專利名稱：蛋白激酶Cθ的結(jié)構(gòu)及相關(guān)應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白激酶Cθ的三維結(jié)構(gòu)。
背景 蛋白激酶是真核細(xì)胞中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的介體，其在生理過程、發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起關(guān)鍵作用。在異常細(xì)胞生理學(xué)和疾病如癌癥中存在失調(diào)的激酶。同樣地，蛋白激酶是調(diào)節(jié)疾病病理學(xué)的吸引人的靶。絲氨酸/蘇氨酸激酶代表真核蛋白激酶的重要部分并且粗分為6個主要類別AGC、CAMK、CMGC、TKL、STE和CK1。蛋白激酶C亞家族屬于AGC家族的AKT激酶亞家族。
概述 蛋白激酶Cθ(PKCθ)的三維模型可以幫助設(shè)計可以與PKCθ相互作用的試劑。具體地，三維模型結(jié)果可以包括PKCθ的原子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。包括結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的模型可以用于基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計或者選擇與PKCθ相互作用的試劑，如抑制劑或者底物。PKCθ的三維模型與其他蛋白激酶模型的比較可以有助于設(shè)計與PKCθ選擇性相互作用的試劑。
一方面，組合物包括包含PKCθ多肽的晶體。PKCθ多肽可以包括PKCθ的催化結(jié)構(gòu)域。PKCθ多肽可以包括SEQ ID NO1的殘基377-696。組合物可以包括結(jié)合PKCθ的試劑。該試劑可以是PKCθ底物或者PKCθ抑制劑。PKCθ抑制劑可以是星形孢菌素。晶體可以衍射X-射線到至少2.5或者至少2.2的分辨率。
另一方面，設(shè)計與PKCθ相互作用的試劑的方法包括產(chǎn)生PKCθ的三維模型。該三維模型可以包括PKCθ原子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。PKCθ的三維模型可以是PKCθ的催化結(jié)構(gòu)域的三維模型。結(jié)構(gòu)坐標(biāo)可以是通過實驗測定的坐標(biāo)。原子可以是PKCθ的活性部位的原子。結(jié)構(gòu)坐標(biāo)可以根據(jù)表2，±不超過1.5的α碳原子的均方根偏差。三維模型可以包括試劑原子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。該方法可以包括改變模型的試劑的結(jié)構(gòu)。該方法可以包括改變模型的試劑的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。
三維模型可以包括選自殘基Leu386、Gly387、Gly389、Val394、Ala407、Lys409、Val422、Met458、Glu459、Tyr460、Leu461、Gly464、Leu466、Asp508、Asn509、Leu511、Ala521和Asp522的原子的原子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。三維模型可以包括選自殘基Glu428、Arg503、Asp504、Lys527、Thr536和Thr538的原子的原子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。三維模型可以包括選自殘基Lys413、Val416、Leu417、Val422、Met426、Lys429、Thr447、Gln449、Leu454、Phe456、Phe691、Arg692、Asn693、Phe694和Ser695的原子的原子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。
該方法可以包括確定PKCθ和試劑之間的擬合。該方法可以包括計算PKCθ的原子和試劑原子之間的距離。該方法可以包括將試劑的三維模型與PKCθ的三維模型對接。該方法可以包括提供包括PKCθ多肽的組合物。PKCθ多肽可以是結(jié)晶的。組合物可以包括與PKCθ相互作用的試劑。該方法可以包括測定PKCθ的催化活性，例如，PKCθ的激酶活性?？梢詫⒃谠噭┐嬖谙聹y定的PKCθ的催化活性與不存在該試劑時測定的PKCθ的催化活性相比較。
另一方面，鑒定能夠改變PKCθ的催化活性的試劑的方法包括提供PKCθ的三維模型，并研究候選試劑與PKCθ的三維模型的相互作用。在再一方面，鑒定能夠改變PKCθ的催化活性的試劑的方法包括提供PKCθ的三維模型，所述模型包括PKCθ的原子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，研究許多候選試劑與PKCθ的三維模型的相互作用，并從所述許多候選試劑中選出預(yù)測改變PKCθ的催化活性的試劑。
可以研究第二種候選試劑與PKCθ的三維模型的相互作用。該方法可以包括選擇經(jīng)預(yù)測改變PKCθ的催化活性的候選試劑?？梢栽谒x試劑存在下測量PKCθ的催化活性。
另一方面，本發(fā)明涉及一種方法，其包括通過用包括PKCθ的晶體的三維結(jié)構(gòu)進行推理性藥物設(shè)計選擇試劑。該方法包括將試劑與PKCθ接觸并檢測該試劑結(jié)合PKCθ的能力。
另一方面，本發(fā)明涉及一種方法，其包括將PKCθ與配體接觸以形成組合物并結(jié)晶該組合物以形成結(jié)晶復(fù)合體，其中配體結(jié)合到PKCθ。結(jié)晶的復(fù)合體衍射X-射線到至少約3.5的分辨率。
再一方面，本發(fā)明涉及軟件系統(tǒng)，其包括導(dǎo)致計算機系統(tǒng)接受與結(jié)合到配體的PKCθ的結(jié)構(gòu)有關(guān)的信息、接受涉及候選試劑的信息，并確定候選試劑對PKCθ的結(jié)合特征的指令。該確定基于與結(jié)合所述配體的PKCθ的結(jié)構(gòu)有關(guān)的信息，和涉及候選試劑的信息。
另一方面，本發(fā)明涉及計算機可讀介質(zhì)上的計算機程序，在該介質(zhì)上存儲了許多指令。當(dāng)這些指令由一個或多個處理器執(zhí)行時，處理器接受涉及結(jié)合配體的PKCθ的結(jié)構(gòu)和候選試劑的信息，和確定該試劑與PKCθ多肽的結(jié)合特征。基于關(guān)于PKCθ的結(jié)構(gòu)的信息和關(guān)于候選試劑的信息確定結(jié)合特征。
另一方面，本發(fā)明涉及一種方法，其包括接受關(guān)于包括結(jié)合配體的PKCθ的復(fù)合體的結(jié)構(gòu)信息和對PKCθ與候選試劑的結(jié)合特征建模。該方法通過例如軟件系統(tǒng)實現(xiàn)。
另一方面，本發(fā)明涉及計算機可讀介質(zhì)上的計算機程序，在所述介質(zhì)上存儲許多指令。當(dāng)這些指令由一個或多個處理器執(zhí)行時，處理器接受涉及包括結(jié)合配體的PKCθ的復(fù)合體的結(jié)構(gòu)的信息，和對PKCθ與候選試劑的結(jié)合特征建模。
另一方面，本發(fā)明涉及軟件系統(tǒng)，其包括導(dǎo)致計算機系統(tǒng)接受關(guān)于包括結(jié)合配體的PKCθ的復(fù)合體的結(jié)構(gòu)的信息和對PKCθ與候選試劑的結(jié)合特征建模。
另一方面，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)受試者中PKCθ活性的方法，其包括使用推理性藥物設(shè)計來選擇能夠調(diào)節(jié)PKCθ活性的試劑并對該受試者施用治療有效量的試劑。
另一方面，本發(fā)明涉及治療患有與PKCθ活性有關(guān)的狀況的受試者的方法，其包括使用推理性藥物設(shè)計來選擇能夠影響PKCθ活性的試劑并對需要該試劑的受試者施用治療有效量的試劑。
另一方面，本發(fā)明涉及預(yù)防性治療對與PKCθ活性有關(guān)的狀況易感的受試者的方法，其包括確定該受試者對該狀況易感，使用推理性藥物設(shè)計選擇能夠影響PKCθ活性的試劑，并對該受試者施用治療有效量的該試劑。
基于結(jié)構(gòu)的建模可以允許鑒定能夠與PKCθ相互作用的試劑，而不需要用實驗在體內(nèi)或者體外測試多種化合物，其目的是鑒定可以與PKCθ相互作用的化學(xué)結(jié)構(gòu)。此類篩選是昂貴且費時的。對與PKCθ相互作用的已知試劑的修飾可以用基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計來檢查，以鑒定具有更理想的性質(zhì)的試劑，所述性質(zhì)為諸如對PKCθ有比對其他蛋白激酶更緊密的結(jié)合或者更大的選擇性，而不需要制備和測試每種經(jīng)修飾的試劑。
一個或多個實施方案的細(xì)節(jié)在附圖和下面的描述中給出。其他特征、目的和優(yōu)點將由說明書和附圖以及由權(quán)利要求書而顯而易見。
附圖描述
圖1是與星形孢菌素復(fù)合的人PKCθ的帶狀圖。
圖2是基于實驗結(jié)構(gòu)坐標(biāo)結(jié)合人PKCθ的星形孢菌素的圖。
圖3A顯示了全長人PKCθ的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。
圖3B顯示了在C末端具有六組氨酸標(biāo)記的人PKCθ的催化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
詳述 蛋白激酶Cθ(PKCθ)和蛋白激酶B/AKT被牽涉入T細(xì)胞信號傳導(dǎo)中以導(dǎo)致T細(xì)胞活化和存活。PKCθ的表達和作用相對局限于T細(xì)胞，其中響應(yīng)T細(xì)胞受體刺激的信號傳導(dǎo)促成T細(xì)胞活化和細(xì)胞因子產(chǎn)生。從而，在T細(xì)胞白血病和T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病中需要PKCθ抑制。見例如，F(xiàn)abbro等人，Pharmacology &Therapeutics 9379-98，2002；和Altman等人，Immunol.Today21567-573，2000，將它們都完整引入本文作為參考。
PKC亞家族的成員受到鈣、二酰甘油(DAG)和佛波酯的調(diào)節(jié)，并且可以基于它們的輔因子需要分成三組常規(guī)的(PKCα、βI、βII、γ)、新的(PKCδ、ε、θ、η)和非典型的(PKCζ、ι、λ、μ)同種型(見Arendt等人，Curr.Opin.Immunol.14323-330，2002，將其完整引入本文作為參考)。這些密切相關(guān)的PKC同工酶已經(jīng)表明在T細(xì)胞、B細(xì)胞和肥大細(xì)胞中有重要作用，從而促成適應(yīng)性免疫和先天性免疫。它們在細(xì)胞功能如細(xì)胞凋亡、分化、運動性、胰島素耐受性和炎癥中有不同作用。PKC的抑制劑當(dāng)前在臨床試驗中用于多種類型的癌癥。
