>60℃，29秒)×20個(gè)循環(huán)。預(yù)計(jì)的溫育條件為60℃ 10min，每30秒搜集數(shù)據(jù)。然而，生產(chǎn)商的軟件不允許這種操作。如圖1所示，修飾的Afu FEN-1未顯示可觀察得到的活瓣內(nèi)切核酸酶活性。
溫育之后，反應(yīng)混合物再在95℃孵育10min，然后按以下條件循環(huán)30次59，1秒—>60℃，59秒。這是為了熱激活修飾的Afu FEN-1，并在此之后測(cè)定它的活性。圖2表明化學(xué)修飾的Afu FEN-1在95℃下溫育，部分恢復(fù)活瓣內(nèi)切核酸酶的活性。
表1 實(shí)施例4 使用順烏頭酸修飾Afu FEN-1 在含20mM MOPS、pH8.0和100mM KCl的緩沖液中進(jìn)行修飾。將Afu FEN-1的濃度調(diào)至1mg/ml。
將順烏頭酸(Aldrich)和DCC(Aldrich)溶于N，N’-二甲基-甲酰胺(DMF)(Fisher，測(cè)序級(jí))中，濃度為1M。在1.5ml Eppendorf管中混合100μl 1M的順烏頭酸、100μl 1M的DCC和100μl DMF?；旌衔镌谑覝販赜?小時(shí)。然后混合物在室溫以12,000rpm離心20分鐘。棄去沉淀物，保留上清液用于修飾Afu FEN-1。
將一體積的活化的檸康酸與99體積的Afu FEN-1混合。室溫溫育1小時(shí)得到化學(xué)滅活的Afu FEN-1。
實(shí)施例5 檸康酸和順烏頭酸修飾的Afu FEN-1間的比較 化學(xué)修飾的酶的不同應(yīng)用需要穩(wěn)定性不同的酰胺鍵。由此，對(duì)于特定的應(yīng)用應(yīng)選擇適宜的羧酸。另外，酰胺鍵的穩(wěn)定性影響到對(duì)修飾的蛋白質(zhì)的儲(chǔ)藏條件確定。
活化的羧酸可與胺基形成酰胺鍵。對(duì)于具體胺基，羧酸的結(jié)構(gòu)影響酰胺鍵的穩(wěn)定性。羧酸結(jié)構(gòu)對(duì)酰胺鍵穩(wěn)定性的影響是可以合理預(yù)測(cè)的。例如，順烏頭酸含三個(gè)羧基。每個(gè)羧基與DCC反應(yīng)形成穩(wěn)定的酯中間體。然而，三個(gè)羧基的反應(yīng)性不相等。由于立體效應(yīng)，預(yù)計(jì)順烏頭酸的3-羧基是與零長(zhǎng)交聯(lián)劑最具有反應(yīng)性的基團(tuán)。當(dāng)順烏頭酸與DCC在反應(yīng)混合物中的摩爾比大約為1時(shí)，對(duì)于每個(gè)DCC分子都有三個(gè)羧基。預(yù)計(jì)DCC和3-羧基之間形成的活性酯濃度比由其它兩羧基的任一羧基形成的活性酯的濃度高。
盡管活化的羧酸的結(jié)構(gòu)可通過多種分析方法確定。根據(jù)Palacian(Palacian et al.，1990，MCB，97101-111)，3-羧基形成的酰胺鍵比其它兩個(gè)羧基形成的酰胺鍵更穩(wěn)定，更難于被破壞。脫?；磻?yīng)應(yīng)比檸康酸更困難。因此激活作用的相對(duì)容易程度可以揭示活化羧酸的組成。
如實(shí)施例2和4，用羧酸或順烏頭酸制備修飾的Afu FEN-1。實(shí)施例3中描述了活瓣內(nèi)切核酸酶-1測(cè)定和激活條件。圖3表明順烏頭酸修飾的酶和檸康酸修飾的酶均沒有任何顯著的活瓣內(nèi)切核酸酶活性。但如圖4所示，激活后，兩種修飾的酶均可通過在95℃溫育10min而被活化。如圖4所示檸康酸修飾的Afu FEN-1的活瓣內(nèi)切核酸酶活性比順烏頭酸修飾的Afu FEN-1所恢復(fù)的多60～70％。
實(shí)施例6 使用檸康酸的NHS酯修飾FEN-1 將DCC、檸康酸和NHS(Aldrich)均溶于DMF，濃度為1M。在1.5ml的管中將200μl DCC、200μl NHS和100μl檸康酸混合。然后混合物室溫溫育1小時(shí)。然后混合物在室溫以12,000rpm離心20分鐘。棄去沉淀物，保留上清液用于修飾Afu FEN-1。
將待修飾的Afu FEN-1置于含20mM MOPS、pH8.0和100mM KCl的緩沖液中。Afu FEN-1的濃度調(diào)至1mg/ml。將一體積的活化的檸康酸與99體積的Afu FEN-1混合。然后混合物在室溫溫育1小時(shí)得到滅活的Afu FEN-1。
