專利名稱：：測定癌癥對表皮生長因子受體靶向性治療反應性的方法測定癌癥對表皮生長因子受體靶向性治療反應性的方法對相關(guān)申請的交叉參考本申請在35U.S.C.119(e)之下要求遞交于2004年3月31日的美國臨時申請系列號60/558,218，遞交于2004年4月9日的美國臨時申請系列號60/561,095，遞交于2004年4月27日的美國臨時申請系列號60/565,753，遞交于2004年4月27日的美國臨時申請系列號'60/565,985，遞交于2004年5月25日的美國臨時申請系列號60/574，035，遞交于2004年6月7日的美國臨時申請系列號60/577,916和遞交于2004年7月29日的美國臨時申請系列號60/592，287的權(quán)益，在此將其內(nèi)容全部并入作為參考.政府支持本發(fā)明由國立衛(wèi)生研究院(N1H)獎助金號ROICA092824，P50CA090578，POl95281,和1K12CA87723-01支持，美國政府具有其某些權(quán)益.背景上皮細胞癌癥，例如，前列腺癌、乳癌、結(jié)腸癌、肺癌、胰癌、卵巢癌、脾癌、睪丸癌、胸腺癌等，是特征為上皮細胞異常、加速生長的疾病。這種加速的生長最初引發(fā)腫瘤形成.最后，還能夠發(fā)生向不同器官位點的轉(zhuǎn)移.盡管已經(jīng)在各種癌癥的診斷和治療上取得了一些進展，但這些疾病仍然導致顯著的死亡率.肺癌是工業(yè)化國家中主要的癌癥死亡原因.根據(jù)細胞在顯微鏡下如何顯現(xiàn)，將在肺中開始的癌癥分成兩種主要類型，非小細胞肺癌和小細胞肺癌.非小細胞肺癌(鱗狀細胞癌，腺癌，和大細胞癌)一般比小細胞肺癌更慢地傳播到其它器官.大約75%的肺癌病例被分類為非小細胞肺癌(例如，腺癌)，而其它25%為小細胞肺癌，非小細胞肺癌(NSCLC)是在美國、日本和西歐癌癥死亡的主要原因.對于患有進行性疾病的患者來說，化療在存活上提供了最適度的益處，但代價是顯著的毒性，這強調(diào)了對治療刑的需要，所述治療劑特異性靶向ii脂導腫瘤生長的關(guān)鍵遣傳損傷(SchillerJH等，NEnglJMed，346:92-98，2002),表皮生長因子受體(EGFR)是170千道爾頓(kDa)的膜結(jié)合蛋白，其表達于上皮細胞的表面上.EGFR是蛋白質(zhì)酪氨酸激醉的生長因子受體家族的成員，所述激酶是一類細胞周期調(diào)控分子(W.J.Gullick等，1986，CancerRes.,46:285-292),EGFR當它的配體(EGF或TGF-a)結(jié)合細胞外結(jié)構(gòu)域時被激活，導致受體細胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的自體磷酸化(S.Cohen等，1980，J.Biol.Chem.,255:4834-4842;A,B.Schreiber等，1983，J.Biol.Chem.,258:846-853).EGFR是促進生長的癌基因，erbB或ErbBl的蛋白產(chǎn)物，但是該基因是一種家族的成員，即原癌基因的ERBB家族，其據(jù)信在許多人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用.特別地，已經(jīng)在乳腺、膀胱、肺、頭、頸和胃癌以及膠質(zhì)母細胞瘤中觀察到EGFR表達的提高.癌基因的ERBB家族編碼四種，結(jié)構(gòu)相關(guān)的跨膜受體，即，EGFR，HER-2/neu(erbB2)，HER陽3(erbB3)和HER-4(erbB4),臨床上，已經(jīng)報道腫瘤中的ERBB癌基因擴增和/或受體過表達與疾病復發(fā)和患者不良預后，以及與治療中的反應性有關(guān)(L.Harris等，1999,Int.J.Biol.Markers,14:8嗎15;和J.Mendelsohn和J.Baselga,2000，Oncogene,19:6550-6565),EGFR由三個主要結(jié)構(gòu)域組成，即，細胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)，其被糖基化并且包含配體結(jié)合性穴和兩個半胱氦酸富集區(qū)；一個短的跨膜結(jié)構(gòu)域，和一個具有固有酪氨酸激醃活性的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域.所述跨膜區(qū)將配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接到細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域上.氨基酸和DNA序列分析，以及EGFR的非糖基化形式的研究表明EGFR的蛋白質(zhì)主鏈具有132kDa的質(zhì)量，具有1186個氨基酸殘基氨基酸殘基(A.L.Ullrich等，1984，Nature,307:418-425;J.Downward等，1984，Nature,307:521-527;C.R.CarHn等，1986,Mol.Cell.Biol"6:257-264;和F.L.V.Mayes和M,D.Waterfield，1984，TheEMBOJ"3:531-537),EGF或TGF-a與EGFR結(jié)合激活信號轉(zhuǎn)導途徑并導致細胞增殖.EGFR的二聚體化，構(gòu)象變化以及內(nèi)化作用作用來傳遞細胞同信號，導致細胞生長調(diào)控(G.Carpenter和S.Cohen,1979，Ann.Rev.Biochem.，48:193-216),影響生長因子受體功能，或?qū)е率荏w和/或12配體過表達的遺傳變化導致細胞增殖.此外，已經(jīng)確定EGFR在細胞分化、細胞運動性增強，蛋白質(zhì)分泌，新血管形成，入侵，轉(zhuǎn)移和癌細胞對化療刑和放射的耐受性中發(fā)揮作用.(M.-J.Oh等，2000，Clin.CancerRes"6:4760-4763).已經(jīng)鑒定了多種EGFR的抑制劑，包括多種已經(jīng)進行臨床試驗用于治療各種癌癥.近期的概述，見deBono,J,S.和Rowinsky，E.K,(2002)，"TheErbBreceptorFamily:ATherapeuticTargetForCancer",TrendsinMolecularMedicine,8，S19-26,在癌癥的治療中對于治療性干預有希望的一組靶標包括HER-激酶axis的成員.它們在實體上皮腫瘤，例如，前列腺、肺和乳腺腫瘤中經(jīng)常上調(diào)，并且在膠質(zhì)母細胞瘤中也上調(diào).表皮生長因子受體(EGFR)是HER-激酶axis的成員，并且已經(jīng)是開發(fā)幾種不同癌癥療法的靶標選擇.EGFR酪氨酸激醉抑制刑(EGFR-TKIs)是這些療法之一，因為酪氨酸殘基的可逆性磷酸化是EGFR途徑激活所必需的，換句話說，EGFR-TKIs阻抑對促進和/或維持細胞信號途徑負責的細胞表面受體，所述信號途徑誘導腫瘤細胸生長和分裂.具體地，據(jù)信這些抑制劑干擾EGFR激酶結(jié)構(gòu)域，稱為HER-l.更有希望的EGFR-TKIs為三個系列的化合物喹唑淋類、吡啶并嘧啶類和吡咯并嘧啶類.