專利名稱：液體混合及提高反應(yīng)效率的微型反應(yīng)器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微型反應(yīng)器，特別是使兩種以上的液體很好地混合、使反應(yīng)效率提高的微型反應(yīng)器及可以很好地用于基因檢查的生物反應(yīng)器。
背景技術(shù)：
近年來，通過利用微型機技術(shù)和超微細(xì)加工技術(shù)，開發(fā)了將用于進行以往的試樣制備、化學(xué)分析、化學(xué)合成等的裝置、部件(例如，泵、閥、流路、傳感器等)微細(xì)化，將其集成在一塊芯片上的系統(tǒng)。它們也被稱為μ-TAS(Micro total Analysis System)、生物反應(yīng)器、Lab-on-chips、生物芯片，有望應(yīng)用于醫(yī)療檢查、診斷領(lǐng)域、環(huán)境測定領(lǐng)域、農(nóng)業(yè)制造領(lǐng)域。尤其是如在基因檢測中所見到的那樣，在需要復(fù)雜的工序、熟練的操作技術(shù)、機器類的操作時，可以說自動化、高速化以及簡便化的微型化分析系統(tǒng)由于不限于成本、必要試樣量、所需時間以及可以不必選擇時間和場所進行分析，因此好處很多。
即使對不選擇場所迅速作出結(jié)果的分析用芯片也很重視分析的定量性、分析的精度和經(jīng)濟性等。因此，用簡單的結(jié)構(gòu)確立高可靠性的送液系統(tǒng)是一課題。要求精度高、可靠性好的微型流體控制元件。本發(fā)明人等已經(jīng)提出了適于其的微型泵系統(tǒng)的方案(專利文獻(xiàn)1及2)。
另外，實現(xiàn)試料的必需量變少、即使作為必需的試劑量少也可以完成分析的微量化是微型反應(yīng)器的最大課題。為了實現(xiàn)這一目標(biāo)必須在混合流路或反應(yīng)室中使液體(試樣和試劑)彼此高效率地混合。雖然也可以另外附設(shè)實現(xiàn)其的混合方式，但容易受芯片的尺寸、形態(tài)等的制約。在微細(xì)流路內(nèi)的混合及反應(yīng)中的反應(yīng)物質(zhì)擴散成為支配反應(yīng)速率(律速)，即使在長的流路中，直到到達(dá)反應(yīng)的物質(zhì)的擴散距離變長。特別在混合濃度大幅度不同的兩種以上的液體時，混合的好壞也影響反應(yīng)效率。因而，要求可以使兩種以上的液體高效率地混合、進行反應(yīng)且簡便的流路。
專利文獻(xiàn)1特開2001-322099號公報專利文獻(xiàn)2特開2004-108285號公報非專利文獻(xiàn)1“DNA芯片技術(shù)及其應(yīng)用”《蛋白質(zhì)核酸酶》第43卷，第13期(1998年)君塚房夫，加藤郁之進，共立出版(株)發(fā)行發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是鑒于這些實際情況而提出的，目的是提供一種可以高效率地混合兩種以上的液體，并使之有效地進行反應(yīng)的微型反應(yīng)器。
另外，本發(fā)明目的是提供一種具有適于DNA擴增的流路系統(tǒng)的基因檢查用微型反應(yīng)器。
用下面的結(jié)構(gòu)可以達(dá)到上述目的。
微型反應(yīng)器包括將含有反應(yīng)試劑的至少兩種液體用微型泵輸送、使它們合流的合流部；設(shè)在所述合流部的下游側(cè)端部、擴散混合所述各液體的混合流路；以及促進擴散混合后的混合液體的反應(yīng)的反應(yīng)促進部。


圖1是表示本發(fā)明第1實施方式中的微型反應(yīng)器的流路構(gòu)成的圖；圖2是說明圖1的微型反應(yīng)器的輸送液體控制系統(tǒng)的圖；圖3是表示從合流部直接將各液體送入直接貯液部的流路構(gòu)成的圖；圖4是表示本發(fā)明第2實施方式中的微型反應(yīng)器的流路構(gòu)成的圖；圖5是說明圖4的微型反應(yīng)器的輸送液體控制系統(tǒng)的圖；
圖6是說明在微細(xì)流路的中央部和壁面附近的流速不同的圖；圖7是表示本發(fā)明第3實施方式中的微型反應(yīng)器的流路構(gòu)成的圖；圖8是說明圖7的微型反應(yīng)器的輸送液體控制系統(tǒng)的圖；圖9是表示本發(fā)明第4實施方式中的微型反應(yīng)器的流路構(gòu)成的圖；圖10是表示本發(fā)明第4實施方式中的微型反應(yīng)器的變形例的圖；圖11是表示從合流部向微細(xì)流路輸送各液體，在微細(xì)流路內(nèi)混合并進行反應(yīng)的流路構(gòu)成的圖；圖12表示壓電泵，(a)是表示該泵之一例的剖面圖，(b)是其上面圖。(c)是表示壓電泵的另一例的剖面圖；圖13(a)、(b)是表示通過從Y字形的分支流路的上游輸送試劑和試樣，使它們合流的狀態(tài)的圖；圖14是疏水性閥沿著流路方向的剖面圖；圖15是表示設(shè)在流路中的主動閥之一例的剖面圖，(a)表示開閥狀態(tài)，(b)表示閉閥狀態(tài)；圖16(a)、(b)是表示設(shè)在流路中的止回閥之一例的剖面圖；圖17是表示試劑存貯部及泵的周邊結(jié)構(gòu)之一例的圖。
具體實施例方式
本發(fā)明的微型反應(yīng)器包括合流部，其將至少含有反應(yīng)試劑的兩種液體用微型泵輸送并使之合流；微細(xì)流路，其設(shè)置在所述合流部之前，使所述各液體擴散混合；貯液部，其設(shè)置在所述微細(xì)流路的下游側(cè)端部之前，由比該微細(xì)流路更寬的空間組成，貯留在該微細(xì)流路中擴散混合的混合液并進行反應(yīng)。
上述的發(fā)明由于微細(xì)流路的寬度狹小，來自合流部的各液體可以通過擴散迅速地混合。而在充分混合后，在寬幅的貯液部中進行反應(yīng)，另一反應(yīng)試劑向一方反應(yīng)試劑的供給，或反應(yīng)試劑向起反應(yīng)的部分的供給不只是由沿著上述的微細(xì)流路那樣的流路的一維方向的供給，而是從周圍的二維方向的供給。
因而，可以使反應(yīng)試劑彼此相遇的概率大幅變高，反應(yīng)速度提高。
本發(fā)明的微型反應(yīng)器具有控制所述微型泵的控制裝置，其在用所述微型泵把所述各液體從所述合流部送往所述微細(xì)流路后，在將送入所述貯液部之前，使所述微細(xì)流路內(nèi)的混合液的輸送暫時停止。
利用所述控制裝置停止輸送液體的時間最好為0.5秒～10分鐘。
上述發(fā)明把微細(xì)流路內(nèi)的混合液送入所述貯液部前，暫時停止輸送液體，在規(guī)定時間期間使微細(xì)流路內(nèi)的各液體擴散并充分混合后，把混合液送入貯液部。從而，可以在貯液部中有效地進行反應(yīng)。
