專利名稱：：具有高分泌水平的突變的原核細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及突變的原核細(xì)胞，其與其它的等基因(isogenic)但未突變的細(xì)胞相比，能夠分泌較高量的至少一種目標(biāo)異源多肽，同時(shí)降低了YusZ或YusX，或其同源物的表達(dá)水平，和構(gòu)建上述細(xì)胞和應(yīng)用上述細(xì)胞生產(chǎn)多肽的方法。
背景技術(shù)：
：yusZ和yusX的DNA序列在1993年首次報(bào)道，但僅作為推定的開(kāi)放閱讀框被報(bào)道(Chen等，1993，MetalloregulationinBacillussubtilisisolationandcharacterizationoftwogenesdifierentiallyrepressedbymetalions，JBact175(17)5428-5437)。在以后的文獻(xiàn)中，人們推測(cè)yusX和緊鄰yusX上游的被稱作yusY的開(kāi)放閱讀框可能是由于單yusXY基因的移碼突變?cè)斐傻?。然而，該文獻(xiàn)的作者沒(méi)有進(jìn)行進(jìn)一步的研究，同時(shí)得出結(jié)論認(rèn)為上述基因在細(xì)胞中的功能仍然是未知的(Kanamaru等，2002，OverexpressionofthePepFOligopeptidaseInhibitsSporulationInitiationinBacillusSubtillis，JBact184(1)43-50)。定義在本發(fā)明中使用了本
技術(shù)領(lǐng)域：
常規(guī)的分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳細(xì)的解釋。如參見(jiàn)，Sambrook、Fritsch和Maniatis，MolecularCloningALaboratoryManual，第二版(1989)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork(在此被稱為“Sambrook等，1998”)；DNACloningAPracticalApproach，第I卷和第II卷(D.N.Glover編著，1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait編著，1984)；NucleicAcidHybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins編著，(1985))；TranscriptionAndTranslation(B.D.Hames和S.J.Higgins編著，(1984))；AnimalCellCulture(R.I.Freshney編著，(1986))；ImmobilizedCellsAndEnzymes(IRLPress，(1986))；B.Perbal，APraccticalGuideToMolecularCloning(1984)。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸“是指單鏈的或雙鏈的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的聚合體，從5’端到3’端閱讀。多核苷酸包括RNA和DNA，可以是從自然界分離的、在體外合成的、或者是將天然的和合成的分子進(jìn)行組合而制備的。術(shù)語(yǔ)“核酸分子”或“核苷酸序列”是指單鏈形式的或雙鏈螺旋形式的核糖核苷(腺苷、鳥(niǎo)苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脫氧核糖核苷(脫氧腺苷、脫氧鳥(niǎo)苷、脫氧胸苷或脫氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合體。可能是雙鏈的DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋。術(shù)語(yǔ)核酸分子，尤其DNA或RNA分子，僅指分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，并不將其限定于任何具體的三級(jí)或四級(jí)形式。因此，上述術(shù)語(yǔ)包括存在于線性或環(huán)狀的DNA分子(如限制性片段)、質(zhì)粒和染色體及他處的雙鏈DNA。在描述特定的雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)時(shí)，本發(fā)明根據(jù)通常的慣例僅給出沿著DNA非轉(zhuǎn)錄鏈(即與mRNA序列同源的鏈)從5’到3’方向的序列。“重組DNA分子”是指經(jīng)過(guò)分子生物學(xué)操作的DNA分子。核酸分子與另外一個(gè)核酸分子，如cDNA、基因組DNA、或RNA是“可雜交的(hybridizable)”，如果單鏈形式的核酸分子在適當(dāng)?shù)臏囟群腿芤弘x子強(qiáng)度條件下能夠與另外一個(gè)核酸分子退火(參見(jiàn)Sambtook等，如前所述)。溫度和離子強(qiáng)度條件決定著雜交的“嚴(yán)緊度(stringency)”。在本發(fā)明中，雜交意味著所述核苷酸序列與標(biāo)記的多核苷酸探針雜交，其中所述標(biāo)記的多核苷酸探針與SEQIDNO1、SEQIDNO3、或SEQIDNO5所示的核苷酸序列在非常低到非常高的嚴(yán)緊條件下雜交。在上述條件下與所述多核苷酸探針雜交的分子，可以使用X-射線膠片或通過(guò)任何其它本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行檢測(cè)。在本上下文中當(dāng)使用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸探針”時(shí)，可理解為所述探針包含至少15個(gè)核苷酸。在一個(gè)感興趣的實(shí)施方式中，所述多核苷酸探針是SEQIDNO1、SEQIDNO3、或SEQIDNO5的至少15個(gè)核苷酸的片段的互補(bǔ)鏈。在另外一個(gè)感興趣的實(shí)施方式中，所述多核苷酸探針是編碼SEQIDNO2、SEQIDNO4、或SEQIDNO6多肽的任意核苷酸序列的互補(bǔ)鏈的具有至少15個(gè)核苷酸的片段。在又一個(gè)感興趣的實(shí)施方式中，所述多核苷酸探針是SEQIDNO1、SEQIDNO3、或SEQIDNO5的互補(bǔ)鏈。在又一個(gè)感興趣的實(shí)施方式中，所述多核苷酸探針是SEQIDNO1、SEQIDNO3、或SEQIDNO5的成熟多肽編碼區(qū)的互補(bǔ)鏈。對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針來(lái)說(shuō)，非常低到非常高的嚴(yán)緊條件定義為按照標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡分析程序，在如下條件下進(jìn)行的預(yù)雜交和雜交42℃、5XSSPE、0.1％SDS、5XDenhardt’s溶液、100微克/ml經(jīng)過(guò)剪切和變性的鮭精DNA。優(yōu)選地，所述至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針包含不超過(guò)1000個(gè)核苷酸。對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針來(lái)說(shuō)，載體材料最后用2xSSC、1％SDS在42℃(非常低的嚴(yán)緊條件)下洗滌三次，每次15分鐘，優(yōu)選用0.5xSSC、0.1％SDS在42℃(低度嚴(yán)緊條件)下洗滌三次，每次15分鐘，更優(yōu)選用0.2xSSC、0.1％SDS在42℃(中度嚴(yán)緊條件)下洗滌三次，每次15分鐘，還更優(yōu)選用0.2xSSC、0.1％SDS在55℃(中高度嚴(yán)緊條件)下洗滌三次，每次15分鐘，最優(yōu)選用0.1xSSC、0.1％SDS在60℃(高度嚴(yán)緊條件)下洗滌三次，每次15分鐘，尤其是用0.1xSSC、0.1％SDS在68℃(非常高的嚴(yán)緊條件)下洗滌三次，每次15分鐘。雖然不是特別優(yōu)選的，但預(yù)期也可以使用較短的探針，如長(zhǎng)度從約15到99個(gè)核苷酸的探針，如長(zhǎng)度從約15到約70個(gè)核苷酸的探針。對(duì)于上述短探針來(lái)說(shuō)，嚴(yán)緊條件定義為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡分析程序，在如下條件下進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌比根據(jù)Bolton和McCarthy所描述的計(jì)算方法(1962，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA481390)計(jì)算的Tm值低5℃-10℃的溫度下，在0.9MNaCl、0.09MTris-HClpH7.6、6mMEDTA、0.5％NP-40、1xDenhardt’s溶液、1mM焦磷酸鈉、1mM磷酸二氫鈉、0.1mMATP、和0.2mg/ml酵母RNA。對(duì)于長(zhǎng)度為約15個(gè)核苷酸到99個(gè)核苷酸的短探針來(lái)說(shuō)，將載體材料在低于所計(jì)算出的Tm值5℃-10℃的溫度下用6xSCC加0.1％SDS洗滌一次，15分鐘，然后用6xSSC洗滌兩次，每次15分鐘。DNA“編碼序列”或“開(kāi)放閱讀框(ORF)”是指當(dāng)置于合適的調(diào)控序列控制之下時(shí)，在體內(nèi)或體外細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽的雙鏈DNA序列。編碼序列的邊界由位于5’(氨基)末端的起始密碼子和位于3’(羧基)末端的翻譯終止密碼子確定。編碼序列包括但不限于，原核序列、來(lái)自真核mRNA的cDNA、來(lái)自真核(如哺乳動(dòng)物)DNA的基因組DNA序列、和甚至合成的DNA序列。如果想要在真核細(xì)胞中表達(dá)編碼序列，則通常將聚腺苷酸化信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止序列置于編碼序列的3’端。表達(dá)載體是一種DNA分子，有線性的和環(huán)狀的，其包含編碼目標(biāo)多肽的片段，其可操作地連接于為其轉(zhuǎn)錄提供的其它片段。所述其它片段可包括啟動(dòng)子和終止子序列，和任選的一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記、增強(qiáng)子、聚腺苷酸化信號(hào)等。表達(dá)載體通常衍生自質(zhì)?；虿《綝NA，或者可包含兩者的元件。轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列是DNA調(diào)控序列，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子等，其提供編碼序列在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。在真核細(xì)胞中，聚腺苷酸化信號(hào)是控制序列?！胺置谛盘?hào)序列”是編碼如下多肽(“分泌肽(secretorypeptide)”)的DNA序列，其作為大型多肽(largerpeptide)的一部分，指導(dǎo)大型多肽通過(guò)細(xì)胞的分泌途徑而分泌，在所述細(xì)胞中合成該大型多肽。所述大型多肽通常在經(jīng)過(guò)分泌途徑的過(guò)程中被切割以去除上述分泌肽。本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”具有本領(lǐng)域公認(rèn)的含義，其表示包含用于結(jié)合RNA聚合酶并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的DNA序列的基因部分。啟動(dòng)子序列通常(但不總是)位于基因的5’非編碼區(qū)。如果一種染色體基因所編碼的多肽不再以功能性形式被表達(dá)，則將上述染色體基因成為非功能性的。此基因的非功能性可以通過(guò)多種本領(lǐng)域已知的基因操作來(lái)誘導(dǎo)，Sambrook等(見(jiàn)上文)描述了其中一些基因操作方法?；虻腛RF的部分缺失通常會(huì)使基因成為非功能性的，突變也是如此。本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“染色體基因的可表達(dá)拷貝”是指染色體基因的ORF拷貝，其中所述ORF可表達(dá)以產(chǎn)生完全功能性基因產(chǎn)物。