已經(jīng)確定了AKT(PKB)和cAMP依賴性的PKA的激酶結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)，它們都屬于AGC激酶家族(見Huse和Kuriyan，Cell 109257-282，2002，將其完整引入作為參考)。需要具有僅具體抑制一種激酶的激酶抑制劑。然而，激酶結(jié)構(gòu)域ATP結(jié)合位點之間的結(jié)構(gòu)相似性在用作疾病治療的高特異性抑制劑的開發(fā)中帶來了挑戰(zhàn)(見Davies等人，Biochem.J.35195-105，2000，將其完整引入作為參考)。激酶活性位點和密切相關(guān)家族成員的活性位點的結(jié)構(gòu)闡明可以增加對抑制劑選擇性和酶作用機理的理解。此外，結(jié)構(gòu)信息可以幫助推理性設(shè)計和最優(yōu)化作為T細(xì)胞介導(dǎo)的變應(yīng)性和自身免疫疾病的治療劑的小分子抑制劑。
結(jié)構(gòu)坐標(biāo)是笛卡兒坐標(biāo)，其描述了原子在三維空間中相對于分子或者分子復(fù)合體中其他原子的位置。使用例如，X-射線晶體學(xué)技術(shù)或者NMR技術(shù)可以得到結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。額外的結(jié)構(gòu)信息可以從光譜技術(shù)(例如，旋光色散(ORD)、圓二色性(CD))、同源性建模和計算方法(如包括來自分子機理或者來自動力學(xué)測定的數(shù)據(jù)的計算方法)得到。
各種軟件程序允許對一組結(jié)構(gòu)坐標(biāo)進行圖解表示以得到分子或者分子復(fù)合體(如結(jié)合星形孢菌素的PKCθ)的表示。通常，這種表示應(yīng)該準(zhǔn)確地反映(相對地和/或絕對地)結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，或者來自結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的信息，如部件之間的距離或者角度。該表示可以是二維圖，如立體二維圖，或者相互作用的二維展示(例如，可以展示分子或者分子復(fù)合體的不同面的計算機展示)，或者相互作用的立體二維展示。坐標(biāo)可以用于指導(dǎo)分子或者分子復(fù)合體的物理三維表示的產(chǎn)生，如球棍模型或者通過快速設(shè)計原型制備的模型。通過數(shù)學(xué)操作，如通過求逆或者整數(shù)加入或者減去可以修飾結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。同樣地，結(jié)構(gòu)坐標(biāo)是相對的坐標(biāo)，并且絕不具體地受到表2的實際的x、y、z坐標(biāo)的限制。
三維分子模型是分子或者分子復(fù)合體的表示。三維模型可以是分子結(jié)構(gòu)的物理模型(例如，球棍模型)，或者分子結(jié)構(gòu)的圖解表示。圖解表示可以包括例如，計算機顯示器上呈現(xiàn)的圖或者圖形。當(dāng)二維表示反映了三維信息，例如，通過使用透視、陰影或者通過用更接近觀察者的部件遮斷離觀察者更遠的部件，二維圖解表示(例如，圖)可以是三維模型。優(yōu)選地，圖解表示準(zhǔn)確地反映了結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，或者從結(jié)構(gòu)坐標(biāo)得到的信息，如模型的部件之間的距離或角度。當(dāng)三位模型包括多肽，如PKCθ多肽時，該模型可以包括一種或多種不同水平的結(jié)構(gòu)，如一級結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)、二級結(jié)構(gòu)(例如，α-螺旋和β-折疊)、三級結(jié)構(gòu)(總體折疊)和四級結(jié)構(gòu)(寡聚化狀態(tài))。模型可以包括不同水平的細(xì)節(jié)。例如，模型可以包括蛋白的二級結(jié)構(gòu)部件的相對位置，而沒有指定原子的位置。更詳細(xì)的模型可以包括原子的位置。
模型可以包括從結(jié)構(gòu)坐標(biāo)得到的特征和其他化學(xué)信息。例如，溶劑可接近的表面的形狀可以從結(jié)構(gòu)坐標(biāo)、模型原子的范德瓦耳斯半徑和溶劑(例如，水)的范德瓦耳斯半徑得到。其他可以從結(jié)構(gòu)坐標(biāo)得到的特征包括但不限于，靜電勢、大分子結(jié)構(gòu)內(nèi)的空隙和口袋的位置和氫鍵和鹽橋的位置。
模型可以包括分子結(jié)構(gòu)中原子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。結(jié)構(gòu)坐標(biāo)可以通過實驗，例如，通過X-射線晶體學(xué)或者NMR光譜學(xué)測定，或者可以通過例如同源性建模產(chǎn)生。分子結(jié)構(gòu)可以包括單個分子、分子的一部分、兩個或更多個分子的復(fù)合體、一組分子或者其組合。在分子復(fù)合體模型中，分子可以通過共價或者非共價鍵結(jié)合，包括例如，氫鍵、疏水相互作用或者靜電引力。分子復(fù)合體可以包括緊密結(jié)合的分子，如酶/抑制劑復(fù)合體，和松散結(jié)合的分子，如結(jié)晶化合物，其在晶體中存在有序溶劑分子或者離子。模型可以包括例如，結(jié)合于試劑的蛋白的復(fù)合體，例如，結(jié)合于抑制劑的酶的復(fù)合體。當(dāng)模型包括結(jié)構(gòu)坐標(biāo)時，可以省略分子中某些原子的坐標(biāo)。
保守替代是與所替代的氨基酸殘基在功能上或者結(jié)構(gòu)上等同的氨基酸替代。保守替代可以包括將一個殘基用具有相似極性、立體排列或者屬于與所替代的殘基相同類別(例如，疏水的、酸性或者堿性的)的另一殘基交換。保守替代包括關(guān)于與PKCθ相互作用的試劑的鑒定和設(shè)計，以及分子替代分析或者同源性建模方面，對PKCθ的三維結(jié)構(gòu)無重要影響的替代。
試劑包括蛋白、多肽、肽、核酸(包括DNA或者RNA)、分子、化合物或者藥物。試劑可以作為酶的底物、抑制劑、激活劑、別構(gòu)劑或者結(jié)合配偶體。
活性部位是分子或者分子復(fù)合體的區(qū)域，其可以與試劑(包括但不限于，蛋白，多肽，肽，核酸，包括DNA或者RNA，分子，化合物或者藥物)相互作用或者結(jié)合?；钚圆课豢梢园ɡ?，試劑結(jié)合部位，以及與結(jié)合的實際部位相鄰或最接近的附屬結(jié)合部位，其可以在與特定試劑相互作用或者結(jié)合后影響活性?；钚圆课豢梢园ㄒ种苿┙Y(jié)合部位。抑制劑可以以下述方式進行抑制，即通過直接干擾底物結(jié)合的實際部位(例如，通過與底物結(jié)合競爭)或者通過間接影響立體構(gòu)象或者電荷電勢，從而防止或者減小底物結(jié)合的實際部位處底物的結(jié)合。例如，活性部位可以是輔因子結(jié)合、底物結(jié)合(例如，將要磷酸化的底物)或者抑制劑結(jié)合的部位。活性部位可以包括別構(gòu)劑結(jié)合的部位，或者磷酸化、糖基化、烷基化、酰化或者其他共價修飾的部位。
均方根偏差(rms偏差或者rmsd)是與平均值偏差的平方的算術(shù)平均值的平方根，且是一種表達與結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的偏差或變差的方法。氨基酸殘基的保守替代可以導(dǎo)致具有所述均方根偏差內(nèi)的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的分子模型。具體地，由于保守替代而相互不同的多肽的兩個分子模型可以具有所述rms偏差內(nèi)(如小于1.5，小于1.0，或者小于0.5)的主鏈原子坐標(biāo)。多肽的主鏈原子包括α碳(Cα或者CA)原子、羰基碳(C)原子、羰基氧(O)原子，和酰胺氮(N)原子。
PKCθ的氨基酸殘基的編號可以與本文給出的不同，并且可以含有某些保守氨基酸替代、添加或者缺失，其產(chǎn)生與表2所定義的相同的三維結(jié)構(gòu)，±小于1.5的主鏈原子的rmsd。其他同種型或者類似物中對應(yīng)的氨基酸和保守替代可以通過肉眼檢查有關(guān)的氨基酸序列或者通過使用通過商業(yè)途徑可獲得的同源性軟件程序(例如，MODELLAR，MSI，San Diego，CA)容易地鑒定。同種型是蛋白的在一級結(jié)構(gòu)上不同的幾個多種形式的任一種。類似物是具有保守氨基酸替代的多肽。
“PKCθ”指PKCθ蛋白或者核酸(例如，DNA或者RNA)，或者其片段。在一些實施方案中，PKCθ的片段可以包括例如，僅蛋白的N-末端結(jié)構(gòu)域、僅蛋白的C-末端結(jié)構(gòu)域或者蛋白的任一結(jié)構(gòu)域的片段。在另一實施方案中，PKCθ的片段可以包括N-末端結(jié)構(gòu)域和C-末端結(jié)構(gòu)域。PKCθ蛋白或者核酸可以來自非哺乳動物或者哺乳動物物種。哺乳動物PKCθ可以來自例如人。示例性非人哺乳動物包括非人靈長類(如猴或者猿)、小鼠、大鼠、山羊、母牛、公牛、豬、馬、羊、野豬、海獺、貓或者狗。示例性非哺乳動物物種包括雞、火雞、蝦、短吻鱷，或者魚。
PKCθ包括N-末端結(jié)構(gòu)域和C-末端催化結(jié)構(gòu)域。N-末端結(jié)構(gòu)域由多個組件組成并且起調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的功能(見，例如，Newton，A.C.，Biochem.J.370，361-371，2003，將其完整引入作為參考)。C-末端催化結(jié)構(gòu)域可以從DNA質(zhì)粒作為可溶的活性蛋白表達，例如，包括人PKCθ的全長序列的殘基362-706。表達可以由啟動子，如誘導(dǎo)型啟動子驅(qū)動。圖3A顯示了PKCθ的全長序列，而圖3B是加入C-末端六組氨酸標(biāo)記的催化結(jié)構(gòu)域的殘基362-706的序列?？梢允褂貌煌趫D3B中所示的其他多肽序列，如在N-末端有額外的或者更少的全長PKCθ序列的殘基的序列，或者在C-末端有更少殘基的序列。在一些實施方案中，PKCθ可以作為與不同于六組氨酸的標(biāo)記(如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、myc、HA、Strep或者FLAG標(biāo)記)的融合蛋白表達。該標(biāo)記可以促進從細(xì)胞，如從細(xì)菌細(xì)胞或者從哺乳動物細(xì)胞系分離PKCθ。例如，PKCθ可以在大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞中表達并從大腸桿菌細(xì)胞分離?？梢栽诠こ袒肴诤系鞍椎牡鞍酌肝稽c，如在多肽和標(biāo)記之間的融合位點處或者其附近切割融合蛋白。當(dāng)需要在PKCθ和配體，如星形孢菌素(天然產(chǎn)物激酶抑制劑)之間形成復(fù)合體時，PKCθ可以在切割和純化后與配體接觸。例如，PKCθ可以在純化前(例如，切割多肽標(biāo)記前)與星形孢菌素混合，或者PKCθ可以在純化后與星形孢菌素混合。在一些實施方案中，星形孢菌素可以與PKCθ在純化前混合，并在純化后再次混合。
