專(zhuān)利名稱(chēng)：具有長(zhǎng)中空件的電穿孔裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有長(zhǎng)中空件的電穿孔裝置以及電穿孔方法，由此將一個(gè)電脈沖或多個(gè)電脈沖施加到包括細(xì)胞的樣本，將細(xì)胞膜電打孔，從而使外來(lái)物質(zhì)可以進(jìn)入細(xì)胞。
背景技術(shù)：
一般地，電穿孔是一種通過(guò)電脈沖使不能穿透細(xì)胞膜的大分子進(jìn)入細(xì)胞的技術(shù)。電穿孔是直接應(yīng)用于細(xì)胞試驗(yàn)和基因治療的廣泛使用并且強(qiáng)烈推薦的方法。如果施加強(qiáng)的電場(chǎng)，則細(xì)胞膜暫時(shí)變成多孔的，對(duì)外來(lái)物質(zhì)表現(xiàn)出滲透性。
所述的電通透作用(electropermeabilization)取決于多種因素，例如脈沖寬度、脈沖持續(xù)時(shí)間、脈沖數(shù)量和其它試驗(yàn)條件。為了理解電穿孔的機(jī)理并加強(qiáng)轉(zhuǎn)染效果，很多研究者對(duì)于上述參數(shù)進(jìn)行了多方面的研究。據(jù)報(bào)導(dǎo)，電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)于穿透細(xì)胞膜并控制傳染發(fā)生的細(xì)胞區(qū)域的范圍，是起到?jīng)Q定性參數(shù)的作用。當(dāng)然，對(duì)其它參數(shù)的研究也取得進(jìn)步。但是，對(duì)細(xì)胞相對(duì)電脈沖的響應(yīng)以及轉(zhuǎn)染的機(jī)理知道很少。由于對(duì)電穿孔理論的缺乏和不足，清楚地看見(jiàn)電穿孔已經(jīng)成為一項(xiàng)重要事情。
參看圖1，為了將電場(chǎng)作用于細(xì)胞懸浮液和基因的混合物，通常使用裝有兩個(gè)平行電極板200的試管。如果對(duì)電極板200施加強(qiáng)電場(chǎng)，可以使基因進(jìn)入細(xì)胞。一次性試管使用鋁電極。
但是，據(jù)報(bào)導(dǎo)，從鋁電極溶解的Al3+離子對(duì)細(xì)胞有不利影響。此外，如果使用鋁電極，由于電極氧化層之間的電壓下降會(huì)使電場(chǎng)強(qiáng)度改變。因此，優(yōu)選地使用鉑電極或金電極。但是，這些材料的電極很貴，因此實(shí)際上難以使用這些材料的電極作為一次或幾次使用后丟棄的試管的電極。圖2是代表傳統(tǒng)電穿孔裝置的方波電穿孔裝置(ECM830，BTX，USA)的照片。
但是，所示的電穿孔裝置具有以下缺點(diǎn)，首先，試管太貴，因?yàn)槭褂娩X塊作為電極。電穿孔裝置的制造商推薦試管使用一次，但是，很多用戶反復(fù)多次進(jìn)行試驗(yàn)，因此出現(xiàn)試驗(yàn)誤差的幾率高。其次，因?yàn)殡姌O材料(Al)在溶液中是反應(yīng)的，并且相對(duì)產(chǎn)生氫的超電勢(shì)(overpotential)低，因此由于水在電極表面分解所述電極容易生成氣泡。第三，產(chǎn)生的離子(Al3+)對(duì)細(xì)胞具有不利作用。第四，由于生成氧化層(Al2O3)，表面電阻明顯增大。第五，電場(chǎng)不均勻。這是因?yàn)榇罅侩娏髁鬟^(guò)電極的角，從而形成電場(chǎng)扭曲。第六，樣本體積變大，使其不適合分析少量細(xì)胞。第七，樣本裝入和倒出試管需要多個(gè)步驟的樣品處理。第八，因?yàn)椴蝗菀讓⒃嚬芴幚磉^(guò)程集成到自動(dòng)化系統(tǒng)中，所以不可能進(jìn)行高通量的電穿孔。第九，水在電極表面的分解引起嚴(yán)重的pH值變化，這對(duì)細(xì)胞有害。因此，對(duì)開(kāi)發(fā)克服上述不足的新電穿孔裝置的需求上升。
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)使用了具有不導(dǎo)電材料的長(zhǎng)中空樣本填充件的電穿孔裝置，其中對(duì)樣本填充件的兩個(gè)末端施加電脈沖，從而電流流過(guò)填充在樣本填充件中的樣本。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)使用這種電穿孔儀并進(jìn)行電穿孔，并將其生物學(xué)結(jié)果與傳統(tǒng)電穿孔法對(duì)比，以完成本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種使用長(zhǎng)中空樣本填充件的電穿孔法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種電穿孔裝置。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種電穿孔系統(tǒng)。
本發(fā)明涉及一種電穿孔法，其中通過(guò)對(duì)樣本施加電場(chǎng)使細(xì)胞膜電穿孔而使外來(lái)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞。更具體地，本發(fā)明涉及一種電穿孔法、一種電穿孔裝置和一種電穿孔系統(tǒng)，其中使用不導(dǎo)電材料的長(zhǎng)中空樣本填充件執(zhí)行電穿孔，并通過(guò)從電極兩個(gè)末端由電極施加電脈沖，使樣本填充件內(nèi)有效地實(shí)現(xiàn)電穿孔。
在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，提供一種電穿孔裝置，包括中空樣本填充件、貯存器和壓力保持裝置，壓力保持裝置連接到樣本填充件的一個(gè)末端，與該末端流體連通，并提供適當(dāng)?shù)膲毫κ箻颖颈３衷跇颖咎畛浼?，從而將樣本供?yīng)到樣本填充件。根據(jù)本發(fā)明的電穿孔裝置的構(gòu)成方式為樣本填充件末端和壓力保持裝置可以直接連接或通過(guò)接頭(例如，T形接頭或Y形接頭)連接。
如果壓力保持裝置通過(guò)接頭連接到樣本填充件，則接頭側(cè)面具有用于插入電極的電極插入部分，并且如果樣本填充件中填充樣本，則插入電極插入部分的電極接觸樣本。根據(jù)本發(fā)明的電穿孔裝置的壓力保持裝置可以是泵、注射器或移液管。在使用根據(jù)本發(fā)明的電穿孔裝置進(jìn)行電穿孔時(shí)，通過(guò)使用壓力保持裝置，首先將含有細(xì)胞的樣本填充到樣本填充件中。將電解液注入已經(jīng)插入電極的貯存器，并連接電穿孔裝置的中空樣本填充件的末端，使其與貯存器的電解液流體連通。另外，對(duì)貯存器的電極以及插入接頭的電極施加電脈沖，從而使填充在樣本填充件中的樣本中的細(xì)胞電穿孔。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，電穿孔裝置根據(jù)本發(fā)明包括中空樣本填充件、貯存器、貯存夾持器和壓力保持裝置，其構(gòu)成方式是，壓力保持裝置是移液管；所述移液管在其主體上形成導(dǎo)電接觸；并且處于樣本填充件內(nèi)的可運(yùn)動(dòng)電極與活塞配合，并且容易拆卸和安裝?？蛇\(yùn)動(dòng)電極起到柱塞的功能，將樣本注入樣本填充件，同時(shí)作為通過(guò)導(dǎo)電接觸電連接樣本的電極。移液管尖端包括樣本填充件和可運(yùn)動(dòng)電極，可運(yùn)動(dòng)電極在移液管尖端中往復(fù)運(yùn)動(dòng)，并直接連接到安裝移液管尖端的軸。如果移液管活塞的工作使可運(yùn)動(dòng)電極在移液管尖端內(nèi)部水平運(yùn)動(dòng)并且使樣本注入樣本填充件中，則樣本接觸可運(yùn)動(dòng)電極并電連接到移液管主體的導(dǎo)電接觸。在優(yōu)選實(shí)施例中，另一個(gè)電極處于貯存器的底部表面，在此處電極接觸貯存的電解液或樣本，并且該電極可以裝到圓柱形貯存夾持器內(nèi)管并與之分離。貯存夾持器上面具有固定移液管和貯存器的固定部分，通過(guò)內(nèi)管連接到貯存器電極的電極端子。貯存夾持器的構(gòu)成可以分開(kāi)成為主體和蓋，或者可以按整體方式構(gòu)成。
如上所述，本發(fā)明提供包括電穿孔裝置和電脈沖發(fā)生器的電穿孔系統(tǒng)。
在根據(jù)本發(fā)明的電穿孔系統(tǒng)中，如果電脈沖施加到接觸貯存器中貯存的電解液或樣本的一個(gè)電極以及插入接頭或與活塞配合工作的另一個(gè)電極，則將樣本填充件中填充的樣本包含的細(xì)胞電穿孔。