實(shí)施例7 使用檸康酸的sulfo-NHS酯修飾FEN-1 sulfo-NHS酯常用于?；磻?yīng)。sulfo-NHS酯具有與NHS酯相同的特異性和反應(yīng)性。sulfo-NHS酯和NHS酯間的不同之處在于水溶性和水溶液中該化合物的穩(wěn)定性。具體而言，sulfo-NHS酯的親水性比NHS酯更強(qiáng)。因此，水溶液中sulfo-NHS酯的水解比NHS酯慢。因此，使用sulfo-NHS酯介導(dǎo)?；磻?yīng)是有利的。
將DCC、檸康酸和sulfo-NHS(Pierce)均溶于DMF，濃度為1M。在1.5ml的管中將200μl DCC、200μl sulfo-NHS和100μl檸康酸混合。然后混合物室溫溫育1小時(shí)。然后混合物在室溫以12,000rpm離心20分鐘。棄去沉淀物，保留上清液用于修飾Afu FEN-1。
將待修飾的Afu FEN-1置于含20mM MOPS、pH8.0和100mM KCl的緩沖液中。Afu FEN-1的濃度調(diào)至1mg/ml。將一體積的活化的檸康酸與99體積的Afu FEN-1混合。然后混合物在室溫溫育1小時(shí)得到滅活的Afu FEN-1。
實(shí)施例8 使用檸康酸修飾Taq DNA聚合酶 將DCC、檸康酸和NHS(Aldrich)均溶于DMF，濃度為1M。在1.5ml的管中將200μl DCC、200μl NHS和100μl檸康酸混合。然后混合物室溫溫育1小時(shí)。然后混合物在室溫以12,000rpm離心20分鐘。棄去沉淀物，保留上清液用于修飾Afu FEN-1。
然后將純化的Taq DNA聚合酶在20mM MOPS、pH8.0和100mM KCl中調(diào)節(jié)至1mg/ml。將一體積的活化的檸康酸與99體積的Taq DNA聚合酶混合。然后混合物在室溫溫育1小時(shí)得到滅活的Taq DNA聚合酶。
實(shí)施例9 修飾酶激活作用的pH依賴性 已有報(bào)道，較高的溫度和較低的pH均促進(jìn)脫?；磻?yīng)(Nieto etal.，1983，Biochem.Biophys.Acta.，749204-210)。在熱啟動(dòng)PCR系統(tǒng)中兩個(gè)因素都存在。在PCR中最常用的緩沖液——Tris緩沖液，在溫度升高時(shí)明顯變得更酸。已測(cè)定，每升高1度(℃)pH下降0.031。例如，如果Tris溶液在22℃時(shí)的pH為8.0，當(dāng)溫度達(dá)到95℃時(shí)溶液pH下降到5.74。
測(cè)定修飾的Taq DNA聚合酶激活作用的pH依賴性。25μl PCR反應(yīng)混合物含有25mM Tris pH8.0或8.7，30mM KCl，3.0mM Mg2+，dATP、dCTP、dGTP和TTP各0.2mM，400nM 5-ROX，1xSybr Green，0.30ng源于K562細(xì)胞(Promega)的人基因組DNA，引物各200nM(參見表2序列信息)，以及10ng修飾或未修飾的Taq DNA聚合酶。擴(kuò)增靶為18S核糖體RNA基因。所有反應(yīng)在一個(gè)平板上進(jìn)行。熱循環(huán)條件包括95℃ 10min，之后按(95℃，15秒—>60℃，30秒)循環(huán)40次。在ABI Prism7000上完成擴(kuò)增。
表2 圖5表示使用未修飾的酶的擴(kuò)增。閾值循環(huán)數(shù)(Ct)和△Rn均不受pH的顯著影響。圖6表示使用修飾的Taq DNA聚合酶的擴(kuò)增。相對(duì)于未修飾的Taq DNA聚合酶，用修飾的Taq DNA聚合酶擴(kuò)增則受到pH的較大影響。例如，pH8.7的系統(tǒng)的Ct改變值比pH8.0的系統(tǒng)高出近10個(gè)循環(huán)。該結(jié)果表明pH對(duì)于修飾酶的激活的重要性。
實(shí)施例10 在非Tris緩沖系統(tǒng)中使用修飾的Taq DNA聚合酶的PCR擴(kuò)增 雖然化學(xué)修飾的DNA聚合酶提供了最嚴(yán)格的熱啟動(dòng)性能，但在PCR中使用化學(xué)修飾的DNA聚合酶還是限于小片段的擴(kuò)增。完成最佳PCR擴(kuò)增的另一個(gè)因素是pH。未修飾的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的緩沖液pH一般為pH8.3～9.0，取決于酶的來源和各廠商的配方。沒有一個(gè)用于PCR的商購緩沖液pH低于pH8.0。另外，緩沖液pH8.0對(duì)于聚合酶的活性事實(shí)上是欠佳的。非最適pH是例如AmpliTaq Gold不能擴(kuò)增大的核酸的原因之一。