可以將PKCθ置于溶液中以用于收集光譜數(shù)據(jù)或者NMR數(shù)據(jù)，或者用于生長晶體。例如，PKCθ可以在鹽(例如，鈉鹽)、聚合物(例如，聚乙二醇(PEG))和/或有機溶劑存在下結(jié)晶。可以通過各種方法，如座滴(sitting drop)或者懸滴蒸汽擴散來生長晶體。通常，可以在約4℃到約60℃(例如，約4℃到約45℃，如約4℃、約15℃、約18℃、約20℃、約25℃、約30℃、約32℃、約35℃、約37℃)的溫度下進行結(jié)晶。
PKCθ的C-末端催化結(jié)構(gòu)域可以作為與試劑的復(fù)合體進行結(jié)晶。具體地，它可以作為與星形孢菌素(天然產(chǎn)物激酶抑制劑)的1:1復(fù)合體從包括NaCl、MgCl2、二硫蘇糖醇(DTT)和Tris緩沖液的溶液結(jié)晶。溶液可以包括沉淀劑，如硫酸銨。PKCθ的晶體可以屬于空間群C2，其尺寸為a＝139.6，b＝42.4，c＝67.7，且β＝116.2°。空間群指晶體的總體對稱，并且包括點對稱和空間對稱。在某些實施方案中，結(jié)合星形孢菌素的PKCθ的晶體可以含有不對稱單位中PKCθ的一個分子。不對稱單位是使用空間群的對稱操作可以從中產(chǎn)生晶體結(jié)構(gòu)的最小單位。晶體通常由對不對稱單位的空間群對稱操作定義的基元和該基元通過晶格的平移構(gòu)成。
通常，結(jié)合星形孢菌素的PKCθ的晶體可以衍射X-射線到約3.5或更小(例如，約3.2或更小、約3.0或更小、約2.5或更小、約2.4或更小、約2.3或更小、約2.2或更小、約2.1或更小、約2.0或更小、約1.9或更小、約1.8或更小、約1.7或更小、約1.6或更小、約1.5或更小、約1.4或更小)的分辨率。在一些實施方案中，晶體可以衍射X-射線到約1.6到約2.5(例如，約1.8到約2.2)的分辨率。
例如，通過X-射線衍射可以得到描述晶體的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)?？梢酝ㄟ^多種方法收集晶體的X-射線衍射數(shù)據(jù)以得到結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。合適的X-射線源包括旋轉(zhuǎn)陽極和同步加速器源(例如，Advanced LightSource(ALS)，Berkeley，California；或Advanced Photon Source(APS)，Argonne，Illinois)。在一些實施方案中，用于產(chǎn)生衍射數(shù)據(jù)的X-射線可以具有約0.5到約1.6(例如，約0.7、約0.9、約1.0、約1.1、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6)的波長。適宜的X-射線檢測器包括平面檢測器和電荷耦合裝置(CCD)。結(jié)合星形孢菌素的PKCθ的復(fù)合體的晶體的X-射線衍射數(shù)據(jù)可以用于得到復(fù)合體中原子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。
在一些實施方案中，X-射線衍射數(shù)據(jù)可以用于構(gòu)建結(jié)合星形孢菌素的PKCθ的電子密度圖，且電子密度圖可以用于得到包括結(jié)合星形孢菌素的PKCθ的復(fù)合體或者該復(fù)合體片段的表示(例如，二維表示、三維表示)。電子密度圖的產(chǎn)生通常涉及使用關(guān)于X-射線散射相位的信息?？梢岳鐝难苌鋽?shù)據(jù)或者從補充衍射實驗提取相位信息來完成電子密度圖的構(gòu)建。用于從X-射線衍射數(shù)據(jù)計算相位的方法包括但不限于，多波長反常色散(MAD)、多重同晶置換(MIR)、具有反常散射的多重同晶置換(MIRAS)、倒易空間溶劑平化、分子置換和具有反常散射的單個同晶置換(SIRAS)，或者它們的組合。這些方法通過對天然蛋白產(chǎn)生同晶結(jié)構(gòu)修飾，如通過包括重原子或者改變已經(jīng)存在的重原子的散射強度，然后測量該天然蛋白和每種修飾的情形的衍射振幅來產(chǎn)生相位信息。如果該額外重原子的位置或者它的散射強度的改變是已知的，那么可以通過解一組同時相位(simultaneous phase)方程可以確定每個衍射的X-射線的相位。用計算機程序，如SHELXS(Sheldrick，Institut Anorg.Chemie，Gttingen，德國)可以鑒定重原子位點的位置，且用計算機程序如MOSFLM、SCALA、SOLOMON和SHARP(“The CCP4 SuitePrograms forProtein Crystallography，”Acta Crystallogr.Sect.D，54905-921，1997；deLa Fortelle和Brigogne，Meth.Enzym.276472-494，1997)可以處理衍射數(shù)據(jù)。在確定相位后，可以構(gòu)建復(fù)合體的電子密度圖。
電子密度圖可以用于得到多肽、復(fù)合體或者多肽或者復(fù)合體片段的表示，這可以通過將多肽或者復(fù)合體(例如，含有結(jié)合于配體的多肽的復(fù)合體)的三維模型與電子密度圖比對來進行。例如，對應(yīng)于結(jié)合于星形孢菌素的PKCθ的電子密度圖可以與以前確定的對應(yīng)于來自啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的未結(jié)合的TPK1δ多肽的電子密度圖進行比對。電子密度圖可以進一步進行比對，這可以通過將其與從進行覆蓋以產(chǎn)生“平均”電子密度圖的一組相似結(jié)構(gòu)(例如，一組或者5、6或者7種蛋白激酶結(jié)構(gòu))產(chǎn)生的電子密度圖比對來進行。
比對方法導(dǎo)致產(chǎn)生一種比較模型，其顯示了所計算的電子密度圖與以前已知的多肽或者以前已知的復(fù)合體的模型不同的程度。然后將比較模型進行一個或多個循環(huán)(例如，2個循環(huán)、3個循環(huán)、4個循環(huán)、5個循環(huán)、6個循環(huán)、7個循環(huán)、8個循環(huán)、9個循環(huán)、10個循環(huán))的改進以產(chǎn)生與電子密度圖的更好的擬合。軟件程序如CNS(Brunger等人，Acta Crystallogr.D54905-921，1998)可以用于改進該模型。比較模型中擬合的質(zhì)量可以通過例如Rwork或Rfree值計測量。Rwork或Rfree的較小值通常表明較好的擬合?？梢哉{(diào)節(jié)比較模型中的不一致來提供修改的比較模型和更低的Rwork或Rfree值。該調(diào)節(jié)可以基于涉及其他已知蛋白激酶多肽(例如，TKP1δ多肽)、人PKCθ多肽、星形孢菌素或者人PKCθ多肽/星形孢菌素復(fù)合體的信息(例如，序列信息)。例如，在其中使用以前已知的蛋白激酶的一個或多個模型，如TKP1δ多肽的結(jié)構(gòu)模型的實施方案中，調(diào)節(jié)可以包括將以前已知的蛋白激酶多肽中的氨基酸用不同蛋白激酶(例如，人PKCθ多肽)的對應(yīng)位點的氨基酸替代。當(dāng)對修改的比較模型的調(diào)節(jié)滿足與電子密度圖的最佳擬合時，所得模型是確定描述X-射線數(shù)據(jù)所得自的多肽或者復(fù)合體的模型。此類過程的方法公開在例如，Carter和Sweet，eds.，“Macromolecular Crystallography”in Methods inEnzymology，Vol.277，Part B，New YorkAcademic Press，1997，和其中的文獻，如Jones和Kjeldgaard，“Electron-Density MapInterpretation，”p.173，以及Kleywegt和Jones，“Model Buildingand Refinement Practice，”p.208中。
上面討論的是通過將以前已知的多肽或者以前已知的復(fù)合體的三維模型與對應(yīng)于該多肽或者復(fù)合體的晶體的新近計算的電子密度圖比對，得到復(fù)合體的表示的方法。可以用于該建模方法的一種調(diào)節(jié)可以包括用星形孢菌素替代以前已知的復(fù)合體的表示中的化合物。
如上所述，包括結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的PKCθ的三維模型可以從PKCθ/星形孢菌素晶體的X-射線衍射數(shù)據(jù)得到。一種這樣的模型的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)在下面表2中顯示。三維模型可以包括根據(jù)表2的PKCθ的部分(例如，PKCθ的結(jié)構(gòu)核心，或者PKCθ的活性部位)的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，±不超過1.5的與氨基酸的α碳原子的均方根偏差，優(yōu)選不超過1.0，且最優(yōu)選不超過0.5。PKCθ的三維模型用于許多應(yīng)用，包括但不限于，顯現(xiàn)、鑒定和表征PKCθ的各種活性部位。活性部位結(jié)構(gòu)然后可以用于設(shè)計與PKCθ相互作用的試劑。
機器，如計算機可以在內(nèi)存中編制PKCθ模型的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，以及能夠在連接于機器的顯示器上產(chǎn)生結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的三維圖解表示的程序。備選地或者額外地，可以設(shè)計和/或利用軟件系統(tǒng)來接受和存儲結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。該軟件系統(tǒng)能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的圖解表示。軟件系統(tǒng)還能夠訪問外部數(shù)據(jù)庫以鑒定具有與星形孢菌素相似結(jié)構(gòu)特征的化合物，和/或鑒定具有使得候選試劑與PKCθ很可能相互作用的特征的一種或多種候選試劑。