此外，根據(jù)本發(fā)明的中空樣本填充件可以按通道結(jié)構(gòu)制成。通道是通過(guò)結(jié)合上板和下板整體形成的，其中通道的兩個(gè)末端按流體連通方式連接到一對(duì)井形的貯存器。如果樣本注入一個(gè)井中并通過(guò)毛細(xì)管作用、水頭壓力或抽吸作用填充在通道中，并且過(guò)量的樣本填充到另一井，則對(duì)通道內(nèi)的細(xì)胞電穿孔的方式是，將一對(duì)電極插入相應(yīng)井中，由此將電場(chǎng)施加到通道中。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的電穿孔方法包括以下步驟利用壓力保持裝置、毛細(xì)管作用或水頭壓力將樣本填充到樣本填充件內(nèi)；將電穿孔裝置的樣本填充件的兩個(gè)末端按流體連通方式連接到貯存器中貯存的樣本或電解液中；以及將電極插入每個(gè)貯存器并對(duì)插入的電極施加電脈沖，將樣本填充件中填充的樣本的細(xì)胞電穿孔。如果樣本太少，優(yōu)選地，在將電極插入貯存器以及將樣本電連接到電極之前，將裝有樣本的貯存器替換為僅裝有電解液的貯存器。
優(yōu)選地，樣本填充件和貯存器是不導(dǎo)電材料，從而使用透明塑料或玻璃。因此，聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、環(huán)烯烴共聚物(Cyclicolefin Copolymer，COC)、聚苯乙烯(PS)、聚乙烯(PE)、共聚酯熱塑性合成橡膠(Copolyster Thermoplastic Elastomer，TPC)、聚酰亞胺、聚丙烯、硅、玻璃、石英或類(lèi)似物質(zhì)用作樣本填充件和貯存器的材料，但不限于此。此外，具有上述微通道樣本填充件的電穿孔裝置，可以容易地與混合、過(guò)濾、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或毛細(xì)管電泳的其它系統(tǒng)集成。
典型的塑料作為中空樣本填充件和貯存器的材料具有明顯的優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)使用這些材料，容易制造根據(jù)本發(fā)明的微通道裝置。此外，這些材料成本合理，透明并且適于活體。如果使用透明塑料，則可以實(shí)時(shí)觀察物質(zhì)被吸入細(xì)胞的過(guò)程。結(jié)果，可以直觀觀察到基因轉(zhuǎn)移到活細(xì)胞中的過(guò)程。
并且，根據(jù)本發(fā)明的另一種電穿孔方法包括以下步驟使用壓力保持裝置，例如注射器或泵，用樣本填充該樣本填充件內(nèi)部；將電穿孔裝置的樣本填充件末端按流體連通方式連接到樣本或電解液；通過(guò)將一個(gè)電極插入貯存器，將另一電極插入用于連接壓力保持裝置和樣本填充件的接頭的電極插入部分，并對(duì)插入的電極施加電脈沖，將樣本填充件中填充的樣本的細(xì)胞電穿孔。如果樣本太少，優(yōu)選地，在將電極插入貯存器以及接觸樣本之前，將裝有樣本的貯存器替換為僅裝有電解液的貯存器。
根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)電穿孔方法包括以下步驟使用移液管型壓力保持裝置將樣本填充到樣本填充件內(nèi)；用電解液填充貯存器并將其插入貯存夾持器；將移液管型壓力保持裝置插入貯存夾持器并通過(guò)固定部分將其固定，并樣本填充件的末端按流體連通方式連接到樣本或電解液；以及通過(guò)對(duì)裝在貯存器的電極和移液管中的可運(yùn)動(dòng)電極施加電脈沖，對(duì)樣本填充件中填充的樣本的細(xì)胞電穿孔。如果樣本太少，優(yōu)選地，在將電極插入貯存器以及接觸樣本之前，將裝有樣本的貯存器替換為僅裝有電解液的貯存器。
此外，通過(guò)調(diào)節(jié)樣本的維持和取出以便使中空樣本填充件內(nèi)連續(xù)執(zhí)行，本發(fā)明可以連續(xù)執(zhí)行電穿孔。
在根據(jù)本發(fā)明的電穿孔裝置、電穿孔系統(tǒng)或電穿孔方法中，電極可以由任何的導(dǎo)電材料制成，并且優(yōu)選地使用鉑電極、金電極、銀電極、銅電極或鍍有上述金屬的塑料。此外，壓力保持裝置可以是泵、注射器或移液管。中空樣本填充件優(yōu)選的是毛細(xì)管、管或通道。在通道的情況下，優(yōu)選的是微通道。特別是，樣本填充件具有樣本填充件縱向長(zhǎng)度(L，cm)與水平截面積(A，cm)之比(R，cm-1)在1/50到1/10000范圍內(nèi)。
通過(guò)容易地測(cè)量流過(guò)樣本填充件的電流，可以電測(cè)量與細(xì)胞的電穿孔狀態(tài)有關(guān)的信息。根據(jù)本發(fā)明的電穿孔裝置可以有效地用于DNA傳遞第一步的電穿孔，并能有助于研究電穿孔機(jī)理。并且，電穿孔裝置可以在基因操作中小型化。


圖1表示根據(jù)傳統(tǒng)電穿孔裝置裝有平行鋁電極板的試管；圖2是方波電穿孔裝置(ECM830，BTX，USA)的傳統(tǒng)電穿孔裝置的照片；圖3表示根據(jù)本發(fā)明電穿孔系統(tǒng)一個(gè)實(shí)施例的結(jié)構(gòu)；圖4表示根據(jù)本發(fā)明電穿孔系統(tǒng)一個(gè)實(shí)施例的結(jié)構(gòu)；圖5表示根據(jù)本發(fā)明電穿孔裝置中圓盤(pán)狀接頭和毛細(xì)管之間的連接狀態(tài)；圖6表示根據(jù)本發(fā)明電穿孔系統(tǒng)一個(gè)實(shí)施例的結(jié)構(gòu)；圖7表示根據(jù)本發(fā)明電穿孔系統(tǒng)另一個(gè)實(shí)施例的結(jié)構(gòu)；圖8表示根據(jù)本發(fā)明電穿孔系統(tǒng)再一個(gè)實(shí)施例的結(jié)構(gòu)；圖9表示用于本發(fā)明電穿孔裝置的移液管的結(jié)構(gòu)；圖10表示圖9移液管的部分放大圖；圖11(a)和11(b)表示用于圖9移液管的樣本填充件和可移動(dòng)電極；
圖12表示用于根據(jù)本發(fā)明電穿孔裝置的貯存器和貯存夾持器的結(jié)構(gòu)圖13表示根據(jù)本發(fā)明電穿孔系統(tǒng)一個(gè)實(shí)施例的結(jié)構(gòu)；圖14表示根據(jù)本發(fā)明具有通道結(jié)構(gòu)的電穿孔裝置的透視圖；圖15是圖14電穿孔裝置的剖視圖；圖16、17和18表示根據(jù)本發(fā)明電穿孔裝置的一個(gè)實(shí)施例；圖19是用本發(fā)明的電穿孔裝置電穿孔后的細(xì)胞顯微照片，其中細(xì)胞是用明場(chǎng)觀察的；圖20是用熒光觀察到的、與圖19相同區(qū)域的細(xì)胞的照片；圖21是用現(xiàn)有技術(shù)電穿孔裝置電穿孔后的細(xì)胞顯微照片，其中細(xì)胞是用明場(chǎng)觀察的；圖22是在熒光下觀察到的、與圖21相同區(qū)域的細(xì)胞照片；圖23是表示使用本發(fā)明的電穿孔裝置電穿孔時(shí)，樣本填充件形狀與電穿孔效率之間關(guān)系的曲線；圖24到33是表示使用本發(fā)明的電穿孔裝置電穿孔時(shí)，樣本填充件形狀與電穿孔效率之間關(guān)系的顯微照片；圖34是表示根據(jù)本發(fā)明對(duì)不同細(xì)胞進(jìn)行電穿孔并通過(guò)綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)得到轉(zhuǎn)染率(熒光表達(dá)的細(xì)胞數(shù)/存活細(xì)胞數(shù))的曲線；圖35是表示圖34結(jié)果的顯微照片；圖36表示通過(guò)本發(fā)明的電穿孔同時(shí)將GFPsiRNA和pEGFP轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中以及顯微鏡測(cè)得的其GFP表達(dá)的結(jié)果；圖37表示當(dāng)使用裝有傳統(tǒng)Al電極的試管執(zhí)行電穿孔時(shí)施加電脈沖之前(a)和之后(b)的Al電極表面；圖38表示在100微米(μm)寬的微通道中的碘化丙錠(propidium iodide，PI)注射過(guò)程；圖39是借助兩個(gè)微通道的電穿孔通過(guò)PI注射的細(xì)胞的顯微照片，其中兩個(gè)微通道分別具有100μm(a)和500μm(b)的不同通道寬度；圖40是對(duì)比不同通道寬度的PI光散射強(qiáng)度的曲線；圖41表示兩個(gè)微通道電穿孔之前和之后的細(xì)胞尺寸變化，兩個(gè)微通道分別具有150μm(a)和500μm(b)的不同通道寬度；圖42表示分別在50μm(a)、150μm(b)、200μm(c)和250μm(d)不同通道寬度的微通道中將細(xì)胞培養(yǎng)七天得到的結(jié)果；圖43(a)是0.75千伏/厘米(kV/cm)電場(chǎng)作用10毫秒(ms)和24小時(shí)后通過(guò)細(xì)胞明場(chǎng)觀察到的照片，圖43(b)是0.4kV/cm電場(chǎng)作用10ms和24小時(shí)后通過(guò)重疊細(xì)胞明場(chǎng)和熒光觀察到的照片；以及43(c)是熒光下觀察到的圖43(b)細(xì)胞的照片。
具體實(shí)施例方式