為了PCR擴(kuò)增的高保真性，可使用具有校正活性的熱穩(wěn)定DNA聚合酶例如Pfu DNA聚合酶(Stratagene)、Vent&Deep Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)。一般而言，這類酶更偏好較高的pH緩沖系統(tǒng)，例如pH8.8，以達(dá)到大核酸的高保真擴(kuò)增。
具體而言，pH在PCR效率中的作用最顯著見于DNA合成步驟中。對(duì)于大片段的擴(kuò)增，引物延伸的優(yōu)選溫度為72℃。對(duì)于小片段，兩步驟PCR是最常見的，其中引物退火和引物延伸通常在60℃進(jìn)行。
而且，不同的緩沖系統(tǒng)，溫度對(duì)pH的影響也不同。例如，當(dāng)溫度升高1℃，Tris和MOPS的pH分別下降0.031和0.009。表3顯示不同溫度的Tris和MOPS的pH。在表3中，22℃時(shí)的pH可用pH計(jì)測(cè)得。其它溫度時(shí)的pH根據(jù)各緩沖液pKa的變化計(jì)算。
表3
根據(jù)表3，如果22℃時(shí)MOPS緩沖液的pH大約為7.25至7.50，那么緩沖液在60℃時(shí)的pH將會(huì)是6.91至7.16。該pH對(duì)于擴(kuò)增小片段時(shí)有益的。如果MOPS緩沖液的pH在約7.50至7.75，那么該緩沖液適于擴(kuò)增大核酸片段。為了確定本發(fā)明的修飾酶是否可用于大核酸片段的擴(kuò)增或高保真的核酸擴(kuò)增，測(cè)定不同的MOPS緩沖液系統(tǒng)的適用度。
在不同的應(yīng)用環(huán)境中使用主題酶的一個(gè)障礙是不同反應(yīng)體系的pH是否允許修飾酶的有效激活。為解決這個(gè)問題，設(shè)計(jì)如下系列實(shí)驗(yàn)。
25μl PCR反應(yīng)混合物含有25mM Tris pH8.0或者25mM MOPSpH7.25、7.50和7.75。剩余成分為30mM KCl，3.0mM Mg2+，dATP、dCTP、dGTP和TTP各0.2mM，400nM 5-ROX，1xSybr Green，0.30ng源于K562細(xì)胞(Promega)的人基因組DNA，引物各200nM(參見表2序列信息)，和10ng未修飾的或修飾的Taq DNA聚合酶。擴(kuò)增靶為18S核糖體RNA基因。所有反應(yīng)在一個(gè)平板上進(jìn)行。熱循環(huán)條件包括95℃ 10min，之后按(95℃，15秒—>60℃，30秒)循環(huán)40次。在ABI Prism 7000上完成擴(kuò)增。結(jié)果在表4中給出。
表4
相比于其中酶無法良好激活(實(shí)施例9)的pH8.70的Tris緩沖液中的修飾的Taq DNA聚合酶，同樣修飾的Taq DNA聚合酶在pH7.25至7.75的MOPS緩沖液中被良好激活并發(fā)揮作用。該結(jié)果表明主題發(fā)明的可逆性修飾的熱穩(wěn)定酶可用于多種擴(kuò)增過程。
實(shí)施例11 截?cái)嘈蚑aq DNA聚合酶的制備和修飾 Taq DNA聚合酶有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。第一個(gè)結(jié)構(gòu)域是DNA聚合酶結(jié)構(gòu)域，第二個(gè)結(jié)構(gòu)域是5’—>3’核酸酶結(jié)構(gòu)域。N末端核酸酶結(jié)構(gòu)域的缺失產(chǎn)生具有較高復(fù)制保真性和熱穩(wěn)定性的截?cái)嘈蚑aq DNA聚合酶(Barnes，1992，Gene 11229-35；Lawyer et al.，1993，PCR Methods App.2(4)275-287)。截?cái)嘈蚑aq DNA聚合酶已成功用于大核酸片段的擴(kuò)增。
編碼截?cái)嘈蚑aq DNA聚合酶的基因(Barnes，1992)被亞克隆至pET-28表達(dá)載體。然后含該缺失突變體的pET-28表達(dá)載體被轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)細(xì)胞系以表達(dá)截?cái)嘈蚑aq DNA聚合酶。采用Lawyer所述的純化方案純化過量表達(dá)的截?cái)嘈蚑aq DNA聚合酶(Lawyer，1993)。
按照實(shí)施例2所述進(jìn)行重組截?cái)嘈蚑aq DNA聚合酶的修飾。