可表達(dá)拷貝可以不由染色體基因的天然啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，其可改為由外源或異源啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，或者其可根本沒(méi)有啟動(dòng)子，僅通過(guò)存在于ORF5’端上游的基因的轉(zhuǎn)錄通讀(transcriptionalread-through)而表達(dá)。在本文中，轉(zhuǎn)錄通讀的含義與本領(lǐng)域通常所公認(rèn)的含義相同。“可操作連接的”，當(dāng)指DNA片段時(shí)，表示將片段進(jìn)行排列以使它們能夠共同發(fā)揮功能以實(shí)現(xiàn)預(yù)期目的，例如從啟動(dòng)子開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，經(jīng)過(guò)編碼片段直至終止子。當(dāng)RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后所述mRNA經(jīng)過(guò)反式RNA剪接(trans-RNAspliced)并被翻譯為由所述編碼序列編碼的蛋白時(shí)，則稱編碼序列在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列的“控制之下”?！爱愒础盌NA是指不是天然位于細(xì)胞中或所述細(xì)胞的染色體位點(diǎn)中的DNA。優(yōu)選的，異源DNA包括對(duì)所述細(xì)胞來(lái)說(shuō)是外源的基因。本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“核酸構(gòu)建體”是指cDNA、基因組DNA、合成DNA或RNA來(lái)源的任意的核酸分子。術(shù)語(yǔ)“構(gòu)建體”是指核酸片段，其可以是單鏈的或雙鏈的，并可基于編碼目標(biāo)多肽的全部或部分天然存在的核苷酸序列。構(gòu)建體可選擇地包含其它核酸片段。本發(fā)明的編碼本發(fā)明多肽的核酸構(gòu)建體可合適地為基因組或cDNA來(lái)源，例如通過(guò)制備基因組或cDNA文庫(kù)，并使用合成寡核苷酸探針根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(參見(jiàn)上文Sambrook等)，通過(guò)雜交篩選出編碼全部或部分多肽的DNA序列所得到的。本發(fā)明編碼多肽的核酸構(gòu)建體還可以通過(guò)已經(jīng)建立的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行合成制備，例如，Beaucage和Caruthers描述的亞磷酰胺(phosphoamidite)方法(TetrahedronLetters22(1981)，1859-1869)，或者M(jìn)attes等描述的方法(EMBOJournal3(1984)，801-805)。按照亞磷酰胺方法，例如在DNA自動(dòng)合成儀中合成寡核苷酸，然后經(jīng)過(guò)純化、退火、連接，并克隆到合適的載體中。此外，核酸構(gòu)建體可以是混合的合成和基因組來(lái)源的、混合的合成和cDNA來(lái)源的、或者混合的基因組和cDNA來(lái)源的，其按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過(guò)連接合成的、基因組或cDNA來(lái)源(如適當(dāng)?shù)?的片段來(lái)制備，其中上述片段對(duì)應(yīng)于完整核酸構(gòu)建體的各個(gè)部分。還可以使用特異性引物通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來(lái)制備核酸構(gòu)建體，例如US4,683,202或Saiki等(Science239(1988)，487-491)所描述的。術(shù)語(yǔ)核酸構(gòu)建體，當(dāng)其包含對(duì)于本發(fā)明編碼序列的表達(dá)來(lái)說(shuō)是必需的控制序列時(shí)，其與術(shù)語(yǔ)“表達(dá)盒”是同義的。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“控制序列”包括對(duì)于核酸序列的編碼序列的表達(dá)來(lái)說(shuō)是必需的或有利的所有組分。每個(gè)控制序列可為對(duì)于編碼多肽的核酸序列來(lái)說(shuō)是天然的或是異源的。這樣的控制序列包括但不限于，前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)序列、和轉(zhuǎn)錄終止子。控制序列最低限度包括啟動(dòng)子，和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止信號(hào)。為了導(dǎo)入特異限制性位點(diǎn)，以便于將控制序列與編碼多肽的核酸序列編碼區(qū)連接到一起，可以為控制序列提供一段接頭?？刂菩蛄锌梢允呛线m的啟動(dòng)子序列，即被宿主細(xì)胞識(shí)別以表達(dá)核酸序列的核酸序列。啟動(dòng)子序列包含介導(dǎo)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列。啟動(dòng)子可以是任意在優(yōu)選宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的核酸序列，并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因中獲得?？刂菩蛄羞€可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，即能夠被宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止子序列可操作地連接到編碼多肽的核酸序列的3’末端。在優(yōu)選宿主細(xì)胞中具有功能的任意終止子，可以在本發(fā)明中使用。控制序列還可以是聚腺苷酸化序列，即可操作地連接到核酸序列的3’末端，并且當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)，作為一種向所轉(zhuǎn)錄的mRNA上添加聚腺苷殘基的信號(hào)而被宿主細(xì)胞識(shí)別的序列。在優(yōu)選宿主細(xì)胞中具有功能的任意聚腺苷酸化序列，均可以在本發(fā)明中使用。控制序列還可以是信號(hào)肽編碼區(qū)，其所編碼的氨基酸序列連接在多肽的氨基末端，所述多肽能夠?qū)⒈磉_(dá)的多肽導(dǎo)入宿主細(xì)胞的細(xì)胞分泌途徑。核酸序列的編碼序列的5’端可以固有包含信號(hào)肽編碼區(qū)，其在翻譯閱讀框中與編碼分泌性多肽的編碼區(qū)片段天然相連?？蛇x擇地，編碼序列的5’端可以包含對(duì)于編碼分泌的多肽的編碼序列部分來(lái)說(shuō)是外源的信號(hào)肽編碼區(qū)。在編碼序列不固有地包含信號(hào)肽編碼區(qū)的情況下，需要外源信號(hào)肽編碼區(qū)。可選擇地，外源信號(hào)肽編碼區(qū)可簡(jiǎn)單地替代天然的信號(hào)肽編碼區(qū)，以獲得相對(duì)于通常與編碼序列連接的天然的信號(hào)肽編碼區(qū)來(lái)說(shuō)增強(qiáng)的胞外蛋白的分泌。信號(hào)肽編碼區(qū)可獲自曲霉屬(Aspergillus)菌種的葡糖淀粉酶或淀粉酶基因、根毛霉屬(Rhizomucor)菌種的脂肪酶或蛋白酶基因、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的α-因子基因、芽孢桿菌屬(Bacillus)菌種的淀粉酶或蛋白酶基因、或小牛前凝乳酶原(preprochymosin)基因。然而，能夠?qū)⒈磉_(dá)的多肽導(dǎo)入優(yōu)選宿主細(xì)胞的分泌途徑的任意信號(hào)肽編碼區(qū)，均可以在本發(fā)明中使用?？刂菩蛄羞€可以是前肽編碼區(qū)，其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得到的多肽稱為酶原(proenzyme)或多肽原(propolypeptide)(某些情況中稱作酶原(zymogen))。多肽原通常是無(wú)活性的，并通過(guò)催化或自主催化從多肽原中切割前肽，從而將多肽原轉(zhuǎn)化為成熟的活性多肽。前肽編碼區(qū)可獲自枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶基因(nprT)、釀酒酵母α-因子基因、或嗜熱毀絲酶(Myceliophthorathermophilum)漆酶基因(WO95/33836)。另外還預(yù)期添加調(diào)控序列，其允許相對(duì)于宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控多肽的表達(dá)。調(diào)控系統(tǒng)的實(shí)例是那些使基因的表達(dá)響應(yīng)于化學(xué)或物理的刺激，包括調(diào)控化合物的存在，而打開(kāi)或關(guān)閉的系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)控系統(tǒng)包括lac、tac、和trp操作子系統(tǒng)。指導(dǎo)本發(fā)明基因轉(zhuǎn)錄(尤其是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄)的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是獲自大腸桿菌(E.coli)lac操作子、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)瓊脂水解酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因(sacB)、枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶基因、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、解淀粉芽孢桿菌BAN淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、和原核β-內(nèi)酰胺酶(Villa-Kamaroff等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA753727-3731)、以及tac啟動(dòng)子(DeBoer等，1983，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA8021-25)的啟動(dòng)子。其它的啟動(dòng)子在“Usefulproteinsfromrecombinantbacteria”，ScientificAmerican，1980，24274-94；以及上文所提及的Sambrook等，1989的文獻(xiàn)中描述。在細(xì)菌宿主細(xì)胞中有效的信號(hào)肽編碼區(qū)是獲自芽孢桿菌NCIB11837的產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶基因、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)、和枯草芽孢桿菌PrsA基因的信號(hào)肽編碼區(qū)。其它的信號(hào)肽在Simonen和Palva，1993，MicrobiologicalReviews57109-137中描述。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸序列、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止信號(hào)的重組表達(dá)載體。還可以將上文所述的各種核酸和控制序列連接在一起，以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體可包括一個(gè)或多個(gè)方便的限制性位點(diǎn)以使編碼多肽的核酸序列在所述位點(diǎn)進(jìn)行插入或取代。可選擇地，本發(fā)明的核酸序列可以通過(guò)將包含所述序列的核酸序列或核酸構(gòu)建體插入到合適的載體而進(jìn)行表達(dá)。在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，所述編碼序列在載體中的位置使得所述編碼序列可操作地與合適的控制序列連接用于進(jìn)行表達(dá)和可能的分泌。重組表達(dá)載體可以是任意可方便地接受重組DNA操作，并且能夠使所述核酸序列表達(dá)的載體(如質(zhì)?；虿《?。載體的選擇將通常取決于載體與其將要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞的兼容性。