在臨床開發(fā)中兩種更先進的化合物包括Gefitinib(由AstraZenecaUKLtd.開發(fā)的化合物ZD1839;商品名IRESSA;下文為"IRESSA")和Erlotinib(由Genentech，Inc.andOSIPharmaceuticals,Inc.開發(fā)的化合物OSI-774;商品名TARCEVA;下文為"TARCEVA");二考都產(chǎn)生了令人鼓舞的臨床結(jié)果.用IRESSA和TARCEVA進行常規(guī)的癌癥治療都包括每天口服不超過500mg的各自化合物.在2003年5月，當IRESSA被批準用于治療晚期非小細胞肺癌患者時，它在這些產(chǎn)品中成為笫一個進入美國市場的.IRESSA是一種口服活性喹唑啉，其通過直接抑制EGFR分子上的輅氨酸激酶辨酸化而起作用.它竟奪三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合位點，導致HER-激酶axis的抑制，IRESSA反應的確切機制并不完全清楚，不過，研究提示EGFR的存在是其作用的必要條件.在使用這些化合物中的顯著限制是其受體在他們開始對治療反應后可能會發(fā)展出對它們的治療效果的耐受性，或者他們可能在任何可測量的程度上完全不對EGFR-TKIs反應.事實上，只有10-15%的晚期非小細胞肺癌患者對EGFR激酶抑制刑反應.因而，在靶向性治療中對于那些最可能受益于這種治療的個體來說更好地理解在對IRESSA和TARCEVA的敏感性之下的分子機制將是極其有益的.本領(lǐng)域明顯需要癌癥的令人滿意的治療，特別是上皮細胞癌癥如肺、卵巢、乳腺、腦、結(jié)腸和前列腺癌癥，其并入了TKI治療的益處并克服了由患者展現(xiàn)的無反應性.這種治療能夠?qū)€體的健康具有戲劇性的影響，特別是癌癥特別常見的老人.發(fā)明概述酪氨酸激酶抑制劑(TKI)療法如gefitinib(IRESSA)在大多數(shù)愛上述癌癥影響的個體中并不有效.本發(fā)明人令人吃驚地發(fā)現(xiàn)EGFR激酶結(jié)構(gòu)域軀體變異的存在基本上提高了EGFR對TKI如IRESSA，TARCEVA的敏感性.例如小于30%的患有這種癌癥的患者易受由目前TKIs進行的治療的影響，而大于50%,更優(yōu)選60，70,80，90%的具有EGFR激酶結(jié)構(gòu)域突變的患者是易受影響的.此外，這些突變賦予EGFR提高的激酶活性.因而，具有這些突變的患者將可能對目前的酪氨酸激酶抑制劑(TKI)療法，例如，gefitinib有反應.因此，本發(fā)明提供一種確定在受癌癥影響的人類患者中表皮生長因子受體(EGFR)靶向性治療有效性的可能性的新方法.該方法包括相對于野生型erbBl基因檢測所述患者的erbBl基因的激酶結(jié)構(gòu)域中的至少一種核酸變異的存在或缺失.至少一種變異的存在表示EGFR靶向性治療可能有效.優(yōu)選地，所述核苷酸變異提高EGFR的激酶活性.隨后可以用EGFR靶向性治療來治療所述患者.在本發(fā)明的一個實施方案中，所述EGFR靶向性治療是路氨酸激酶抑制刑.在優(yōu)選的實施方案中，所述路氨酸激酶抑制刑是苯氨基喹唑啉.所述苯氨基喹唑啉可以是合成的苯氨基喹唑啉，優(yōu)選地，所述合成的苯氨基全唑啉為gefitmib或erlotmib。在另一個實施方案中，所述EGFR把向性治療是不可逆的EGFR抑制劑，包括4-二甲基氡基-1)11"2-烯酸4-(3-氯-4-象-苯氨基)-3-氛基-7-乙氣基-喹啉-6-基-酰胺("EKB-569"，有時稱作"EKI-569"，見例如WO/2005/018677和Torrance等，NatureMedicine,vol.6，No.9，S印t.2000，p.1024)和/或HKI-272或HKI-357(Wyeth;見Greenberger等，Proc.llthNCIEORTC-AACRSymposiumonNewDrugsinCancerTherapy,ClinicalCancerRes.Vol.6Supplement,Nov.2000,ISSN1078-0432;inRabindran等，CancerRes.64:3958-3965(2004);HolbroandHynes，Ann.Rev.Pharm,Tox.44:195-217(2004);Tsou等，j.Med.Chem.2005,48,1107-1131;andTejpar等，J.Clin,Oncol.ASCOAnnualMeetingProc.Vol.22，No.l4S:3579(2004)),在本發(fā)明的一個實施方案中，所迷EGFR獲自有或處于發(fā)生癌癥危險中的患者的生物樣品.EGFR(或erbBl基因)激酶結(jié)構(gòu)域中的變異影響ATP結(jié)合口袋的構(gòu)象結(jié)構(gòu).優(yōu)選地，EGFR激酶結(jié)構(gòu)域中的變異是框內(nèi)刪除或外顯子18、19、20或21中的取代.在一個實施方案中，所述框內(nèi)刪除在EGFR(erbBl)的外顯子19中.優(yōu)選地所述外顯子19中的框內(nèi)刪除在刪除處至少由密碼子747，748，749，和750上的氨基酸亮氨酸、精氨酸、谷氨酸和丙氨酸組成.在一個實施方案中，所述框內(nèi)刪除包含核苷酸2235-2249并刪除氨基酸746-750(序列谷氨酸，亮氨酸，精氨酸，谷氨酸和丙氨酸)，見表2,表S2，困2B，圖4A，圖5，SEQIDNO:511,困6C,和困8C.在另一個實施方案中，所述框內(nèi)刪除包含核苷酸2236-2250并刪除氛基酸氨基酸746-750,見表S2，困5，SEQIDNO:51，和困6C.或者，所述框內(nèi)刪除包含核苷酸2240-2251，見表2,困2C,圖4A，圖5,SEQIDNO:511，或核苷酸2240-2257，見表2,表S3A，困2A，閨4A，困5，SEQIDNO:511，困6C,和圖8E.或者，所述框內(nèi)刪除包含核苷酸2239-2247與在核苷酸2248上的半胱氨酸對鳥嚷呤的取代，見表S3A和困8D，或核苷酸2238-2255的刪除和核苷酸2237上的胸腺嘧啶對腺嘌呤的取代，見表S3A和圖8F，或核苷酸2254-2277的刪除，見表S2,或者，所述刪除包含核苷酸2239-2250delTTAAGAGAAGCA;2251A>C，或2240-2254ddTAAGAGAAGCA，或2257-2271delCCGAAAGCCAACAAG，如表S3B中所示，在另一個實施方案中，所述取代在EGFR的外顯子2中.所述外顯子2中的取代包含至少一個氨基酸，在一個實施方案中，所述外顯子2中的取代在核苷酸2573上包含一個鳥嚷呤對胸腺嘧啶的取代，見圖4A和圖5，SEQIDNO:511.這種取代導致氨基酸取代，其中野生15型亮氨酸在氨基酸858上被精氨酸所替換，見困5,表2，表S2,表S3A,困2D，圖6A，困8B，和SEQIDNO:512.或者，所述外顯子2中的取代在核苷酸2582上包含一個腺嚷呤對胸腺嘧啶的取代，見困4A和困5，SEQIDNO:511.這種取代導致了氡基酸取代，其中野生型亮氨酸在氨基酸861上被谷氨酰胺所替換，見困5,表2，圖2E，表S3B，和SEQIDNO:512,所述取代還可以在EGFR的外顯子18中.在一個實施方案中，所述外顯子18中的取代是在核苷酸2155上胸腺嘧啶對鳥嚷呤的取代，見圖4A和困5，SEQIDNO:511.