實(shí)施例12 使用DNA聚合酶和Afu FEN-1內(nèi)切核酸酶的定量PCR 使用缺乏5’核酸酶活性的DNA聚合酶和活瓣內(nèi)切核酸酶-1的、并且在美國(guó)專利6,528,254和6,548,250中描述的定量PCR，兩篇專利的公開內(nèi)容通過引用的方式全文納入本說明書。內(nèi)切核酸酶FEN-1能裂解許多二級(jí)結(jié)構(gòu)，例如裂解形成分子內(nèi)或分子間二級(jí)結(jié)構(gòu)的引物和/或探針。如果發(fā)生這種裂解，它會(huì)對(duì)擴(kuò)增和/或信號(hào)檢測(cè)產(chǎn)生消極影響。所述分子內(nèi)或分子間結(jié)構(gòu)在較低溫度時(shí)比在較高溫度時(shí)更穩(wěn)定。因此內(nèi)切核酸酶造成的裂解更有可能在低溫時(shí)發(fā)生。因此，在升高的溫度下變?yōu)榫哂谢钚缘目赡婊瘜W(xué)修飾的FEN-1在較低溫度時(shí)有助于減少或者甚至阻止這類裂解。因而使用該可逆化學(xué)修飾的內(nèi)切核酸酶可改善擴(kuò)增和信號(hào)檢測(cè)。
25μl PCR反應(yīng)混合物含有15mM Tris pH8.0，4.0mM Mg2+，dATP、dCTP、dGTP和TTP各0.2mM，400nM5-ROX，1xSybr Green，1.5ng人基因組DNA(ABI)，引物各400nM，100nM探針(參見表5序列信息)以及10ng修飾的截?cái)嘈蚑aq DNA聚合酶(實(shí)施例11)和6ng或10ng修飾的或未修飾的Afu FEN-1。擴(kuò)增靶是10號(hào)染色體上的基因片段。熱循環(huán)條件包括25℃，15分鐘—>95℃，10分鐘，和按以下條件循環(huán)45次95℃，15秒—>60℃，1分鐘。在ABI Prism 7000上完成擴(kuò)增。
表5 當(dāng)采用6ng未修飾的Afu FEN-1的PCR成功用于檢測(cè)靶核酸時(shí)，該反應(yīng)較含有可逆性修飾的內(nèi)切核酸酶而言產(chǎn)生顯著較弱的信號(hào)(圖7)。當(dāng)反應(yīng)中使用的Afu FEN-1的濃度增加到10ng時(shí)，修飾的和未修飾的酶間的差異更顯著。該結(jié)果表明不同于完全無法檢測(cè)靶核酸的10ng未修飾的Afu FEN-1，用10ng修飾的Afu FEN-1檢測(cè)是成功的(圖8)。
實(shí)施例13 羧酸修飾的DNA聚合酶與二羧酸酐修飾的DNA聚合酶間的比較 以下研究比較了主題發(fā)明的可逆的熱穩(wěn)定DNA聚合酶和按美國(guó)專利5,677,152所述使用二羧酸酐修飾的聚合酶間的有效性(例如反應(yīng)速度和反應(yīng)敏感性)。
25μl PCR反應(yīng)混合物含有Tris緩沖液pH8.0，4.0mM Mg2+，dATP，dCTP，dGTP和TTP各0.2mM，400nM 5-ROX，300pg人基因組DNA(ABI)，引物各200，400或800nM，200nM探針(參見表6序列信息和加入的各種引物的量)，以及10ng修飾的Taq DNA聚合酶(實(shí)施例8)。UnivesalTaqMan PCR Master Mix(Part Number 4304437)購自Applied Biosystem(ABI)?；净旌弦?master mix)包含AmpliTaq Gold即一種用二羧酸酐修飾的Taq DNA聚合酶。表6列出擴(kuò)增靶。標(biāo)準(zhǔn)ABI熱循環(huán)方案是95℃，10min，然后按以下條件循環(huán)50次95℃，15s—>60℃，1min。快速熱循環(huán)方案是95℃，5min，然后按以下條件循環(huán)50次95℃，5s—>60℃，30s、在ABI Prism 7000上完成擴(kuò)增。結(jié)果在表7至表9以及圖9-11中給出。
表6

表7羧酸修飾的DNA聚合酶的快速熱循環(huán)方案與標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)方案的比較
表8采用快速熱循環(huán)方案的羧酸修飾的DNA聚合酶和酐修飾的DNA聚合酶間的比較
*4個(gè)中有2個(gè)未擴(kuò)增。
表9羧酸修飾的DNA聚合酶(快速熱循環(huán)方案)和酐修飾的DNA聚合酶(標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)方案)間的比較