下面將參考附圖詳細(xì)說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明的電穿孔裝置、電穿孔系統(tǒng)和電穿孔方法。在所有附圖中，為了避免繁瑣，不再重復(fù)對(duì)相似或等價(jià)部分或零件的解釋。雖然聯(lián)系某些優(yōu)選實(shí)施例描述了本發(fā)明，但應(yīng)該理解的是，本發(fā)明包含的主旨不并限于這些具體的實(shí)施例。相反，本發(fā)明的主旨包括權(quán)利要求精神和范圍內(nèi)包含的替換、修改和等價(jià)條款。本發(fā)明引用的文件作為參考文獻(xiàn)結(jié)合在本發(fā)明中。
圖3表示根據(jù)本發(fā)明電穿孔系統(tǒng)一個(gè)實(shí)施例的結(jié)構(gòu)。該電穿孔系統(tǒng)包括用于產(chǎn)生電脈沖的脈沖發(fā)生器100；貯存樣本的一對(duì)貯存器(reservoir)300；以及樣本填充件400，例如其中填充樣本的毛細(xì)管或管子。這對(duì)貯存器300通過(guò)樣本填充件400連接使流體連通。在這對(duì)貯存器300中分別插入連接脈沖發(fā)生器100的電極200。通過(guò)對(duì)電極200施加電場(chǎng)，將填充在樣本填充件400中的樣本的細(xì)胞電穿孔。此時(shí)，樣本填充件400可以是兩個(gè)末端都開(kāi)口，或者僅在任一個(gè)末端開(kāi)口。換句話說(shuō)，只要樣本填充件400適于填充樣本并且可以在其兩個(gè)末端施加電場(chǎng)，樣本填充件的任何部分開(kāi)口都是可以的。
圖4表示根據(jù)本發(fā)明電穿孔系統(tǒng)一個(gè)實(shí)施例的結(jié)構(gòu)。該電穿孔系統(tǒng)包括單個(gè)貯存器(未圖示)；諸如毛細(xì)管或管子的中空樣本填充件400；以及壓力保持裝置的注射器600，該注射器連接在樣本填充件400的末端，用于保持適當(dāng)?shù)膲毫?，使樣本填充件可以在其?nèi)部填充樣本。在圖4的電穿孔系統(tǒng)中，樣本填充件400的末端和壓力保持裝置600通過(guò)T形接頭510連接。T形接頭510具有電極插入部分512，電極200插入該電極插入部分中以施加電脈沖。向樣本填充件400中填充樣本，并且電極200接觸樣本。適配器511將樣本填充件400末端連接到接頭510，并將接頭510連接到壓力保持裝置600。
圖5表示根據(jù)本發(fā)明的圓盤(pán)形接頭520和樣本填充件400之間的連接狀態(tài)，其中圓盤(pán)形接頭520用于在電穿孔裝置中連接樣本填充件和壓力保持裝置。圖5的圓盤(pán)形接頭520中具有孔521，樣本可以經(jīng)過(guò)這個(gè)孔。在圓盤(pán)側(cè)面形成電極插入部分512。L形電極220插入電極插入部分512，從而如果在樣本填充件400中填充樣本，則電極接觸樣本。
圖6表示根據(jù)本發(fā)明電穿孔系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施例。該電穿孔系統(tǒng)包括貯存器300、如圖4所示的電穿孔裝置，以及用于產(chǎn)生電脈沖的脈沖發(fā)生器100。樣本包括貯存在貯存器300中的細(xì)胞或電解液。電極200插入貯存器300以接觸樣本。此外，形成連接的方式是，樣本填充件400的末端流體地連通貯存器的樣本。在執(zhí)行電穿孔時(shí)，泵620控制的注射器600作為壓力保持裝置，使樣本填充件400內(nèi)部充滿樣本。此時(shí)，在樣本填充件400充滿樣本后，可以用填充電解液的貯存器替換填充樣本的貯存器。通過(guò)在接觸貯存器400中貯存的樣本或電解液的電極200和插入接頭520的電極之間施加電脈沖，將填充在樣本填充件400中的樣本的細(xì)胞電穿孔。
圖7表示本發(fā)明電穿孔系統(tǒng)的另一個(gè)實(shí)施例，其中泵620作為壓力保持裝置，其連接是與樣本填充件的末端流體地相通。因此，樣本填充件400通過(guò)接頭520連接到泵620。
圖8表示根據(jù)本發(fā)明的電穿孔系統(tǒng)的另一個(gè)實(shí)施例，其中移液管630作為壓力保持裝置，與樣本填充件流體地相通。在此圖中，樣本填充件400通過(guò)接頭520連接到移液管630。
圖9表示用于根據(jù)本發(fā)明的電穿孔裝置的移液管的結(jié)構(gòu)，其中移液管630作為壓力保持裝置，與樣本填充件流體地相通。圖10表示與可運(yùn)動(dòng)電極230b和樣本填充件440的移液管630連接的局部放大圖。樣本填充件440直接連接到移液管尖端安裝軸631。作為壓力保持裝置的移液管630在其主體上具有導(dǎo)電接觸632，可運(yùn)動(dòng)電極230b插入樣本填充件并裝在移液管中，從而與移液管的活塞634相通，并在樣本填充件中往復(fù)運(yùn)動(dòng)。圖11(a)和(b)表示用于移液管的樣本填充件440和可運(yùn)動(dòng)電極230b。
圖12表示用于本發(fā)明電穿孔裝置的貯存器330和貯存夾持器340的結(jié)構(gòu)。貯存夾持器340在上內(nèi)管壁形成固定移液管的移液管固定部分640，而且還具有電連接到固定部分640的電極端子250b和在其底部形成的其它電極端子250a。貯存器在其下方裝有接觸電解液或樣本的電極230a。如果移液管630固定在貯存夾持器的移液管固定部分640上，則可運(yùn)動(dòng)電極230b、移液管接觸632和移液管固定部分640電連接在一起。在執(zhí)行電穿孔時(shí)，用移液管吸取樣本并填充到樣本填充件440，裝有電解液的貯存器330插入貯存夾持器340的內(nèi)管，移液管固定地插在移液管固定部分640中，使移液管的末端與貯存器的電解液流體地相通，并通過(guò)貯存夾持器340的電極端子250a、250b對(duì)兩個(gè)電極230a、230b施加電脈沖，使樣本填充件中的細(xì)胞電穿孔。在電穿孔之后，將移液管與貯存器和貯存夾持器分離，并按下移液管按鈕633，以便容易重新吸取電穿孔的細(xì)胞。貯存夾持器340可以制成上蓋340a和主體340b之間可分離(見(jiàn)圖12)，或者可以制成整體。樣本填充件可拆卸地連接到移液管尖端安裝軸631，從而可以制成一次性的(見(jiàn)圖10)。此外，可以使用所述穿孔儀器和電脈沖發(fā)生器制成自動(dòng)電穿孔系統(tǒng)。圖13表示根據(jù)本發(fā)明的電穿孔系統(tǒng)的另一個(gè)實(shí)施例，其中并行排列有一個(gè)或多個(gè)電穿孔裝置，每個(gè)包括連接到注射器型壓力保持裝置的樣本填充件。
圖14是根據(jù)本發(fā)明具有微通道結(jié)構(gòu)的樣本填充件和井形貯存器的電穿孔裝置的透視圖。該電穿孔裝置包括由上板350a和下板350b構(gòu)成的基體，上面形成微通道中空樣本填充件和成對(duì)的井，所述井與樣本填充件的兩個(gè)末端流體地相通連接。圖15是沿圖14的線A-A’截取的剖視圖。該電穿孔裝置在其兩側(cè)形成用于插入脈沖發(fā)生器電極的一對(duì)或多對(duì)井(351a-355a，351b-355b)，從而對(duì)包括細(xì)胞的樣本施加電脈沖，其中形成微通道(451-455)以連接相應(yīng)的井(351a-351b，352a-352b，353a-353b，354a-354b，355a-355b)。通過(guò)將電極插入井中并施加電脈沖，可以對(duì)細(xì)胞膜電穿孔，并且使外來(lái)物質(zhì)可以進(jìn)入細(xì)胞。在上述電穿孔裝置中，每個(gè)通道的通道長(zhǎng)度不同。因此即使向脈沖發(fā)生器的電極施加相同電壓，每個(gè)通道的電場(chǎng)強(qiáng)度也是不同的。
電場(chǎng)強(qiáng)度可以通過(guò)下面的式1得到E＝V/L (1)式中，E是施加的電場(chǎng)強(qiáng)度，V是電極兩端的電壓差，以及L是通道長(zhǎng)度。
結(jié)果，即使在微通道兩端施加相同電壓，由于通道長(zhǎng)度不同也得到相互不同的電場(chǎng)。
具有微通道樣本填充件的上述電穿孔裝置可以制成整體，或者可以通過(guò)連接玻璃基體或塑料基體制成。在通過(guò)連接塑料基體制成電穿孔裝置時(shí)，優(yōu)選地，電穿孔裝置應(yīng)包括上基板350a和下基板350b，其中上基板具有形成井的孔，上或下基板形成凹陷的通道。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的電穿孔裝置形成的樣本填充件的長(zhǎng)度為1毫米(mm)-10厘米(cm)。更優(yōu)選地，樣本填充件的長(zhǎng)度為1cm-5cm。優(yōu)選地，如果樣本填充件具有通道結(jié)構(gòu)，則其通道的高度為2μm-2mm，其寬度為10μm-10mm。更優(yōu)選地，通道的高度為20μm-200μm，其寬度為100μm-5mm。根據(jù)本發(fā)明具有通道結(jié)構(gòu)的電穿孔裝置可以通過(guò)微型電子機(jī)械系統(tǒng)(Micro Electronic Mechanical System，MEMS)技術(shù)制造。