載體可以是線性或者閉環(huán)形質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即作為存在于染色體外的實(shí)體存在的其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制的載體，如質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體、或人工染色體。載體可包含任意確保自主復(fù)制的工具。可選擇地，載體可以是如下的載體，當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，其被整合到基因組，然后與所整合的染色體一起復(fù)制。載體系統(tǒng)可以是單個(gè)載體或質(zhì)粒，或兩個(gè)或多個(gè)載體或質(zhì)粒，其共同含有將被導(dǎo)入宿主細(xì)胞的基因組的總DNA，或轉(zhuǎn)座子。本發(fā)明的載體優(yōu)選包含一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記，其允許容易地選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。選擇標(biāo)記可以是這樣的基因，其表達(dá)產(chǎn)物提供抗微生物劑抗性或病毒抗性、對(duì)于重金屬的抗性、原養(yǎng)型到營(yíng)養(yǎng)缺陷型等?？股剡x擇標(biāo)記賦予了對(duì)一些抗生素的抗生素抗性，如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、新霉素、潮霉素、或氨甲蝶呤。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞來(lái)說(shuō)，合適的標(biāo)記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。本發(fā)明的載體優(yōu)選包含使載體、或載體的較小部分穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組，或使載體在宿主細(xì)胞中不依賴于細(xì)胞基因組而自主復(fù)制的元件。載體、或載體的較小部分，如本發(fā)明的擴(kuò)增單元，當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，可以整合到宿主細(xì)胞基因組。對(duì)于染色體整合，載體可依賴于載體中編碼多肽的核酸序列，或載體的任何其它元件，用于通過(guò)同源或非同源重組將載體穩(wěn)定整合到基因組。可選擇地，載體可包含額外的核酸序列，其用于指導(dǎo)通過(guò)同源重組整合到宿主細(xì)胞基因組中。所述額外的核酸序列能夠使載體精確整合到宿主細(xì)胞基因組染色體的準(zhǔn)確位置。為了提高在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)優(yōu)選包含足夠數(shù)目的核酸，如100至1,500個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選400至1,500個(gè)堿基對(duì)，并最優(yōu)選800至1,500個(gè)堿基對(duì)，其與相應(yīng)的靶序列高度同源以增強(qiáng)同源重組的可能性。整合元件可以是任意的與宿主細(xì)胞基因組中的靶序列同源的序列。此外，整合元件可以是非編碼或編碼核酸序列；適于通過(guò)同源重組而進(jìn)行位點(diǎn)特異性整合的編碼序列的具體實(shí)例在WO02/00907(Novozymes，Denmark)中給出，其全文并入本文作為參考。另一方面，可將載體通過(guò)非同源重組而整合到宿主細(xì)胞基因組。這樣的核酸序列可以是任意的與宿主細(xì)胞基因組中的靶序列同源的序列，而且，此外，可以是非編碼或編碼序列。載體、表達(dá)盒、擴(kuò)增單元、基因或?qū)嶋H上任何確定的核苷酸序列的拷貝數(shù)是指在任一時(shí)刻存在于宿主細(xì)胞中的相同拷貝的數(shù)目?；蚧蛄硪淮_定的染色體核苷酸序列可以在染色體上存在一個(gè)、兩個(gè)或多個(gè)拷貝。自主復(fù)制載體可以在每個(gè)宿主細(xì)胞中存在一個(gè)、或幾百個(gè)拷貝。本發(fā)明的擴(kuò)增單元是指這樣的核苷酸序列，其能夠整合到宿主細(xì)胞染色體，并且其可以在宿主細(xì)胞中通過(guò)倍增復(fù)制來(lái)提高整合到染色體上的拷貝的數(shù)目。上述單元包含本文所定義的表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含至少一個(gè)目標(biāo)基因的拷貝和如本文中所定義的宿主細(xì)胞染色體基因的可表達(dá)拷貝。當(dāng)擴(kuò)增單元被整合到宿主細(xì)胞染色體時(shí)，其被定義為染色體的一個(gè)特殊區(qū)域，其易于通過(guò)兩個(gè)DNA直接重復(fù)區(qū)域之間的同源重組而得到復(fù)制。因此擴(kuò)增單元相對(duì)于兩側(cè)的DNA的精確邊界是功能性地定義的，因?yàn)閺?fù)制過(guò)程可能實(shí)際上復(fù)制部分導(dǎo)入染色體的DNA以及部分它本身的內(nèi)源染色體，這取決于重復(fù)區(qū)域內(nèi)的準(zhǔn)確重組位點(diǎn)。上述原理在Janniére等的文獻(xiàn)中(1985，StablegeneamplificationinthechromosomeofBacillussubtilis.Gene，4047-55)闡明，該文獻(xiàn)并入本文作為參考。對(duì)于自主復(fù)制，載體可進(jìn)一步包含能夠使其在所述宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177、pACYC184、pUB110、pE194、pTA1060和pAMbetal的復(fù)制起點(diǎn)。在酵母宿主細(xì)胞中使用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是2微米復(fù)制起點(diǎn)，CEN6和ARS4的組合，和CEN3和ARS1的組合。復(fù)制起點(diǎn)可以是帶有突變的復(fù)制起點(diǎn)，其中所述突變使其在宿主細(xì)胞中以溫度敏感的(temperaturesensitive)方式起作用(參見(jiàn)如Ehrlich，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA751433)。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸序列的重組宿主細(xì)胞，其有利地用于多肽的重組生產(chǎn)。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包含任何在復(fù)制過(guò)程中由于發(fā)生突變而不同于親代細(xì)胞的子代。所述細(xì)胞優(yōu)選用包含本發(fā)明的核酸序列的載體轉(zhuǎn)化，然后將該載體整合到宿主染色體中。“轉(zhuǎn)化”是指將包含本發(fā)明核酸序列的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使載體作為染色體整合子(chromosomalintegrant)或者作為自我復(fù)制的染色體外載體而被保持。通常，整合被認(rèn)為是有利的，因?yàn)檫@樣核酸序列更有可能穩(wěn)定地保持在所述細(xì)胞中。可以通過(guò)如上所述的同源或非同源重組使所述載體整合到宿主染色體中。細(xì)菌宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，可以通過(guò)例如下述的方式實(shí)現(xiàn)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)如Chang和Cohen，1979，MolecularGeneralGenetics168111-115)、使用感受態(tài)細(xì)胞(參見(jiàn)如Young和Spizizin，1961，JournalofBacteriology81823-829，或Dubnar和Davidoff-Abelson，1971，JournalofMolecularBiology56209-221)、電穿孔(參見(jiàn)如Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques6742-751)、或接合(conjugation)(參見(jiàn)如Koehler和Thorne，1987，JournalofBacteriology1695771-5278)。將上述轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中在能使目標(biāo)多肽表達(dá)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，之后從細(xì)胞或培養(yǎng)液中回收產(chǎn)生的多肽。用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任意的適用于培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)基，如基本培養(yǎng)基或包含合適添加物的復(fù)合培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基可由供應(yīng)商獲得，或可以根據(jù)公開(kāi)的配方(如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)的目錄)制備。使用本領(lǐng)域已知的方法制備上述培養(yǎng)基(細(xì)菌和酵母的參考文獻(xiàn)，參見(jiàn)如Bennett，J.W.和LaSure，L.編輯的MoreGeneManipulationsinFungi，AcademicPress，CA，1991)。通過(guò)常規(guī)方法從培養(yǎng)基中回收多肽，所述常規(guī)方法包括通過(guò)離心或過(guò)濾從培養(yǎng)基中分離出宿主細(xì)胞，使用鹽如硫酸銨沉淀所述上清液或?yàn)V液中的蛋白質(zhì)成分，通過(guò)各種層析方法，如離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、親和層析等進(jìn)行純化，使用何種層析方法這依賴于所純化多肽的類型?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的對(duì)所述多肽具有特異性的方法來(lái)檢測(cè)所述多肽。這樣的檢測(cè)方法可包括使用特異性抗體、生成酶產(chǎn)物、或酶底物的消失。例如，可以使用酶活性測(cè)定來(lái)檢測(cè)多肽的活性?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法來(lái)純化本發(fā)明的多肽，所述方法包括但不限于，層析(如離子交換層析、親和層析、疏水層析、層析聚焦和大小排阻層析)、電泳方法(如制備型等電聚焦(IEF)、溶解度差異(如硫酸銨沉淀法)、或提取(參見(jiàn)如ProteinPurification，J.-C.Janson和LarsRyden編輯，VCHPublishers，NewYork，1989)。在本上下文中，術(shù)語(yǔ)“基本上(substantially)純的多肽”是指這樣的多肽制劑，其包含至多10重量％的與所述多肽天然結(jié)合的其它多肽物質(zhì)(優(yōu)選其它多肽物質(zhì)的百分率較低，如至多8重量％，至多6重量％，至多5重量％，至多4重量％，至多3重量％，至多2重量％，至多1重量％，和至多重量％)。因此，優(yōu)選基本上純的多肽的純度為至少92％，即所述多肽占制劑中存在的總多肽物質(zhì)的至少92重量％，并優(yōu)選更高的百分率，如至少94％的純度，至少95％的純度，至少96％的純度，至少96％的純度，至少97％的純度，至少98％的純度，至少99％的純度，和最多99.5％的純度。本發(fā)明所公開(kāi)的多肽優(yōu)選是基本純的形式。具體地，優(yōu)選本發(fā)明公開(kāi)的多肽是“基本上(essentially)純的形式”，即，多肽制劑基本上不含其它與其天然結(jié)合的多肽物質(zhì)。這可以通過(guò)例如利用公知的重組方法來(lái)制備所述多肽而實(shí)現(xiàn)。在本文中，術(shù)語(yǔ)“基本純的多肽”與術(shù)語(yǔ)“分離的多肽”和“分離形式的多肽”是同義的。在本上下文中，兩個(gè)氨基酸序列或者兩個(gè)核苷酸序列之間的同源性用參數(shù)“同一性”來(lái)描述。為了本發(fā)明的目的，可以使用完全Smith-Waterman比對(duì)法來(lái)進(jìn)行序列比對(duì)和計(jì)算同源性得分，完全Smith-Waterman比對(duì)法對(duì)蛋白和DNA比對(duì)均適用。對(duì)蛋白和DNA比對(duì)，分別使用缺省計(jì)分矩陣BLOSUM50和同一性矩陣。