結(jié)果表明羧酸修飾的熱穩(wěn)定DNA聚合酶比酐修飾的熱穩(wěn)定DNA聚合酶更快速并且更敏感。例如，表8表明采用標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)方案時(shí)羧酸修飾的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的Ct值比酐修飾的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的Ct值低。多數(shù)情況下，在羧酸修飾的熱穩(wěn)定DNA聚合酶介導(dǎo)的反應(yīng)中的Ct值比酐修飾的熱穩(wěn)定DNA聚合酶介導(dǎo)的反應(yīng)的Ct值低大約整數(shù)2至14。而且，表9表明酐修飾的熱穩(wěn)定DNA聚合酶介導(dǎo)的反應(yīng)為得到相當(dāng)?shù)腃t，該反應(yīng)要采用標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)方案，而羧酸修飾的熱穩(wěn)定DNA聚合酶介導(dǎo)的反應(yīng)可采用快速熱循環(huán)來完成。
在標(biāo)準(zhǔn)方案下，酐修飾的酶(購自ABI)與羧酸修飾的Taq DNA聚合酶表現(xiàn)得幾乎同樣好(表9)。但采用快速熱循環(huán)條件時(shí)觀察到兩個(gè)體系的顯著差異(表8)。圖9-11表示三種代表性的結(jié)果。圖9表示快速熱循環(huán)條件下靶3的擴(kuò)增結(jié)果。在進(jìn)行比較的8個(gè)靶中，ABI的PCR混合液對(duì)于靶3的作用最好。ABI的基本混合物的Ct仍有1.5個(gè)循環(huán)的滯后。在靶5上觀察到更大的Ct差異即7.37(圖10)。在快速循環(huán)條件下，ABI的試劑基本無法檢測(cè)到靶。圖11表示靶8的等位基因1的擴(kuò)增結(jié)果。
排除因儀器不同而不同的加熱和冷卻時(shí)間，快速條件使反應(yīng)時(shí)間縮短36.3分鐘或53％。許多情況下都非常想要得到快速結(jié)果，例如臨床應(yīng)用、可疑樣品中的有害微生物和病毒的檢測(cè)。甚至在基礎(chǔ)研究應(yīng)用中，它可以用于高通量檢測(cè)。因此，該結(jié)果表明羧酸修飾的熱穩(wěn)定酶比酐修飾的酶在快速條件下作用更佳。
前文內(nèi)容只是說明本發(fā)明的原理。應(yīng)理解的是，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能制定雖然沒有在本文得到明確描述或表現(xiàn)，但體現(xiàn)了本發(fā)明的原理各種方案，這些方案包括在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。此外，本文列舉的所有實(shí)施例和條件用語主要意在幫助讀者理解本發(fā)明的原理和有助于發(fā)明者改進(jìn)該技術(shù)的概念，它們應(yīng)被理解為不限于所述的特別列舉的實(shí)施例和條件。另外，列舉了本發(fā)明的原理、具體方面和實(shí)施方案及其實(shí)施例的本文的敘述，意在包括它們的結(jié)構(gòu)和功能等同物。另外，應(yīng)理解的是，所述等同物包括現(xiàn)在已知的等同物和將來開發(fā)出的等同物即任何不論結(jié)構(gòu)如何而發(fā)揮相同作用的所開發(fā)的成分。因此本發(fā)明的范圍不應(yīng)限于本文所示和描述的例舉實(shí)施方案。更確切地，本發(fā)明的范圍和精神通過附隨地權(quán)利要求項(xiàng)來體現(xiàn)。
序列表
<110>畢萬里
<120>可逆性修飾的熱穩(wěn)定酶組合物及其制備方法和使用方法
<130>NSTR-001WO
<150>60/578,442
<151>2004-06-09
<160>35
<170>FastSEQ for Windows version 4.0
<210>1
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>3權(quán)利要求
1.一種熱穩(wěn)定酶組合物，其中所述熱穩(wěn)定酶組合物包括已被共價(jià)修飾而導(dǎo)致酶活性基本完全失活的熱穩(wěn)定酶，
其中所述修飾的熱穩(wěn)定酶組合物在所配制的25℃時(shí)約pH7至約pH9的水性緩沖液中、在約50℃以上的溫度時(shí)的溫育，使組合物的活性在約20分鐘以內(nèi)至少增加兩倍。