圖16(a)、(b)、(c)和(d)表示根據(jù)本發(fā)明的電穿孔裝置的各種結(jié)構(gòu)。圖16(a)到(c)表示在其兩側(cè)形成用于插入脈沖發(fā)生器的電極的幾對(duì)井的結(jié)構(gòu)，并且每對(duì)井形成一個(gè)通道，通道形成連接多對(duì)井的空間并填充樣本。特別是，圖16(c)表示的電穿孔裝置中的井的排列方式是每對(duì)井的距離不同。
圖16(d)所示的電穿孔裝置在其兩側(cè)形成插入脈沖發(fā)生器電極的一對(duì)井，還形成連接這對(duì)井并填充樣本的多個(gè)通道。
圖17所示的電穿孔裝置在其兩側(cè)形成插入脈沖發(fā)生器電極的成對(duì)井，并且每對(duì)井形成一個(gè)通道，其中每個(gè)通道的寬度彼此不同。如果樣本填充件的每個(gè)通道的通道長(zhǎng)度不同，則每個(gè)通道可以施加不同的電場(chǎng)。
圖18(a)和18(b)所示的電穿孔裝置是，連接相應(yīng)井的每個(gè)通道的長(zhǎng)度和寬度都不同。根據(jù)本發(fā)明的電穿孔裝置是，在相同電場(chǎng)下，與傳統(tǒng)電穿孔裝置相比，流過(guò)很小的電流，因?yàn)殡娏鲀H流過(guò)中空的樣本填充件。結(jié)果，可以減小功率消耗，并且如果需要，可以為了便攜目的制成使用電池作為電源。
下面將說(shuō)明使用根據(jù)本發(fā)明的電穿孔裝置和電穿孔系統(tǒng)的電穿孔實(shí)驗(yàn)和生物學(xué)結(jié)果。
優(yōu)選實(shí)施例1使用移液管型電穿孔裝置的人胚腎HEK-293細(xì)胞株(cell line)的電穿孔實(shí)驗(yàn)
1-1細(xì)胞制備HEK-293細(xì)胞株(ATCC，CRL-1573)在25平方厘米(cm2)培養(yǎng)瓶中貯存在補(bǔ)充10％胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的培養(yǎng)基中，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并培養(yǎng)到70％匯集(confluency)。接著，移去上述培養(yǎng)基，用磷酸緩沖溶液(PBS)清洗細(xì)胞，并胰蛋白酶處理。加入補(bǔ)充FBS的培養(yǎng)基并離心，然后用PBS緩沖溶液清洗細(xì)胞，并再次在補(bǔ)充10％FBS的培養(yǎng)基中懸浮，制成細(xì)胞樣本。
1-2電穿孔將在1-1中制備的約100微升(μl)HEK-293細(xì)胞樣本在室溫下裝入貯存器。在100μl樣本中插入5微克(μg)質(zhì)粒DNApEGFP(來(lái)源GenBankAccessionU55762；CLONTECH Lab.)作為轉(zhuǎn)染物并混合。將根據(jù)本發(fā)明的電穿孔裝置的樣本填充件末端(見(jiàn)圖8)插入貯存器中的混合溶液中。使用移液管型壓力保持裝置在樣本填充件內(nèi)部填充樣本，同時(shí)樣本填充件的末端連接成與貯存器中貯存的混合溶液流體連通。將此貯存器替換為僅含有電解液的貯存器，并將樣本填充件的末端浸在含有電解液的貯存器中形成流體連通。另外，設(shè)置電場(chǎng)施加條件，例如脈沖電壓、脈沖持續(xù)時(shí)間和脈沖重復(fù)頻率，等等。在本實(shí)驗(yàn)中，電場(chǎng)設(shè)置成，施加0.57kV/cm的電場(chǎng)一次，脈沖持續(xù)30ms。接著，在上述電場(chǎng)條件下，向插入連接到電穿孔裝置外部的接頭中的電極以及僅含有電解液的貯存器施加電脈沖。
1-3取出電穿孔的細(xì)胞使用移液管將樣本填充件中的樣本移到培養(yǎng)盤(pán)，并添加培養(yǎng)基。在CO2培養(yǎng)箱中將細(xì)胞培養(yǎng)24-48小時(shí)。計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量并測(cè)量其轉(zhuǎn)染率。
1-4結(jié)果圖19和圖20是根據(jù)本發(fā)明的電穿孔裝置插入質(zhì)粒DNA pEGFP的HEK-293細(xì)胞的顯微照片。圖19是明場(chǎng)(bright field)照片，圖20是熒光下觀察到的照片。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是，如照片所示，轉(zhuǎn)染率(熒光表達(dá)的細(xì)胞數(shù)/存活細(xì)胞數(shù))在90到95％范圍內(nèi)，并且細(xì)胞的存活率超過(guò)90％。圖21和圖22是使用圖1所示的傳統(tǒng)電穿孔裝置在相同條件下得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的顯微照片，其中HEK-293細(xì)胞轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒DNA pEGFP。圖21是明場(chǎng)照片，圖22是熒光下觀察到的照片。實(shí)驗(yàn)結(jié)果是，轉(zhuǎn)染率約50％，觀察到的細(xì)胞存活率小于本發(fā)明。需要注意的是，經(jīng)常在現(xiàn)有技術(shù)中觀察到的死細(xì)胞或生長(zhǎng)很少的細(xì)胞(圖21中的圓形細(xì)胞)在本發(fā)明結(jié)果中大大減少(圖19和圖20)。因此，可以說(shuō)，當(dāng)使用根據(jù)本發(fā)明的電穿孔裝置時(shí)，轉(zhuǎn)染率和存活率明顯改善。此外，如果使用根據(jù)本發(fā)明的電穿孔裝置，容易取回滲入特殊物質(zhì)的細(xì)胞。
1-5基于樣本填充件幾何結(jié)構(gòu)變化的影響分析將1-1中制備的約100μl HEK-293細(xì)胞樣本倒入室溫的貯存器。將5μg質(zhì)粒DNA pEGFP作為轉(zhuǎn)染物加入100μl樣本并混合，并且使用圖8的電穿孔裝置進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用移液管型壓力保持裝置吸取樣本，并將該貯存器替換為僅含有電解液的貯存器。將樣本填充件的末端浸入含有電解液的貯存器形成流體連通。電場(chǎng)條件的設(shè)置方式是，425V/cm的電場(chǎng)施加三次，脈沖持續(xù)時(shí)間10ms。在這樣的方式下執(zhí)行穿孔，毛細(xì)管樣本填充件固定成截面直徑0.135cm，而末端之間的長(zhǎng)度從0.4cm變到4cm。表1表示幾何條件和實(shí)驗(yàn)條件。
表1

在上面的表中，L表示樣本填充件的縱向長(zhǎng)度(cm)，D表示截面直徑(cm)，A表示截面面積(cm2)，并且R(cm-1)＝L/A。
在上述條件下電穿孔之后，將樣本填充件中的樣本移到培養(yǎng)盤(pán)并培養(yǎng)24小時(shí)。數(shù)出細(xì)胞數(shù)并測(cè)量轉(zhuǎn)染率。圖22表示其結(jié)果。
圖23表示當(dāng)R小于50時(shí)轉(zhuǎn)染率大大減小的曲線。圖24到圖33是用根據(jù)本發(fā)明的電穿孔裝置插入質(zhì)粒DNA pEGFP的HEK-293細(xì)胞的顯微照片。每幅圖左側(cè)是明場(chǎng)觀察到的照片，右側(cè)是熒光下觀察到的照片。
1-6使用不同細(xì)胞線的電穿孔實(shí)驗(yàn)在相同條件下對(duì)不同細(xì)胞株進(jìn)行電穿孔。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖34所示，表2所示的所有細(xì)胞通過(guò)本發(fā)明的電穿孔裝置都表現(xiàn)出優(yōu)秀的轉(zhuǎn)染率。圖34表示以圖表給出的轉(zhuǎn)染率，圖35表示相對(duì)GFP表達(dá)的顯微照片結(jié)果。
表2

1-7 siRNA轉(zhuǎn)染使用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢CHO細(xì)胞株(ATCCCRL-9618)、HeLa細(xì)胞株(ATCC，CCL-2)和人卵巢腺瘤SK-OV-3細(xì)胞株(ATCCHTB-77)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按照與1-1到1-4相同的方式進(jìn)行電穿孔觀察GFP表達(dá)，但0.25納摩爾(nmol)GFP siRNA(Ambion，No.4626，USA)和5μg pEGFP作為轉(zhuǎn)染物與100μl樣本混合。如圖36所示，當(dāng)使用GFP siRNA和pEGFP混合溶液作為轉(zhuǎn)染物時(shí)幾乎未觀察到GFP表達(dá)，這表明pEGFP和siRNA都在細(xì)胞內(nèi)有效傳播，從而GFP表達(dá)被細(xì)胞內(nèi)的siRNA阻止。