這種取代導致了氨基酸取代，其中野生型甘氨酸在密碼子719上被半胱氨酸所取代，見困5，SEQIDNO:512.在另一個實施方案中，所述外顯子18中的取代是在核苷酸2155上腺噪呤對烏嘌呤的取代，導致氨基酸取代，其中野生型甘氨酸在密碼子719上被絲氨酸所取代，見表S2，困6B，困8A，圖5,SEQIDNO:511和512.在另一個實施方案中，所述取代是在SEQIDNO:511的核苷酸2316之后和核苷酸2317之前烏嚷呤，鳥嚷呤和胸腺嘧啶(GGT)的插入(23162317insGGT),這也可以描述為纈氨酸(V)在氨基酸772上的插入(P772一H733insV).其它的突變顯示于表S3B中并包括，例如，在SEQIDNO:511的核苷酸2309之后和核苷酸2310之前CAACCCGG的插入和在SEQIDNO:511的核苷酸2311之后和核苷酸2312之前GCGTGGACA的插入.所述取代還可以在外顯子20中并且在一個實施方案中為在核苷酸2334和2335上的AA對于GG的取代，見表S3B.總之，在優(yōu)選的實施方案中，erbBl基因的核酸變異是在SEQIDNO511的核苷酸2155上胸腺嘧啶對烏嚷呤或腺嚷呤對鳥嚷呤的取代，在SEQIDNO511的核苷酸2235-2249,2240-2251,2240-2257，2236-2250，2254-2277，或2236-2244的刪除，在SEQIDNO511的核苷酸2316之后和在核苷酸2317之前核苷酸鳥嚷呤，鳥嚷呤，和胸腺嘧咬(GGT)的插入，以及在SEQIDNO511的核苷酸2573上烏嚷呤對胸腺嘧啶或在2582上腺嚷呤對胸腺嘧啶的取代.通過擴增編碼受體的核酸片段可以測定至少一個核酸變異的存在或缺失的檢測.待擴增的片段為1000核苷酸長，優(yōu)逸地，500核苷酸長，最優(yōu)選ioo核苷酸長或更小.待擴增的片段可以包括多種變異.在另一個實施方案中，至少一個核酸變異的存在或缺失的檢測提供了將包含變異位點的EGFR核酸與至少一種核酸探針接觸.所述探針優(yōu)選地與包括變異位點并且在變異位點包含互補核苷酸的核酸序列在選擇性雜交條件下雜交.雜交可以用可檢測的標記進行檢測.在又一個實施方案中，至少一個核酸變異的存在或缺失的檢測包括對至少一個核酸序列進行測序并將獲得的序列與已知的erbBl核酸序列比較.或者，至少一個核酸變異的存在或缺失包含至少一個核酸序列的質(zhì)謙測定.在優(yōu)選的實施方案中，至少一個核酸變異的存在或缺失的檢測包括進行聚合酶鏈式反應(PCR).擴增包含假定變異的erbBl核酸序列并測定擴增的核酸的核苷酸序列.測定擴增的核酸的核苷酸序列包括對至少一個核酸片段進行測序.或者，通過利用任何能夠根據(jù)其大小分離擴增產(chǎn)物的方法，包括自動的和手動的凝膠電泳等等可以分析擴增產(chǎn)物?；蛘撸辽僖粋€核酸變異的存在或缺失的檢測包括測定基因中多種變異的單倍型.在另一個實施方案中，通過分析erbBl基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì))t可以檢測EGFR變異的存在或缺失.在這種實施方案中，使用特異性結(jié)合變異EGFR的探針.在優(yōu)選的實施方案中，所述探針是優(yōu)選結(jié)合到變異EGFR上的抗體.變異EGFR的存在預示著EGFR靶向性治療有效的可能性.或者，所述探針可以是抗體片段，嵌合性抗體，人源化抗體或適體.本發(fā)明進一步提供一種探針，其在選擇性結(jié)合條件下特異性結(jié)合到在EGFR基因(erbBl)中包含至少一個核酸變異的核苷酸序列上.在一個實施方案中，所迷變異是在erbBl的激酶結(jié)構(gòu)域中的突變，其賦予ATP結(jié)合性口袋的結(jié)構(gòu)變化，本發(fā)明的探針可以包含大約500個核苷酸堿基的核苷酸序列，優(yōu)選大約100個核苷酸堿基，最優(yōu)選大約50個核苷酸堿基或大約25個核苷酸堿基或更小的長度.所述探針可以由DNA，RNA,或肽核酸(PNA)組成。另外，所述探針可以包含可檢測的標記，如例如，熒光或酶學標記，17本發(fā)明另外提供一種在受癌癥影響的患者中測定表皮生長因子受體(EGFR)靶向性治療有效的可能性的新方法.所述方法包括測定來自患者的生物樣品中的EGFR的激酶活性.與正常對照相比，在用EGFR配體剌激之后激醃活性的提高表明EGFR靶向性治療很可能是有效的.本發(fā)明進一步提供一種治療具有或處于形成癌癥的危險之中的患者的新方法.所述方法包括確定患者的EGFR的激酶結(jié)構(gòu)域是否包含至少一種核酸變異。優(yōu)選地，EGFR位于肺瘤或癌癥的位點上并且所述核酸變異是軀體性的.這種變異的存在表示EGFR靶向性治療將是有效的.如果所述變異存在，向患者施用酪氨酸激醃抑制劑.如上，向經(jīng)鑒定的患者施用的輅氨酸激醉抑制刑可以是苯氨基喹唑啉或不可逆的酪氨酸激蘇抑制劑，如例如，EKB-S69,HKI-272和/或HKI-357(Wyeth),優(yōu)選地，所述苯氨基全唑啉是合成的的苯氡基喹唑啉并且最優(yōu)選地所述合成的的苯氨基喹唑啉是gefitinib和erlotinib,要通過本發(fā)明的方法治療的癌癥包括，例如，但不限于，胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳癌、頭頸癌、肺癌、非小細胞肺癌、神經(jīng)系統(tǒng)癌、腎癌、視網(wǎng)膜癌、皮膚癌、肝癌、胰癌、生殖-泌尿系統(tǒng)癌和膀胱癌，在優(yōu)選的實施方案中，所述癌癥是非小細胞肺癌.還包括實施本發(fā)明的PCR方法的試刑盒.所述試劑盒包括至少一對設(shè)計來退火到基因邊界核酸區(qū)上的簡并引物對，所述基因編碼EGFR激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合口袋.此外，所述試劑盒包含實施PCR擴增所必需的產(chǎn)品和試刑，以及說明書.在優(yōu)選的實施方案中，包含在試劑盒中的引物對逸自SEQIDNO:505，SEQIDNO:506，SEQIDNO:507，和SEQIDNO:508.在實施例中的表6和7中列出的引物也是優(yōu)選的.在又一個實施方案中，本發(fā)明公開了一種選擇化合物的方法，所述化合物抑制變異表皮生長因子受體(EGFR)的催化性激酶活性.作為第一步，將變異EGFR與可能的化合物接觸.隨后檢測所述變異EGFR得到的激酶活性并選擇抑制變異EGFR的激酶活性的化合物.在一個實施方案中，所述變異EGFR包含在細胞中.還可以使用所述方法選擇變異EGFR的激蘇活性的化合物，所述變異EGFR在激酶結(jié)構(gòu)域中具有次發(fā)突變，其賦予對TKI,例如gefitinib或erlotinib的耐受性，在一個實施方案中，對所述變異EGFR進行標記.在另一個實施方案中，將EGFR結(jié)合到固體支持物上.在優(yōu)選的實施方案中，所述固體支持物是蛋白質(zhì)芯片.在本發(fā)明的又一個實施方案中，公開了一種抑制變異表皮生長因子受體(EGFR)的催化性激酶活性的藥物組合物.抑制變異EGFR的催化劑激酶活性的化合物選自抗體、抗體片段、小分子、肽、蛋白質(zhì)、反義核酸、核酶、PNA、siRNA、寡核苷酸適體，和肽適體.還公開了一種治療患有EGFR介導性疾病的患者的方法，按照該方法，對患者施用抑制變異表皮生長因子受體(EGFR)的催化性激酶活性的藥物組合物.