為了暫時停止輸送液體，具體地可以停止微型泵的驅(qū)動，在經(jīng)過規(guī)定時間后再開動驅(qū)動，或者，也可以在微細(xì)流路下游側(cè)端部的附近設(shè)置后述的疏水性閥，用該疏水性閥使液體停止后，不中斷泵的驅(qū)動電壓，暫時用不使液體流動程度的壓力繼續(xù)對泵施加常規(guī)的驅(qū)動電壓，經(jīng)過規(guī)定時間后，提高驅(qū)動電壓，使液壓成為疏水性閥容許壓以上，把混合液送入貯液部。
通過這樣設(shè)置疏水性閥，可以防止在停止驅(qū)動泵時液體通過毛細(xì)管力任意移動。
本發(fā)明的微型反應(yīng)器包括合流部，其將含有反應(yīng)試劑的至少兩種液體用微型泵輸送并使之合流；環(huán)狀微細(xì)流路，其設(shè)在所述合流部的下游側(cè)，進行所述反應(yīng)試劑的相互反應(yīng)；閥，其設(shè)在所述環(huán)狀微細(xì)流路的上游側(cè)和/或下游側(cè)；循環(huán)用微型泵，其設(shè)在所述環(huán)狀微細(xì)流路上，在所述環(huán)狀微細(xì)流路內(nèi)，在環(huán)閉合狀態(tài)，用所述閥使從所述合流部輸送的所述各液體的混合液循環(huán)。
上述的發(fā)明把各液體從合流部導(dǎo)入環(huán)狀微細(xì)流路，用閥使其在閉合環(huán)的狀態(tài)下循環(huán)，因此，可以使環(huán)中的混合液有效地混合，同時，通過在流路的中心部分和壁面附近之間的液體的流速梯度可以促進把另一反應(yīng)試劑輸向一方反應(yīng)試劑，或把反應(yīng)試劑輸向發(fā)生反應(yīng)的部分。這樣，通過循環(huán)可以同時提高各液體的混合及反應(yīng)試劑之間的擴散效率，可以提高反應(yīng)速度。
進而，通過與試樣的濃度吻合控制循環(huán)速度和循環(huán)時間，可以控制反應(yīng)效率。
本發(fā)明的微型反應(yīng)器包括合流部，其將含有反應(yīng)試劑的至少兩種液體用微型泵輸送并使之合流；微細(xì)流路，其設(shè)置在所述合流部之前，進行所述反應(yīng)試劑的相互反應(yīng)；控制裝置，其切換從所述合流部向所述微細(xì)流路內(nèi)輸送的所述各溶液的混合液的輸送方向，在所述微細(xì)流路內(nèi)使所述混合液反復(fù)前后移動，控制所述微型泵。
上述本發(fā)明使用用于輸送包含反應(yīng)試劑的各液體的各泵中的多個或任一個泵，使微細(xì)流路中的液體前后移動，從而可以使微細(xì)流路中的混合液有效地混合，同時，通過在流路的中心部分和壁面附近之間的液體的流速梯度，可以促進把另一反應(yīng)試劑輸向一方反應(yīng)試劑，或把反應(yīng)試劑輸向發(fā)生反應(yīng)的部分。這樣，通過使微細(xì)流路內(nèi)的混合液反復(fù)移動，可以同時提高各液體的混合及反應(yīng)試劑之間的擴散效率，可以提高反應(yīng)速度。
另外，用輸送含反應(yīng)試劑的微型泵能有效地混合，沒有必要在流路上配置混合用的另外的微型泵。
本發(fā)明的微型反應(yīng)器設(shè)有用微型泵輸送包含作為擴增對象的DNA的DNA溶液的微細(xì)流路；從所述微細(xì)流路分支、用微型泵輸送試劑液體的多個分支流路；構(gòu)成使在所述微細(xì)流路中輸送的所述DNA溶液與從所述各分支流路的所述試劑液體按順序合流進行基因擴增反應(yīng)。
在上述的發(fā)明中，微型反應(yīng)器的流路，特別是在使基因擴增反應(yīng)那樣的濃度低的擴增對象的DNA和由該DNA通過擴增反應(yīng)得到的擴增后的DNA向基點前進的反應(yīng)時，為了防止一次向DNA溶液混合試劑液體后，成為反應(yīng)基點的DNA的濃度過分下降，而通過緩緩地加試劑液體，使成為基點的DNA的濃度隨著擴增而增加同時進行反應(yīng)，故可以提高反應(yīng)效率。
本發(fā)明的微型反應(yīng)器具有控制所述各微型泵的控制裝置，其使所述DNA溶液和所述試劑液體在合流部混合，在該混合液到達(dá)下一合流部跟前暫時停止該混合液的輸送。
上述發(fā)明由于借助合流部使所述DNA溶液和所述試劑液體在微細(xì)流路內(nèi)混合，在把該混合液輸送到下一合流部跟前后，停止該混合液的輸送，充分地進行反應(yīng)，反應(yīng)效率提高。
在上述各發(fā)明中，作為微型泵最好使用包括以下部分的微型泵。即包括流路阻力根據(jù)壓差變化的第1流路、相對壓差變化的流路阻力的變化比例比第1流路小的第2流路、與第1流路和第2流路連接的加壓室、使該加壓室的內(nèi)部壓力變化的調(diào)節(jié)器和驅(qū)動該調(diào)節(jié)器的驅(qū)動裝置。
上述各發(fā)明中的微型反應(yīng)器最好通過用由所述微型泵的驅(qū)動裝置發(fā)出的驅(qū)動信號控制調(diào)節(jié)器的動作，以便包含使反應(yīng)的化合物的各溶液按希望的比例混合。
上述各發(fā)明的微型反應(yīng)器最好在使包含作為擴增對象的DNA的DNA溶液和試劑液體合流的合流部的上游側(cè)的各流路中，設(shè)置存貯所述DNA溶液的DNA存貯部和存貯所述試劑液體的試劑存貯部，同時，在這些存貯部的上游側(cè)設(shè)有泵連接部，在這些泵連接部上連接所述微型泵，通過由各微型泵供給驅(qū)動液，推出所述各存貯部內(nèi)的所述DNA溶液及所述試劑液體，并使它們合流，開始基因擴增反應(yīng)。
上述的各發(fā)明的微型反應(yīng)器最適合用于混合試樣或由試樣抽出的DNA溶液、或者由試樣抽出的、從RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的cDNA溶液和包含反應(yīng)試劑的試劑液體，進行基因擴增反應(yīng)。
本發(fā)明的微型反應(yīng)器能用于基因檢查、藥劑感受性檢查、細(xì)菌檢查、病毒檢查、檢查血液和尿等的生化檢查，環(huán)境中的二_英濃度等的環(huán)境檢查、新創(chuàng)藥物、化學(xué)反應(yīng)等領(lǐng)域。
本發(fā)明的微型反應(yīng)器能高效率地混合兩種以上的液體更有效地進行反應(yīng)。
下面參照