具有含有此類數(shù)據(jù)的存儲器或者含有此類數(shù)據(jù)的軟件系統(tǒng)的機器可以幫助推理性設(shè)計或選擇PKCθ活性的抑制劑或者激活劑，包括評估試劑與PKCθ或者PKCθ復(fù)合體結(jié)合的能力，以及幫助對通過與PKCθ的結(jié)構(gòu)或者序列同源性關(guān)聯(lián)起來的化合物或者蛋白進行建模。例如，這種機器或者軟件系統(tǒng)可以幫助評估試劑與PKCθ結(jié)合的能力，或者可以幫助對通過與PKCθ的結(jié)構(gòu)或者序列同源性關(guān)聯(lián)起來的化合物或者蛋白進行建模。本文所用的激活劑或者激動劑指增強PKCθ的至少一種活性的化合物，且抑制劑或者拮抗劑指抑制人PKCθ多肽的至少一種活性或者具有人PKCθ多肽的相反活性的化合物。例如，化合物如星形孢菌素可以通過降低T細(xì)胞中PKCθ的激酶活性率作為人PKCθ多肽的拮抗劑起作用。
機器可以產(chǎn)生PKCθ、其部分(如包括活性部位或結(jié)合部位的部分)、PKCθ/星形孢菌素復(fù)合體或者PKCθ類似物的表示(例如，二維表示或者三維表示)。例如，軟件系統(tǒng)可以使得機器產(chǎn)生此類信息。該機器可以包括機器可讀的數(shù)據(jù)存儲介質(zhì)，該介質(zhì)包含用機器可讀的數(shù)據(jù)編碼的數(shù)據(jù)存儲材料。機器可讀的數(shù)據(jù)可以包括PKCθ或者結(jié)合于星形孢菌素的PKCθ的原子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。包括數(shù)據(jù)存儲材料的機器可讀的存儲介質(zhì)可以包括常規(guī)的計算機硬盤驅(qū)動器、軟盤驅(qū)動器、DAT磁帶、CD-ROM、DVD和其他磁性介質(zhì)、磁-光介質(zhì)、光學(xué)介質(zhì)和適于計算機使用的其他介質(zhì)。機器還可以有存儲用于處理機器可讀數(shù)據(jù)的指令的工作內(nèi)存，以及偶聯(lián)于工作存儲器和機器可讀的數(shù)據(jù)存儲介質(zhì)的中央處理器(CPU)，其目的是將機器可讀的數(shù)據(jù)處理成所希望的三維表示。最后，顯示器可以連接到CPU，從而用戶可以看到三維表示。因此，當(dāng)使用由關(guān)于使用所述數(shù)據(jù)的指令編程的計算機(例如，加載本文描述類型的一個或多個程序的計算機)時，該機器能夠顯示本文描述的分子或者分子復(fù)合體，或者分子復(fù)合體的分子的部分的任一種的圖解表示(例如，二維圖解表示、三維圖解表示)。
PKCθ的活性部位可以包括抑制劑結(jié)合部位，如星形孢菌素結(jié)合部位。PKCθ的活性部位可以包括氨基酸殘基Leu386、Gly387、Gly389、Val394、Ala407、Lys409、Val422、Met458、Glu459、Tyr460、Leu461、Gly464、Leu466、Asp508、Asn509、Leu511、Ala521和Asp522(見圖3A和3B)的一個或多個?；钚圆课豢梢园▽儆诨罨蔚陌被釟埢鶜埢?22-543，或者與活化片段相互作用的殘基，如Glu428、Arg503、Asp504、Lys527、Thr536和Thr538。PKCθ的活性部位可以包括疏水基元的氨基酸殘基，或者與疏水基元相互作用的氨基酸殘基，如Lys413、Val416、Leu417、Val422、Met426、Lys429、Thr447、Gln449、Leu454、Phe456、Phe691、Arg692、Asn693、Phe694和Ser695。PKCθ的活性部位可以由結(jié)構(gòu)坐標(biāo)描述。結(jié)構(gòu)坐標(biāo)可為調(diào)節(jié)的±不超過1.5的氨基酸的α碳原子的均方根偏差，優(yōu)選不超過1.0，且最優(yōu)選不超過0.5。活性部位可以由表2中的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)描述(見下文)。
通過包括使用PKCθ的表示，如結(jié)合于星形孢菌素的PKCθ的三維模型的表示的方法，可以鑒定或者設(shè)計與PKCθ相互作用(例如，結(jié)合)的試劑。該模型可以是具有來自PKCθ氨基酸序列的保守替代的PKCθ類似物的模型。優(yōu)選地，該模型包括PKCθ的原子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。結(jié)構(gòu)坐標(biāo)可以是例如表2中的坐標(biāo)，任選調(diào)節(jié)的±不超過1.5，不超過1.0，或不超過0.5的PKCθ的α碳原子的均方根偏差。在該方法中，用結(jié)合于星形孢菌素的PKCθ的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)產(chǎn)生三維模型。該模型可以包括PKCθ的部分，如活性部位。然后可以通過用三維模型對候選試劑進行計算機擬合分析來設(shè)計或者鑒定與模型相互作用的候選試劑。
顯示器(例如，計算機顯示器)可以為用戶顯示PKCθ的三維模型的表示，例如，PKCθ的活性部位的圖。該模型可以包括結(jié)合于PKCθ的試劑，或者用戶可以將試劑的三維模型重疊在PKCθ三維模型上。試劑可以是例如PKCθ的底物或者抑制劑、候選底物或者候選抑制劑。模型中的試劑可以是已知的化合物、新的化學(xué)結(jié)構(gòu)或者化學(xué)結(jié)構(gòu)的片段。用戶可以檢查PKCθ/試劑復(fù)合體的所得三維模型。例如，通過改變以前存在的PKCθ/試劑復(fù)合體模型，如PKCθ/星形孢菌素復(fù)合體的模型，可以產(chǎn)生PKCθ/試劑復(fù)合體的三維模型。需要試劑密切擬合活性部位。換句話說，試劑可以具有互補于活性部位的形狀的形狀。在試劑的原子和PKCθ的原子之間存在優(yōu)選的距離，或者距離范圍。長于優(yōu)選距離的距離可以與試劑和PKCθ(例如，PKCθ的活性部位)間的弱相互作用有關(guān)。短于優(yōu)選距離的距離可以與排斥力有關(guān)，所述排斥力削弱了試劑和PKCθ之間的相互作用。當(dāng)原子之間的距離太短時，可以發(fā)生空間沖突。當(dāng)兩個原子的位置不合理地接近在一起時，例如，當(dāng)兩個原子通過小于它們的范德瓦耳斯半徑之和的距離分開時，發(fā)生空間沖突。如果存在空間沖突，那么用戶可以調(diào)整試劑相對于PKCθ的位置(例如，試劑的剛體平移或者旋轉(zhuǎn))，直到空間沖突減小。用戶可以調(diào)節(jié)試劑或者試劑附近的PKCθ的構(gòu)象，以減小空間沖突。通過改變試劑的結(jié)構(gòu)，例如，將龐大的基團，如芳族環(huán)改變成較小的基團，如甲基或者羥基，或者將剛性基團改變成可以適應(yīng)不產(chǎn)生空間沖突的構(gòu)象的柔性基團，也可以除去空間沖突。靜電力也可以影響試劑和活性部位之間的相互作用。例如，靜電性質(zhì)可以與減弱試劑和PKCθ之間的相互作用的排斥力有關(guān)。通過改變試劑的電荷，例如，通過用中性基團置換帶正電荷的基團，可以減輕靜電排斥。
影響試劑和PKCθ之間的結(jié)合強度的力也可以在PKCθ/試劑模型中評估。這些力可以包括但不限于，氫鍵、靜電力、疏水相互作用、范德瓦耳斯相互作用、偶極-偶極相互作用、π-堆積力和陽離子-π相互作用。用戶可以肉眼評估這些力，例如，通過注意以適于氫鍵的距離和角度排列的氫鍵供體/受體對。基于該評估，用戶可以改變模型以發(fā)現(xiàn)PKCθ和試劑之間更有利的相互作用。改變模型可以包括改變PKCθ的三維結(jié)構(gòu)而不改變它的化學(xué)結(jié)構(gòu)，例如，通過改變氨基酸側(cè)鏈構(gòu)象或者主鏈雙面夾角。改變模型可以包括改變試劑的位置或者構(gòu)象，如上所述。改變模型還可以包括改變試劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)，例如，通過替代、添加或者除去基團來改變。例如，如果PKCθ上的氫鍵供體位于該試劑上的氫鍵供體附近，那么用戶可以用氫鍵受體置換試劑上的氫鍵供體。
試劑和PKCθ的相對位置或者它們的構(gòu)象可以被調(diào)節(jié)，以發(fā)現(xiàn)特定試劑與PKCθ的最優(yōu)化的結(jié)合幾何形狀。最優(yōu)化的結(jié)合幾何形狀的特征是例如，有利的氫鍵距離和角度、最大的靜電引力、最小的靜電排斥、疏水部分與水性環(huán)境隔離和不存在空間沖突。最優(yōu)化的幾何形狀可以具有PKCθ/試劑復(fù)合體的可能的幾何形狀家族的最低的計算能量。例如，通過分子力學(xué)或者分子動力學(xué)計算可以確定最優(yōu)化的幾何形狀。
可以產(chǎn)生具有不同結(jié)合的試劑的PKCθ/試劑的一系列模型(例如，二維模型、三維模型)?？梢詾樵撓盗兄蠵KCθ/試劑復(fù)合體的每個模型計算得分。該得分可以描述例如，PKCθ和試劑之間相互作用的預(yù)期強度。得分可以反映上述影響上述結(jié)合強度的因素之一。得分可以為反應(yīng)超過一種因素的合計得分。不同的試劑可以根據(jù)它們的得分分類。
可以通過機器(例如，計算機)以自動化方式進行試劑設(shè)計中的步驟。例如，PKCθ活性部位的模型以及一系列候選試劑的模型可以在機器中編程。機器可以發(fā)現(xiàn)每種候選試劑對PKCθ活性部位的最優(yōu)化的結(jié)合幾何形狀，并計算得分來確定該系列中的哪些試劑可能與PKCθ最強地相互作用。
可以設(shè)計和/或?qū)嵤┸浖到y(tǒng)來促進這些步驟。用于產(chǎn)生此類三維模型或者進行必要的擬合分析的軟件系統(tǒng)(例如，計算機程序)包括，但不限于Accelrys，Inc.(San Diego，CA)的MCSS、Ludi、QUANTA、Insight II、Cerius2、CHARMm和Modeler；TRIPOS，Inc.(St.Louis，MO)的SYBYL、Unity、FleXX和LEAPFROG；AUTODOCK(Scripps Research Institute，La Jolla，CA)；GRID(Oxford University，Oxford，英國)；DOCK(University of California，San Francisco，CA)；和Flo+和Flo99(Thistlesoft，Morris Township，NJ)。其他有用的程序包括Openeye Scientific Software(Santa Fe，NM)的ROCS、ZAP、FRED、Vida和Szybki；Schrodinger，LLC(Portland，OR)的Maestro、Macromodel和Glide；MOE(Chemical ComputingGroup，Montreal，Quebec)；Allegrow(Boston De Novo，Boston，MA)、CNS(Brunger等人，Acta Crystall.Sect.D 54905-921，1997)和GOLD(Jones等人，J.Mol.Biol.24543-53，1995)。使用MOLSCRIPT、RASTER3D或PYMOL(Kraulis，J.Appl.Crystallogr.24946-950，1991；Bacon和Anderson，J.Mol.Graph.6219-220，1998；DeLano，The PYMOL Molecular Graphics System(2002)DeLano Scientific，San Carlos，CA)，結(jié)構(gòu)坐標(biāo)還可以用于顯示PKCθ的三維結(jié)構(gòu)。