在一個實施方案中，所述EGFR介導性疾病是癌癥，在優(yōu)選的實施方案中，所述癌癥是上皮起源的.例如，所述癌癥是胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳癌、頭頸癌、肺癌、非小細胞肺癌、神經(jīng)系統(tǒng)癌、腎癌、視網(wǎng)膜癌、皮膚癌、肝癌、胰癌、生殖-泌尿系統(tǒng)癌和膀胱癌，在優(yōu)選的實施方案中，所述癌癥是非小細胞肺癌.在另一個實施方案中，公開了一種預測在erbBl基因的激酶結(jié)構(gòu)域中獲得次發(fā)突變(或選摔突變)的方法.將表達erbBl的變異形式的細胞與有效的，然而是亞致死劑量的酪氨酸激酶抑制劑接觸.選擇抗路氨酸激酶抑制劑生長阻滯作用的細胞并對erbBl核酸分析erbBl激酶結(jié)構(gòu)域中其它突變的存在.在一個實施方案中，所述細胞是體外的，在另一個實施方案中，所述細胞獲自轉(zhuǎn)基因動物，在一個實施方案中，所述轉(zhuǎn)基因動物是小鼠.在此小鼠模型中，待研究的細胞獲自腫瘤活檢組織.通過本發(fā)明選擇的在erbBl激酶結(jié)構(gòu)域中包含次發(fā)突變的細胞可以用在以上方法中以選擇化合物，所述化合物抑制在激酶結(jié)構(gòu)域中具有次發(fā)突變的變異EGFR的激酶活性.在預測在erbBl基因的激酶結(jié)構(gòu)域中獲得次發(fā)突變的另一個實施方案中，首先將表達erbBl基因變異形式的細胞與效量的誘變劑接觸.所述誘變劑是，例如，甲磺酸乙醋(EMS),N-乙基-N-亞確基脲(ENU),N-甲基-N-亞硝基脲(MNU)，phocarbaxinehydrochloride(Pre),甲璜酸甲酴(MeMS)，苯丁醵氮芥(Chi),美法侖，porcarbazine19hydrochloride,環(huán)罅酰胺(Cp),碟酸二乙醋(Et2S04),丙烯酰胺單體(AA),三亞乙基密胺(TEM),氮芥，長春新堿，二甲基亞硝胺，N-甲基-N'-硝基-亞硝基胍(MNNG)，7,12二甲基苯并(a)蒽(DMBA)，環(huán)氣乙烷，六甲基辨酰胺，bisulfan，或ethylmethanesulforate(EtMs).隨后將細胞與有效的，但亞致死劑量的路氨酸激酶抑制刑接觸.選擇抗酪氨酸激酶抑制刑生長阻滯作用的細胞并對erbBl核酸分析erbBl激醃結(jié)構(gòu)域中其它突變的存在.附圖簡述圖1A-1B顯示在頑固性非小細胞肺癌(NSCLC)中Gefitinib反應的代表性困示，病例6的胸腔CT掃描(表1),顯示(困1A)用gefitinib治療前在右肺中的大的質(zhì)量，(圖IB)在開始Gefitinib治療后的六周出現(xiàn)顯著的改善.圖2顯示Gefitinib反應性腫瘤中的EGFR突變.圖2A-2C顯示腫瘤樣本中EGFR基因的核苷酸序列，在激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)具有雜合的框內(nèi)刪除(雙峰)(出現(xiàn)順序分別為SEQIDNOS643-654).在有義和反義方向的追蹤顯示證明了刪除的兩人斷裂點；野生型核苷酸序列以大寫字母顯示，而突變序列以小寫字母顯示，delL747-T751insS突變的5'斷裂點的前面為T-C取代，其并不改變編碼的氨基酸.圖2D和圖2E顯示雜合的錯義突變(箭頭)，導致在fi^氨酸激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸取代(SEQIDNOS656&658).雙峰代表雜合突變位點上的兩個核苷酸，為了進行比較，還顯示了相應的野生型序列(SEQIDNOS655&657),圖2F是二聚EGFR分子被EGF配體結(jié)合的流程圖.突出了細胞外結(jié)構(gòu)域(包含兩種受體配體L卜結(jié)構(gòu)域和fiirin-Hke結(jié)構(gòu)域)，跨膜區(qū)，和細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(包含催化性激酶結(jié)構(gòu)域).指出了用途受體激活標記的自體礴酸化位點的酪氨酸"^(Y-1068)的位置，以及由EGFR自體磷酸化激活的下游效應劑(STAT3,MAP激酶(MAPK)，和AKT).顯示了腫瘤相關(guān)突變的定位，都在酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域中.圖3表明突變EGFR的增強的EGF依賴型激活和突變EGFR對Gefitinib提高的敏感性.困3A顯示野生型EGFR相比，在添加EGF到血清饑俄細胞中后delL747-P753insS和L858R突變體的配體誘導的激活時間過程.EGFR自體磷酸化被用作受體激活的標記，與Cos-7細胞中表達的EGFR總體水平(對照；右板)相比，使用用特異性識別EGFR的磷酸化輅氡酸11)68殘基的抗體的蛋白質(zhì)印跡(左板).在加入EGF(10ng/ml)的時間間隔上測重EGFR的自體砩酸化.圖3B是野生型和突變型受體磷酸化作用的EGF誘導的圖示(見版A).利用NIH圖像軟件對來自三個獨立實驗的放射自顯影進行量化；將EGFR磷酸化作用的強度規(guī)格化為總體蛋白質(zhì)表達，并顯示為受體的百分比激活，帶有標準偏差.圖3C顯示由Gefitinib產(chǎn)生的EGFR激活的劑量依賴型抑制.通過表達野生型或突變型受體的Cos-7細胞的蛋白質(zhì)印跡分析證明EGFR的酪氨酸1068的自體鱗酸化，并用100ng/ml的EGF刺激30min.如所示對細胞不處理(U)或用提高濃度的Gefitiiiib預處理3hrs(左板)，表達的EGFR蛋白總量顯示為對照(右板).圖3D顯示來自對圖版3C所述的兩種實驗的結(jié)果的量化(NIH困像軟件).將磷酸化的EGFR濃度規(guī)格化為蛋白質(zhì)表達水平并表示為受體的百分比激活.圖4顯示了在EGFR的ATP-結(jié)合性口袋內(nèi)關(guān)鍵位點上的突變的聚類.圖4A顯示在多種NSCLC情況下(SEQIDNOS495-504(DNA))，EGFR基因的外顯子19中重疊的框內(nèi)刪除和外顯子21的錯義突變的位置，對每種外顯子顯示部分核苷酸序列，通過虛線標記刪除并突出和對錯義突變下劃線；顯示野生型EGFR核苷酸和氨基酸序列(SEQIDNOS493&494(DNA)&509-510(氨基酸)).圖4B顯示EGFRATP裂口的立體結(jié)構(gòu)，兩翼是激酶結(jié)構(gòu)域的氨基(N)和羧基(C)凸起部(源自PDB1M14的等同物，并利用Cn3D軟件展示).抑制劑Gefitinib，閨示占據(jù)ATP裂口.顯示了兩種錯義突變的定位，在激酶的激活性環(huán)內(nèi)；三個框內(nèi)刪除都存在于另一個環(huán)內(nèi)，在ATP裂口側(cè)翼。圖4C顯示EGFR激酶結(jié)構(gòu)域的特寫，顯示與結(jié)合ATP或抑制劑相關(guān)的氨基酸殘基。具體地，4-苯氨基喹唑淋化合物如gefitinib通過占21據(jù)ATP結(jié)合位點抑制催化，其中它們與甲碟氨酸793(M793)和半胱氨酸775(C775)殘基形成氫鍵，而它們的苯胺環(huán)接近甲疏氨酸766(M766)，賴氨酸(K745)，和亮氨酸788(L788)殘基.