本發(fā)明的實施方式。本發(fā)明的構(gòu)成，特別適于高效率地混合濃度差別很大的兩種以上的液體，進而通過以濃度低的一側(cè)的物質(zhì)濃度為基點或者以濃度低的一側(cè)的物質(zhì)及由反應(yīng)得到的生成物為基點進行的反應(yīng)，尤其適于基因擴增反應(yīng)。本發(fā)明的微型反應(yīng)器在各種實施方式中可以遵照本發(fā)明的主旨任意改變、變更，其都包含在本發(fā)明中。
在下面的實施方式中以基因檢查用的微型反應(yīng)器為例進行說明。該微型反應(yīng)器用ICAN(Isothermal chimera primer initiatednucleic acid amplification)法進行試樣和試劑的基因擴增反應(yīng)及檢測。
第1實施方式圖1是表示在本發(fā)明的第1實施方式的微型反應(yīng)器中進行試樣和試劑的混合及反應(yīng)的流路構(gòu)成的圖。如圖所示，從試樣存貯部1用微型泵(未圖示)輸送的試樣和從試劑存貯部2用微型泵(未圖示)輸送的試劑液體在Y字形流路的合流部3合流送向后續(xù)的微細(xì)流路4。
微細(xì)流路4例如作成寬0.2mm、深0.2mm、到進行ICAN反應(yīng)的圖中虛線內(nèi)區(qū)域的貯液部5的距離為125mm。
向微細(xì)流路內(nèi)輸送試劑及試樣是用與設(shè)在這些存貯部上游側(cè)的泵連接部連接的微型泵來進行。圖17表示試劑存貯部及微型泵周邊結(jié)構(gòu)之一例。在試劑存貯部2的流路方向的兩側(cè)設(shè)有密封液存貯部93，防止在使用前試劑的漏出和污染等。借助泵連接部91連接泵31，通過用泵31把貯存在驅(qū)動液存貯部92中的驅(qū)動液向下游側(cè)輸送，使試劑存貯部內(nèi)的試劑與密封液一起推出進行輸送。
另外，83是具有圖14所示結(jié)構(gòu)的疏水性閥，該疏水性閥83遮斷了向正方向的輸液壓力到達(dá)規(guī)定壓的液體的通過，容許通過施加規(guī)定壓以上的輸液壓力的液體的通過。如圖所示，疏水性閥83由節(jié)流流路徑的部分組成，因此，設(shè)置成從一端側(cè)到達(dá)該節(jié)流流路51的液體向另一端側(cè)通過。該節(jié)流流路51例如對與兩側(cè)串聯(lián)連接的縱橫為200μm×200μm的流路形成縱橫為200μm×30μm的程度。
為了將液體從細(xì)徑的節(jié)流流路51的端部推向粗徑的流路84，由于表面張力必須要有規(guī)定的液體輸送壓力。因而，由于用來自微型泵的泵壓可以控制液體的停止和通過，故可以例如在流路的規(guī)定位置暫時停止液體的移動，在希望的時間再開始從該位置向前面的流路輸送液體。
根據(jù)需要，也可以在節(jié)流流路51的內(nèi)面施加防水性涂層，如施加氟系的涂層。
在泵連接部91和試劑存貯部2之間的流路上設(shè)有抽出空氣用的流路94。該抽出空氣用的流路94從泵連接部91和試劑存貯部2之間的流路分支，其末端開放。從該抽出空氣用的流路94除去例如在泵連接等時存在于流路內(nèi)的氣泡。
作為微型泵，最好用壓電泵。圖12(a)是表示該泵之一例的剖面圖，圖12(b)是其上面圖。在該微型泵中設(shè)有形成第1液室48、第1流路46、加壓室45、第2流路47及第2液室49的基板42，在基板42上疊層的上側(cè)基板41，在上側(cè)基板41上疊層的振動板43，在面對振動板43的加壓室45側(cè)疊層的壓電元件44和用于驅(qū)動壓電元件44的驅(qū)動部(未作圖示)在該例中，作為基板42用厚度500μm的感光性玻璃基板，通過進行達(dá)到100μm的腐蝕，形成第1液室48、第1流路46、加壓室45、第2流路47及第2液室49。第1流路46的寬度為25μm、長度為20μm。第2流路47的寬度為25μm、長度為150μm。
通過在基板42上疊層作為玻璃基板的上側(cè)基板41形成第1液室48、第1流路46、第2液室49及第2流路47的上面。與上側(cè)基板41的加壓室45的上面接觸的部分通過腐蝕等加工貫通。
在上側(cè)基板41的上面疊層由厚度為50μm的薄板玻璃組成的振動板43，在其上面迭疊層例如由厚50μm的鈦鋯酸鉛(PZT)陶瓷等組成的壓電元件44。
用來自驅(qū)動部的驅(qū)動電壓，壓電元件44和貼在其上的振動板43振動，由此增減加壓室45的體積。第1流路46和第2流路47寬度和深度相同，第2流路的長度比第1流路長，在第1流路46中，只要壓差變大，在流路內(nèi)就會發(fā)生紊流卷起漩渦，流路阻抗增加。另一方面，在第2流路4 7中，由于流路長，即使壓差變大也容易形成層流，與第1流路相比流路阻力的變化比例相對壓差的變化小。
例如，通過對壓電元件44的驅(qū)動電壓，使振動板43向著加壓室45的內(nèi)方向飛快位移供給很大的壓差，同時使加壓室45的體積減少，其次使振動板43從加壓室45向著外方向緩慢位移，供給小的壓差，同時使加壓室45的體積增加，則液體向該圖的B方向輸送。反之，若使振動板43向著加壓室45的外方向飛快位移，供給很大的壓差，同時使加壓室45的體積增加，其次使振動板43從加壓室45向著內(nèi)方向緩慢位移，供給小的壓差，同時使加壓室45的體積減少，液體向該圖的A方向輸送。
在第1流路和第2流路中，相對壓差的變化的流路阻力的變化比例的不同未必是由流路長度的不同而引起的，也可以是由于其它的形狀的不同而引起。
如果用上述那樣構(gòu)成的壓電泵，通過改變泵的驅(qū)動電壓波形、電壓值及頻率，可以控制液體的輸送方向、輸送速度。在圖12(c)中表示了該泵的另一例。在該例中，由硅基板71、壓電元件44及沒有圖示的撓性配線構(gòu)成泵。硅基板71是用眾所周知的光刻技術(shù)把硅片加工成規(guī)定形狀，通過腐蝕形成加壓室45、振動板43、第1流路46、第1液室48、第2流路47及第2液室49。分別在第1液室48中設(shè)有口72，在第2液室49中設(shè)有口73。借助這些口與微型反應(yīng)器的泵連接部連通。如通過穿孔成口的基板74和微型反應(yīng)器的泵連接部附近上下重合，可以使泵與微型反應(yīng)器連接。另外，也可能在一塊硅基板上形成多個泵。此時，希望在與微型反應(yīng)器連接的口的相反側(cè)的口上連接驅(qū)動液罐。有多個泵時，這些口也可以連接一個公用的驅(qū)動液罐。
向試樣和試劑溶液的微細(xì)流路內(nèi)輸送液體，如圖13(b)所示，除同時驅(qū)動雙方的泵，從Y字形分支流路的A方向輸送試劑81，從B方向輸送試樣82之外，也可以如圖13(a)所示，通過交互進行從Y字形分支流路的A方向輸送試劑81，從B方向輸送試樣82，成為試劑81和試樣82在流路84內(nèi)以圓片形交互填充那樣輸送液體，而提高泵輸送液體的切換速度，若使該圓片層的厚度短，試劑81和試樣82之間的擴散就會變快。