優(yōu)選實(shí)施例2使用通道結(jié)構(gòu)的電穿孔裝置對(duì)SK-OV-3進(jìn)行電穿孔實(shí)驗(yàn)2-1制造微通道結(jié)構(gòu)在優(yōu)選實(shí)施例2中，使用具有微通道結(jié)構(gòu)的樣本填充件的電穿孔裝置進(jìn)行生物實(shí)驗(yàn)。通過(guò)諸如模制之類(lèi)的方法制造電穿孔裝置，該裝置具有插入電極的井以及用于連接井的中空樣本填充件的通道。制造不同的通道結(jié)構(gòu)的樣本填充件，通道的高度20μm，長(zhǎng)度2cm，寬度100到500μm。但是，明顯地，通道圖案是通過(guò)使用光掩模的照片平版印刷法形成的。例如，首先，在硅晶片上旋轉(zhuǎn)涂覆負(fù)性光刻膠(SU-8，MicroChem，Massachusetts，USA)，形成20μm厚的母模(mold master)。通過(guò)掩模對(duì)準(zhǔn)器(MA-6，Karl Suss GmbH，Germany)執(zhí)行軟烘烤，在SU-8涂覆的硅晶片上形成掩模圖案。將SU-8圖案曝光，并執(zhí)行曝光后烘烤，顯影和硬烘烤過(guò)程。然后，將PDMS和固化劑的混合物(Sylgard 184，DOW Corning Co.，USA)倒入圖案。固化條件為90℃30分鐘。將25W氧氣等離子處理的聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)層結(jié)合到玻璃基體上，形成微通道。
2-2細(xì)胞制備和培養(yǎng)使用供應(yīng)熱滅活的胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS，Sigma)、青霉素(100單位/ml)、鏈霉素(100μg/ml)和L-谷酰胺(4mM)的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s Medium)，在溫度37℃、濕度5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)SK-OV-3細(xì)胞(ATCC，HTB-77)。使用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)從25cm2組織培養(yǎng)瓶中分離細(xì)胞。將最終細(xì)胞懸液濃度調(diào)節(jié)到1×107細(xì)胞/ml。施加脈沖后的細(xì)胞存活率作為生存能力的直接證據(jù)。在施加電脈沖之前，將碘化丙啶(propidium iodide，PI)加入細(xì)胞培養(yǎng)基。PI是常規(guī)使用的熒光標(biāo)記。PI是活細(xì)胞中細(xì)胞膜進(jìn)入的指示劑，并且插入核酸中。如果細(xì)胞膜是可滲透的，則PI進(jìn)入細(xì)胞，并與核酸結(jié)合發(fā)出紅色熒光。由于紅色熒光的強(qiáng)度取決于與核酸結(jié)合的PI量，因此可以進(jìn)行定量分析。在本實(shí)驗(yàn)中，將1.0毫克/毫升(mg/ml)PI按1∶20(體積/體積，v/v)比例加入細(xì)胞培養(yǎng)基。
由于從水母Aequorea victoria中提取的綠熒光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)具有較高可視性并發(fā)出有效的內(nèi)熒光團(tuán)，因此它廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。GFP作為細(xì)胞和器官中蛋白質(zhì)示蹤的基本表達(dá)標(biāo)記。在本實(shí)驗(yàn)中，質(zhì)粒分離試劑盒(Promega，USA)用于提取和提純pEGFP-NI質(zhì)粒，用于結(jié)腸炎細(xì)菌E.coli傳遞GFP。通過(guò)電泳在瓊脂糖凝膠上檢驗(yàn)提取的質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒的濃度是用分光光度計(jì)測(cè)量260納米(nm)的吸光度確定的。在施加脈沖之前，質(zhì)粒pEGFP-NI應(yīng)用于濃度0.1微克/微升(μg/μl)的樣本。報(bào)告基因表達(dá)用于評(píng)價(jià)成功的轉(zhuǎn)染。為了檢查所述表達(dá)，將暴露于電脈沖的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。在施加脈沖后，將通道結(jié)構(gòu)的電穿孔裝置浸入DMEM培養(yǎng)基中，并在EGFP表達(dá)檢查之前置于培養(yǎng)器中24小時(shí)。為了進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，除了氧氣等離子(O2plasma)外，不對(duì)微通道裝置進(jìn)行任何前處理。
2-3電穿孔電穿孔系統(tǒng)包括上述2-1中具有通道結(jié)構(gòu)樣本填充件的電穿孔裝置，國(guó)產(chǎn)高壓脈沖發(fā)生器、Pt電極和電極夾持器。
將上述2-2中制備的細(xì)胞樣本輸入一個(gè)井中，通過(guò)毛細(xì)管力或水頭壓作用使通道型樣本填充件充滿細(xì)胞樣本或使過(guò)量的樣本充入其他井中，或通過(guò)抽吸(pumping)使井和樣本填充件充入。通過(guò)將電極夾持器固定在顯微鏡上，在施加電脈沖下可以觀察電滲透過(guò)程。將高壓脈沖發(fā)生器通過(guò)模擬輸出板(COMI-CP301，Comizoa，韓國(guó))連接到計(jì)算機(jī)，并通過(guò)LabVIEW ver 6.1(National Instrument，USA)程序控制。為了驗(yàn)證根據(jù)本發(fā)明的電穿孔裝置的性能，將我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與方波電穿孔裝置(ECM830，BTX，USA，見(jiàn)圖2)和裝有平行鋁電極的2毫米(mm)間隙的試管(見(jiàn)圖1)的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。為了分析相同電場(chǎng)(1kV/cm)下所述兩個(gè)系統(tǒng)的性能，對(duì)試管施加電壓200V，對(duì)本發(fā)明的微通道裝置施加電壓2kV。通道寬度變化為100μm、200μm、300μm、400μm和500μm，并對(duì)這5種情況使用PI進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于GFP轉(zhuǎn)染和表達(dá)，在從0.75kV/cm到0.25kV/cm的不同脈沖條件下進(jìn)行10ms實(shí)驗(yàn)。為了觀察PI吸收，使用裝有100W汞燈和x20物鏡(0.4數(shù)值孔徑(NA))(LX790，Olympus，USA)的反相熒光顯微鏡。用530±20nm帶通濾光器光學(xué)地過(guò)濾光線，用590nm長(zhǎng)通(long pass)濾光器過(guò)濾從電穿孔細(xì)胞誘發(fā)的熒光。使用12位CCD攝像機(jī)(PCO，Kelheim，德國(guó))在15幀/秒的速率得到分辨率640×480像素的圖像。所有情況的曝光時(shí)間為10ms。為了觀察關(guān)于細(xì)胞生存能力和GFP轉(zhuǎn)染的熒光，用475±5nm帶通濾光器過(guò)濾激發(fā)的光，并用520nm長(zhǎng)通濾光器過(guò)濾誘發(fā)的熒光。使用彩色3IT CCD攝像機(jī)(AW-E300，Panasonic，USA)得到分辨率640×480像素的圖像。
2-4結(jié)果當(dāng)使用Al電極(見(jiàn)圖1)對(duì)試管中施加電脈沖時(shí)，在電極表面電化學(xué)產(chǎn)生氣泡，形成兩層液體和氣體相。圖37表示在使用裝有傳統(tǒng)Al電極的試管進(jìn)行電穿孔時(shí)，施加電脈沖之前(a)和之后(b)的Al電極表面。圖37(b)表示在電極表面形成氣泡。氣泡生成非常快并產(chǎn)生復(fù)雜的液體運(yùn)動(dòng)。所述氣泡運(yùn)動(dòng)與施加脈沖過(guò)程中的電泳一起導(dǎo)致大部分培養(yǎng)基和細(xì)胞的不均勻狀態(tài)。此外，鋁是容易形成氧化層(Al2O3)的材料，氧化層起到高電阻層作用。在根據(jù)本發(fā)明的電穿孔裝置中，未發(fā)現(xiàn)氣泡形成或復(fù)雜的培養(yǎng)基運(yùn)動(dòng)，這表明僅在兩個(gè)末端安裝的電極以及本發(fā)明中使用的電極材料(Pt)的化學(xué)穩(wěn)定性阻止氣泡形成直接影響樣本。結(jié)果，雖然其中生成氣泡的試管中的大部分培養(yǎng)基運(yùn)動(dòng)強(qiáng)烈，但因?yàn)槠錃馀萦绊懞苄?，具有本發(fā)明通道結(jié)構(gòu)的電穿孔裝置中的培養(yǎng)基可以保持在穩(wěn)定狀態(tài)下。根據(jù)本發(fā)明的微通道結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)是明顯的，并且沒(méi)有電極的可見(jiàn)影響，這種電穿孔的機(jī)理可以使用顯微鏡和類(lèi)似方法進(jìn)行直觀研究。