預測突變所靶向的環(huán)內(nèi)的框內(nèi)刪除相對于抑制刑改變這些氨基酸的位置.顯示突變的殘基在酪氨酸激酶的激活環(huán)內(nèi).困5顯示erbBl基因的核苷酸和氨基酸序列.所迷氨基酸被描述為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的單個字母.通過患者數(shù)目來突出激酶結(jié)構(gòu)域中的核苷酸變異，見表2.SEQIDNO:511包括核苷酸1到3633,SEQIDNO:512包括氨基酸1到1210。圖6A-6C:在EGFR和B-Raf激蘇結(jié)構(gòu)域內(nèi)的選定區(qū)的序列比對.人NSCLC中EGFR突變的描繪.iEGFR(gb:X00588;)NSCLC腫瘤中的突變以灰色突出顯示.在多種腫瘤類型(5)中的B-Raf(gb:M95712)突變以黑色突出顯示.星號表示殘基EGFR和B-Raf之間保守的殘基.困6A描繪了激活環(huán)中的L858R突變(SEQIDNOS477-479)。困6B描繪了P環(huán)中的G719S突變(SEQIDNOS480-482),圖6C描繪了EGFR外顯子19中的刪除突變(SEQIDNOS483-489).圖7:EGFR激酶結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)中的錯義突變G719S和L858R和Del-l刪除的位置.激活環(huán)以黃色顯示，P環(huán)以藍色顯示并指出C端凸起和N端凸起.由突變或刪除靶向的殘基以紅色突出顯示。Del-l突變靶向密碼子746-750的殘基ELREA.突變定位在激酶內(nèi)高度保守的區(qū)域中并發(fā)現(xiàn)于p環(huán)和激活環(huán)中，其包圍著ATP并且也是gefitinib和erlotinib預測結(jié)合的區(qū)域，圖8A-SF.來自正常組織和來自肺瘤組織的EGFRDNA的代表性色譜.鑒定的突變的定位如下.圖8A描繪了外顯子18激酶結(jié)構(gòu)域P環(huán)(SEQIDNOS659-660),圖8B描繪了外顯子21激酶結(jié)構(gòu)域A-環(huán)(SEQIDNOS661-662),圖8C描繪了外顯子19激酶結(jié)構(gòu)域Del-1(SEQIDNOS663-665)。圖8D描繪了外顯子19激酶結(jié)構(gòu)域Del-3(SEQIDNOS666-668).困8E描繪了外顯子19激酶結(jié)構(gòu)域Del-4(SEQIDNOS669-671)。困8F描繪了外顯子19激酶結(jié)構(gòu)域Dd-5(SEQIDNOS672-674)。圖9:EGFR和BCR-ABL多肽的序列比對和賦予藥物耐受性表型的殘基的定位，將由GenBank編號NM005228中公開的核苷酸編碼的EGFR多肽(SEQIDNO:492)和由GenBank編號M14752中公開的核苷酸序列編碼的BCR-ABL多肽(SEQIDNO:491)進行比對并用陰影標注保守性殘基，通過星號表示賦予對酪氨酸激酶抑制劑imatinib(STI571，Glivec/Gleevec)耐受性的BCR-ABL突變.圖10顯示對于患有轉(zhuǎn)移性NSCLC患者來說決定進行EGFR測試的過程.圖11EGFR外顯子18-24的困(未給出比例尺).箭頭描述了鑒定突變的定位.星號表明在每個位置上具有突變的患者的數(shù)目.單相交圖描繪了外顯子19刪除的重疊，以及具有每個刪除的患者的數(shù)目，注意這些結(jié)果并沒有包括目前所有的EGFR突變.詳細描述本發(fā)明提供一種確定在受癌癥影響的人類患者中表皮生長因子受體(EGFR)把向性治療有效的可能性的新方法，該方法包括檢測所述患者的erbBl基因的激酶結(jié)構(gòu)域中的至少一種核酸變異的存在或缺失.至少一種變異的存在表示EGFR靶向性治療可能有效.優(yōu)選地，所述核苷酸變異提高EGFR的激酶活性.隨后可以用EGFR把向性治療來治療所述患者.在本發(fā)明的一個實施方案中，所述EGFR靶向性治療是酪氨酸激酶抑制刑.在優(yōu)選的實施方案中，所述酪氨酸激酶抑制劑是苯氨基喹唑啉.所述苯氨基喹唑啉可以是合成的苯氦基喹唑啉，優(yōu)選地，所述合成的苯氨基喹唑啉為gefitinib或erlotinib.定義術(shù)語"ErbBl","表皮生長因子受體"，和"EGFR"在本文中相互交換使用并指如，例如，在Carpenter等Ann.Rev.Biochem.56:881-914(1987)中公開的天然序列EGFR，包括其變體(例如如在Humphrey等PNAS(USA)87:4207-4211(1990)中的刪除突變EGFR),ErbBl指編碼EGFR蛋白產(chǎn)物的基因.本文所用的術(shù)語"提高激酶活性的核苷酸變異"指基因的核苷酸序列中的變異(即突變)，其導致提高的激酶活性.提髙的激酶活性是在所述核酸中的變異的直接結(jié)果并且所述基因編碼的蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)。本文所用的術(shù)語"藥物"或"化合物"指施用給個體以治療或預防或23控制疾病或狀況的化學實體或生物學產(chǎn)品，或化學實體或生物學產(chǎn)品的組合.優(yōu)選地，但并非必需地，所述化學實體或生物學產(chǎn)品是低分子量化合物，但是也可以是較大的化合物，例如，核酸的寡聚體，氨基酸，或糖類，包括但不限于蛋白質(zhì)，寡核苷酸，核酶，DNA酶，糖蛋白，siRNAs，脂蛋白，適體，及其改進和組合.在本發(fā)明的背景中術(shù)語"基因型"指基因的特定等位形式，其可以用在特定位點存在于核酸序列中的特定核苷酸來定義.術(shù)語"基因的變異形式"，"基因的形式"，或"等位基因"指基因在群體中的一種特定形式，所述特定形式與相同基因的其它形式在所述基因序列中的至少一個，經(jīng)常是大于一個變異位點的序列上有所不同.在基因的不同等位基因之間差異的這些變異位點上的序列稱作"基因序列變異"或"變異"或"變體"。本領(lǐng)域已知的其它等同術(shù)語包括突變和多態(tài)性，盡管突變經(jīng)常用來指與有害表型相關(guān)聯(lián)的等位基因.在本發(fā)明的優(yōu)選方面，所述變異選自由本文變異表中所列出的變異.在本發(fā)明的背景下，術(shù)語"探針"指能夠可檢測地區(qū)分結(jié)構(gòu)不同的靶分子的分子.根據(jù)所用探針的類型和靶分子的類型，檢測可以以多種不同方式實現(xiàn).因而，例如，檢測可以基因靶分子的活性水平的區(qū)別，但優(yōu)選基于特異性結(jié)合的檢測.這種特異性結(jié)合的例子包括抗體結(jié)合和核酸探針雜交.因而，例如，探針可以包括酶底物，抗體和抗體片段，優(yōu)選核酸雜交探針.如本文所用的，術(shù)語"有效"和"有效性"包括藥學有效性和生理安全性.藥學有效性指治療在患者中導致所需的生物學作用的能力.生理安全性指在細胞，組織和/或生物水平上的毒性，或其它有害生理作用的水平(通常稱為副作用)，其是由治療的施用而產(chǎn)生的."有效性較小的"指治療導致藥學有效性的治療上明顯較低的水平和/或有害生理作用的治療上較高的水平.