在微細(xì)流路4內(nèi)由于微細(xì)流路的寬度狹小，來自合流部的各液體通過擴散迅速地混合，在將向貯液部5送入之前，為了使試劑和試樣充分地混合，也可以暫時停止微細(xì)流路內(nèi)的混合液的輸送。微型泵的停止時間最好為0.5秒～10分鐘。圖2是表示控制該泵暫時停止動作的控制系統(tǒng)的圖。如圖所示，微型泵31借助放大器32、D/A變換器33與微型計算機34連接。這些微型泵31、放大器32、D/A變換器33與微型計算機34等與進行基因擴增反應(yīng)的芯片安裝在不同的本體上。微型計算機31裝有定時器35，用事先定好程序的定時控制微型泵31停止及再開。
為了達(dá)到暫時停止輸送液體，具體地可以停止微型泵的驅(qū)動，在經(jīng)過規(guī)定的時間后再開始驅(qū)動，或也可以在細(xì)微流路下游側(cè)端部的附近設(shè)置后述的疏水性閥(圖14)，該疏水性閥使液體停止后，不中止泵的驅(qū)動電壓、用暫時使液體不動程度的壓力在泵上繼續(xù)施加定值的驅(qū)動電壓，并在經(jīng)過規(guī)定時間后，提高驅(qū)動電壓，使液壓達(dá)到疏水性閥容許壓以上，將混合液送入貯液部。
通過這樣設(shè)置疏水性閥可以防止在泵的驅(qū)動停止時液體由于毛細(xì)管力隨便移動。
在微細(xì)流路內(nèi)使試樣和試劑液體充分?jǐn)U散混合后，向貯液部5送入混合溶液，在貯存狀態(tài)下進行ICAN反應(yīng)。
貯液部5由比微細(xì)流路4更寬地形成的空間構(gòu)成，例如微細(xì)流路的寬度為0.2mm、深度為0.2mm時，貯液部5形成直徑為5.6mm、深度為0.2mm的空間。
微細(xì)流路4由于寬度狹小，來自合流部3的各液體通過擴散迅速地混合，另一方面，向擴增對象的DNA供給反應(yīng)試劑由于限制在沿著流路的一維方向，所以不能迅速地反應(yīng)。即如圖11所示，在微細(xì)流路4中在使混合液停止的狀態(tài)下，進行反應(yīng)的系統(tǒng)中，反應(yīng)速度慢，殘留大量沒有用于擴增的反應(yīng)試劑。
與此相反，通過在寬的液體貯存部5進行反應(yīng)，由于引物等反應(yīng)試劑由二維方向供給擴增對象的DNA，即從周圍整體供給，所以DNA和反應(yīng)試劑相遇的概率大幅提高，故反應(yīng)速度提高。
如圖3所示，若在試樣和試劑液體的合流部3和貯液部5之間作成不設(shè)置微細(xì)流路4的結(jié)構(gòu)，由于從合流部3流向貯液部5的各液體沒有充分?jǐn)U散地使界面10存在其中，故擴散需要時間，反應(yīng)速度變慢。
第2實施方式圖4是表示本發(fā)明第2實施方式的微型反應(yīng)器中試樣和試劑的混合及進行反應(yīng)的流路結(jié)構(gòu)的圖。如圖所示，從試樣貯存部1通過微型泵(未作圖示)輸送液體的試樣和從試劑貯存部2通過微型泵(未作圖示)輸送液體的試劑液體在Y字形流路的合流部3合流，通過閥12向后續(xù)的環(huán)狀微細(xì)流路11輸送液體。
填充在環(huán)狀的微細(xì)流路中11的試樣和試劑液體的混合液通過設(shè)在環(huán)內(nèi)的微型泵14，用閥12和閥13在環(huán)閉合的狀態(tài)下循環(huán)。通過循環(huán)，在環(huán)內(nèi)流動的試劑液體和試樣有效地擴散混合。
作為用于使混合液在環(huán)狀的微細(xì)流路11的環(huán)在閉合的狀態(tài)下循環(huán)的閥，本實施方式分別在環(huán)狀的微細(xì)流路11的上游側(cè)和下游側(cè)設(shè)有閥12和閥13，為了抑制向環(huán)外流出液體，在使環(huán)閉合的狀態(tài)下使混合液循環(huán)，也可以在環(huán)狀的微細(xì)流路11的上游側(cè)或下游側(cè)的任一方設(shè)置閥。但是，若上游側(cè)沒有閥，在循環(huán)時間變長時，環(huán)內(nèi)的液體成分就可能會向上游擴散，故最好如圖4所示，在上游側(cè)和下游側(cè)都設(shè)置閥。
環(huán)狀的微細(xì)流路11的尺寸可以用例如寬為0.3mm、深為0.3mm、環(huán)的直徑為16.5mm，作為循環(huán)用的微型泵1 4，可以使用上述的壓電泵。該泵的尺寸例如為2mm×0.7mm×0.3mm。在閥13使用上述的疏水性閥時，其尺寸例如為寬0.025mm、深為0.3mm，在閥12或閥13使用主動閥時，該閥體的尺寸例如直徑為0.6mm的程度。
通過循環(huán)，環(huán)內(nèi)流動的試劑液體和試樣有效地擴散混合，同時，通過流路的中心部分和壁面附近的液體的流速梯度，DNA和引物等反應(yīng)試劑相遇的概率提高，反應(yīng)速度加快。
若根據(jù)圖6說明這一點，由于流路17的中央部的液體流19a比壁面18附近的液體流19b快，通過該流速梯度，可以促進DNA和反應(yīng)試劑的相對移動，故DNA和環(huán)內(nèi)的各個位置的反應(yīng)試劑相遇的概率提高，反應(yīng)速度加快。
另外，通過適合試樣濃度控制循環(huán)速度和循環(huán)時間，可以控制反應(yīng)效率。
環(huán)內(nèi)的液體循環(huán)可以是向同一方向連續(xù)循環(huán)，也可以切換循環(huán)方向。
反應(yīng)完成后，打開閥13，環(huán)內(nèi)的液體用輸送試樣或試劑的上游側(cè)的微型泵向后續(xù)流路輸送。環(huán)的上游側(cè)的閥12可以用主動閥或止回閥，環(huán)的下游側(cè)的閥13可以用主動閥或前述的疏水性閥(圖14)。即使在環(huán)狀的微細(xì)流路11的上游側(cè)或下游側(cè)的任一方設(shè)置閥時，作為閥同樣可以使用它們，在上游側(cè)和下游側(cè)兩側(cè)設(shè)置時，這些閥可以任意組合使用。
圖15是表示主動閥之一例的剖面圖。圖15(a)表示開閥狀態(tài)，15(b)表示閉閥狀態(tài)。該主動閥向下方突出的閥部64形成的撓性基板63疊層在形成開口65的基板62上。
關(guān)閥時，如圖15(b)所示，通過從上方側(cè)用空氣壓、油壓、水壓活塞和壓電執(zhí)行元件、形狀記憶合金執(zhí)行元件等閥體變形裝置按壓撓性基板63，相對基板62緊貼閥部64以覆蓋開口65，由此，遮斷向B方向的逆流。另外，主動閥不限于用外部的驅(qū)動裝置動作，閥體也可以是自己變形堵塞流路的結(jié)構(gòu)。例如也可以使用雙金屬通過通電加熱變形或使用形狀記憶合金通過通電加熱變形。