2-5插入率(intercalation)和電滲透率過(guò)程(electro-permeability process)檢查在將脈沖施加到本發(fā)明具有微通道樣本填充件的穿孔裝置之后，觀察到通道內(nèi)在毫秒(ms)單位過(guò)程中的局部PI進(jìn)入。如果相同范圍的電場(chǎng)作用于常規(guī)系統(tǒng)，則在微通道內(nèi)在幾乎所有細(xì)胞內(nèi)檢查到PI滲透率過(guò)程。圖38表示100μm寬的微通道的PI注入過(guò)程。在剛施加脈沖之后，僅從正極方向注入PI。隨著時(shí)間過(guò)去，熒光消散到所有細(xì)胞內(nèi)部(c到d)，并且在10秒后，核酸開(kāi)始發(fā)出熒光(e到h)。觀察直接反映了與核酸有關(guān)的PI特性。因?yàn)檫@提供了有關(guān)基本細(xì)胞過(guò)程的重要信息，實(shí)時(shí)觀察單個(gè)活細(xì)胞的功能非常有優(yōu)勢(shì)。例如，通過(guò)檢測(cè)熒光共振能量傳遞(fluorescence resonance energytransfer，F(xiàn)RET)，可以觀察到細(xì)胞質(zhì)中的oligoDNA對(duì)與c-fos mRNA結(jié)合。因?yàn)檫@是實(shí)時(shí)直接觀察到的，因此本發(fā)明的微通道裝置非常有用。
2-6基于在具有微通道樣本填充件的電穿孔裝置中通道寬度變化的電穿孔影響在電穿孔裝置中，觀察到相對(duì)染料吸收的熒光強(qiáng)度根據(jù)通道寬度而不同。如果施加相同電脈沖，相對(duì)細(xì)胞區(qū)的灰度單位強(qiáng)度隨通道寬度增大而減小。圖39是在施加30秒脈沖之后，分別在不同通道寬度100μm(a)和500μm(b)的兩個(gè)微通道中通過(guò)電穿孔將PI注入細(xì)胞的顯微照片，其中電場(chǎng)是1kV/cm，脈沖持續(xù)時(shí)間10ms?？梢源_認(rèn)，在窄通道寬度(100μm)的微通道中的細(xì)胞PI吸收遠(yuǎn)大于較寬通道寬度(500μm)的微通道中的細(xì)胞。為了對(duì)比不同通道寬度的5個(gè)微通道的PI吸收，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中以15幀/秒拍攝圖像。每50幀進(jìn)行圖像處理。通過(guò)使用圖形軟件(Pait Shop Pro 7.0，Jasc Software，USA)和MATLAB程序(MathWorks，Inc.，USA)，從細(xì)胞區(qū)的灰度單位中減去作為背底的灰度單位平均強(qiáng)度。相對(duì)PI強(qiáng)度的對(duì)比數(shù)據(jù)表示在圖40中。應(yīng)該注意的是，通道寬度影響PI吸收。因?yàn)樵诨谠嚬艿南到y(tǒng)中除了電極間隙外的幾何參數(shù)并未得到嚴(yán)重關(guān)注，因此微通道樣本填充件中的所述現(xiàn)象應(yīng)予以特殊注意。電脈沖對(duì)細(xì)胞的影響在明場(chǎng)下分析。明場(chǎng)分析法是在150μm和500μm寬度的兩個(gè)條件下進(jìn)行的。脈沖條件與其它實(shí)驗(yàn)的相同(在1kV/cm電場(chǎng)下10ms)。在施加脈沖之后，拍攝暴露在電脈沖下的圖像25秒。細(xì)胞暴露在電脈沖下立即膨脹。圖41表示兩個(gè)微通道電穿孔之前和之后的細(xì)胞尺寸變化，每個(gè)微通道分別具有不同通道寬度150μm(a)和500μm(b)。通過(guò)使用AutoCAD2002(Autodesk，Inc.，USA)，測(cè)量細(xì)胞直徑增大，并計(jì)算相對(duì)施加脈沖之前的直徑的增大率。雖然150μm通道寬度的細(xì)胞直徑增大了約23％，但500μm通道寬度的細(xì)胞直徑增大了約10％。通道寬度的所述差異可能來(lái)自于不同程度的電穿孔。從這些結(jié)果可以確認(rèn)，應(yīng)該考慮微通道樣本填充件電穿孔過(guò)程中諸如通道寬度或高度的通道截面的幾何形狀。
2-7在PDMS通道樣本填充件中的細(xì)胞培養(yǎng)PDMS由于其生物相容性和滲透性，是一種適合于通道裝置的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。因?yàn)橥ǔＴ贓GFP轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的電穿孔之后的細(xì)胞中表達(dá)需要24小時(shí)，所以在根據(jù)本發(fā)明的通道樣本填充件的EGFP轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中需要具有細(xì)胞培養(yǎng)功能。對(duì)通道樣本填充件是否用于細(xì)胞培養(yǎng)的貯存器進(jìn)行檢查。細(xì)胞可以注入通道中，并且整個(gè)PDMS通道裝置浸在細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)中，并在培養(yǎng)器中貯存7天。圖42表示其培養(yǎng)結(jié)果。在PDMS通道裝置中僅進(jìn)行O2等離子過(guò)程，將PDMS結(jié)合到玻璃上。7天后，作為對(duì)通道末端的井和細(xì)胞的觀察結(jié)果，應(yīng)該注意到，細(xì)胞很好地分散在底部表面并保持優(yōu)秀的狀態(tài)。50μm通道寬度的中央通道的細(xì)胞仍存活，但其狀態(tài)不好(見(jiàn)圖42(a))?？雌饋?lái)缺少新鮮培養(yǎng)基和CO2，并且通道寬度相對(duì)通道長(zhǎng)度窄造成的狹窄物理空間，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有不利影響。圖42(b)、(c)和(d)也表示分別在150μm、200μm和250μm不同通道寬度的微通道中將細(xì)胞培養(yǎng)7天得到的結(jié)果?？梢宰⒁獾?，細(xì)胞在較寬的微通道中附著、分散并成功運(yùn)動(dòng)。作為上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，可以確認(rèn)，在根據(jù)本發(fā)明的電穿孔裝置中可以進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。這表明，在長(zhǎng)時(shí)間研究不同細(xì)胞時(shí)，實(shí)時(shí)可視化功能提供很多優(yōu)點(diǎn)。此外，通過(guò)使用納米尺寸量子點(diǎn)半導(dǎo)體，預(yù)計(jì)可以使用本發(fā)明的電穿孔裝置在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)同時(shí)跟蹤活細(xì)胞內(nèi)的多種蛋白質(zhì)路線。
2-8在SK-OV-3細(xì)胞中的EGFP表達(dá)通過(guò)廣泛用作基因表達(dá)標(biāo)記的EGFP進(jìn)行生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。首先，施加1.5kV的電脈沖感應(yīng)0.75kV/cm的電場(chǎng)10ms。在使用目前的標(biāo)記BTX電穿孔裝置感染SK-OV-3細(xì)胞時(shí)，這是一個(gè)適合的條件。所述電場(chǎng)條件對(duì)于在通道結(jié)構(gòu)的樣本填充件中的細(xì)胞太苛刻。在24小時(shí)后檢查細(xì)胞，并且其結(jié)果表示在圖43(a)?？梢宰⒁獾?，細(xì)胞在底部表面的分散未處于優(yōu)秀狀態(tài)。未檢測(cè)到熒光。對(duì)于目前標(biāo)記電穿孔裝置足夠的電場(chǎng)，用于本發(fā)明通道結(jié)構(gòu)電穿孔裝置時(shí)太強(qiáng)，因此本發(fā)明中的電場(chǎng)在0.25kV/cm到0.75kV/cm范圍內(nèi)變化。其結(jié)果是，在0.4kV/cm到0.5kV/cm范圍內(nèi)成功感染細(xì)胞，并且可以確認(rèn)綠熒光已經(jīng)表達(dá)。最優(yōu)選的是條件是0.4kV/cm。圖43(b)和(c)表示其結(jié)果。從此結(jié)果可以證明，根據(jù)本發(fā)明的電穿孔裝置的電穿孔能量效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于使用試管型電穿孔裝置的能量效率。