對(duì)于缺口中的第一個(gè)殘基，蛋白的罰分是-12，DNA的罰分是-16，而對(duì)于缺口中的其它殘基，蛋白的罰分是-2，DNA的罰分是-4?？梢允褂肍ASTA包v20u6版本來(lái)進(jìn)行比對(duì)(W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，“ImprovedToolsforBiologicalSequenceAnalysis”，PNAS852444-2448，和W.R.Pearson(1990)，“RapidandSensitiveSequenceComparisonwithFASTPandFASTA”，MethodsinEnzymology，18363-98)。進(jìn)行蛋白序列的多重比對(duì)可以使用“ClustalW”(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.(1994)CLUSTALWimprovingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting，positions-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice.NucleicAcidsResearch，224673-4680)。DNA序列的多重比對(duì)可以使用蛋白比對(duì)作為模板，將其中的氨基酸用DNA序列相應(yīng)的密碼子代替。在本上下文中，YusZ或YusX蛋白的功能同源物是指這樣的蛋白，當(dāng)其在細(xì)胞中降低表達(dá)水平時(shí)，使異源多肽(優(yōu)選一種酶，如α-淀粉酶)的分泌與正常表達(dá)YusZ或YusX功能同源物的等基因細(xì)胞相比增加，其都是在基本上相同的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的。此外，當(dāng)如上文所述進(jìn)行比對(duì)時(shí)，YusZ或YusX蛋白的功能同源物分別與YusZ或YusX蛋白具有至少50％，優(yōu)選55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％，或最優(yōu)選99％的氨基酸序列同一性。在本上下文中，術(shù)語(yǔ)“等位基因變體”表示占據(jù)同一染色體基因座的兩個(gè)或多個(gè)基因可選形式中的任一個(gè)。等位基因變體可以通過(guò)突變自然出現(xiàn)，同時(shí)可能在群體中形成多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?即所編碼的多肽沒(méi)有發(fā)生變化)，或者可編碼氨基酸序列發(fā)生變化的多肽。多肽的等位變體是指由基因的等位基因變體編碼的多肽。本文所定義的功能同源物包括等位基因變體。YusZ或YusX蛋白或其功能同源物可以是從自然界分離并鑒定的野生型的蛋白。上述野生型蛋白可以通過(guò)本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行特定篩選。此外，編碼YusZ或YusX蛋白或其功能同源物的基因，可以通過(guò)DNA改組技術(shù)來(lái)制備，如在J.E.Ness等NatureBiotechnology17893-896(1999)中所描述的。另外，YusZ或YusX蛋白或其功能同源物可以是人工變體。所述人工變體可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如通過(guò)定點(diǎn)/隨機(jī)誘變來(lái)構(gòu)建。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，氨基酸的改變(在人工變體以及野生型多肽中)是較少天然的，其為不明顯影響蛋白的折疊和/或活性的保守性氨基酸取代；小缺失，通常為一個(gè)到大約30個(gè)氨基酸的缺失；小氨基或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸殘基；小接頭肽，多至大約20-25個(gè)殘基；或小延伸，其通過(guò)改變凈電荷或其它功能而有利于純化，如多組氨酸束(poly-histidinetract)、抗原表位或結(jié)合域。保守取代的實(shí)例是在堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和甲硫氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸)的組內(nèi)的氨基酸取代。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代在本領(lǐng)域是已知的，并例如在H.Neurath和R.L.Hill，1979，TheProteins，AcademicPress，NewYork中描述。最經(jīng)常發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly以及它們的反向交換。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，上述修飾可以發(fā)生在分子功能關(guān)鍵區(qū)的外面，從而使多肽仍然保持其活性。因此，對(duì)于本發(fā)明核苷酸序列所編碼多肽的活性必需的氨基酸殘基，并由此優(yōu)選不進(jìn)行修飾，如取代，可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(alaninescanningmutagenesis)(參見(jiàn)如Cunningham和Wells，1989，Science2441081-1085)來(lái)鑒定。在后一項(xiàng)技術(shù)中，在分子中的每個(gè)帶正電荷的殘基導(dǎo)入突變，并測(cè)試所得到的突變分子的活性，以鑒定出對(duì)于分子的活性來(lái)說(shuō)必需的氨基酸殘基。還可以通過(guò)三維結(jié)構(gòu)分析技術(shù)來(lái)測(cè)定底物-酶相互作用的位點(diǎn)，如通過(guò)如核磁共振分析、晶體學(xué)或光親和標(biāo)記(參見(jiàn)如Vos等，1992，Science255306-312；Smith等，1992，JournalofMolecularBiology224899-904；Wlodaver等，1992，F(xiàn)EBSLetters30959-64)的技術(shù)所測(cè)定的。此外，可以通過(guò)導(dǎo)入核苷酸取代來(lái)修飾編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列，其中上述核苷酸取代不造成由核苷酸序列編碼的多肽的氨基酸序列的改變，但其相應(yīng)于用來(lái)生產(chǎn)酶的宿主生物的密碼子使用特征(codonusage)。向核苷酸序列中導(dǎo)入突變，使其中一個(gè)核苷酸交換為另外一個(gè)核苷酸，可以使用本領(lǐng)域已知的任意方法通過(guò)定點(diǎn)誘變而實(shí)現(xiàn)。特別有用的方法是，使用帶有目標(biāo)插入物的超螺旋雙鏈DNA載體，和兩條包含所需突變的合成引物。每條互補(bǔ)于載體的相反鏈的寡核苷酸引物在使用PfuDNA聚合酶的溫度循環(huán)過(guò)程中進(jìn)行延伸。由于引物的摻入，生成含有交錯(cuò)切口的突變質(zhì)粒。在進(jìn)行完溫度循環(huán)之后，將產(chǎn)物用DpnI進(jìn)行處理，其中Dpnl特異于甲基化和半甲基化的DNA，以將親代DNA模板消化并選擇出含有突變的合成DNA。還可以使用本領(lǐng)域已知的其它方法。關(guān)于核苷酸取代的一般性描述參見(jiàn)如Ford等，1991，ProteinExpressionandPurification295-107。附圖附圖1顯示如下文實(shí)施例7所描述的染色的或標(biāo)記的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)的凝膠。通過(guò)PAGE，檢測(cè)了來(lái)自yusZ-缺失菌株(ANaprH-b)的四份獨(dú)立分離物的蛋白酶產(chǎn)量(附圖1，1-4號(hào))，并與來(lái)自其它等基因?qū)φ站?ANaprH)的四份獨(dú)立分離物的蛋白酶產(chǎn)量進(jìn)行了比較，PAGE凝膠上標(biāo)記的蛋白酶條帶的濃度的差異清楚地顯示yusZ-缺失菌株(ANaprH-b)比相應(yīng)的參考菌株(ANaprH)產(chǎn)生了更多的蛋白酶。發(fā)明概述枯草芽孢桿菌yusZ的DNA序列顯示在SEQIDNO1中，推定的編碼氨基酸序列顯示在SEQIDNO2中，枯草芽孢桿菌yusX的DNA序列顯示在SEQIDNO3中，推定的編碼氨基酸序列顯示在SEQIDNO4中；枯草芽孢桿菌yusY的DNA序列顯示在SEQIDNO5中，推定的編碼氨基酸序列顯示在SEQIDNO6中。地衣芽孢桿菌yusZ的DNA編碼序列顯示在SEQIDNO24中，推定的編碼氨基酸序列顯示在SEQIDNO25中。本發(fā)明所要解決的問(wèn)題是如何提高在原核細(xì)胞中生產(chǎn)的異源多肽的分泌。本發(fā)明提供了突變的原核細(xì)胞，其與各自相應(yīng)的其它等基因但未突變的細(xì)胞相比，降低了YusZ(SEQIDNO’s2或25)、YusX(SEQIDNO4)、或其同源物的表達(dá)水平，并分泌較高量的至少一種目標(biāo)異源多肽。通常，在相同的生長(zhǎng)條件下，將本發(fā)明的突變細(xì)胞與未突變的親本細(xì)胞相比，其中所述突變體來(lái)源于未突變的親本細(xì)胞；除了導(dǎo)致YusZ或YusX表達(dá)水平降低的突變外，親本細(xì)胞與突變細(xì)胞是完全等基因的。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在原核宿主細(xì)胞中降低YusZ或YusX的表達(dá)水平能夠提高分泌的異源多肽的產(chǎn)量。此結(jié)果對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)分泌的多肽例如酶是非常令人感興趣的。因此，在第一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種突變的原核細(xì)胞，其與其它等基因但未突變的細(xì)胞相比，降低了YusZ(SEQIDNO’s2或25)、YusX(SEQIDNO4)、或其同源物的表達(dá)水平，并分泌較高量的至少一種目標(biāo)異源多肽。在第二個(gè)方面中，本發(fā)明涉及構(gòu)建突變的原核細(xì)胞的方法，所述方法包含如下步驟a)對(duì)原核細(xì)胞進(jìn)行突變；和b)篩選那些與其它等基因但未突變的細(xì)胞相比，降低了YusZ(SEQIDNO’s2或25)或YusX(SEQIDNO4)、或其同源物的表達(dá)水平，并分泌較高量的至少一種目標(biāo)異源多肽的突變細(xì)胞。本發(fā)明的最后一個(gè)方面涉及生產(chǎn)目標(biāo)多肽的方法，所述方法包含如下步驟a)培養(yǎng)突變的原核細(xì)胞，其與其它的等基因但未突變的細(xì)胞相比，降低了YusZ(SEQIDNO’s2或25)、YusX(SEQIDNO4)、或其同源物表達(dá)水平，并分泌較高量的目標(biāo)多肽；和b)分離目標(biāo)多肽。發(fā)明詳述本發(fā)明的第一方面涉及一種突變的原核細(xì)胞，其與其它等基因但未突變的細(xì)胞相比，降低了YusZ(SEQIDNO’s2或25)、YusX(SEQIDNO4)、或其同源物的表達(dá)水平，并分泌較高量的至少一種目標(biāo)異源多肽。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式涉及第一方面的細(xì)胞，其是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞，優(yōu)選是芽孢桿菌屬細(xì)胞，更優(yōu)選是嗜堿芽孢桿菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(B.brevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)、B.clausii、凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)、燦爛芽孢桿菌(B.lautus)、遲緩芽孢桿菌(B.lentus)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、或蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)細(xì)胞；或涉及第二或第三方面的方法，其中所述細(xì)胞如上所列。在本文中，YusZ或YusX蛋白的進(jìn)化同源物(evolutionaryhomologue)、等位基因變體、人工變體、改組蛋白、種間變體(speciesvariant)等等，均被稱作YusZ或YusX蛋白或“功能同源物”(functionalhomologue)，并且本發(fā)明人預(yù)期在本發(fā)明的細(xì)胞和方法中降低上述功能同源物蛋白的表達(dá)將同等有效。