術(shù)語"引物"正如本文所用的，是指這樣一種寡核普酸即，當這種寡核苷酸被置于催化合成與多核苷酸互補的引物延伸產(chǎn)物的條件下時，它能夠用作沿互補鏈進行多核苷酸合成的起始點.這些條件包括在適當?shù)木彌_液("緩沖液"包括作為輔因子或影響pH、離子強度等的成份)中，和在適當?shù)臏囟认麓嬖谒姆N不同的三磷酸核苷酸或核苷類似物以及一種或多種用于聚合的試劑例如DNA聚合酶和/或反轉(zhuǎn)錄24酶.引物必須長得足以在用于聚合蘇的試刑存在時引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成.典型的引物含有長至少大約s個核苷酸的基本上與靶序列互補的序列，但是在某種程度上較長的引物是優(yōu)選的.引物通常含有大約15-26個核苷酸，但也可以采用更長的引物.引物總是含有基本上與靶序列，即引物可以與之退火的待擴增的特異性序列，互補的序列.除了與靶序列互補的序列之外，引物還可任選地包含其它序列，術(shù)語"啟動子序列"定義了由RNA聚合酶特異性識別的核酸序列單鏈，所述RNA聚合酶結(jié)合到所識別的序列上并引發(fā)產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄過程.原則上，可以采用任何啟動子序列，只要對于該啟動子具有已知的可獲得的能夠識別起始序列的聚合酶即可.已知的有用啟動子是那些被某些噬菌體聚合酶，如噬菌體T3、T7或SP6識別的啟動子."微陣列"是在固體支持物表面上形成的具有優(yōu)選不連續(xù)區(qū)域，每一區(qū)域具有限定的面積，的線性或二維陣列.由單個固體支持物的表面上待檢測的靶多核苷酸的總數(shù)來確定微陣列上不連續(xù)區(qū)域的密度，優(yōu)選的是至少大約50/cm2，更優(yōu)選的是至少大約100/cm2，甚優(yōu)選的是至少大約500/cm2，并且更甚優(yōu)選的是至少大約1，000/cm2,正如本文所用的，DNA微陣列是置于芯片或其它表面上的用來擴增或克隆靶多核苷酸的寡核苷酸引物陣列.由于每個特定引物組在陣列中的位置是已知的，因此基于靶多核苷酸與微陣列中特定位置的結(jié)合，可以確定它們的特性.術(shù)語"標記物"是指能夠產(chǎn)生指示測定樣品中存在靶多核苷酸的可檢測信號的組合物.適宜的標記物包括放射性同位素、核苷酸發(fā)色團、酶、底物、熒光分子、化學發(fā)光部分、磁性顆粒、生物發(fā)光部分以及類似物質(zhì)。于是，標記物是可以由分光的、光化學的、生物化學的、免疫化學的、電子的、光學的或化學的工具檢測的任何組合物.術(shù)語"支持物"是指常規(guī)的支持物，如珠、顆粒、棒、纖維、過濾器、膜以及硅烷或硅酸鹽支持物，如玻片.術(shù)語"擴增"廣義上是指產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，所述擴增產(chǎn)物可包括例如其它靶分子，或者靶樣分子或者與靶分子互補的分子，所述分子是由樣品中靶分子的存在而產(chǎn)生的.在靶物是核酸的情形中，利用DNA或RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄酶可以酶促產(chǎn)生擴增產(chǎn)物.25如本文所用的，"生物學樣品"指從個體中分離的組織或液體的樣品，它包括但不限于，例如，血液、血漿、血清、腫瘤活檢組織、尿液、糞便、痰、脊拔液、胸水、乳頭吸取物、淋巴液、皮膚、呼吸道、腸道和泌尿生殖道的外分泌物、淚液、唾液、乳液、細胞(包括但不限于血細胞)、肺瘤、器官，也包括體外細胞培養(yǎng)組分的樣品.在優(yōu)選的實施方案中，樣品來自切除術(shù)、支氣管活檢組織，或原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤的核心針活檢組織，或來自胸水的細胞團.此后，使用細針吸取樣品.樣品可以是石蠟包埋或冷凍的組織.術(shù)語"抗體"意為一種免疫球蛋白，其能夠結(jié)合抗原，如本文所用的抗體意為包括能夠結(jié)合目標抗原或抗原片段的抗體片段，例如F(ab')2，F(xiàn)ab'，F(xiàn)ab.優(yōu)選地，所述抗體結(jié)合抗原抑制EGFR的變異形式的活性.術(shù)語"人源化抗體"在本文用于描迷完全的抗體分子，即由兩條完全的輕鏈和兩種完全的重鏈組成，以及只由抗體片段，例如Fab，F(xiàn)ab',F(ab)2,和Fv組成，其中CDRs源自非人來源而剩余的lg分子的部分或其部分源自人抗體，優(yōu)選地產(chǎn)生自編碼人抗體的核酸序列.術(shù)語"人抗體"和"人源化抗體"在本文用來描述一種抗體，該抗體分子的所有部分都源自編碼人抗體的核酸序列.這些人抗體是適于用在抗體療法中，因為這些抗體將在人患者中引發(fā)小的或不引發(fā)免疫反應.術(shù)語"嵌合性抗體"在本文中用于描述抗體分子以及抗體片段，如上面在術(shù)語"人源化抗體"的定義中所述.術(shù)語"嵌合性抗體"表達人源化抗體.嵌合性抗體具有源自第一種哺乳類物種的重鏈或輕鏈氨基酸序列的至少一部分以及源自第二種不同的哺乳類物種的重鏈或輕鏈氨基酸序列的另一部分.優(yōu)選地，所述可變區(qū)源自非人哺乳類物種并且恒定區(qū)源自人類物種，具體地，嵌合性抗體優(yōu)選產(chǎn)自非人哺乳動物的編碼可變區(qū)的9個核苷酸序列以及來自人的編碼抗體恒定區(qū)的核香酸序列.表2是與本發(fā)明中所述方法相關(guān)的erbBl的激酶結(jié)構(gòu)域中的DNA序列變異的部分列表.這些變化由本發(fā)明人在來自對gefitinib起反應的患有NSCLC的患者以及不接觸gefitinib的患者的生物學樣品的研究中鑒定.26利用任一種本領(lǐng)域公知的技術(shù)可以將核酸分子從特定的生物學樣品中分離出來，所選的特定分離方法適于特定的生物學樣品.例如凍融和堿裂解方法可以用于從固體物質(zhì)中獲得核酸分子；熱和堿裂解方法可以用于從尿中獲得核酸分子；而蛋白醉K提取可以用于從血液中獲核酸(Rolff，A等PCR:ClinicalDiagnosticsandResearch,Springer(1994).檢測方法可以用多種方式來測定在具有或處于形成癌癥的危險之中的患者中的erbBl基因的激酶結(jié)構(gòu)域中特定變異或多種變異的存在或缺失.這些測試通常利用收集自生物學樣品的DNA或RNA樣品來進行，所述生物學樣品例如，活檢組織、尿、糞便、唾液、血液、細胞、組織刮屑、乳腺抽吸物或其它細胞物質(zhì)，并且能夠通過多種方法進行，包括，但不限于，PCR，與等位基因特異性探針雜交，酴學突變檢測，化學剪切錯配，質(zhì)譜分析或DNA測序，包括小型測序.在特定的實施方案中，與等位基因特異性探針雜交能夠以兩種形式進行(l)等位基因特異性寡核苷酸結(jié)合到固相(玻璃、硅、尼龍膜)和溶液中標記的樣品上，正如在許多DNA芯片應用中一樣，或(2)在溶液中結(jié)合樣品(經(jīng)常是克隆的DNA或PCR擴增DNA)和標記的寡核苷酸(可以是等位基因特異性的或短的以便允許通過雜交進行測序).診斷測試可以包括一組變異，經(jīng)常在固體支持物上，其能夠進行一個以上變異的同時測定.在另一方面，測定erbBl基因中至少一種提高激酶活性的核酸變異的存在必需單倍型測試.