試劑無論是抑制劑還是激活劑，都可以通過篩選合適的數(shù)據(jù)庫來選擇，可以通過結(jié)合合適的軟件程序分析空的PKCθ活性部位的立體構(gòu)型和電荷電勢來從頭設(shè)計，或者可以用PKCθ或者其他蛋白激酶的已知的抑制劑或者激活劑的特征來設(shè)計。該方法可以用于設(shè)計或者選擇PKCθ抑制劑或激活劑。可以設(shè)計和/或?qū)嵤┸浖到y(tǒng)來促進數(shù)據(jù)庫搜索，和/或試劑篩選和設(shè)計。
一旦已經(jīng)設(shè)計或者鑒定了試劑，就可以得到或者合成該試劑并進一步評估它對PKCθ活性的影響。例如，通過將所鑒定的試劑與PKCθ接觸并測量該試劑對PKCθ活性的影響，可以評估該試劑。一種評估試劑的方法可以包括在體外或者體內(nèi)進行的活性測定。例如，將試劑與PKCθ接觸并測量該試劑對多肽的激酶活性的影響來評估試劑。試劑可以通過它們增加或者減小PKCθ磷酸化肽底物，如生物素化的肽底物FRAKGSLFQ的能力來評定。反應(yīng)可以包括標(biāo)記的ATP(例如，33P-ATP)，且通過測量經(jīng)標(biāo)記的肽底物的所得水平可以監(jiān)控激酶活性。
可以在體內(nèi)進行活性測定，如激酶活性測定。例如，該測定可以是基于細(xì)胞的測定。
取決于試劑對PKCθ的作用，試劑可以作為PKCθ活性的抑制劑或者激活劑。試劑還可以在星形孢菌素存在下接觸PKCθ，以確定該試劑是否抑制PKCθ和星形孢菌素之間的結(jié)合?？梢陨L含有結(jié)合于所鑒定的試劑的PKCθ的晶體，并通過X-射線晶體學(xué)測定結(jié)構(gòu)?？梢曰诘谝环N試劑與PKCθ的相互作用設(shè)計或者鑒定第二種試劑。
各種分子分析和推理性藥物設(shè)計技術(shù)進一步公開在例如美國專利5,834,228、5,939,528和5,856,116，以及PCT申請?zhí)朠CT/US98/16879、公開的WO 99/09148中，將它們的內(nèi)容引入本文作為參考。
盡管已經(jīng)描述了一些實施方案，但是還預(yù)期其他實施方案。作為實例，盡管已經(jīng)描述了涉及結(jié)合于星形孢菌素的PKCθ的實施方案，但是本文的描述更一般地涉及任意PKCθ多肽和任意配體。 實施例 將人PKCθ的C末端催化結(jié)構(gòu)域(從殘基362到殘基706)克隆到pET-16b表達載體。該載體向所表達的蛋白的C-末端導(dǎo)入6-組氨酸標(biāo)記(見圖3B)。將該質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21-DE3用于超表達。10升細(xì)胞培養(yǎng)物在37℃下擴增到OD600約0.4。然后降溫到25℃后加入終濃度0.1mM的IPTG以誘導(dǎo)表達。細(xì)胞生長額外的4小時后收獲。
將收獲的細(xì)胞重懸浮在25mM Tris pH8.0，25mM NaCl，5mM 2-巰基乙醇，5mM咪唑，50μM ATP和蛋白酶抑制劑中，并用微流化器(microfluidizer)裂解。將裂解物應(yīng)用到20mL鎳-NTA樹脂，在4℃下保持1小時。隨后將樹脂倒入層析柱并用包含25mM咪唑的相同緩沖液充分洗滌。用200mM咪唑緩沖液洗脫結(jié)合于樹脂的蛋白。然后立即將蛋白加載到陰離子交換劑HQ(高容量季銨化的聚乙烯亞胺)上，并用25mM Tris pH8.0，25mM NaCl，5mM DTT，50μMATP洗滌柱，然后通過應(yīng)用25mM到500mM NaCl的線性梯度進行解析。含有PKCθ的級分通過SDS-PAGE選擇，合并并用25mMTris pH8.0，5mM DTT稀釋兩倍，并加載到肝素層析柱上。將流通物(flow-through)立即應(yīng)用到羥基磷灰石柱并用25mM Tris pH8.0，50mM NaCl，5mM DTT充分洗滌。0到100mM磷酸鈉的線性梯度洗脫了靶蛋白。然后將該蛋白在Superdex 200大小排阻層析柱上作為單體分類，對25mM Tris pH8.0，50mM NaCl，5mM DTT過夜透析，并濃縮到7mg/mL(通過Bradford測定法測定)后用于結(jié)晶實驗。在最后的濃縮步驟前，將星形孢菌素以過量的1∶1.2摩爾比加入PKCθ。
制備表達激酶結(jié)構(gòu)域的細(xì)菌提取物并在體外分析激酶活性，其中每次分析使用5μg蛋白，終濃度為83μM生物素化的肽底物(FRAKGSLFQ)(SEQ ID NO3)、166μM ATP、0.5μL33P ATP(比活度為3000Ci/mmol，10mCi/mL)、84ng/μL磷脂酰絲氨酸、溶于20mM MOPS pH7.2中的8.4ng/μL二酰甘油、25mM β-甘油醛、1mM原釩酸鈉、1mM DTT、1mM CaCl2，終體積30μL，在室溫下進行30分鐘。用4-10nM激酶結(jié)構(gòu)域以相似的放射性激酶測定法測定純化的激酶的活性。通過加入含有EDTA的緩沖液中止激酶反應(yīng)，并將激酶反應(yīng)轉(zhuǎn)移到鏈霉抗生物素蛋白包被的閃爍板(scintiplate)進行洗滌并用平板讀出器進行放射性檢測。備選地，將5到10μL反應(yīng)混合物在磷酸纖維素紙上點樣并用0.75％磷酸洗滌3次，且用丙酮洗滌1次。向磷酸纖維素紙加入閃爍混合物并用閃爍計數(shù)器檢測結(jié)合的放射性。與僅有肽和與僅有激酶的對照反應(yīng)物有關(guān)的放射性作為背景從最后的計數(shù)中扣除。
將PKCθ與星形孢菌素的溶液濃縮到50mM NaCl，5mM MgCl2，5mM DTT，25mM Tris-HCl緩沖液，pH8.0中的7mg/mL。從18℃的懸滴得到晶體。該滴含有1μL蛋白溶液和1μL沉淀溶液。沉淀溶液是2M硫酸銨，40mM DTT和0.1M Bis-tris，pH5.0。將晶體在含有結(jié)晶試劑加上25％甘油的低溫溶液(cryo-solution)中穩(wěn)定化，在尼龍環(huán)中封固并在100K氮氣流中瞬間凍結(jié)。在Advanced LightSource(Berkeley，CA)下用Quantum-4CCD檢測器(AreaDetector Systems)收集X-射線衍射數(shù)據(jù)到2分辨率，然后用HKL2000軟件(見Otwinowski和Minor，Methods Enzymol.276307-326，1997，將其完整引入本文作為參考)簡化。在表1中給出了數(shù)據(jù)收集的統(tǒng)計學(xué)。
序列比對表明人PKCθ和TPK1δ(來自啤酒糖酵母的依賴cAMP的蛋白激酶催化亞基)具有42％的序列同一性和63％的二級結(jié)構(gòu)相似性。使用AMORE以TPK1的結(jié)構(gòu)(Protein Data Bank編碼1FOT)作為搜索模型(見Acta Cryst.D50，1994；和Mashhoon等人，Arch.Biochem.Biophys.38711-19，2001，將其完整引入本文作為參考)，通過分子置換計算相位。用8到3.5的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了旋轉(zhuǎn)和平移函數(shù)解。用BUSTER程序和TNT產(chǎn)生最大熵省略圖(maximumentropy omit map)以減小模型偏倚和為結(jié)合的抑制劑產(chǎn)生更詳細(xì)的圖(見Bricogne，Acta Cryst.D4937-60，1993；和Tronrud，Methodsin Enzymology 277B，1997，將它們都完整引入本文作為參考)。N-葉和所有彎曲環(huán)中的一些殘基很差地擬合該圖。為了克服模型偏倚和為PKCθ模型產(chǎn)生更好的圖，通過重疊7個蛋白激酶坐標(biāo)，包括來自1FOT.pdb數(shù)據(jù)文件的蛋白激酶坐標(biāo)，計算“平均圖”。用CNS程序計算平均圖(見Brunger等人，Acta Cryst.D54905-921，1998，將其完整引入本文作為參考)。所得電子密度圖可以更容易地被解釋，特別是N葉中的環(huán)區(qū)。將該模型重建并改進，并通過R因子、Rfree的減小以及殘基怎樣擬合該圖來判斷模型的質(zhì)量。許多個重建循環(huán)后，改進會聚到R因子為0.201和Rfree為0.216。在表1中給出了改進統(tǒng)計學(xué)。最終的模型包括殘基Ile377-Pro649和Gln688-Phe696、兩個磷酸基(如磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸，見下文)、115個有序水分子和1個星形孢菌素分子的坐標(biāo)。N-末端的前12個殘基、C-末端區(qū)Pro650-Asp687和C-末端的最后10個殘基由于它們的電子密度無序而不包括在模型中。
表1.X-射線衍射數(shù)據(jù)收集的統(tǒng)計學(xué) 下面在表2中給出改進模型的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。在表2中，“#”列對給出坐標(biāo)的每個原子分配一個指數(shù)?！懊Q”列指出哪種類型的原子，且“res”列指出該原子屬于哪種類型的殘基。“鏈”指出該原子屬于哪個多肽?！皉es#”給出原子的殘基數(shù)。例如，原子號1(表2中的第一行)是Ile377的β碳(CB)。它的x、y和z結(jié)構(gòu)坐標(biāo)分別在X、Y和Z列中給出。標(biāo)題為“occ”的列描述了分配給該原子的占用(1.00＝完全占用)，而“B”列以2的單位提供了B因子(或者溫度因子)。結(jié)合的星形孢菌素的坐標(biāo)用res列中的條目“STU”表示，且磷酸蘇氨酸和磷酸絲氨酸分別通過“TPB”和“SPB”表示。
PKCθ的催化結(jié)構(gòu)域的總體折疊類似于其他蛋白激酶，包括AGC家族的激酶、PKA和PKB/AKT(見Yang等人，Nature Struct.Biology 9940-944，2002，將其完整引入本文作為參考)。圖1中顯示的帶狀解了結(jié)構(gòu)的保守核心、小N-末端葉(殘基377-461)和大C-末端葉(殘基466-696)，它們通過作為鉸鏈的柔性多肽接頭(殘基462-465，NGGD)連接。N-末端葉包括5鏈β折疊(β1-β5)，和兩個α螺旋(αB和αC)，且C-末端葉大部分為螺旋的，具有8個α螺旋(αD到αK)和四個β鏈(β6-β9)。