如上所述，使用本發(fā)明的相同電穿孔裝置可以實(shí)時(shí)觀察注入過(guò)程。在根據(jù)本發(fā)明方法的電穿孔中，氣泡的產(chǎn)生以及細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞的復(fù)雜運(yùn)動(dòng)均未發(fā)現(xiàn)。與試管不同，長(zhǎng)、薄和中空的樣本填充件由于其幾何結(jié)構(gòu)限制了電流方向，因此在整個(gè)樣本填充件中形成均勻的電場(chǎng)。所述樣本填充件中的均勻環(huán)境增強(qiáng)了細(xì)胞中的物質(zhì)吸收率。
工業(yè)適用性如上所述，使用本發(fā)明的電穿孔裝置可以容易地對(duì)細(xì)胞電穿孔。此外，由于細(xì)胞是在毛細(xì)管、包括管或微通道的管道中電穿孔的，因此可以有效地取回并使用電穿孔的細(xì)胞。薄、長(zhǎng)和中空結(jié)構(gòu)的樣本填充件使電流僅流過(guò)窄的管道，從而與傳統(tǒng)的寬而短的試管相比，可以在此樣本填充件中得到均勻的電場(chǎng)。因此，可以減少實(shí)驗(yàn)條件導(dǎo)致的誤差。本發(fā)明的電穿孔裝置具有可以安裝和可以拆卸的電極和樣本填充件，從而允許永久使用性能優(yōu)異的鉑電極，或者便宜的一次性電極，使可以在一次使用后方便地丟棄樣本填充件。當(dāng)使用性能優(yōu)異的電極時(shí)，可以減少由于水分解產(chǎn)生的氧氣或金屬離子形成。此外，樣本損失很少。另外，可以僅用少量樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因?yàn)榭梢詫⑸倭繕颖咎畛涞綐颖咎畛浼钠渲腥』?，并且?jīng)過(guò)電穿孔取回。此外，通過(guò)適當(dāng)控制壓力保持裝置，大量樣本可以自動(dòng)實(shí)驗(yàn)；并且通過(guò)使用并行的多個(gè)電穿孔裝置，可以容易地建立最佳實(shí)驗(yàn)條件，從而同時(shí)處理幾個(gè)樣本。
權(quán)利要求
1.一種電穿孔系統(tǒng)，用于通過(guò)對(duì)包括細(xì)胞的樣本施加一個(gè)電脈沖或多個(gè)電脈沖將細(xì)胞膜電穿孔而使外來(lái)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，該系統(tǒng)包括電穿孔裝置；以及用于產(chǎn)生電脈沖的脈沖發(fā)生器，其中，所述電穿孔裝置還包括不導(dǎo)電材料的長(zhǎng)中空樣本填充件；貯存器，所述貯存器連接成與樣本填充件的一個(gè)末端流體連通；以及壓力保持裝置，所述壓力保持裝置通過(guò)具有電極插入部分的接頭連接到中空樣本填充件的另一末端以形成流體連通，所述貯存器具有接觸樣本或電解液的電極，樣本填充件通過(guò)壓力保持裝置充滿樣本，填充在貯存器中的樣本或電解液連接到樣本填充件末端形成流體連通，并且將一個(gè)電脈沖或多個(gè)電脈沖施加到與填充在貯存器中的樣本或電解液接觸的一個(gè)電極以及插入到接頭的電極插入部分的另一個(gè)電極上，從而將樣本填充件中填充的樣本中的細(xì)胞實(shí)施電穿孔。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中，樣本填充件具有的縱向長(zhǎng)度(L，cm)與水平截面積(A，cm2)之比(R，cm-1)在1/50到1/10000的范圍內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的系統(tǒng)，其中，所述中空樣本填充件是毛細(xì)管、管或通道。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的系統(tǒng)，其中，并行排列有兩個(gè)以上的電穿孔裝置。
5.一種電穿孔系統(tǒng)，用于通過(guò)對(duì)包括細(xì)胞的樣本施加一個(gè)電脈沖或多個(gè)電脈沖將細(xì)胞膜電穿孔而使外來(lái)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，該系統(tǒng)包括電穿孔裝置；以及用于產(chǎn)生電脈沖的脈沖發(fā)生器，其中，所述電穿孔裝置還包括不導(dǎo)電材料的長(zhǎng)中空樣本填充件；壓力保持裝置，所述壓力保持裝置連接到中空樣本填充件的一個(gè)末端形成流體連通；貯存器，其連接到樣本填充件的另一個(gè)末端形成流體連通，并具有接觸樣本或電解液的電極；以及貯存夾持器，所述貯存夾持器裝有用于固定壓力保持裝置的固定部分、電連接到固定部分的電極端子以及電連接到裝在貯存器上的電極的電極端子，其中，所述壓力保持裝置為在其部分主體上具有導(dǎo)電接觸的移液管，并且插入置于樣本填充件內(nèi)的可運(yùn)動(dòng)電極以與活塞連通；以及其中，中空樣本填充件直接裝在移液管尖端安裝軸上并可以分離，可運(yùn)動(dòng)電極通過(guò)移液管的按鈕上升或下降到樣本填充件末端，以使樣本填充到樣本填充件或?qū)⑵淙』?，移液管插入并固定在貯存夾持器內(nèi)管，移液管主體的接觸體通過(guò)貯存夾持器內(nèi)管的固定部分電連接到電極端子，定位樣本填充件使得與貯存器中貯存的樣本或電解液流體連通，并且將一個(gè)電脈沖或多個(gè)電脈沖施加到與貯存器中貯存的樣本或電解液接觸的電極上，從而將填充在樣本填充件中的樣本中的細(xì)胞實(shí)施電穿孔。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的系統(tǒng)，其中，樣本填充件具有的縱向長(zhǎng)度(L，cm)與水平截面積(A，cm2)之比(R，cm-1)在1/50到1/10000的范圍內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的系統(tǒng)，其中，中空樣本填充件是毛細(xì)管或管。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的系統(tǒng)，其中，可運(yùn)動(dòng)電極是表面涂覆有導(dǎo)電材料的塑料件。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的系統(tǒng)，其中并行排列有兩個(gè)以上的電穿孔裝置。
10.一種電穿孔系統(tǒng)，用于通過(guò)對(duì)包括細(xì)胞的樣本施加一個(gè)電脈沖或多個(gè)電脈沖將細(xì)胞膜電穿孔而使外來(lái)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，該系統(tǒng)包括電穿孔裝置；以及用于產(chǎn)生電脈沖的脈沖發(fā)生器，其中，所述電穿孔裝置還包括不導(dǎo)電材料的長(zhǎng)中空樣本填充件；在與中空樣本填充件的基板相同的基板上形成的一對(duì)井，所述井連接到樣本填充件的兩個(gè)末端形成流體連通；以及將脈沖發(fā)生器的一個(gè)電脈沖或多個(gè)電脈沖施加到樣本上的電極，以及其中，電極插在所述井中，對(duì)所述井施加電脈沖，從而將樣本填充件中的細(xì)胞實(shí)施電穿孔。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的系統(tǒng)，其中，樣本填充件具有的縱向長(zhǎng)度(L，cm)與水平截面積(A，cm2)之比(R，cm-1)在1/50到1/10000的范圍內(nèi)。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的系統(tǒng)，其中，中空樣本填充件由一個(gè)微通道或多個(gè)微通道制成。
13.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的系統(tǒng)，其中并行排列有兩個(gè)以上的電穿孔裝置。