圖16(a)、16(b)是表示止回閥之一例的剖面圖。圖16(a)的止回閥把微小球67作為閥體，通過利用微小球67的移動開閉在基板62上形成的開口68容許或遮斷液體的通過。即，在從A方向輸送液體時，由于微小球67利用液壓背離基板62，開放開口68，故容許液體通過。另一方面，在液體從B方向逆流時，由于微小球67落座在基板62上，開口68被關(guān)閉，故液體的通過被遮斷。
圖16(b)的止回閥疊層在基板62上，即其端部沿開口68的上側(cè)延伸出的撓性基板69通過利用液壓在開口68的上側(cè)上下移動而開閉開口68。即，在從A方向輸送液體時，由于撓性基板69的端部利用液壓背離基板62，開放開口68，故容許液體通過。另一方面，在液體從B方向逆流時，由于撓性基板69緊貼在基板62上，開口68被關(guān)閉，故液體的通過被遮斷。
圖5是表示輸送液體用和循環(huán)用的微型泵及閥的控制系統(tǒng)的圖。如圖所示，輸送液體用的微型泵31和循環(huán)用的微型泵14借助放大器32、D/A轉(zhuǎn)換器33與微型計算機34連接。
進而，用于開閉閥12、閥13的汽缸36借助D/A轉(zhuǎn)換器33與微型計算機34連接。
微型計算機31裝有定時器35，用預(yù)先定好程序的定時控制輸送液體用的微型泵31和循環(huán)用的微型泵14的液體輸送及閥12、閥13的開閉。
第3實施方式圖7是表示在本發(fā)明第3實施方式的微型反應(yīng)器中進行試樣和試劑的混合及反應(yīng)的流路結(jié)構(gòu)。如圖所示，從試樣存貯部1用微型泵(未作圖示)輸送的試樣和從試劑存貯部2用微型泵(未作圖示)輸送的試劑液體在Y字形流路的合流部3合流，送向后續(xù)的微細(xì)流路21。
微細(xì)流路21例如作成寬為0.2mm、深為0.2mm，在該微細(xì)流路21(圖中用虛線包圍區(qū)域的流路)內(nèi)進行ICAN反應(yīng)。
在將試樣和試劑液體填充到微細(xì)流路21中后，驅(qū)動輸送試樣的微型泵，使得反復(fù)切換輸送液體的方向，使微細(xì)流路21內(nèi)的混合液在微細(xì)流路21內(nèi)前后移動、進行ICAN反應(yīng)。例如在微細(xì)流路21的寬為0.2mm、深為0.2mm、液體量為25μl時，只要使其進行振幅25mm、周期為5秒左右的往復(fù)運動即可。
通過該前后移動，微細(xì)流路21內(nèi)的試劑液體和試樣有效擴散混合，同時，如圖6所說明的由于流路的中心部分和壁面附近的液體的流速梯度，DNA和試劑相遇的概率變高，反應(yīng)速度提高。
另外，由于在試劑存貯部側(cè)的流路設(shè)置防止逆流的閥22，用輸送試樣的微型泵使微細(xì)流路21內(nèi)的混合液前后移動，故不必在流路上設(shè)置混合用的另外的微型泵。在該微型泵中，如圖12所示的壓電泵最合適。
圖7只用一個微型泵使混合液往復(fù)運動，但也可以不設(shè)閥22，通過驅(qū)動試樣存貯部側(cè)的微型泵和試劑存貯部側(cè)的微型泵，使微細(xì)流路21內(nèi)的混合液往復(fù)運動。
圖8是表示輸送液體用的微型泵31及閥22的控制系統(tǒng)的圖。如圖所示，輸送液體用的微型泵31借助放大器32、D/A轉(zhuǎn)換器33與微型計算機34連接。
進而，用于開閉閥22的氣缸36借助D/A轉(zhuǎn)換器33與微型計算機34連接。
微型計算機31裝載著計時器35，用事先定好程序的定時，控制輸送液體用的微型泵31的液體輸送及閥22的開閉。
第4實施方式圖9是表示本發(fā)明的第4實施方式的微型反應(yīng)器中試樣和試劑的混合及進行反應(yīng)的流路構(gòu)成的圖。如圖所示，來自試樣存貯部1的試樣用微型泵(未作圖示)在微細(xì)流路25(圖中虛線包圍的流路)內(nèi)輸送。從該微細(xì)流路25分支成用微型泵(未作圖示)輸送試劑液體的多個分支流路27a、27b、27c。試劑液體借助干流路26從試劑存貯部2向分支流路27a、27b、27c輸送。
來自試樣存貯部1的試樣在微細(xì)流路25內(nèi)向下游側(cè)前進，同時，在合流部28a、28b、28c中按順序與試劑液體合流，進行擴增反應(yīng)。下面，按照試樣在合流部28a、28b、28c前進的順序，在微細(xì)流路25內(nèi)的試樣和試劑液體的混合及反應(yīng)進行說明。
從試樣存貯部1輸送的試樣一到達(dá)合流部28a就會與來自分支流路27a的試劑液體合流。此時合流的試劑液體的量是把試劑液體總量分割到各分支流路27a、27b、27c的量。在該混合液的前端部，即將要到達(dá)下一合流部28b之前都可以進行試樣和試劑的擴散混合及擴增反應(yīng)，但在混合液的前端部即將要到達(dá)合流部28b時，根據(jù)需要停止輸送液體，充分進行擴增反應(yīng)。在合流部28a和合流部28b之間的微細(xì)流路25內(nèi)的混合液中，DNA例如可以擴增到數(shù)倍。
其次，再次開始輸送試樣，從合流部28b跟前輸送的試樣在合流部28b與來自分支流路27b的試劑液體合流。在該混合液的前端部到達(dá)合流部28c之前都可以進行試樣和試劑的擴散混合及擴增反應(yīng)，但在混合液的前端部即將到達(dá)合流部28c之前，根據(jù)需要停止輸送液體，進行擴增反應(yīng)。在合流部28b和合流部28c之間的微細(xì)流路25內(nèi)的混合液中，DNA例如可以進一步擴增到數(shù)倍。另一方面，若后續(xù)的試樣連續(xù)地到達(dá)合流部28a，與來自分支流路27a的試劑液體合流，與上述一樣，進行試樣和試劑的擴散混合及擴增反應(yīng)，在合流部28a和合流部28b之間的微細(xì)流路25內(nèi)的混合液中，DNA例如可以擴增到數(shù)倍。
其次，再次開始試樣的輸送，從合流部28c跟前輸送的試樣在合流部28c與來自分支流路27c的試劑液體合流，和上述一樣，進行試樣和試劑的擴散混合及擴增反應(yīng)，在比合流部28c靠前的微細(xì)流路25內(nèi)的混合液中，DNA例如可以進一步擴增到數(shù)倍。另一方面，在合流部28a和合流部28b之間及合流部28b和合流部28c之間的微細(xì)流路25內(nèi)的混合液中，也可以和上述一樣擴增DNA。