ATP結(jié)合口袋由星形孢菌素占據(jù)并且接近兩個葉的界面的鉸鏈片段。β鏈1和2之間的核苷酸結(jié)合環(huán)(殘基386-394)也稱作富含甘氨酸的環(huán)(LGxGxxGxV)，在許多蛋白激酶中顯示出顯著的結(jié)構(gòu)變異性(見Bossemeyer等人，Trends Biochem.Sci.19201-205，1994，將其完整引入本文作為參考)。在PKCθ結(jié)構(gòu)中，富含甘氨酸的環(huán)由于星形孢菌素結(jié)合而采取了閉合的、固定的構(gòu)象。PKCθ結(jié)構(gòu)中存在在所有激酶中都不變的關(guān)鍵催化殘基。根據(jù)用于定義催化活性激酶構(gòu)象的結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)(見Huse和Kuriyan，Cell 109257-282，2002，將其完整引入本文作為參考)，這些殘基保留了在其他活性激酶結(jié)構(gòu)中觀察到的分子內(nèi)相互作用。
如在反映活性酶的大多數(shù)Ser/Thr激酶結(jié)構(gòu)中一樣(Johnson等人，Cell 85149-158，1996，將其完整引入本文作為參考)，C-葉的活化片段(殘基526-540)是非常有序的、采取伸展的構(gòu)象并且在538位有磷酸化的Thr。Thr538的磷酸化表明活化片段的自磷酸化(與另一種酶催化的磷酸化相對)，因為激酶結(jié)構(gòu)域在大腸桿菌中表達。一些離子相互作用，尤其是磷酸蘇氨酸538和帶正電荷的Arg 503和Lys 527之間的離子相互作用與PKA和PKB中等價的相互作用相似，而在涉及螺旋αC的那些相互作用之間存在明顯不同(見下文)。
C-末端疏水基元(HM，序列FxxFS*，其中*代表絲氨酸側(cè)鏈的磷酸化)是AGC家族內(nèi)保守的部件。在PKCθ結(jié)構(gòu)中，Ser695經(jīng)磷酸化并且與N-葉的疏水溝相鄰，位于與PKA和PKB中FXXF-結(jié)合口袋相似的位置。HM基序也被PKCθ激酶結(jié)構(gòu)域自磷酸化。已經(jīng)提出HM絲氨酸的磷酸化通過促進HM和N-葉之間緊密的分子內(nèi)結(jié)合來穩(wěn)定AGC激酶的活性構(gòu)象(見Yang等人，Nature Struct.Biology 9940-944，2002)。特征性芳族殘基、磷酸絲氨酸695和N-葉的疏水溝之間的相互作用是保守的，表明磷酸絲氨酸695在PKCθ中起了與PKA和PKB中相似的作用。
星形孢菌素是天然產(chǎn)物蛋白激酶抑制劑，其對PKC同種型有低的納摩爾效力，但是對其他蛋白激酶如酪蛋白激酶1(CK1)、酪蛋白激酶2(CK2)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和CSK僅有微摩爾效力(見Meggio等人，Eur.J.Biochem.234317-22，1995，將其完整引入本文作為參考)。因為該選擇性，星形孢菌素已經(jīng)用作靶定激酶的催化位點進行推理性藥物設(shè)計的藥效團模型。
星形孢菌素占據(jù)了PKCθ的腺苷結(jié)合口袋。該抑制劑與該酶的主鏈形成三個氫鍵，并且在N-葉和C-葉之間深疏水裂隙內(nèi)產(chǎn)生充分的的范德瓦耳斯接觸。見圖2，其顯示了星形孢菌素和PKCθ之間在ATP結(jié)合位點中的范德瓦耳斯接觸。氫鍵結(jié)合基元參與星形孢菌素的內(nèi)酰胺環(huán)和主鏈原子Glu459和Leu461之間，和糖苷環(huán)和Asp508的羰基氧之間的相互作用。多數(shù)非極性相互作用來自富含甘氨酸的環(huán)殘基(Leu386、Gly387、Gly389、Val394)，并且剩余的相互作用包括來自N-末端葉的四個殘基(Ala407、Lys409、Met458和Tyr460)和來自C-末端葉的9個殘基(Leu461、Gly464、Leu466、Leu511、Ala521、Val422、Asn509、Ala521和Asp522)。
當(dāng)與結(jié)合于星形孢菌素的PKA和CDK2激酶的結(jié)構(gòu)比較時，在星形孢菌素-PKCθ接觸中存在顯著差異。首先，星形孢菌素與PKCθ僅產(chǎn)生了三個氫鍵，相反，與PKA和CDK2中有四個潛在的氫鍵接觸。在富含甘氨酸的環(huán)中存在顯著差異。特別地，與PKA和CDK2相反，PKCθ中星形孢菌素的容納導(dǎo)致富含甘氨酸的環(huán)的完全閉合。結(jié)果，該區(qū)域中的主鏈和側(cè)鏈殘基(殘基388-392)更深地移動到ATP結(jié)合口袋接受位置中，其將與ATP沖突，從而產(chǎn)生與星形孢菌素的明顯更非極性的接觸。在星形孢菌素結(jié)合于MK2后，已經(jīng)觀察到等同殘基的類似移位(Underwood等人，Structure 11627-636，2003，將其完整引入作為參考)。
活化片段是高度可變的結(jié)構(gòu)元件，其對于蛋白激酶的調(diào)節(jié)和催化活性是關(guān)鍵的。該區(qū)域作為活化或滅活輔因子的對接部位(dockingsite)(見Engh和Bossemeyer，Pharmacology & Therapeutics 9399-111，2002，將其完整引入作為參考)，并且為肽底物的容納提供了P+1口袋。與其他Ser/Thr蛋白激酶中一樣，PKCθ的活化片段(殘基522-543)位于不變的DFG和TPD基元之間，并且包括Thr538處的高度保守的磷酸化位點。實際上，觀察到附著到該殘基的磷酸基團的清晰的電子密度，表明在大腸桿菌中表達期間，Thr538被自催化磷酸化。有趣的是，磷酸化的Thr538側(cè)翼的序列(KTNT*F，其中*表示磷酸化)在-3位含有帶正電荷的殘基，其與PKC亞家族公認(rèn)的優(yōu)選底物序列(RXXT*/S*F)相容(參見Nishikawa等人，J.Biol.Chem.272952-60，1997，將其完整引入作為參考)。與缺少該堿性殘基的多數(shù)PKC同種型不同，Lys535的存在提示PKCθ在Thr538上自身磷酸化的可能性，并且與如下結(jié)論相一致全長PKCθ的K409W突變體在活化環(huán)不磷酸化并且是無活性的(見Liu等人，Biochem.J.361255-265，2002，將其完整引入作為參考)。同樣地，PKCθ的催化結(jié)構(gòu)域的K409W突變體在活化環(huán)不磷酸化并且是無活性的。
結(jié)構(gòu)結(jié)果提示活化片段中磷酸基團的關(guān)鍵作用是補償指向該活化片段的一簇帶正電荷的殘基。在PKCθ中，磷酸化的Thr538與Arg503形成兩個氫鍵，而與Lys527形成一個氫鍵。該相互作用網(wǎng)絡(luò)在許多蛋白激酶中高度保守并且在活化中起重要作用。特別地，Thr538磷酸通過保守的Arg503的離子相互作用可以對催化環(huán)提供直接連接，從而幫助穩(wěn)定催化性基Asp504的正確取向。除了與堿性殘基的靜電相互作用，磷酸化的Thr538也通過氫鍵結(jié)合Thr536的側(cè)鏈氧。從轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞免疫沉淀的全長PKCθ的體外活性研究證明Thr538Glu突變體的活性是野生型酶的1/3(見Liu等人，Biochem.J.361255-265，2002)。這與如下發(fā)現(xiàn)一致磷酸基團的所有三個氧原子都參與與蛋白的直接離子相互作用，從而表明該位置的谷氨酸將僅提供磷酸氨基酸(phosphoamino acid)的部分模擬。總之，這些離子接觸可以穩(wěn)定磷酸化的活化環(huán)的構(gòu)象，類似于在PKA和PKB的活性狀態(tài)中觀察到的。
在PKC亞家族內(nèi)，在活化片段Thr的磷酸化在PKCθ、PKCε和PKCδ之間不同。與PKCθ和PKCε相反，PKCδ的活性不需要活化片段Thr。PKCδ可能利用附近的Glu500殘基來保持上面關(guān)于磷酸化的PKCθ激酶結(jié)構(gòu)域描述的一些離子相互作用。有趣的是，Glu500是PKCδ特有的并且在其他PKC同種型上沒有看到。與此一致并且再次與PKCθ相反，PKCδ上Thr向Glu酸替代與野生型相比僅增強激酶活性(見，Liu等人，Biochem.J.361255-265，2002)，這可能通過促進與蛋白的額外離子相互作用來實現(xiàn)。與PKCθ不同，PKCε活化片段Thr不能自磷酸化并且據(jù)報道被PDK-1磷酸化(見Cenni等人，Biochem.J.363537-545，2002，將其完整引入作為參考)。也已經(jīng)報道PDK-1與PKCθ結(jié)合(參見Liu等人，Biochem.J.361255-265，2002)。然而，PKCθ激酶結(jié)構(gòu)域可以自磷酸化活化片段Thr。
除了PKC新亞家族內(nèi)的不同之外，涉及活化環(huán)和螺旋αC之間結(jié)構(gòu)偶聯(lián)的相互作用的細(xì)節(jié)與其他AGC激酶包括PKA或者PKB相比在PKCθ中相當(dāng)不同。如同在其他激酶中的，αC螺旋將N-葉、C-葉和活性部位連接在一起。見圖1。螺旋的N-末端的不變谷氨酸殘基Glu428與催化中心中不變賴氨酸殘基Lys409形成離子對，并且與活化片段的保守的DFG基元直接接觸。K409R突變除去了PKCθ的催化活性(見Villalba和Altman，Current Cancer Drug Targets2125-137，2002，將其完整引入本文作為參考)。
在PKA和PKB兩者中，螺旋αC提供了與磷酸氨基酸接觸的堿性殘基(PKA中的His87和PKB中的His196)。在PKCθ中，結(jié)構(gòu)上等同的殘基是Cys424。由于該序列差異，在PKCθ中不存在等同離子對。相反，觀察到新的氫鍵模式，其將αC螺旋直接連接到活化片段，但是不連接磷酸基團。該配對方案涉及來自活化片段的N-末端部分的Glu528和來自αC螺旋的Arg430之間的靜電相互作用。從而，不變的組氨酸-磷酸蘇氨酸接觸以促進PKA和PKB中正確的葉取向的結(jié)構(gòu)作用可以在PKCθ中通過涉及Glu528和Arg430的備選離子對來實現(xiàn)。
PKCθ，如其他蛋白激酶一樣，具有兩個額外的保守磷酸化部位，稱作轉(zhuǎn)角(turn)基元(殘基657-685)和疏水基元(HM)FxxFS*(殘基691-695)。在PKCθ結(jié)構(gòu)中，對應(yīng)于轉(zhuǎn)角基元的區(qū)域完全無序。對殘基650-687沒有明顯確定的電子密度。殘基697-706也無序。與PKB的疏水基元(HM)(其具有17個非常有序的氨基酸殘基的一段序列)不同，PKCθ的HM明顯更短(殘基688-696)并且顯示出高B因子值，從而表明該片段中的無序。這些觀察一起表明PKCθ的轉(zhuǎn)角基元和HM在該具體晶體形式中或者由于不存在激酶底物都是內(nèi)在柔性的。