測定單倍型的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如，在WO00/04194中.優(yōu)選地，測定至少一種提高激醃活性的核酸變異的存在或缺失包括通過聚合醉鏈式反應(PCR)測定變異位點的序列.或者，測定提高激酶活性的核酸變異的存在或缺失可以包括鏈末端DNA測序或小型測序，寡核苷酸雜交或質(zhì)譜分析.本發(fā)明的方法可以用來預測在具有或處于形成癌癥的危險之中的患者中EGFR靶向性治療有效(或無效)的可能性.優(yōu)選地，癌癥包括上皮組織起源的癌癥，包括，但不限于，胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳癌、頭頸癌、肺癌、非小細胞肺癌、神經(jīng)系統(tǒng)癌、腎癌、視網(wǎng)27膜癌、皮膚癌、肝癌、胰癌、生殖-泌尿系統(tǒng)癌和膀胱癌.在優(yōu)選的實施方案中，所述癌癥是非小細胞肺癌.本發(fā)明一般性地涉及erbBl基因的激醉結(jié)構(gòu)域中的變異的鑒定，其是在具有或處于形成癌癥的危險之中的患者中EGFR靶向性治療有效的指征.此外，在EGFR的激酶結(jié)構(gòu)域中特異性變異的鑒定，在效果上，能夠用作診斷或預防測試.例如，在erbBl基因的激酶結(jié)構(gòu)域中至少一個變異的存在表明患者將可能受益于用EGFR靶向化合物進行的治療，如，例如，輅氨酸激酶抑制劑.用于診斷性測試的方法是本領(lǐng)域公知的并公開于專利申請WO00/04194中，在此并入作為參考，在一種例示性的方法中，所述診斷性測試包括擴增跨越erbBl基因序列的激酶結(jié)構(gòu)域中的一個或多個變異的DNA或RNA(—般在將RNA轉(zhuǎn)變成cDNA后)片段。隨后對這種擴增的片段進行測序和/或進行聚丙烯酰胺凝膠電泳以便鑒定擴增片段中的核酸變異，PCR在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種通過PCR，或，備選地，在連接鏈式反應(LCR)中篩選erbBl基因的激酵結(jié)構(gòu)域中變異的方法(見，例如，Landegran，等，1988.Science241:1077-1080;和Nakazawa,等，1994.Proe.Natl,Acad.Sci.USA91:360-364),后者可以特別用于檢測EGFR基因中的點突變(見，Abravaya，等，1995.Nucl.AcidsRes.23:675_682).該方法包括以下步驟設(shè)計筒并引物用于擴增靶序列，所述引物對應于基因的一種或多種保守性區(qū)域，利用獲自測試生物學樣品的DNA或cDNA作為模板用引物進行擴增反應，和分析PCR產(chǎn)物.測試生物學樣品與對照樣品的PCR產(chǎn)物的比較表明測試生物學樣品中的變異.所述變化可以是核酸變異在測試生物學樣品中的缺失或存在，備選的擴增方法包括自持序列復制(見，Guatelli,等，1990.Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874-1878)，轉(zhuǎn)錄擴增系統(tǒng)(見，Kwoh，等，1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173-1177);Qb復制酶(見，Lizardi，等，1988.BioTechnology6:1197),或任何其它核酸擴增方法，然后利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)對擴增的分子進行檢測。這存在的話.利用蛋白質(zhì)的氨基酸序列或erbBl基因的激酶結(jié)構(gòu)域的核酸序列作為指導設(shè)計根據(jù)本發(fā)明的有用引物，所述序列例如SEQIDNO:493，SEQIDNO:494,SEQIDNO:509，和SEQIDNO:510.在基因的同源性區(qū)域設(shè)計引物，其中至少兩個同源區(qū)域被可變序列的差異區(qū)分隔開，所述序列在長度或核酸序列上是可變的.例如，相同的或高度同源的，優(yōu)選具有至少大約6個，優(yōu)選至少8-10個連接氨基酸的至少80%-85%，更加優(yōu)選至少90-99%的同源性氨基酸序列，最優(yōu)選地，所述氨基酸序列是100%相同的.基于密碼子簡并性和在已知基因家族成員之間給定位置上各種氨基酸的保持設(shè)計正向和反向引物.本文提到的同源性程度是基于利用標準序列比較軟件進行的氨基酸序列分析，如使用默認設(shè)置的蛋白質(zhì)-BLAST(http:〃www,iicbi.nlni,iiih,gov/BLAST/),下表3給出了簡并密碼子的用法和它們的標準符號<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>優(yōu)選地避免任何6倍的簡并密碼子如L，R和S，因為它們將引入高于6倍的簡并性.對于L來說，TTR和CTN折衷成YTN(8倍簡并性)，對于R來說，CGN和AGR折衷成MGN(8倍簡并性)，最后S，TCN和AGY能夠折衷成WSN(16倍簡并性).Inallthreecaseson6ofthese將會匹配靶序列.為了避免這種特異性的喪失，優(yōu)選避免這些區(qū)域，或制成兩群，每群都有備選的簡并密碼子，例如S在一個集合中包括TCN，而AGY在另一個臬合中.利用多種現(xiàn)有的計算機程序，包括，但不限于OligoAnalyzer3.0;OligoCalculator;NetPrimer;Metbprimer;Primer3;WebPrimer;PrimerFinder;Primer9;01igo2002;Pride或GenomePHde;Oligos;和Codebop可以設(shè)計引物，關(guān)于這些程序的詳細信息可以獲知，例如，www.咖lbiol.Net.利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標記可以對引物進行標記.這些標記包括，但不限于放射性、熒光、染料和酶學標記.利用能夠根據(jù)其大小分離擴增產(chǎn)物的任何方法都可以進行擴增產(chǎn)物的分析，包括自動和手動的凝膠電泳，質(zhì)譜分析等等.或者，利用序列差異，使用SSCP，DGGE,TGGE,化學剪切或限制性片段多態(tài)性以及雜交到例如核酸陣列上可以分離擴增產(chǎn)物.核酸分離、擴增和分析的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是常規(guī)的并且方案的例子可以見于，例如，MolecularCloning:ALaboratoryManual(3-VolumeSet)Ed.JosephSambrook,DavidW.Russel,andJoeSambrook，ColdSpringHarborLaboratory;3rdedition(January15，2001)，ISBN:08"69S773.