這樣，由于分割試劑，使試劑從多個合流部28a、28b、28c階段性地合流，在微細(xì)流路25內(nèi)緩緩地擴增DNA，與例如在一個合流部內(nèi)一下子合流試樣和試劑進行反應(yīng)的情況相比，在本實施方式中，DNA和反應(yīng)試劑通過流路內(nèi)的擴散相遇概率變高，反應(yīng)效率大幅增加。即在象基因擴增反應(yīng)那樣，使?jié)舛鹊偷囊环降姆磻?yīng)物質(zhì)(擴增的DNA)和由反應(yīng)得到的反應(yīng)物質(zhì)(擴增后的DNA)向基點前進的反應(yīng)時，由于若使試劑液體和試樣一下子合流進行混合，作為反應(yīng)的基點的DNA的濃度會過度下降，因此，為了防止這一情況，通過邊緩緩地加試劑液體，增加作為基點的反應(yīng)物質(zhì)(DNA)，邊進行反應(yīng)，可以整體提高反應(yīng)效率。
圖10是表示在本實施例的微型反應(yīng)器中試樣和試劑的混合及進行反應(yīng)的流路構(gòu)成的改變例的圖。在該圖的流路結(jié)構(gòu)中，也和圖9的情況一樣，把來自試樣存貯部25的試樣送到微細(xì)流路25，由合流部28a～28d階段性地合流來自分支流路27a～27d的試劑液體，在微細(xì)流路25內(nèi)邊有效地使DNA擴增，邊向下游側(cè)輸送液體。在該例中，設(shè)流路寬度為0.2mm、流路深度為0.2mm，各合流部間的微細(xì)流路25的長度為30mm、分支流路27的長度為3mm。
本實施方式也和圖2、圖5、圖8一樣裝有控制微型泵暫時停止動作的控制系統(tǒng)，可以利用微型計算機34，在各合流部28的跟前暫時停止在微細(xì)流路25內(nèi)的液體的輸送，進行反應(yīng)。
以上對本發(fā)明的微型反應(yīng)器的實施方式進行了說明，但本發(fā)明不局限于這些實施方式，可以按照本發(fā)明的宗旨任意改變、變更，這些改變、變更等也包含在本發(fā)明中。即對于本發(fā)明的微型反應(yīng)器的全體或部分，只要符合本發(fā)明宗旨，可以把構(gòu)造、結(jié)構(gòu)、配置、形狀形態(tài)、尺寸、材質(zhì)、方式、方法作成各種各樣。
下面對適合于本發(fā)明的結(jié)構(gòu)的微型反應(yīng)器及作為適合基因擴增程序和檢測程序的結(jié)構(gòu)的基因檢查用微型反應(yīng)器進行說明。
微型反應(yīng)器由用樹脂、玻璃、硅、陶瓷等制成的一塊芯片組成。在該芯片上用超微細(xì)加工技術(shù)在對機能適當(dāng)?shù)奈恢迷O(shè)置例如試劑存貯部、流路、泵連接部、試劑定量部、混合部、反應(yīng)部等各部。在基因檢查微型反應(yīng)器中進一步設(shè)置探測DNA存貯部、控制存貯部，如有必要設(shè)置逆轉(zhuǎn)錄酶存貯部。
上述微型反應(yīng)器最好在存放了試劑的各試劑存貯部的上游部設(shè)置泵連接部，在這些泵連接部上連接微型泵，以通過由各微型泵供給驅(qū)動液，從試劑存貯部向流路推出試劑，開始規(guī)定的反應(yīng)、合成等。
基因檢查用的微型反應(yīng)器的試樣存貯部與試樣注入部連通，進行試樣的暫時存放和向混合部供給試樣。根據(jù)情況也可以擔(dān)負(fù)血球分離的作用等。試劑和試劑的混合、及試樣和試樣的混合可以在一個混合部中按希望的比率混合，或者分割為任意個或兩個，設(shè)置多個合流部進行混合，以最終達(dá)到希望的比率。最好構(gòu)成通過用微型泵驅(qū)動裝置發(fā)出的驅(qū)動信號控制調(diào)節(jié)器的動作，以按希望的比率混合各試劑。
通過將血液等試樣注入微型反應(yīng)器的上述試樣注入部，在微型反應(yīng)器內(nèi)自動地進行規(guī)定的反應(yīng)，如合成反應(yīng)、化學(xué)反應(yīng)、抗原體反應(yīng)、基因擴增反應(yīng)及為檢測這些反應(yīng)所進行的必要的處理，構(gòu)成對于多個項目可以同時且在短時間內(nèi)進行檢查。使用本發(fā)明的微型反應(yīng)器的理想的檢查形態(tài)，事先封入規(guī)定量的必要的試劑類，對每一個試樣使用該微型反應(yīng)器。例如作為進行基因檢查用的微型反應(yīng)器作為試樣的DNA(包括通過把從試樣抽出的RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的DNA)和DNA擴增反應(yīng)用試劑類的擴增反應(yīng)并進行擴增產(chǎn)物的檢測的單元使用。
在本發(fā)明的微型反應(yīng)器中包含在形成流路的芯片上連接微型泵使用的部件、在芯片上事先連接微型泵的部件及裝有芯片及控制微型泵、閥等的控制系統(tǒng)的部件。另外，也可以是在裝有微型泵等的另外的裝置本體上安裝芯片進行反應(yīng)、檢測的部件，該裝置本體由涉及各自控制液體輸送、溫度、反應(yīng)的控制系統(tǒng)及受理光學(xué)檢測、數(shù)據(jù)收集及處理的單元等構(gòu)成?；驒z查用途時，該裝置本體由于通過在其上安裝芯片，對試樣樣本可以通用，故即使有多個試樣也能高效快速地進行處理。
上述的微型反應(yīng)器由于任一部件都被小型化，作成方便搬運的形態(tài)，故對使用場所和時間沒有限制，作業(yè)性、操作性良好。
使用本發(fā)明的微型反應(yīng)器可以使包含由從試樣提取的DNA、或從試樣提取的RNA通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的cDNA的試樣和包含反應(yīng)試劑的試劑液體混合，很好地進行基因擴增反應(yīng)。
試樣作為測定對象的試樣，基因檢查時，作為形成擴增反應(yīng)的模板的核酸是基因、DNA或RNA。由可能包含這樣的核酸的試料進行調(diào)制或是單離均可。由這樣試料調(diào)制基因、DNA或RNA的方法沒有特別的限制，可以使用現(xiàn)有的技術(shù)。最近，開發(fā)了由用于DNA擴增的生體試料調(diào)制基因、DNA或RNA的技術(shù)，即使是試劑盒等形態(tài)也能使用。
對試樣自身也沒有特別的限制，如來自生物體的全血、血清、(血沉)棕黃層、尿、糞便、唾液、喀痰等的幾乎所有的試樣；細(xì)胞培養(yǎng)物；病毒、細(xì)菌、真菌、酶、植物、動物等的含有核酸的試樣；可能混入或含有微生物等的試樣、可能含有其它核酸的所有試樣等都可以成為對象。
DNA可以按照常規(guī)方法通過苯酚·氯仿提取和乙醇沉淀從試樣中分離純化。為了分離核酸，一般已知的是使用有接近飽和濃度的胍鹽酸鹽、異硫氰酸鹽這樣的高濃度離液序列高的試劑。
RNA的情況只要逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中使用的引物可以制備，就沒有特別的限制。例如，除了試樣中的總RNA之外，作為基因發(fā)揮功能的逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA、表達(dá)基因的直接的信息傳遞載體的mRNA、rRNA等RNA分子群成為對象。這些RNA可以利用適當(dāng)?shù)哪孓D(zhuǎn)錄酶變化為cRNA之后進行分析。mRNA的制備方法可以按照眾所周知的技術(shù)進行，轉(zhuǎn)錄酶可以容易地獲得。