附著在PKCθ的Ser695的磷酸基團具有清晰的電子密度并且與Gln449形成兩個氫鍵-一個與其側(cè)鏈原子，而另一個與其主鏈酰胺氮。所觀察到的氫鍵模式與體外PKCθ活性分析結(jié)果一致。在全長PKCθ的該位置用谷氨酸替代絲氨酸(即Ser695Glu突變體)是PKCθHM磷酸化的令人滿意的模擬。全長PKCθSer695Glu具有野生型全長PKCθ的60％的催化活性(見，Liu等人，Biochem.J.，361255-265，2002)。
在HM基元和N-葉的疏水溝之間也有充分的疏水接觸。這些接觸涉及不變的苯丙氨酸殘基(Phe691和Phe694)和來自αB和αC螺旋和β5鏈的殘基(Lys413、Val416、Leu417、Val422、Met426、Lys429、Thr447、Leu454和Phe456)。這些相互作用一起在穩(wěn)定αB和αC螺旋的有序構(gòu)象中起重要的結(jié)構(gòu)作用。已表明PKA和PKB中的等同苯丙氨酸殘基對于這些酶的穩(wěn)定性和催化活性是必需的(見Balendran等人，Curr.Biol.9393-404，1999；和Alessi等人，EMBOJ.156541-6551，1996，將其每一篇都完整引入本文作為參考)。
PKCθ的HM磷酸化是最佳酶活性所必需的，從轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞免疫沉淀的全長PKCθSer695Ala突變體中激酶活性減小到1/5(見Liu等人，Biochem.J.361255-265，2002)。PKCθ突變體T538A已經(jīng)完全失去了其疏水基元的磷酸化，從而表明HM區(qū)代表自磷酸化部位。見Lang和Cohen，Sci.STKE 108RE17，2001；和Yang等人，Molecular Cell 91227-1240，2002，將它們的每一篇完整引入作為參考。通過大腸桿菌中表達的激酶結(jié)構(gòu)域的突變分析，我們已經(jīng)表明Ser695Ala催化結(jié)構(gòu)域突變體已經(jīng)完全失去了Thr538處的活化片段的磷酸化，從而提示PKCθ自磷酸化涉及如最初激活機理一樣的HM和活化片段磷酸化。
其他公開的AGC激酶的無活性和活性構(gòu)象，包括它們的磷酸化和非磷酸化或者部分磷酸化對應(yīng)物顯示出不同的結(jié)構(gòu)特征。除了在活化片段和C-末端疏水基元中看到的構(gòu)象改變之外，這些差異涉及與N-葉中αB和αC螺旋的結(jié)構(gòu)無序或者不一致有關(guān)的N-和C-葉的相對布置。如PKB和PKA(它們以它們的活性狀態(tài)結(jié)晶)一樣，PKCθ的αB和αC螺旋、活化片段和HM非常有序并且關(guān)于催化部位殘基對齊。這與無活性PKA和PKB的對應(yīng)區(qū)域相反，所述無活性PKA和PKB的對應(yīng)區(qū)域的特征是構(gòu)象無序或者結(jié)構(gòu)不一致。
此外，PKCθ與蛋白激酶的兩種迄今為止報道的主要構(gòu)象狀態(tài)(稱作“開放的”和“閉合的”)的詳細(xì)比較表明與星形孢菌素復(fù)合的PKCθ的激酶結(jié)構(gòu)域采取了獨特的部分閉合的構(gòu)象(見Biondi等人，EMBO J.214219-4228，2002，將其完整引入作為參考)。用兩種分類標(biāo)準(zhǔn)來區(qū)分開放和閉合構(gòu)象富含甘氨酸的環(huán)的開放(基于PKA結(jié)構(gòu)中的距離Ser53-Gly186)和αC螺旋的定位(基于His87和磷酸化Thr197之間的距離)。見Taylor等人，Annu.Rev.Cell.Biol.8429-62，1992，將其完整引入作為參考。為了避免與結(jié)構(gòu)上等同的位置處序列差異有關(guān)的可能的復(fù)雜性，并且因此使得這些標(biāo)準(zhǔn)適用于PKCθ，故改為測量對應(yīng)殘基的Cα原子之間的距離。該比較的結(jié)果表明，除了富含甘氨酸的環(huán)之外，PKCθ中葉的相對布置表明與“中間”激酶結(jié)構(gòu)的最大相似性PKA與抑制劑星形孢菌素或者balanol復(fù)合，而PDK1與ATP復(fù)合。從而，PKCθ的催化結(jié)構(gòu)域連同星形孢菌素結(jié)合后富含甘氨酸環(huán)的的完全閉合展示出“中間”構(gòu)象，即，部分閉合的構(gòu)象。
表2.PKCθ/星形孢菌素復(fù)合體的結(jié)構(gòu)坐標(biāo) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù))表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 表2(續(xù)) 其他實施方案在權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.組合物，其包含包括PKCθ多肽的晶體。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述PKCθ多肽包括PKCθ的催化結(jié)構(gòu)域。
3.權(quán)利要求1或者2任一項的組合物，其中所述PKCθ多肽基本上由PKCθ的催化結(jié)構(gòu)域組成。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述PKCθ多肽包含SEQ ID NO1的殘基377-696。
5.權(quán)利要求1-5任一項的組合物，其還包含結(jié)合于PKCθ的試劑。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述試劑是PKCθ底物。
7.權(quán)利要求5或者6任一項的組合物，其中所述試劑是PKCθ抑制劑。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中所述PKCθ抑制劑是星形孢菌素。
9.權(quán)利要求1-8任一項的組合物，其中所述晶體能夠衍射X-射線到至少3.5的分辨率。
10.權(quán)利要求1-9任一項的組合物，其中所述晶體的結(jié)構(gòu)包含表2的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，±不超過1.5的α碳的均方根偏差。
11.設(shè)計與PKCθ相互作用的試劑的方法，其包括產(chǎn)生PKCθ的三維模型。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述PKCθ的三維模型是PKCθ的催化結(jié)構(gòu)域的三維模型。
13.權(quán)利要求11或者12任一項的方法，其中所述三維模型包括PKCθ的原子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述結(jié)構(gòu)坐標(biāo)是實驗測定的坐標(biāo)。
15.權(quán)利要求13或者14任一項的方法，其中所述原子是PKCθ的活性部位的原子。
16.權(quán)利要求13-15任一項的方法，其中所述結(jié)構(gòu)坐標(biāo)根據(jù)表2，±不超過1.5的α碳原子的均方根偏差。
17.權(quán)利要求13的方法，其中所述三維模型包括試劑原子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。
18.權(quán)利要求17的方法，其還包括改變模型的試劑的結(jié)構(gòu)。
19.權(quán)利要求17或者18任一項的方法，其還包括改變模型的試劑的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。
20.權(quán)利要求11-19任一項的方法，其中所述三維模型包括選自PCKθ的殘基Leu386、Gly387、Gly389、Val394、Ala407、Lys409、Val422、Met458、Glu459、Tyr460、Leu461、Gly464、Leu466、Asp508、Asn509、Leu511、Ala521和Asp522的原子的原子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。
21.權(quán)利要求11-20任一項的方法，其中所述三維模型包括選自PCKθ的殘基Glu428、Arg503、Asp504、Lys527、Thr536和Thr538的原子的原子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。
22.權(quán)利要求11-21任一項的方法，其中所述三維模型包括選自PCKθ的殘基Lys413、Val416、Leu417、Val422、Met426、Lys429、Thr447、Gln449、Leu454、Phe456、Phe691、Arg692、Asn693、Phe694和Ser695的原子的原子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。
23.權(quán)利要求11-22任一項的方法，其還包括確定PKCθ和試劑之間的擬合。
24.權(quán)利要求23的方法，其中確定擬合包括計算PKCθ的原子和試劑的原子之間的距離。
25.權(quán)利要求17的方法，其還包括計算PKCθ的原子和試劑的原子之間的距離。
26.權(quán)利要求11-16任一項的方法，其還包括將試劑的三維模型與PKCθ的三維模型對接。
27.權(quán)利要求11-26任一項的方法，其還包括提供包括PKCθ多肽的組合物。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述PKCθ多肽是結(jié)晶的。
29.權(quán)利要求27或者28任一項的方法，其中所述組合物包括與PKCθ相互作用的試劑。
30.權(quán)利要求27-29任一項的方法，其還包括測定PKCθ的催化活性。
31.權(quán)利要求29的方法，其還包括測定PKCθ的催化活性，并比較在試劑存在下PKCθ的催化活性與不存在試劑時測定的PKCθ的催化活性。
32.設(shè)計與PKCθ相互作用的試劑的方法，其包括產(chǎn)生PKCθ的三維模型，所述模型包括PKCθ的原子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述三維模型包括選自殘基Leu386、Gly387、Gly389、Val394、Ala407、Lys409、Val422、Met458、Glu459、Tyr460、Leu461、Gly464、Leu466、Asp508、Asn509、Leu511、Ala521和Asp522的原子的原子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。