2.權(quán)利要求1的熱穩(wěn)定酶組合物，其中所述的熱穩(wěn)定酶為熱穩(wěn)定DNA聚合酶、熱穩(wěn)定RNA聚合酶、熱穩(wěn)定RNA酶H、熱穩(wěn)定核酸酶或者熱穩(wěn)定DNA連接酶、熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶、熱穩(wěn)定RecA、熱穩(wěn)定解旋酶。
3.權(quán)利要求1的熱穩(wěn)定酶組合物，其中所述熱穩(wěn)定酶為熱穩(wěn)定聚合酶。
4.權(quán)利要求3的熱穩(wěn)定酶組合物，其中所述熱穩(wěn)定聚合酶為熱穩(wěn)定DNA聚合酶。
5.權(quán)利要求1的熱穩(wěn)定酶組合物，其中所述熱穩(wěn)定聚合酶為熱穩(wěn)定RNA聚合酶。
6.權(quán)利要求1的熱穩(wěn)定酶組合物，其中所述熱穩(wěn)定酶為熱穩(wěn)定核酸酶。
7.權(quán)利要求1的熱穩(wěn)定酶組合物，其中所述熱穩(wěn)定酶源于水生棲熱菌、嗜熱棲熱菌、海棲熱袍菌、敏捷氣熱菌、風(fēng)產(chǎn)液菌、閃爍古生球菌、熱堅(jiān)芽孢桿菌、生氫氧化碳嗜熱菌、熱自養(yǎng)甲烷桿菌ΔH、詹氏甲烷球菌、熾熱甲烷嗜熱菌、冰島熱棒菌、Pyrococcus endeavori、激烈熱球菌、Pyrococcus horihoshii、Pyrococcus profundus、伍斯氏火球菌、隱蔽熱網(wǎng)菌、嗜酸熱硫化葉菌、硫磺礦硫化葉菌、熱硫化氫熱厭氧桿菌、速生熱球菌、Thermococcus fumicolans、Thermococcusgorgonarius、Thermococcus kodakaraensis K0D1、Thermococcuslitoralis、Thermococcus peptonophilus、90N-7熱球菌、TY熱球菌、斯氏熱球菌、Thermococcus zilligii、嗜酸熱原體、Thermusbrokianus、Thermuscaldophilus GK24、黃棲熱菌、紅色棲熱菌或它們的突變體。
8.權(quán)利要求1的熱穩(wěn)定酶組合物，其中所述的熱穩(wěn)定酶組合物在所配制的25℃時(shí)約pH 7至約pH 8的水性緩沖液中、在約50℃以上的溫度時(shí)的溫育，使酶活性在約20分鐘以內(nèi)至少增加兩倍。
9.權(quán)利要求1的熱穩(wěn)定酶組合物，其中所述熱穩(wěn)定酶已被下式所示的羧酸修飾劑修飾，
其中R為氫、取代或未取代的苯基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的雜芳基、或者取代或未取代的烷基。
10.權(quán)利要求9的熱穩(wěn)定酶組合物，其中所述羧酸修飾劑為檸康酸或順烏頭酸。
11.一種可逆性滅活熱穩(wěn)定酶的方法，包括
(a)將下式羧酸修飾劑與零長(zhǎng)交聯(lián)劑化合物反應(yīng)
其中R為氫、取代或未取代的苯基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的雜芳基、或者取代或未取代的烷基；和
(b)將熱穩(wěn)定酶與所述活化的羧酸修飾劑反應(yīng)以可逆性滅活熱穩(wěn)定酶。
12.權(quán)利要求11的方法，其中零長(zhǎng)交聯(lián)劑為酯提供羧酸修飾劑。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述零長(zhǎng)交聯(lián)劑化合物為碳二亞胺化合物，伍德瓦德氏試劑K、N，N’-羰基二咪唑、TSTU(O-(N-琥珀酰亞胺基)-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸鹽)、BTU((O-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸鹽)、TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽)、TFFH(N，N’，N”，N”’-四甲基脲2-氟-六氟磷酸鹽)、PyBOP(苯并三唑-1-基-氧-三吡咯烷-磷六氟磷酸鹽)、EEDQ(2-乙氧基-1-乙氧羰基-1，2-二氫喹啉)、DI PCDI(二異丙基碳二亞胺)、MSNT(1-(均三甲基苯-2-磺?；?-3-硝基-1H-1，2，4-三唑)或者三異丙基苯磺酰氯。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述碳二亞胺化合物為1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉乙基)碳二亞胺(CMC)，二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或二異丙基碳二亞胺(DIC)。