14.一種電穿孔系統(tǒng)，用于通過(guò)對(duì)包括細(xì)胞的樣本施加一個(gè)電脈沖或多個(gè)電脈沖將細(xì)胞膜電穿孔而使外來(lái)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，該系統(tǒng)包括電穿孔裝置；以及用于產(chǎn)生電脈沖的脈沖發(fā)生器，其中，所述電穿孔裝置還包括不導(dǎo)電材料的長(zhǎng)中空樣本填充件；一對(duì)貯存器，與樣本填充件兩個(gè)末端連接以形成流體連通；以及貯存器具有與樣本或電解液接觸的電極，一個(gè)電脈沖或多個(gè)電脈沖被施加到與貯存器中貯存的樣本或電解液接觸的電極上，從而將填充在樣本填充件中的樣本中的細(xì)胞實(shí)施電穿孔。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的系統(tǒng)，其中，樣本填充件具有的縱向長(zhǎng)度(L，cm)與水平截面積(A，cm2)之比(R，cm-1)在1/50到1/10000的范圍內(nèi)。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的系統(tǒng)，其中，中空樣本填充件是毛細(xì)管或管。
17.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的系統(tǒng)，其中并行排列有兩個(gè)以上的電穿孔裝置。
18.一種電穿孔裝置，用于通過(guò)對(duì)包括細(xì)胞的樣本施加一個(gè)電脈沖或多個(gè)電脈沖將細(xì)胞膜電穿孔而使外來(lái)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，該裝置包括不導(dǎo)電材料的長(zhǎng)中空樣本填充件；連接到樣本填充件的一個(gè)末端以形成流體連通的貯存器；以及連接到樣本填充件的另一個(gè)末端以形成流體連通的壓力保持裝置。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的電穿孔裝置，其中，樣本填充件具有的縱向長(zhǎng)度(L，cm)與水平截面積(A，cm2)之比(R，cm-1)在1/50到1/10000的范圍內(nèi)。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的電穿孔裝置，其中，中空樣本填充件是毛細(xì)管、管或通道。
21.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的電穿孔裝置，其中，壓力保持裝置通過(guò)接頭連接，所述接頭具有用于插入電極的電極插入部分。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的電穿孔裝置，其中，電極插入所述電極插入部分以施加電脈沖，如果樣本填充件中填充有樣本，則電極接觸該樣本。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的電穿孔裝置，其中，所述接頭是一個(gè)圓盤(pán)，所述圓盤(pán)中形成有用于流過(guò)樣本的孔，并且電極插入部分形成在圓盤(pán)的側(cè)面。
24.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的電穿孔裝置，其中，壓力保持裝置是泵、注射器或移液管。
25.一種電穿孔裝置，用于通過(guò)對(duì)包括細(xì)胞的樣本施加一個(gè)電脈沖或多個(gè)電脈沖將細(xì)胞膜電穿孔而使外來(lái)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，該裝置包括不導(dǎo)電材料的長(zhǎng)中空樣本填充件；壓力保持裝置，其連接到中空樣本填充件的一個(gè)末端以形成流體連通；貯存器，其連接到樣本填充件的另一個(gè)末端以形成流體連通，并具有與樣本或電解液接觸的電極；以及貯存夾持器，該貯存夾持器包括用于固定壓力保持裝置的固定部分、電連接到固定部分的電極端子以及電連接到裝在貯存器上的電極的電極端子。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的電穿孔裝置，其中，壓力保持裝置是移液管，在其部分移液管主體上具有導(dǎo)電接觸，并且插入可運(yùn)動(dòng)電極以形成與活塞的連通，并且中空樣本填充件直接裝在移液管尖端安裝軸上并且可以與之分離。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的電穿孔裝置，其中，中空樣本填充件是毛細(xì)管或管。
28.根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的電穿孔裝置，其中，樣本填充件具有的縱向長(zhǎng)度(L，cm)與水平截面積(A，cm2)之比(R，cm-1)在50到10000的范圍內(nèi)。
29.一種電穿孔裝置，用于通過(guò)對(duì)包括細(xì)胞的樣本施加一個(gè)電脈沖或多個(gè)電脈沖將細(xì)胞膜電穿孔并使外來(lái)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，該裝置包括不導(dǎo)電材料的長(zhǎng)中空樣本填充件；以及連接在樣本填充件兩個(gè)末端以形成流體連通的一對(duì)貯存器。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的電穿孔裝置，其中樣本填充件具有的縱向長(zhǎng)度(L，cm)與水平截面積(A，cm2)之比(R，cm-1)在1/50到1/10000的范圍內(nèi)。
31.根據(jù)權(quán)利要求28或29所述的電穿孔裝置，其中，中空樣本填充件是毛細(xì)管或管。
32.一種電穿孔裝置，用于通過(guò)對(duì)包括細(xì)胞的樣本施加一個(gè)電脈沖或多個(gè)電脈沖將細(xì)胞膜電穿孔并使外來(lái)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，該裝置包括不導(dǎo)電材料的長(zhǎng)中空樣本填充件；以及在與中空樣本填充件的基板相同的基板上形成的一對(duì)井，所述井連接到樣本填充件的兩個(gè)末端以形成流體連通。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的電穿孔裝置，其中，樣本填充件具有的縱向長(zhǎng)度(L，cm)與水平截面積(A，cm2)之比(R，cm-1)在1/50到1/10000的范圍內(nèi)。
34.根據(jù)權(quán)利要求32或33所述的電穿孔裝置，其中，中空樣本填充件包括微通道。
35.根據(jù)權(quán)利要求32或33所述的電穿孔裝置，其中，中空樣本填充件的兩個(gè)以上的通道連接到一對(duì)井以形成流體連通。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的電穿孔裝置，其中，所述通道的每個(gè)通道長(zhǎng)度是不同的。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的電穿孔裝置，其中，所述通道的每個(gè)通道寬度是不同的。
38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的電穿孔裝置，還包括上基板和下基板，其中，上基板形成孔，所述孔中形成井，并且上基板或下基板形成有凹陷的通道。
39.一種電穿孔方法，用于通過(guò)對(duì)包括細(xì)胞的樣本施加一個(gè)電脈沖或多個(gè)電脈沖將細(xì)胞膜電穿孔并使外來(lái)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，其中使長(zhǎng)和中空的不導(dǎo)電材料樣本填充件充滿樣本，并且將一個(gè)電脈沖或多個(gè)電脈沖施加到其兩個(gè)末端，從而使電流流過(guò)樣本。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中，樣本填充件具有的縱向長(zhǎng)度(L，cm)與水平截面積(A，cm2)之比(R，cm-1)在1/50到1/10000的范圍內(nèi)。
41.根據(jù)權(quán)利要求39或40所述的方法，其中，中空樣本填充件是毛細(xì)管、管或通道。
42.根據(jù)權(quán)利要求39或40所述的方法，其中，樣本填充件中的電穿孔是連續(xù)進(jìn)行的。
全文摘要
一種電穿孔裝置，包括長(zhǎng)的中空件，以便在電穿孔過(guò)程中提供均勻的電場(chǎng)，其中特別是，執(zhí)行電穿孔是通過(guò)在中空件充滿包括細(xì)胞和將要注入細(xì)胞的物質(zhì)的流體樣本之后，由一對(duì)電極從長(zhǎng)的中空件兩個(gè)末端施加電脈沖。
文檔編號(hào)C12N13/00GK1965079SQ200580018428
公開(kāi)日2007年5月16日 申請(qǐng)日期2005年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月12日
發(fā)明者張準(zhǔn)根, 曹槿昌, 鄭燦一, 申永植, 金貞我, 鄭年哲 申請(qǐng)人:數(shù)字生物科技株式會(huì)社