特別地，優(yōu)選的實(shí)施方式涉及如下的細(xì)胞，其中YusZ或YusX蛋白或其功能同源物包含分別與SEQIDNO2或SEQIDNO4所示氨基酸序列具有至少70％同一性的氨基酸序列；優(yōu)選分別與SEQIDNO2或SEQIDNO4所示氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、或甚至99％的同一性的氨基酸序列。另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式涉及本發(fā)明的細(xì)胞、或本發(fā)明的方法，其中的YusZ或YusX蛋白或其功能同源物包含或分別由SEQIDNO2或SEQIDNO4所示的氨基酸序列組成。基于yusX和yusY基因在操縱子中的結(jié)構(gòu)(organisation)，降低YusX的表達(dá)可以通過(guò)突變上述編碼基因，或通過(guò)突變操縱子緊鄰上游的開(kāi)放閱讀框即yusY來(lái)實(shí)現(xiàn)。相應(yīng)地，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，降低YusZ或YusX或其同源物的表達(dá)是通過(guò)突變一個(gè)或多個(gè)相對(duì)應(yīng)的編碼基因來(lái)實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明的細(xì)胞優(yōu)選在yusZ(SEQIDNOs1或24)、yusX(SEQIDNO3)、和/或yusY(SEQIDNO5)、或其同源物中突變；而且優(yōu)選地，所述yusZ、yusX、和/或yusY的同源物編碼具有分別與SEQIDNOs2或25、SEQIDNO4、或SEQIDNO6所示序列具有至少70％同一性；或者優(yōu)選分別與SEQIDNOs2、SEQIDNO4、或SEQIDNO6所示氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、或甚至99％的同一性的氨基酸序列的多肽；最優(yōu)選地，所述yusZ、yusX、和/或yusY的同源物具有分別與SEQIDNO’s1或24、SEQIDNO3、或SEQIDNO5所示序列具有至少70％同一性；或優(yōu)選分別與SEQIDNOs1或24、SEQIDNO3、或SEQIDNO5所示序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、或甚至99％的同一性的核苷酸序列。如本文中的其他地方所述，在細(xì)胞中鑒定功能性yusZ、yusX或YusY基因的一種方法是通過(guò)雜交。因此，優(yōu)選的實(shí)施方式涉及第一方面的細(xì)胞，或第二或第三方面的方法，其中所述細(xì)胞在至少一個(gè)多核苷酸突變，其中所述至少一個(gè)多核苷酸中的至少100bp大小的亞序列與具有SEQIDNOs1或24、SEQIDNO3、或SEQIDNO5所示序列或其各自的互補(bǔ)序列的多核苷酸在非常低到非常高嚴(yán)緊性雜交條件下，優(yōu)選非常低、低、中度、中高、高度或非常高的嚴(yán)緊雜交條件下雜交。本發(fā)明的細(xì)胞可以用任何合適的方式進(jìn)行突變，而且進(jìn)行上述誘變的方法在本領(lǐng)域是公知的。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式涉及第一方面的細(xì)胞，其中的yusZ、yusX、和/或yusY，或其同源物從染色體中部分或全部缺失。另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式涉及如下的細(xì)胞，其中的yusZ、yusX、和/或yusY，或其同源物包含至少一個(gè)移碼突變或無(wú)義突變。本發(fā)明的突變細(xì)胞與其它的等基因但未突變的細(xì)胞如親本細(xì)胞相比，降低了YusZ或YusX蛋白、或其功能類似物的表達(dá)水平。應(yīng)通過(guò)如下來(lái)進(jìn)行對(duì)比在基本相同的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)胞以及等基因但未突變的細(xì)胞，然后通過(guò)本領(lǐng)域任意標(biāo)準(zhǔn)方法比較YusZ或YusX蛋白的量。優(yōu)選本發(fā)明的細(xì)胞比未突變細(xì)胞少產(chǎn)生至少5％的YusZ或YusX，更優(yōu)選至少10％、還更優(yōu)選至少20％、最優(yōu)選至少50％的YusZ或YusX蛋白或其功能同源物。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞與其它等基因但未突變的細(xì)胞相比，YusZ或YusX或其同源物的表達(dá)水平降低了至少兩倍；優(yōu)選所述細(xì)胞與其它等基因但未突變的細(xì)胞相比，檢測(cè)不到Y(jié)usZ或YusX或其同源物的表達(dá)。正如本發(fā)明人在此所顯示的，在基本相同的條件下培養(yǎng)時(shí)，第一方面的細(xì)胞比對(duì)應(yīng)的等基因但未突變的細(xì)胞，分泌更大量的目標(biāo)異源多肽。因此，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式涉及第一方面的細(xì)胞，其比其它等基因但未突變的細(xì)胞分泌更大量的目標(biāo)異源多肽。優(yōu)選本發(fā)明的細(xì)胞比未突變細(xì)胞多分泌至少5％、更優(yōu)選至少10％、還更優(yōu)選至少20％、最優(yōu)選至少50％?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域任意合適的分析方法來(lái)檢測(cè)由所述細(xì)胞分泌的異源多肽的量；在下文中顯示了一個(gè)非限制性的檢測(cè)α淀粉酶分泌量的實(shí)例。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述至少一種異源多肽包含酶，優(yōu)選所述酶是裂合酶、連接酶、水解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶或異構(gòu)酶。將編碼異源多肽的多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)拷貝穩(wěn)定地整合到原核細(xì)胞的染色體的方法在本領(lǐng)域中被充分地描述，如WO94/14968、WO99/41358、WO91/09129、WO02/00907或WO01/90393，上述文獻(xiàn)在此全部并入作為參考。因此，在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)染色體整合的編碼所述至少一種異源多肽的多核苷酸的拷貝。本領(lǐng)域技術(shù)人員非常清楚，在多肽的工業(yè)化生產(chǎn)中，提高編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸的表達(dá)是有利的，而且增強(qiáng)啟動(dòng)子強(qiáng)度是提高表達(dá)的途徑之一，這在本領(lǐng)域中是公知常識(shí)，參見(jiàn)WO99/43835、WO93/10249、WO98/07846、或WO03/008575，上述文獻(xiàn)在此全文并入作為參考。優(yōu)選的實(shí)施方式涉及本發(fā)明的細(xì)胞，其中的所述至少一種異源多肽由從至少一個(gè)異源啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的多核苷酸編碼，優(yōu)選所述至少一個(gè)啟動(dòng)子包含人工啟動(dòng)子，更優(yōu)選所述人工啟動(dòng)子包含一個(gè)或多個(gè)mRNA穩(wěn)定序列(mRNAstabilizingsequence)，優(yōu)選衍生自cryIIIa啟動(dòng)子。實(shí)施例材料與方法菌株枯草芽孢桿菌168，F(xiàn).Kunst等，“ThecompletegenomesequenceoftheGram-positivebacteriumBacillussubtilis”，Nature(1997)390249-256?？莶菅挎邨U菌AN83，該菌株是攜帶質(zhì)粒pKTH10的枯草芽孢桿菌168，其中所述質(zhì)粒組成型地大量表達(dá)淀粉酶?？莶菅挎邨U菌AN133，該菌株是缺失yusZ基因的枯草芽孢桿菌168菌株?？莶菅挎邨U菌AN137，該菌株是攜帶質(zhì)粒pKTH10的AN133，其中所述質(zhì)粒組成型地大量表達(dá)淀粉酶?？莶菅挎邨U菌AN151，該菌株是缺失yusX基因的枯草芽孢桿菌168菌株。枯草芽孢桿菌AN155，該菌株是攜帶質(zhì)粒pKTH10的AN151，其中所述質(zhì)粒組成型地大量表達(dá)淀粉酶。地衣芽孢桿菌SJ1707，該菌株在美國(guó)專利No.5,698,415中描述。地衣芽孢桿菌AN10R，該菌株是將SJ1707進(jìn)行基因工程改造以過(guò)量表達(dá)來(lái)自NocardiopsisprasinaNRLL18262(WO1988/003947)的蛋白酶10R。地衣芽孢桿菌AN10R-b，該菌株是缺失yusZ基因的地衣芽孢桿菌AN10R菌株。地衣芽孢桿菌ANaprH，該菌株是將SJ1707進(jìn)行基因工程改造以過(guò)量表達(dá)來(lái)自Bacillusclausii的aprH堿性蛋白酶基因。地衣芽孢桿菌ANaprH-b，該菌株是缺失yusZ基因的地衣芽孢桿菌ANaprH菌株。枯草芽孢桿菌PP289-5，用于接合轉(zhuǎn)移包含來(lái)自pUB110(在WO96/23073中描述)的oriT的質(zhì)粒的供體菌株?？莶菅挎邨U菌AN220，該菌株是將枯草芽孢桿菌168進(jìn)行基因工程改造以過(guò)量表達(dá)來(lái)自解淀粉芽孢桿菌的apr堿性蛋白酶基因。枯草芽孢桿菌AN225，該菌株是缺失yusZ基因的AN220。引物yusZ1F(SEQIDNO7)ccttcccggggctaagcttttcggcyusZ2R(SEQIDNO8)gatagactcccacgcgctggacgctcctgtyusZ2F(SEQIDNO9)acaggagcgtccagcgcgtgggagtctatcyusZ3R(SEQIDNO10)aacggtaccctgaccaagcagacagyusX1F(SEQIDNO11)aatgcccgggcaagctttacagctgyusX2R(SEQIDNO12)ggcgtcacgcacagcaacgagcgacgattgyusX2F(SEQIDNO13)caatcgtcgctcgttgctgtgcgtgacgccyusX3R(SEQIDNO14)aatcggtaccatcataatgactgtcyusZlich1F(SEQIDNO19)tcagcagcccgcggagcagccgttttaatggaaccyusZlich2R(SEQIDNO20)atgaccgcacgttcccaaatgctcgtcgcgcccgttacaayusZlich3F(SEQIDNO21)ttgtaacgggcgcgacgagcatttgggaacgtgcggtcatyusZlich4R(SEQIDNO22)gcggatttgacgtcaatcgcttaccagtgcggaaac質(zhì)粒pKTH10VehmaanperaJ，SteinbornG，HofemeisterJ.，“GeneticmanipulationofBacillusamyloliquefaciens.”，JBiotechnol，1990-07，19(2-3)221-40。該質(zhì)粒組成型表達(dá)解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶(AmyQ)。pSJ6410質(zhì)粒pSJ2739(在美國(guó)專利6,100,063中描述)的衍生質(zhì)粒，pSJ2739又是衍生自pE194，在復(fù)制上屬于天然溫度敏感型。PSJ6410由pE194復(fù)制子、以及衍生自質(zhì)粒pUB110的片段、和地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因、以及在該基因前面的來(lái)自蘇云金芽孢桿菌cryIIIA調(diào)控區(qū)的片段組成。這些額外的片段對(duì)于使用pSJ6410在本發(fā)明中作為載體是不相關(guān)的。pAN28通過(guò)將用限制酶XmaI和KpnI酶切的PCR產(chǎn)物yuszSOEpcr(SEQIDNO15)連接到pSJ6410質(zhì)粒用XmaI-KpnI酶切后的大的片段上。上述質(zhì)粒包含pE194的溫度敏感復(fù)制起點(diǎn)，被用于通過(guò)雙交換事件(doublecross-overevent)將yusZ基因從枯草芽孢桿菌168的染色體中缺失。