34.權(quán)利要求32或者33任一項的方法，其中所述三維模型包括選自殘基Glu428、Arg503、Asp504、Lys527、Thr536和Thr538的原子的原子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。
35.權(quán)利要求32-34任一項的方法，其中所述三維模型包括選自殘基Lys413、Val416、Leu417、Val422、Met426、Lys429、Thr447、Glu449、Leu454、Phe456、Phe691、Arg692、Asn693、Phe694和Ser695的原子的原子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。
36.權(quán)利要求32-35任一項的方法，其中所述結(jié)構(gòu)坐標(biāo)根據(jù)表2，±不超過1.5的α碳原子的均方根偏差。
37.設(shè)計與PKCθ相互作用的試劑的方法，其包括產(chǎn)生PKCθ的三維模型，所述模型包括PKCθ的催化結(jié)構(gòu)域的原子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述三維模型包括選自殘基Leu386、Gly387、Gly389、Val394、Ala407、Lys409、Val422、Met458、Glu459、Tyr460、Leu461、Gly464、Leu466、Asp508、Asn509、Leu511、Ala521和Asp522的原子的原子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。
39.權(quán)利要求37或者38任一項的方法，其中所述三維模型包括選自殘基Glu428、Arg503、Asp504、Lys527、Thr536和Thr538的原子的原子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。
40.權(quán)利要求37-39任一項的方法，其中所述三維模型包括選自殘基Lys413、Val416、Leu417、Val422、Met426、Lys429、Thr447、Glu449、Leu454、Phe456、Phe691、Arg692、Asn693、Phe694和Ser695的原子的原子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。
41.權(quán)利要求37-40任一項的方法，其中所述結(jié)構(gòu)坐標(biāo)根據(jù)表2，±不超過1.5的α碳原子的均方根偏差。
42.設(shè)計與PKCθ相互作用的試劑的方法，其包括產(chǎn)生結(jié)合于配體的PKCθ的三維模型。
43.鑒定能夠改變PKCθ的催化活性的試劑的方法，其包括
提供PKCθ的三維模型；和
研究第一種候選試劑與PKCθ的三維模型的相互作用。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述三維模型包括PKCθ的原子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述結(jié)構(gòu)坐標(biāo)根據(jù)表2，±不超過1.5的α原子碳的均方根偏差。
46.權(quán)利要求43-45任一項的方法，其還包括研究第二種候選試劑與PKCθ的三維結(jié)構(gòu)模型的相互作用。
47.權(quán)利要求43-46任一項的方法，其還包括在第一種候選試劑存在下測量PKCθ的催化活性。
48.權(quán)利要求46的方法，其還包括在第二種候選試劑的存在下測量PKCθ的催化活性。
49.鑒定能夠改變PKCθ的催化活性的試劑的方法，其包括
提供PKCθ的三維模型，所述模型包括PKCθ原子的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)；和
研究多種候選試劑與PKCθ的三維模型的相互作用；和
從所述多種候選試劑選擇經(jīng)預(yù)測改變PKCθ的催化活性的試劑。
50.方法，其包括
通過用結(jié)晶復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)進行推理性藥物設(shè)計來選擇試劑，其中該復(fù)合體包含PKCθ多肽；
將試劑與PKCθ多肽接觸；和
檢測試劑結(jié)合PKCθ多肽的能力。
51.方法，其包括
使PKCθ多肽與配體接觸以形成組合物；并
結(jié)晶所述組合物以形成結(jié)晶復(fù)合體，其中配體結(jié)合于PKCθ多肽，
其中結(jié)晶復(fù)合體可以衍射X-射線到至少約3.5的分辨率。
52.軟件系統(tǒng)，其包括導(dǎo)致計算機系統(tǒng)進行如下操作的指令
接受與結(jié)合于配體的PKCθ多肽的結(jié)構(gòu)有關(guān)的信息；
接受與候選試劑有關(guān)的信息；和
確定候選試劑與PKCθ多肽的結(jié)合特征，其中該確定是基于與結(jié)合于配體的PKCθ多肽的結(jié)構(gòu)有關(guān)的信息和與候選試劑有關(guān)的信息的。
53.存在于在其上存儲了許多指令的計算機可讀介質(zhì)上的計算機程序，其當(dāng)由一個或多個處理器執(zhí)行時，導(dǎo)致一個或多個處理器
接受與包含結(jié)合于配體的PKCθ多肽的復(fù)合體的結(jié)構(gòu)有關(guān)的信息；
接受與候選試劑有關(guān)的信息；和
確定候選試劑與PKCθ多肽的結(jié)合特征，其中該確定是基于與PKCθ多肽的結(jié)構(gòu)有關(guān)的信息和與候選試劑有關(guān)的信息的。
54.方法，其包括
接受與包含結(jié)合于配體的PKCθ的復(fù)合體的結(jié)構(gòu)有關(guān)的信息；和
對PKCθ與候選試劑的結(jié)合特征建模，
其中該方法通過軟件系統(tǒng)實現(xiàn)。
55.包含指令的軟件，所述指令用于
接受與包含結(jié)合于配體的PKCθ的復(fù)合體的結(jié)構(gòu)有關(guān)的信息；和
對PKCθ與候選試劑的結(jié)合特征建模，
其中該軟件在計算系統(tǒng)上執(zhí)行。
56.權(quán)利要求55的軟件，其在計算機可讀介質(zhì)上具體化。
57.存在于在其上存儲了許多指令的計算機可讀介質(zhì)上的計算機程序，其當(dāng)由一個或多個處理器執(zhí)行時，導(dǎo)致一個或多個處理器
接受與包含結(jié)合于配體的PKCθ多肽的復(fù)合體的結(jié)構(gòu)有關(guān)的信息；和
對PKCθ多肽與候選試劑的結(jié)合特征建模。
58.包含指令的軟件系統(tǒng)，所述指令用于導(dǎo)致計算機系統(tǒng)
接受與包含結(jié)合于配體的PKCθ多肽的復(fù)合體的結(jié)構(gòu)有關(guān)的信息；和
對PKCθ多肽與候選試劑的結(jié)合特征建模。
59.調(diào)節(jié)受試者中PKCθ活性的方法，其包括
使用推理性藥物設(shè)計來選擇能夠調(diào)節(jié)PKCθ活性的試劑；和
對受試者施用治療有效量的該試劑。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述試劑能夠在體內(nèi)抑制或者減小PKCθ激酶活性。
61.權(quán)利要求59或60任一項的方法，其中所述推理性藥物設(shè)計包括使用包括PKCθ多肽的結(jié)晶復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述結(jié)晶復(fù)合體還包括配體。
63.權(quán)利要求62的方法，其中所述配體是星形孢菌素。
64.治療患有與PKCθ活性有關(guān)的狀況的受試者的方法，其包括
使用推理性藥物設(shè)計選擇能夠影響PKCθ活性的試劑；和
對需要其的受試者施用治療有效量的所述試劑。
65.權(quán)利要求64的方法，其中所述試劑能夠抑制PKCθ活性。
66.權(quán)利要求64或者65任一項的方法，其中所述試劑能夠在體內(nèi)抑制PKCθ激酶活性。
67.權(quán)利要求64-66任一項的方法，其中所述狀況是T細(xì)胞介導(dǎo)的病癥。
68.權(quán)利要求67的方法，其中所述T細(xì)胞介導(dǎo)的病癥是白血病或者自身免疫病。
69.預(yù)防性治療對與PKCθ活性相關(guān)的狀況易感的受試者的方法，其包括
確定該受試者對與PKCθ活性相關(guān)的狀況易感；
使用推理性藥物設(shè)計來選擇能夠影響PKCθ活性的試劑；和
對該受試者施用治療有效量的所述試劑。
70.權(quán)利要求69的方法，其中所述試劑能夠在體內(nèi)抑制PKCθ激酶活性。
71.權(quán)利要求69或者70任一項的方法，其中所述狀況是T細(xì)胞介導(dǎo)的病癥。
72.權(quán)利要求71的方法，其中所述T細(xì)胞介導(dǎo)的病癥是白血病或者自身免疫病。
73.根據(jù)權(quán)利要求42到51任一項設(shè)計或者鑒定的試劑在制備用于預(yù)防或者治療與PKCθ活性相關(guān)的狀況的藥物中的用途。
74.權(quán)利要求73的用途，其中該試劑能夠抑制PKCθ活性。
75.權(quán)利要求74的用途，其中所述試劑能夠在體內(nèi)抑制PKCθ激酶活性。
76.權(quán)利要求73、74或者75任一項的用途，其中所述狀況是T細(xì)胞介導(dǎo)的病癥。
77.權(quán)利要求76的用途，其中所述T細(xì)胞介導(dǎo)的病癥是白血病或者自身免疫病。
78.根據(jù)權(quán)利要求43到52任一項鑒定或者設(shè)計的試劑，其用于預(yù)防或者治療與PKCθ活性有關(guān)的狀況。
79.權(quán)利要求78的試劑，其中所述試劑能夠抑制PKCθ活性。
80.權(quán)利要求78的試劑，其中所述試劑能夠在體內(nèi)抑制PKCθ激酶活性。
81.權(quán)利要求78、79或者80任一項的試劑，其中所述狀況是T細(xì)胞介導(dǎo)的病癥。
82.權(quán)利要求81的試劑，其中所述T細(xì)胞介導(dǎo)的病癥是白血病或者自身免疫病。
全文摘要
蛋白激酶Cθ(PKCθ)的三維結(jié)構(gòu)可以用于設(shè)計與PKCθ相互作用的試劑的方法中。該試劑可以是PKCθ活性的抑制劑。
文檔編號C12N9/00GK1977041SQ200580018488
公開日2007年6月6日 申請日期2005年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月7日
發(fā)明者Z·B·徐, S·奧蘭德, S·沃爾夫羅姆, K·馬拉基安, L·林, M·斯塔爾, J·李, L·費茨, R·格雷科, D·喬哈里, W·S·索默斯, L·莫斯亞克 申請人:惠氏公司