15.權(quán)利要求11的方法，其中所述羧酸修飾劑為檸康酸或者順烏頭酸。
16.權(quán)利要求11的方法，其中所述熱穩(wěn)定酶為熱穩(wěn)定DNA聚合酶、熱穩(wěn)定RNA聚合酶、熱穩(wěn)定RNA酶H、熱穩(wěn)定核酸酶、或者熱穩(wěn)定DNA連接酶、熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶、熱穩(wěn)定RecA、熱穩(wěn)定解旋酶。
17.權(quán)利要求11的方法，其中所述熱穩(wěn)定酶為熱穩(wěn)定聚合酶。
18.權(quán)利要求11的方法，其中所述熱穩(wěn)定聚合酶為熱穩(wěn)定DNA聚合酶。
19.權(quán)利要求11的方法，其中所述熱穩(wěn)定聚合酶為熱穩(wěn)定RNA聚合酶。
20.權(quán)利要求11的方法，其中所述熱穩(wěn)定酶為熱穩(wěn)定核酸酶。
21.權(quán)利要求11的方法，其中所述熱穩(wěn)定酶源于水生棲熱菌、嗜熱棲熱菌、海棲熱袍菌、敏捷氣熱菌、風(fēng)產(chǎn)液菌、閃爍古生球菌、熱堅(jiān)芽孢桿菌、生氫氧化碳嗜熱菌、熱自養(yǎng)甲烷桿菌ΔH、詹氏甲烷球菌、熾熱甲烷嗜熱菌、冰島熱棒菌、Pyrococcus endeavori、激烈熱球菌、Pyrococcus horihoshii、Pyrococcus profundus、伍斯氏火球菌、隱蔽熱網(wǎng)菌、嗜酸熱硫化葉菌、硫磺礦硫化葉菌、熱硫化氫熱厭氧桿菌、速生熱球菌、Thermococcus fumicolans、Thermococcusgorgonarius、Thermococcus kodakaraensis K0D1、Thermococcuslitoralis、Thermococcus peptonophilus、90N-7熱球菌、TY熱球菌、斯氏熱球菌、Thermococcus zilligii、嗜酸熱原體、Thermusbrokianus、Thermus caldophilus GK24、黃棲熱菌、紅色棲熱菌或它們的突變體。
22.一種引物延伸的方法，包括
(a)將以下物質(zhì)混合制備引物延伸反應(yīng)混合物
(i)包含靶核酸的樣品；
(ii)與靶核酸互補(bǔ)的第一引物；和
(iii)權(quán)利要求3的熱穩(wěn)定聚合酶組合物；和
(b)溫育所述引物延伸反應(yīng)混合物至約50℃以上的溫度一段時(shí)間，該時(shí)間足以使熱穩(wěn)定DNA聚合酶組合物激活，以便所述聚合酶由所述第一引物和所述靶核酸制得引物延伸產(chǎn)物。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述引物延伸反應(yīng)混合物還包含與靶核酸互補(bǔ)的第二引物。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述方法為擴(kuò)增所述靶核酸的方法。
25.權(quán)利要求22的方法，其中所述熱穩(wěn)定聚合酶為熱穩(wěn)定DNA聚合酶。
26.權(quán)利要求22的方法，其中所述熱穩(wěn)定聚合酶為熱穩(wěn)定RNA聚合酶。
27.權(quán)利要求22的方法，其中所述熱穩(wěn)定聚合酶源于水生棲熱菌、嗜熱棲熱菌、海棲熱袍菌、敏捷氣熱菌、風(fēng)產(chǎn)液菌、閃爍古生球菌、熱堅(jiān)芽孢桿菌、生氫氧化碳嗜熱菌、熱自養(yǎng)甲烷桿菌ΔH、詹氏甲烷球菌、熾熱甲烷嗜熱菌、冰島熱棒菌、Pyrococcus endeavori、激烈熱球菌、Pyrococcus horihoshii、Pyrococcus profundus、伍斯氏火球菌、隱蔽熱網(wǎng)菌、嗜酸熱硫化葉菌、硫磺礦硫化葉菌、熱硫化氫熱厭氧桿菌、速生熱球菌、Thermococcus fumicolans、Thermococcusgorgonarius、Thermococcus kodakaraensis K0D1、Thermococcuslitoralis、Thermococcus peptonophilus、90N-7熱球菌、TY熱球菌、斯氏熱球菌、Thermococcus zilligii、嗜酸熱原體、Thermusbrokianus、Thermus caldophilus GK24、黃棲熱菌、紅色棲熱菌或它們的突變體。
28.引物延伸反應(yīng)混合物，包括
(a)第一引物；
(b)核苷酸；和