PCR產(chǎn)物yuszSOEpcr是利用重疊延伸的剪接(splicingbyoverlapextension)技術(shù)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生的(SOEbyPCR，HortonRM等，Biotechniques，1990-05；8(5)528-35)。兩個(gè)中間PCR產(chǎn)物，PCR1和PCR2，在末端都有一小段對(duì)方的序列，在第二階段的PCR過(guò)程中將其混合在一起，從而產(chǎn)生最終的剪接產(chǎn)物，yuszSOEpcr。PCR1是通過(guò)使用引物yusZ1F和yusZ2R得到的，其包含yusZ上游序列(655bp)。PCR2是通過(guò)使用引物yusZ2F和yusZ3R得到的，其包含yusZ下游序列(690bp)。將枯草芽孢桿菌168的染色體DNA作為PCR的模板。在第二階段的PCR過(guò)程中，以PCR1和PCR2作為模板，以yusZ1F和yusZ3R作為引物，從而得到所述剪接產(chǎn)物(1315bp)，其中的yusZ基因從編碼280個(gè)氨基酸縮減到僅編碼25個(gè)氨基酸。質(zhì)粒pAN28的完整核苷酸序列顯示在SEQIDNO16中。pAN23通過(guò)將用限制酶XmaI和KpnI酶切的PCR產(chǎn)物yusxSOEpcr(SEQIDNO17)連接到pSJ6410質(zhì)粒用XmaI-KpnI酶切后的大的片段上。上述質(zhì)粒包含pE194的溫度敏感復(fù)制起點(diǎn)，被用于通過(guò)雙交換事件將yusX基因從枯草芽孢桿菌168的染色體中缺失。PCR產(chǎn)物yusxSOEpcr是利用重疊延伸的剪接技術(shù)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生的(SOEbyPCR，HortonRM等，Biotechniques，1990-05；8(5)528-35)。兩個(gè)中間PCR產(chǎn)物，PCR1和PCR2，在末端都有一小段對(duì)方的序列，在第二階段的PCR過(guò)程中將其混合在一起，從而產(chǎn)生最終的剪接產(chǎn)物，yusxSOEpcr。PCR1是通過(guò)使用引物yusX1F和yusX2R得到的，其包含yusX上游序列(560bp)。PCR2是通過(guò)使用引物yusX2F和yusX3R得到的，其包含yusX下游序列(560bp)。將枯草芽孢桿菌168的染色體DNA用作PCR的模板。在第二階段的PCR過(guò)程中，以PCR1和PCR2作為模板，以yusX1F和yusX3R作為引物，從而得到所述剪接產(chǎn)物(1090bp)，其中的yusX基因從500個(gè)氨基酸縮減到27個(gè)氨基酸。質(zhì)粒pAN23的完整序列顯示在SEQIDNO18中。pAN212b質(zhì)粒pSJ2739(在美國(guó)專利6,100,063中描述)的衍生質(zhì)粒，pSJ2739又是pE194的衍生質(zhì)粒，pE194在復(fù)制上屬于天然溫度敏感型。pAN212b由pE194復(fù)制子、以及衍生自質(zhì)粒pUB110的片段組成。質(zhì)粒pAN212b的完整序列顯示在SEQIDNO23中。常規(guī)分子生物學(xué)方法除非另有所述，DNA操作和轉(zhuǎn)化均使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法來(lái)進(jìn)行(Sambrook等(1989)，MolecularcloningAlaboratorymanual，ColdSpringHarborlab，ColdSpringHarbor，NY；Ausubel，F(xiàn).M.等(編著)，“CurrentprotocolsinMolecularBiology”，JohnWiley和Sons，1995；Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(編著)，“MolecularBiologicalMethodsforBacillus”，JohnWileyandSons，1990)。DNA操作時(shí)酶的使用按照供應(yīng)商的說(shuō)明來(lái)進(jìn)行(例如限制性核酸內(nèi)切酶、連接酶等可獲自NewEnglandBiolabs，Inc.)。感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化如下列文獻(xiàn)中所述，Yasbin，R.E.，Wilson，G.A.和Young，F(xiàn).E.(1975)，TransformationandtransfectioninlysogenicstrainsofBacillussubtilisevidenceforselectiveinductionofprophageincompetentcells.J.Bacteriol，121296-304。培養(yǎng)基LB瓊脂如Ausubel，F(xiàn).M.等(編著)，“CurrentprotocolsinMolecularBiology”，JohnWileyandSons，(1995)中所述。LBP在LB瓊脂中添加0.05M的磷酸鉀，pH7.0。LBPG在LB瓊脂中添加0.5％的葡萄糖(Glucose)和0.05M磷酸鉀，pH7.0。LBPSK在LB瓊脂中添加0.05M的磷酸鉀，pH7.0和1％的脫脂乳。BPX如EP0506780(WO91/09129)中所述。發(fā)酵在裝有100mlBPX的搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵，來(lái)評(píng)估淀粉酶的產(chǎn)量，發(fā)酵條件是37℃，300rpm，發(fā)酵7天。收獲10ml的培養(yǎng)物，10,000(10.000)g離心以去除細(xì)胞和碎片。澄清的上清液用于分析α-淀粉酶的活性。α-淀粉酶活性分析以4，6-亞乙基(G7)-p-硝基苯基(G1)-α，D-麥芽七糖苷(maltoheptaoside)(亞乙基-G7PNP)作為底物，通過(guò)酶促比色試驗(yàn)法來(lái)檢測(cè)α-淀粉酶的活性(BoehringerMannheim，Germanyart.1442309)。在特定的一系列條件下(溫度、pH值、反應(yīng)時(shí)間、緩沖液條件)，1mg的給定α-淀粉酶將水解一定量的底物，從而生成黃色。在405nm下測(cè)定顏色強(qiáng)度(colourintensity)。在給定的一系列條件下，測(cè)定得到的吸光度與所述α-淀粉酶的活性成正比。蛋白酶分析在微量滴定板中利用分光光度法測(cè)定蛋白酶活性。蛋白酶水解切割寡肽N-suc-ala-ala-pro-phe-pNA(L-1400，Bachem)生成黃色，可以在405nm下檢測(cè)。實(shí)施例1枯草芽孢桿菌yusZ-缺失突變株的構(gòu)建通過(guò)PCR利用SOE產(chǎn)生1315bp的yuszSOEpcrDNA片段，其包含yusZ基因的同閱讀框(in-frame)的255個(gè)氨基酸缺失，然后克隆到帶有溫度敏感復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒(pSJ6410)，生成質(zhì)粒pAN28。將pAN28通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到枯草芽孢桿菌168菌株，并在45℃下(非允許溫度)，在添加了1微克/mlerm的LBPG培養(yǎng)基上鋪板培養(yǎng)以篩選整合子(intergant)。將這些培養(yǎng)板上的轉(zhuǎn)化子在yusZ-上游或yusZ-下游基因座處通過(guò)單(erm+)交換事件整合了上述質(zhì)粒。質(zhì)?？梢砸詢煞N方式之一被切除，其中之一產(chǎn)生野生型菌株，另外一種情況中產(chǎn)生yusZ基因被yuszSOEpcr(ΔyusZ)取代的菌株。為了進(jìn)行切除、篩選和鑒定缺失yusZ的菌株，將上述整合子接種到10ml的LB中，并在30℃生長(zhǎng)過(guò)夜(允許溫度)。將100微升長(zhǎng)出的(outgrown)整合子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到10mlLB，并在30℃再次生長(zhǎng)過(guò)夜。將細(xì)胞在LBPG上鋪板，溫度為30℃，然后通過(guò)影印平板法，將其中發(fā)生雙交換(整合-切除)的菌株標(biāo)記為erm-。采用yusZ1F和yusZ3R引物對(duì)菌株進(jìn)行PCR分析，以檢測(cè)發(fā)生了雙交換事件的菌株中野生型(2155bp)或缺失型(1315bp)的yusZ基因的存在。分離yusZ-缺失的菌株，命名為AN133，并且通過(guò)對(duì)涵蓋完整yuszSOEpcr區(qū)(引物yusZ1F和yusZ3R)的全面序列分析來(lái)驗(yàn)證上述缺失。實(shí)施例2枯草芽孢桿菌yusZ-缺失突變株的淀粉酶產(chǎn)量用質(zhì)粒pKTH10轉(zhuǎn)化AN133，其組成型表達(dá)解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶AmyQ。所得到的菌株命名為AN137。由兩份獨(dú)立的分離物一式三份地檢測(cè)AN137的淀粉酶產(chǎn)量，并與對(duì)照菌株AN83的淀粉酶產(chǎn)量進(jìn)行比較。AN137菌株(ΔyusZ)與對(duì)照菌株AN83相比提高了α-淀粉酶的產(chǎn)量，平均產(chǎn)量高于對(duì)照菌株AN83，達(dá)205％，其中對(duì)照菌株AN83攜帶的是野生型的yusZ基因。結(jié)果如表1所示。表1AN137菌株(ΔyusZ)以及對(duì)照菌株AN83的淀粉酶產(chǎn)量。實(shí)施例3枯草芽孢桿菌yusX-缺失突變株的構(gòu)建通過(guò)PCR利用SOE產(chǎn)生1090bp的yusxSOEpcrDNA片段，其包含yusX基因的473個(gè)氨基酸的同閱讀框缺失，并將其克隆到帶有溫度敏感復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒(pSJ6410)，得到質(zhì)粒pAN23，如上所述。將pAN23通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入枯草芽孢桿菌168菌株，并在45℃下(非允許溫度)，在添加了1微克/mlerm的LBPG培養(yǎng)基上鋪板培養(yǎng)以篩選出整合子。這些培養(yǎng)板上的轉(zhuǎn)化子在yusX-上游或yusX-下游基因座處通過(guò)單(erm+)交換事件整合了上述質(zhì)粒。切除質(zhì)?？梢杂袃煞N方式，其中之一將產(chǎn)生野生型菌株，在另外一種情況下將產(chǎn)生yusX基因被yusxSOEpcr(ΔyusX)取代的菌株。為了進(jìn)行切除、篩選和鑒定缺失yusX的菌株，將上述整合子接種到10ml的LB，并在30℃生長(zhǎng)過(guò)夜(允許溫度)。將100微升長(zhǎng)出的整合子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到10mlLB，并再次在30℃生長(zhǎng)過(guò)夜。將細(xì)胞在LBPG上在30℃鋪板，然后通過(guò)影印平板法，將發(fā)生雙交換(整合-切除)的菌株標(biāo)記為erm-。用引物yusX1F和yusX3R對(duì)菌株上進(jìn)行PCR，以檢測(cè)發(fā)生了雙交換的菌株中野生型(2539bp的PCR產(chǎn)物)或截短的(1090bp的PCR產(chǎn)物)yusX基因的存在。將yusX-缺失的菌株命名為AN151，并且通過(guò)涵蓋完整yusxSOEpcr區(qū)(引物yusX1F和yusX3R)的全面序列分析來(lái)驗(yàn)證。實(shí)施例4枯草芽孢桿菌yusX-缺失突變株的淀粉酶產(chǎn)量用質(zhì)粒pKTH10轉(zhuǎn)化yusX-缺失突變株AN151，其中上述質(zhì)粒組成型表達(dá)解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶AmyQ。所得到的菌株命名為AN155。由兩份獨(dú)立的分離物一式二份地檢測(cè)AN155的淀粉酶產(chǎn)量，并與對(duì)照菌株AN83的淀粉酶產(chǎn)量進(jìn)行比較。結(jié)果如表2所示，yusX缺失的AN155菌株與對(duì)照菌株AN83相比，提高了α-淀粉酶的產(chǎn)量，平均產(chǎn)量高于對(duì)照菌株AN83，達(dá)239％，其中對(duì)照菌株AN83攜帶的是野生型yusX基因的拷貝。表2AN137菌株(yusX-缺失突變株)和對(duì)照菌株AN83的淀粉酶產(chǎn)量。實(shí)施例5地衣芽孢桿菌yusZ缺失突變株的構(gòu)建可以通過(guò)任意可用的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)缺失地衣形芽孢桿菌的yusZ基因。