擴增方法本發(fā)明的微型反應(yīng)器中，對擴增方法沒有限定。例如，DNA擴增技術(shù)可以使用多方面廣泛利用的PCR擴增法。用于實施該擴增技術(shù)的各種條件已經(jīng)被詳細(xì)地進行了研究，并被記載于包括其改良方面的各種文獻(xiàn)中。在PCR擴增中，需要使溫度在3個溫度區(qū)間內(nèi)升降的溫度管理，可以成為最適于微芯片的溫度控制的流路裝置已經(jīng)由本發(fā)明人提出(特開2004-108285)。可以在本發(fā)明的微型反應(yīng)器的擴增用流路中應(yīng)用這種裝置系統(tǒng)。因此，熱循環(huán)可以高速切換，微細(xì)流路可以作為熱容量小的微反應(yīng)室，因此DNA擴增通過手動操作可以在微管，微型瓶等中進行，并且可以在比往的方式短得多的時間內(nèi)進行。
不需要像PCR反應(yīng)這樣的復(fù)雜的溫度管理的、最近開發(fā)的ICAN(Isothermal chimera primer initiated nucleic acid amplication)法具有以下特征在50-65℃的任意的一定溫度下可以在短時間內(nèi)實施DNA擴增(特許第3433929號)。因此，ICAN法由于在本發(fā)明的微型反應(yīng)器中可以用簡便的溫度管理因此是最佳的擴增技術(shù)。在手動操作中需要1小時的這種方法，在本發(fā)明的生物反應(yīng)器中用10-20分鐘、優(yōu)選15分鐘結(jié)束直至分析。
DNA擴增反應(yīng)也可以是其它的PCR改良方法，本發(fā)明的微型反應(yīng)器存在可以根據(jù)流路的設(shè)計變化等對應(yīng)于任意一種的柔軟性。使用任意DNA擴增反應(yīng)的情況，其技術(shù)均詳細(xì)地被公開了，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地獲得。
·試劑類(i)引物PCR引物是與要擴增的特定部位的DNA鏈的兩端互補的兩種核苷酸。這種設(shè)計已經(jīng)被開發(fā)了專用的應(yīng)用，如果是本領(lǐng)域技術(shù)人員就可以通過DNA合成、化學(xué)合成等容易地制備。ICAN法用的引物是DNA和RNA的嵌合引物，其制備方法也已經(jīng)在技術(shù)上建立了(特許第3433929號)。引物的設(shè)計及選擇重要的是擴增反應(yīng)成功與否，使用影響效率的最合適的引物。
此外，如果使生物素預(yù)先結(jié)合在引物上，可以通過與基板上的鏈霉親和素的結(jié)合將擴增產(chǎn)物DNA固定在基板上，可以提供擴增產(chǎn)物的定量。作為其它的引物標(biāo)記物質(zhì)，可以例舉有地高辛、各種熒光色素等。
(ii)擴增反應(yīng)用試劑類包括在擴增反應(yīng)中使用的酶在內(nèi)的試劑類均可以容易地在PCR用和ICAN法中的任意一個獲得。
作為PCR法中的試劑類型，至少包括2’-脫氧核苷5’-三磷酸、此外還包括Taq DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶。
ICAN法中的試劑類至少包括2’-脫氧核苷5’-三磷酸，可以與要檢測的基因特異性雜交的嵌合引物，具有鏈置換活性的DNA聚合酶、核酸內(nèi)切酶的RNase。
(iii)對照內(nèi)部對照，對于目的核酸(DNA，RNA)，可以作為擴增的監(jiān)視或定量時的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來使用。由于內(nèi)部對照的序列在與試樣不同的序列的兩側(cè)具有與試樣用引物相同的引物可以雜交的序列，因此可以與試樣同樣擴增。陽性對照的序列是檢測試樣的特異性序列，引物雜交部分與其之間的序列與試樣相同。對照中使用的核酸(DNA，RNA)可以使用公知技術(shù)文獻(xiàn)中記載的。陰性對照包含所有核酸(DNA，RNA)之外的試劑等，在感染的有無的檢查，背景補正中使用。
(iv)逆轉(zhuǎn)錄用試劑RNA的試劑的情況是，試劑為用于由RNA合成cDNA的逆轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄引物等，這些都有市售，均可以容易獲得。
這些擴增用基質(zhì)(2’-脫氧核苷5’-三磷酸)，基因擴增用試劑等分別被預(yù)先將規(guī)定量封入一個微型反應(yīng)器的上述試劑儲存部中。因此，本發(fā)明的微型反應(yīng)器在使用時不必每次填充必要量的試劑，即達(dá)到可以使用的狀態(tài)。
檢測步驟檢測擴增的目的基因的DNA的方法沒有特別的限定，根據(jù)需要可以使用最佳的方法。這種方法中主流的是諸如可視分光側(cè)光法、熒光測定法、發(fā)光冷光法這樣的檢測方法。進而，可例舉有電化學(xué)方法、表面等離子共振、晶體振蕩器微平衡等方法。
使用上述微型反應(yīng)器，作為一例，可以按以下步驟進行擴增和檢測。即(1)從這些儲存部向流路輸送試樣或從試樣提取的DNA或由試樣或從試樣提取的RNA通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的eDNA與經(jīng)生物素修飾的引物，在微細(xì)流路內(nèi)擴增基因的步驟；(2)混合含有在微細(xì)流路內(nèi)擴增的基因的擴增反應(yīng)液和變性液，將擴增的基因變性成單鏈的處理步驟；(3)將擴增基因變性處理成單鏈的處理液輸送到吸附了鏈霉親和素的微細(xì)流路中，固定前述擴增的基因的步驟；(4)末端經(jīng)FITC(fluorescein isothiocyanate，異硫氰酸熒光素)修飾的探針DNA流入到固定了擴增的基因的微細(xì)流路中，探針DNA與固定的基因雜交的步驟；(5)經(jīng)FITC抗體表面修飾的膠體金液流入到前述微細(xì)流路中，由此使該膠體金吸附到與固定的基因雜交的經(jīng)FITC修飾的探針上的步驟；(6)光學(xué)測定前述微細(xì)流路中的膠體金的濃度的步驟。
優(yōu)選的是，在前述各過程之間，根據(jù)需要包括將清洗液輸送到吸附了鏈霉親和素的前述流路中的步驟。作為這種清洗液，最佳的是例如各種緩沖液、鹽類水溶液、有機溶劑等。