(c)權(quán)利要求3的熱穩(wěn)定酶組合物。
29.權(quán)利要求28的引物延伸反應(yīng)混合物，其中所述混合物還包括第二引物。
30.權(quán)利要求28的引物延伸反應(yīng)混合物，其中所述核苷酸為核糖核苷酸。
31.權(quán)利要求28的引物延伸反應(yīng)混合物，其中所述核苷酸為脫氧核糖核苷酸。
32.權(quán)利要求28的引物延伸反應(yīng)混合物，其中所述熱穩(wěn)定聚合酶為熱穩(wěn)定DNA聚合酶。
33.權(quán)利要求28的引物延伸反應(yīng)混合物，其中所述熱穩(wěn)定聚合酶為熱穩(wěn)定RNA聚合酶。
34.權(quán)利要求28的引物延伸反應(yīng)混合物，其中所述熱穩(wěn)定聚合酶源于水生棲熱菌、嗜熱棲熱菌、海棲熱袍菌、敏捷氣熱菌、風(fēng)產(chǎn)液菌、閃爍古生球菌、熱堅(jiān)芽孢桿菌、生氫氧化碳嗜熱菌、熱自養(yǎng)甲烷桿菌ΔH、詹氏甲烷球菌、熾熱甲烷嗜熱菌、冰島熱棒菌、Pyrococcusendeavori、激烈熱球菌、Pyrococcus horihoshii、Pyrococcusprofundus、伍斯氏火球菌、隱蔽熱網(wǎng)菌、嗜酸熱硫化葉菌、硫磺礦硫化葉菌、熱硫化氫熱厭氧桿菌、速生熱球菌、Thermococcusfumicolans、Thermococcus gorgonarius、Thermococcuskodakaraensis K0D1、Thermococcus lItoralis、Thermococcuspeptonophilus、90N-7熱球菌、TY熱球菌、斯氏熱球菌、Thermococcuszilligii、嗜酸熱原體、Thermusbrokianus、Thermus caldophilusGK24、黃棲熱菌、紅色棲熱菌或它們的突變體。
35.一種包含權(quán)利要求1的熱穩(wěn)定酶組合物的試劑盒。
36.權(quán)利要求35的試劑盒，其中所述熱穩(wěn)定酶為熱穩(wěn)定DNA聚合酶、熱穩(wěn)定RNA聚合酶、熱穩(wěn)定RNA酶H、熱穩(wěn)定核酸酶、或者熱穩(wěn)定DNA連接酶、熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶、熱穩(wěn)定RecA、熱穩(wěn)定解旋酶。
37.權(quán)利要求35的試劑盒，其中所述熱穩(wěn)定酶為熱穩(wěn)定聚合酶。
38.權(quán)利要求35的試劑盒，其中所述熱穩(wěn)定聚合酶為熱穩(wěn)定DNA聚合酶。
39.權(quán)利要求35的試劑盒，其中所述熱穩(wěn)定聚合酶為熱穩(wěn)定RNA聚合酶。
40.權(quán)利要求35的試劑盒，其中所述熱穩(wěn)定酶為熱穩(wěn)定核酸酶。
41.權(quán)利要求35的試劑盒，其中所述熱穩(wěn)定DNA聚合酶源于水生棲熱菌、嗜熱棲熱菌、海棲熱袍菌、敏捷氣熱菌、風(fēng)產(chǎn)液菌、閃爍古生球菌、熱堅(jiān)芽孢桿菌、生氫氧化碳嗜熱菌、熱自養(yǎng)甲烷桿菌ΔH、詹氏甲烷球菌、熾熱甲烷嗜熱菌、冰島熱棒菌、Pyrococcus endeavori、激烈熱球菌、Pyrococcus horihoshii、Pyrococcus profundus、伍斯氏火球菌、隱蔽熱網(wǎng)菌、嗜酸熱硫化葉菌、硫磺礦硫化葉菌、熱硫化氫熱厭氧桿菌、速生熱球菌、Thermococcus fumicolans、Thermococcus gorgonarius、Thermococcus kodakaraensis K0D1、Thermococcus litoralis、Thermococcus peptonophilus、90N-7熱球菌、TY熱球菌、斯氏熱球菌、Thermococcus zilligii、嗜酸熱原體、Thermus brokianus、Thermus caldophilus GK24、黃棲熱菌、紅色棲熱菌或它們的突變體。
全文摘要
本發(fā)明提供了可逆性修飾的熱穩(wěn)定酶組合物及其制備方法。本發(fā)明還提供了使用可逆性修飾的熱穩(wěn)定酶組合物的方法以及包含所述可逆性修飾的熱穩(wěn)定酶的試劑盒和系統(tǒng)。
文檔編號(hào)C12N9/12GK101426908SQ200580018816
公開日2009年5月6日 申請(qǐng)日期2005年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月9日
發(fā)明者畢萬里 申請(qǐng)人:紐星實(shí)驗(yàn)室