地衣芽孢桿菌的基因組序列是可公開(kāi)得到的；地衣芽孢桿菌yusZ基因的序列如SEQIDNO24所示，其所編碼的多肽如SEQIDNO25所示。例如，可以使用如上所述的(在“質(zhì)?！辈糠?，pAN28)通過(guò)重疊延伸拼接(SOE-PCR)的技術(shù)產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。PCR1可包含yusZ上游序列，其可以使用yusZlich1F和yusZlich2R作為引物，使用SJ1707染色體DNA作為模板在PCR反應(yīng)中生成。PCR2可包含yusZ下游序列，其可以使用yusZlich3F和yusZlich4R作為引物，以SJ1707的染色體DNA作為模板在另外的PCR反應(yīng)中生成。在第二階段的PCR過(guò)程中，使用PCR1和PCR2作為模板，以yusZlich1F和yusZlich4R作為引物，產(chǎn)生剪接產(chǎn)物(991bp，稱作yuzZlichSOE)，其中yusZ基因由編碼280個(gè)氨基酸減至僅編碼25個(gè)氨基酸?？赏ㄟ^(guò)將yusZlichSOE克隆到溫度敏感型質(zhì)粒pAN212b的BsaHI-SacII位點(diǎn)來(lái)構(gòu)建稱為“缺失質(zhì)粒(deletionplasmid)”的質(zhì)粒-得到質(zhì)粒pAN212b-yusZ(＝缺失質(zhì)粒)。質(zhì)粒pAN212b-yusZ的完整序列如SEQIDNO26所示?？蓪⑸鲜鋈笔з|(zhì)粒轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌接合供體菌株P(guān)P289-5(其包含染色體dal-缺失，和質(zhì)粒pBC16和pLS20)的感受態(tài)細(xì)胞，并通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)方法(如WO02/00907所述)接合到地衣芽孢桿菌AN10R和ANaprH菌株。然后可將yusZ缺失從缺失質(zhì)粒通過(guò)(由整合和切除溫度敏感的質(zhì)粒介導(dǎo)的)PCR1和PCR2的雙同源重組轉(zhuǎn)移到目標(biāo)地衣芽孢桿菌菌株的染色體(如實(shí)施例2所述)?？梢允褂靡飝usZlich1F和yusZlich4R通過(guò)PCR來(lái)鑒定yusZ-缺失的菌株，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)序列分析進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)施例6地衣芽孢桿菌yusZ-缺失突變株的10R蛋白酶產(chǎn)量將地衣芽孢桿菌菌株SJ1707進(jìn)行改造以非常高水平地表達(dá)NocardiopsisprasinaNRLL18262(AN10R)的蛋白酶10R。由AN10R缺失yusZ基因得到AN10R-b。由四份獨(dú)立的分離物一式二份地檢測(cè)AN10R-b的蛋白酶產(chǎn)量，并與對(duì)照菌株AN10R的蛋白酶產(chǎn)量進(jìn)行比較。AN10R-b菌株(yusZ-缺失突變株)與對(duì)照菌株AN10R相比，提高了蛋白酶的產(chǎn)量，比AN10R平均高出72％。結(jié)果如表3所示。表3AN10R-b菌株(yusZ-缺失突變株)和對(duì)照菌株An10R的蛋白酶10R的產(chǎn)量。實(shí)施例7地衣芽孢桿菌yusZ-缺失突變株的AprH蛋白酶產(chǎn)量將地衣芽孢桿菌菌株SJ1707改造以高水平表達(dá)Bacillusclausii(ANaprH)的aprH蛋白酶基因。ANaprH缺失yusZ基因得到ANaprH-b菌株。由四份獨(dú)立的分離物測(cè)定ANaprH-b的蛋白酶產(chǎn)量(圖1，1-4號(hào))并與來(lái)自對(duì)照菌株ANaprH的四份獨(dú)立的分離物的蛋白酶產(chǎn)量，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)進(jìn)行比較，其中凝膠被標(biāo)記以使蛋白酶可見(jiàn)。如圖1所示，丙烯酰胺凝膠上標(biāo)記的蛋白酶條帶的濃度差別清楚地顯示yusZ-缺失菌株(ANaprH-b)比對(duì)應(yīng)的參考菌株(ANaprH)產(chǎn)生更多的aprH編碼的蛋白酶。實(shí)施例8枯草芽孢桿菌yusZ-缺失突變株的Apr蛋白酶產(chǎn)量將枯草芽孢桿菌菌株168進(jìn)行改造以高水平表達(dá)解淀粉酶芽孢桿菌(AN220)的apr蛋白酶基因。AN220缺失yusZ基因得到AN225。由四份獨(dú)立的分離物一式二份地檢測(cè)AN225的蛋白酶產(chǎn)量，并與對(duì)照菌株AN220的蛋白酶產(chǎn)量相比較。AN225菌株(yusZ-缺失突變株)提高了蛋白酶的產(chǎn)量，平均比對(duì)照菌株AN220高出了14％。結(jié)果如表4所示。表4AN10R-b(ΔyusZ)和對(duì)照菌株An10R的蛋白酶10R的產(chǎn)量。序列表<110>諾維信公司(NovozymesA/S)<120>具有高分泌水平的突變的原核細(xì)胞<130>10576.204<160>26<170>PatentInversion3.3<210>1<211>843<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)168<400>1atgaataaaaaaatagccatcgtgacaggagcgtccagcggcttcggtctgctggcagct60gtaaagcttgcccgatcatttttcgtgatagccacatcaagacagcctgaaaaagcggaa120cagcttcgagaattggctgcagcacacaatgtgtctgattctattcacattacagctctc180gatgtcaccgatgaacaatctatagtctcattcggaaaagctgttagtgcttacgccccg240atcgatttactcgttaacaacgccggaacggcttatggaggatttatcgaggatgtgccg300atggaacatttcagacaacaatttgaaacgaatgtcttcggtgtgatccatgtgacaaaa360accgtgctgccttacataagaaagcatggcggcgcaaagattataaacgtgagcagcatc420agcggactgacaggattcccagcgctgtcgccatatgtttcttccaagcatgcattggaa480ggtttttctgaaagcctgcgtatcgagctgcttccgttcggtatcgaaaccgctttgatc540gagccgggctcatacaagacatcgatctggtcaacgtcattatcaaattttatgtcggtg600cctgctgacgattcagcctatcatcaatactataaaaagatcctttcctatgttcaaaaa660aacggagaagaaagcggagatccccaagaggttgccgacctcatttatcaattggcaaca720aaacagcacataaagaatttgcgatacccgatcggaaagggcatcaagctcaccctgctg780ttccgatcgctttttccttggtctgcgtgggagtctatcctgaagaaaaagctattcagc840tga843<210>2<211>280<212>PRT<213>枯草芽孢桿菌168<400>2MetAsnLysLysIleAlaIleValThrGlyAlaSerSerGlyPheGly151015LeuLeuAlaAlaValLysLeuAlaArgSerPhePheValIleAlaThr202530SerArgGlnProGluLysAlaGluGlnLeuArgGluLeuAlaAlaAla354045HisAsnValSerAspSerIleHisIleThrAlaLeuAspValThrAsp505560GluGlnSerIleValSerPheGlyLysAlaValSerAlaTyrAlaPro65707580IleAspLeuLeuValAsnAsnAlaGlyThrAlaTyrGlyGlyPheIle859095GluAspValProMetGluHisPheArgGlnGlnPheGluThrAsnVal100105110PheGlyValIleHisValThrLysThrValLeuProTyrIleArgLys115120125HisGlyGlyAlaLysIleIleAshValSerSerIleSerGlyLeuThr130135140GlyPheProAlaLeuSerProTyrValSerSerLysHisAlaLeuGlu145150155160GlyPheSerGluSerLeuArgIleGluLeuLeuProPheGlyIleGlu165170175ThrAlaLeuIleGluProGlySerTyrLysThrSerIleTrpSerThr180185190SerLeuSerAsnPheMetSerValProAlaAspAspSerAlaTyrHis195200205GlnTyrTyrLysLysIleLeuSerTyrValGlnLysAsnGlyGluGlu210215220SerGlyAspProGlnGluValAlaAspLeuIleTyrGlnLeuAlaThr225230235240LysGlnHisIleLysAsnLeuArgTyrProIleGlyLysGlyIleLys245250255LeuThrLeuLeuPheArgSerLeuPheProTrpSerAlaTrpGluSer260265270IleLeuLysLysLysLeuPheSer275280<210>3<211>1503<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌168<400>3atgaatcggctttccgcagattttcaatcgtcgctcgttacattagatcataaacttgtg60gacattaatcaagacgtgtggaatgaattgttaacaaaaccgggattgcgcgatgtttct120tacatattaaatgaaagaagacagagggttgccgaaaagcttagccccggtaaggaaaaa180ctgatcggaaaccttgcggtggac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要求6所述的細(xì)胞，其中所述yusZ、yusX和/或yusY同源物編碼多肽，所述多肽具有分別與SEQIDNOs2或25、SEQIDNO4、或SEQIDNO6所示序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)胞，其中所述yusZ、yusX和/或yusY同源物具有分別與SEQIDNOs1或24、SEQIDNO3、或SEQIDNO5所示序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其在至少一種多核苷酸突變，其中所述至少一種多核苷酸中具有至少100bp大小的亞序列能夠與具有SEQIDNOs1或24、SEQIDNO3、或SEQIDNO5所示序列或其各自的互補(bǔ)序列的多核苷酸在中等嚴(yán)緊雜交條件下雜交。10.根據(jù)權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中yusZ、yusX和/或yusY，或其同源物，部分或全部從染色體中缺失。11.根據(jù)權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中yusZ、yusX和/或yusY，或其同源物，包含至少一種移碼突變或無(wú)義突變。12.根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其與其它的等基因但未突變的細(xì)胞相比，YusZ或YusX，或其同源物的表達(dá)水平降低至少兩倍。13.根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其與其它的等基因但未突變的細(xì)胞相比，檢測(cè)不到Y(jié)usZ或YusX，或其同源物的表達(dá)。14.根據(jù)權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中所述至少一種異源多肽包含酶。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的細(xì)胞，其中所述的酶是裂合酶、連接酶、水解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶或異構(gòu)酶。16.根據(jù)權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其包含一個(gè)或多個(gè)染色體整合的、編碼所述至少一種異源多肽的多核苷酸的拷貝。17.