上述檢測方法優(yōu)選的是通過可視光，最終可以以高敏感度測定的方式。機器比熒光測定用途廣，妨礙因素少而且數(shù)據(jù)處理更容易。優(yōu)選的是使用通過用于這種目的的光學(xué)檢測裝置與含有上述微型泵的送液手段和控制微型反應(yīng)器的流路中的各反應(yīng)的反應(yīng)溫度的溫度控制裝置一起組裝，構(gòu)成一體化的本發(fā)明的基因檢測裝置進行檢測。
在上述過程中，變性液適用于將基因DNA變成單鏈的試劑，例如，可以例舉有氫氧化鈉、氫氧化鉀等。探針可以例舉有寡聚脫氧核苷酸等。此外，除FITC之外還可以例舉有RITC(羅丹明異硫氰酸鹽)等熒光物質(zhì)。
上述擴增和檢測，在基因檢測裝置主體上進行，該裝置主體控制微型泵和溫度的同時具有與預(yù)先送液順序、容量、時間等相關(guān)設(shè)定的各個條件作為程序內(nèi)容的軟件，前述微型泵，前述檢測裝置和溫度控制裝置一體化。在該裝置主體上安裝可以拆卸的上述芯片。通過注入試樣優(yōu)選自動開始分析、試樣和試劑類的送液、基于混合的基因擴增反應(yīng)、基因檢測反應(yīng)和光學(xué)的測定可以作為一系列的過程自動實施，測定數(shù)據(jù)、必要的條件、記錄事項一起儲存在文件內(nèi)。
權(quán)利要求
1.微型反應(yīng)器，其特征在于，包括合流部，該合流部將含有反應(yīng)試劑的至少兩種液體用微型泵輸送并使之合流；混合流路，該混合流路設(shè)置在所述合流部的下游側(cè)端部，使所述各液體擴散混合；以及反應(yīng)促進部，該反應(yīng)促進部促進擴散混合了的混合液體的反應(yīng)。
2.如權(quán)利要求1所述的微型反應(yīng)器，其特征在于，所述反應(yīng)促進部為貯液部，該貯液部設(shè)置在所述混合流路的下游側(cè)端部，由比該混合流路更寬的空間構(gòu)成，將在該混合流路中擴散混合的混合液貯留并進行反應(yīng)。
3.如權(quán)利要求2所述的微型反應(yīng)器，其特征在于，具有控制裝置，該控制裝置控制所述微型泵，使在用所述微型泵把所述各液體從所述合流部輸送至所述混合流路后，在將送入所述貯液部之前，使所述混合流路內(nèi)的各液體的輸送暫時停止。
4.如權(quán)利要求3所述的微型反應(yīng)器，其特征在于，利用所述控制裝置停止輸送液體的時間為0.5秒～10分鐘。
5.如權(quán)利要求1所述的微型反應(yīng)器，其特征在于，所述反應(yīng)促進部包括環(huán)狀混合流路，該環(huán)狀混合流路設(shè)在所述合流部的下游側(cè)端部，進行所述各液體的反應(yīng)；閥，該閥設(shè)在所述環(huán)狀混合流路的上游側(cè)和/或下游側(cè)；以及循環(huán)用微型泵，該循環(huán)用微型泵設(shè)在所述環(huán)狀混合流路內(nèi)，在所述環(huán)狀混合流路內(nèi)，在用所述閥使環(huán)閉合狀態(tài)下，循環(huán)從所述合流部輸送的所述各液體的混合液。
6.如權(quán)利要求1所述的微型反應(yīng)器，其特征在于，所述反應(yīng)促進部具有控制裝置，該控制裝置控制所述微型泵，切換從所述合流部向所述混合流路內(nèi)輸送的所述各溶液的混合液的輸送方向，在所述混合流路內(nèi)使所述混合液反復(fù)前后移動。
7.如權(quán)利要求1所述的微型反應(yīng)器，其特征在于，所述反應(yīng)促進部具有以下構(gòu)成設(shè)有用微型泵輸送包含作為擴增對象的DNA的DNA溶液的混合流路；以及從所述混合流路分支、用微型泵輸送試劑液體的多個分支流路；使在所述混合流路中輸送的所述DNA溶液與從所述各分支流路的所述試劑液體按順序合流，進行基因擴增反應(yīng)。
8.如權(quán)利要求7所述的微型反應(yīng)器，其特征在于，具有控制裝置，該控制裝置控制所述各微型泵，使所述DNA溶液和所述試劑液體在合流部合流，在該混合液即將到達(dá)下一合流部之前暫時停止該混合液的輸送。
9.如權(quán)利要求1所述的微型反應(yīng)器，其特征在于，所述微型泵包括流路阻力根據(jù)壓差變化的第1流路、相對壓差變化的流路阻力的變化比例比第1流路小的第2流路、與第1流路及第2流路連接的加壓室、使該加壓室的內(nèi)部壓力變化的調(diào)節(jié)器和驅(qū)動該調(diào)節(jié)器的驅(qū)動裝置。
10.如權(quán)利要求1所述的微型反應(yīng)器，其特征在于，通過用由所述微型泵的驅(qū)動裝置發(fā)出的驅(qū)動信號控制調(diào)節(jié)器的動作，使包含反應(yīng)試劑的至少兩種液體按所定的比例混合。
11.如權(quán)利要求1所述的微型反應(yīng)器，其特征在于，在使包含作為擴增對象的DNA的DNA溶液和試劑液體合流的合流部的上游側(cè)的各流路中，設(shè)置存貯所述DNA溶液的DNA存貯部和存貯所述試劑液體的試劑存貯部，同時，在這些各存貯部的上游側(cè)設(shè)有泵連接部，在這些泵連接部上連接所述微型泵，通過由各微型泵供給驅(qū)動液，推出所述各存貯部內(nèi)的所述DNA溶液及所述試劑液體，并使它們合流，開始基因擴增反應(yīng)。
12.如權(quán)利要求1所述的微型反應(yīng)器，其特征在于，將試樣或由試樣提取的DNA的溶液、或從由試樣提取的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的cDNA的溶液和包含反應(yīng)試劑的試劑液體混合，進行基因擴增反應(yīng)。
全文摘要
一種微型反應(yīng)器，其將含有反應(yīng)試劑的至少兩種液體用微型泵輸送并使之在微細(xì)流路(4)內(nèi)合流，使各液體擴散混合后，把液體送入設(shè)在微細(xì)流路(4)的下游側(cè)端部的幅寬的貯液部(5)并在該貯液部(5)中進行反應(yīng)。另外，也可以把各液體的混合液在環(huán)狀的微細(xì)流路內(nèi)循環(huán)，或使混合液在微細(xì)流路內(nèi)前后移動。還有，在基因擴增反應(yīng)中，從輸送試樣的微細(xì)流路分支的分支流路向微細(xì)流路內(nèi)緩緩輸送試劑，同時進行擴增反應(yīng)。
文檔編號C12Q1/68GK1965074SQ20058001839
公開日2007年5月16日 申請日期2005年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月8日
發(fā)明者山東康博, 上田榮一, 中島彰久, 東野楠, 石田暢久 申請人:柯尼卡美能達(dá)醫(yī)療印刷器材株式會社