根據(jù)權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)所述的細(xì)胞，其中所述至少一種異源多肽由從至少一種異源啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的多核苷酸編碼。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的細(xì)胞，其中所述至少一種啟動(dòng)子包含人工啟動(dòng)子。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的細(xì)胞，其中所述人工啟動(dòng)子包含一種或多種mRNA穩(wěn)定序列，優(yōu)選衍生自cryIIIa啟動(dòng)子。20.構(gòu)建突變的原核細(xì)胞的方法，所述方法包含如下步驟a)將原核細(xì)胞突變；和b)篩選與其它等基因但未突變的細(xì)胞相比，降低了YusZ(SEQIDNOs2或25)或YusX(SEQIDNO4)、或其同源物的表達(dá)水平、并分泌較高量的至少一種目標(biāo)異源多肽的突變細(xì)胞。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述細(xì)胞是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述細(xì)胞是芽孢桿菌屬細(xì)胞。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述細(xì)胞是嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、B.clausii、凝結(jié)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、或蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。24.根據(jù)權(quán)利要求20-23任一項(xiàng)所述的方法，其中所述YusZ或YusX同源物包含分別與SEQIDNOs2或25、或SEQIDNO4所示序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。25.根據(jù)權(quán)利要求20-24任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)中所述細(xì)胞在yusZ(SEQIDNOs1或24)、yusX(SEQIDNO3)和/或yusY(SEQIDNO5)，或其同源物中突變。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述yusZ、yusX和/或yusY同源物編碼多肽，所述多肽具有分別與SEQIDNOs2或25、SEQIDNO4、或SEQIDNO6所示序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述yusZ、yusX和/或yusY同源物具有分別與SEQIDNOs1或24、SEQIDNO3、或SEQIDNO5所示序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。28.根據(jù)權(quán)利要求20-27任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)中所述細(xì)胞在至少一種多核苷酸中突變，其中所述至少一種多核苷酸中具有至少100bp大小的亞序列與具有SEQIDNOs1或24、SEQIDNO3、或SEQIDNO5所示序列或其各自的互補(bǔ)序列的多核苷酸在中等嚴(yán)緊雜交條件下雜交。29.根據(jù)權(quán)利要求25-28任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)中所述細(xì)胞通過(guò)從細(xì)胞的染色體中部分或全部缺失yusZ、yusX和/或yusY，或其同源物來(lái)進(jìn)行突變。30.根據(jù)權(quán)利要求25-28任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)中所述細(xì)胞通過(guò)在yusZ、yusX和/或yusY，或其同源物中導(dǎo)入至少一種移碼突變或無(wú)義突變來(lái)進(jìn)行突變。31.根據(jù)權(quán)利要求20-30任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(b)中所篩選的細(xì)胞與其它的等基因但未突變的細(xì)胞相比，YusZ或YusX，或其同源物的表達(dá)水平降低了至少兩倍。32.根據(jù)權(quán)利要求20-31任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(b)中所篩選的細(xì)胞與其它的等基因但未突變的細(xì)胞相比，檢測(cè)不到Y(jié)usZ或YusX，或其同源物的表達(dá)。33.根據(jù)權(quán)利要求20-32任一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少一種目標(biāo)異源多肽包含酶。34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述酶是裂合酶、連接酶、水解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶或異構(gòu)酶。35.根據(jù)權(quán)利要求20-34任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)染色體整合的、編碼所述至少一種目標(biāo)異源多肽的多核苷酸的拷貝。36.根據(jù)權(quán)利要求20-35任一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少一種目標(biāo)異源多肽由從至少一種異源啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的多核苷酸編碼。37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述至少一種啟動(dòng)子包含人工啟動(dòng)子。38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述人工啟動(dòng)子包含一種或多種mRNA穩(wěn)定序列，優(yōu)選衍生自cryIIIa啟動(dòng)子。39.生產(chǎn)目標(biāo)多肽的方法，所述方法包含如下步驟(a)培養(yǎng)突變的原核細(xì)胞，其與其它的等基因但未突變的細(xì)胞相比，降低了YusZ(SEQIDNOs2或25)、YusX(SEQIDNO4)、或其同源物的表達(dá)水平，同時(shí)分泌較高量的目標(biāo)多肽；和(b)分離目標(biāo)多肽。40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述細(xì)胞是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞。41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述細(xì)胞是芽孢桿菌屬細(xì)胞。42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述細(xì)胞是嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、B.clausii、凝結(jié)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、或蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。43.根據(jù)權(quán)利要求39-42任一項(xiàng)所述的方法，其中所述YusZ或YusX同源物包含分別與SEQIDNOs2或25、或SEQIDNO4所示序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。44.根據(jù)權(quán)利要求39-43任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)中所述細(xì)胞在yusZ(SEQIDNOs1或24)、yusX(SEQIDNO3)、和/或yusY(SEQIDNO5)，或其同源物中突變。45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述yusZ、yusX、和/或yusY同源物編碼多肽，所述多肽具有分別與SEQIDNos2或25、SEQIDNO4、或SEQIDNO6所示序列具有至少70％同一性的氨基酸序列。46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述yusZ、yusX、和/或yusY同源物具有分別與SEQIDNOs1或24、SEQIDNO3、或SEQIDNO5所示序列具有至少70％同一性的核苷酸序列。47.根據(jù)權(quán)利要求39-46任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)中所述細(xì)胞在至少一種多核苷酸中突變，其中所述至少一種多核苷酸中具有至少100bp大小的亞序列與具有SEQIDNOs1或24、SEQIDNO3、或SEQIDNO5所示序列或其各自的互補(bǔ)序列的多核苷酸在中度嚴(yán)緊雜交條件下雜交。48.根據(jù)權(quán)利要求39-47任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)中所述細(xì)胞通過(guò)從細(xì)胞的染色體中部分或全部缺失yusZ、yusX、和/或yusY，或其同源物來(lái)進(jìn)行突變。49.根據(jù)權(quán)利要求39-47任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)中所述細(xì)胞通過(guò)向yusZ、yusX、和/或yusY，或其同源物中導(dǎo)入至少一種移碼突變或無(wú)義突變來(lái)進(jìn)行突變。50.根據(jù)權(quán)利要求39-49任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)中所述細(xì)胞與其它的等基因但未突變的細(xì)胞相比，YusZ或YusX，或其同源物的表達(dá)水平降低了至少兩倍。51.根據(jù)權(quán)利要求39-50任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)中所述細(xì)胞與其它的等基因但未突變的細(xì)胞相比，檢測(cè)不到Y(jié)usZ或YusX，或其同源物的表達(dá)。52.根據(jù)權(quán)利要求39-51任一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少一種目標(biāo)多肽包含酶。53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述酶是裂合酶、連接酶、水解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶或異構(gòu)酶。54.根據(jù)權(quán)利要求39-53任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)染色體整合的、編碼所述至少一種目標(biāo)多肽的多核苷酸的拷貝。55.根據(jù)權(quán)利要求39-54任一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少一種目標(biāo)多肽由從至少一種異源啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的多核苷酸編碼。56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中所述至少一種啟動(dòng)子包含人工啟動(dòng)子。57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述人工啟動(dòng)子包含一個(gè)或多個(gè)mRNA穩(wěn)定序列，優(yōu)選衍生自cryIIIa啟動(dòng)子。全文摘要本發(fā)明涉及一種突變的原核細(xì)胞，其與其它的等基因但未突變的細(xì)胞相比，能分泌較高量的至少一種目標(biāo)異源多肽，并降低了YusZ或YusX，或其同源物的表達(dá)水平，以及構(gòu)建上述細(xì)胞和使用上述細(xì)胞生產(chǎn)多肽的方法。文檔編號(hào)C12N1/21GK1965085SQ200580018631公開(kāi)日2007年5月16日申請(qǐng)日期2005年4月7日優(yōu)先權(quán)日2004年4月7日發(fā)明者阿倫·K·尼爾森,邁克爾·D·拉斯馬森申請(qǐng)人:諾維信公司