用于PCR擴增的特別有用的方案來源是PCR(Basics:FromBackgroundtoBench)byM.J.McPherson，S.G.Mller，R.Beynon，C,Howe，SpringerVeiiag;1stedition(October15，2000)，ISBN:0387916008,優(yōu)選地，使用下列引物通過聚合酶鏈式反應(PCR)對人EGFR的外顯子19和21進行擴增外顯子19有義引物，5'-GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC-3'(SEQIDNO:505);外顯子19反義引物，5'-CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG3，(SEQIDNO:506);外顯子21有義引物，5'-CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC-3'(SEQIDNO:507);和外顯子21反義引物，5'-GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG-3'(SEQIDNO:508),在備選的實施方案中，通過限制性酶切模式的變化可以鑒定來自樣品細胞的EGFR基因中的突變.例如用一種或多種限制性內(nèi)切酶對樣品和對照DNA進行分離、擴增(任選地)、消化，并通過凝膠電泳測定片段長度大小并進行比較.在樣品和對照DNA之間的片段長度大小差異表明樣品DNA中的突變.另外，使用序列特異性核酶(見，例30如，美國專利號5,493,531)可以用來通過核酶剪切位點的形成或缺失來評估特異性突變的存在.檢測EGFR基因中突變的其它方法包括利用防護剪切刑來檢測RNA/RNA或RNA/DNA雜合雙螺旋中的錯配堿基的方法，見，例如，Myers，等，1985.Science230:1242,通常，本領(lǐng)域的"錯配剪切"技術(shù)通過提供由包含野生型EGFR序列的RNA或DNA與獲自組織樣品的潛在突變RNA或DNA雜交(標記)形成的雜合雙螺旋開始.用剪切雙螺旋的單鏈區(qū)的試劑處理雙鏈雙螺旋，所述單鏈區(qū)如由于對照和樣品鏈之間的堿基錯配存在的區(qū)域.例如，RNA/DNA雙螺旋可以用RNA酶進行處理而DNA/DNA雜合體用Sl核酶處理以酶學消化錯配區(qū).在其它的實施方案中，DNA/DNA或RNA/DNA雙螺旋都可以用羥胺或四氣化鋨或用哌啶處理以便消化錯配區(qū).在消化錯配我后，隨后在變性聚丙烯酰胺凝膠上通過大小分離得到的物質(zhì)以測定突變的位點。見，例如，Cotton,等，1988.Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:4397;Saleeba，等，1992.MethodsEnzymol.217:286-295.在一個實施方案中，可以將對照DNA或RNA進行標記用于檢測.在又一個實施方案中，錯配剪切反應采用一種或多種蛋白質(zhì)，其在檢測和繪制獲自細胞樣品的EGFRcDNAs中的點突變終謙的限定系統(tǒng)中識別雙鏈DNA中的錯配堿基對(所謂的"DNA錯配修復"酶)。例如大腸桿菌(E.coli)的mutY酶在G/A錯配上剪切A而來自Hela細胞的胸腺嘧啶DNA糖基酶在G/T錯配上剪切T,見，例如，Hsu，等，l"4.Carcinogenesis15:1657-1662,根據(jù)一種例示性的實施方案，將基于EGFR序列，例如，DEL-l到DEL-5，G719S,G857V,L883S或L858REGFR序列，雜交到來自測試細胞的cDNA或其它DNA產(chǎn)物上.用DNA錯配修復酶處理雙螺旋，剪切產(chǎn)物，如果有的話，可以由電泳方法等進行檢測.見，例如，美國專利號5,459,039.在其它實施方案中，電泳遷移率的改變將被用于鑒定EGFR基因中的突變.例如，單鏈構(gòu)象多態(tài)(SSCP)可以用來檢測突變和野生型核酸之間電泳遷移率的差異.見，例如，Orita，等，1989.Proc.Natl,Acad.Sci.USA:86:2766;Cotton,1993.Mutat.Res.285:125-144;Hayashi，1992.Genet.Anal.Tech.Appl,9:73-79.將對樣品的單鏈DNA片段和對照EGFR核酸進行變性并讓它復性.單鏈核酸的二級結(jié)構(gòu)隨著序列31的不同而變化，得到的電泳遷移率的變化使得即使是單一堿基變化的檢測成為可能.可以用標記探針對DNA片段進行標記或檢測.通過使用RNA(而不是DNA)可以提高測定的靈敏性，其中二級結(jié)構(gòu)對于序列的變化更加敏感.在一個實施方案中，主趙方法基于電泳遷移率的變化，利用雜合雙螺旋分析分離雙鏈的雜合雙螺旋分子.見，例如，Keen,等，1991,TrendsGenet.7:5,在又一個實施方案中，利用變性梯度凝膠電泳(DGGE)測定包含梯度變性刑的聚丙烯酰胺凝膠中的突變或野生型片段的遷移.見，例如，Myers,等，1985.Nature313:495.當DGGE用作分析方法時，將對DNA進行修飾以確保它不會完全變性，例如通過PCR加入大約40bp的高度熔解性富含GC的DNA的GC夾.在另一個實施方案中，使用溫度梯度代替變性梯度以鑒定對照和樣品DNA的遷移率的差異，見，例如,RosenbaumandReissner，1987.Biophys,Chem.265:12753,用來檢測點突變的其它技術(shù)的例子包括，但不限于，選擇性寡核苷酸雜交，選擇性擴增，或選擇性引物延伸.例如，可以制備寡核苷酸引物，其中將已知的突變置于中央并且只有如果發(fā)現(xiàn)了完全的配對隨后才在允許雜交的條件下雜交到靶DNA上.見，例如，Saiki，等，1986.Nature324:163;Saiki，等，1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:6230.當寡核苷酸附于雜交膜上并與標記的靶DNA雜交時，這些等位基因特異性寡核苷酸被雜交到PCR擴增的靶DNA或多種不同的突變上.或者，依賴于選擇性PCR擴增的等位基因特異性擴增技術(shù)可以用在與本發(fā)明的關(guān)聯(lián)中.用作特異性擴增引物的寡核苷酸可以在分子的中央(從而擴增依賴于差別雜交；見，例如，Gibbs，等，1989.Nucl.AcidsRes.17:24374448)或在一個引物的最外3'端攜帶目標突變，所述3'端在合適的條件下，可以防止錯配，或減少聚合酶延伸(見，例如，P畫ner，1993.Tibtech.11:238)此外希望在突變區(qū)導入新的限制性位點以創(chuàng)造基于剪切的檢測.見，例如，Gasparmi,等，1992.Mol.CellProbes6:1.預期在某些實施方案中還可以利用擴增用的Taq連接酶進行擴增.見，例如，Barany，1991.Proc.Natl,Acad.Sci.USA88:189.在這些情況下，只有在5'序列的3'端上有完全配對才會發(fā)生連接，使得通過觀察擴增的存在或缺失而在特異性位點上檢測已知突變的存在成為成能.固體支持物和探針在備選的實施方案中，檢測至少一種核酸變異的存在或缺失包括將上面鑒定的對應于erbBl基因的所需區(qū)域的核酸序列與探針接觸.所述探針能夠辨別基因的特定形式或特定變異或多種變異的存在，例如，通過差異結(jié)合或雜交.因而，例示性的探針包括核酸雜交探針，肽核酸探針，包含核苷酸的探針，其還包含至少一種核苷酸類似物，和抗體，例如單克隆抗體，和本文討論的其它探針.本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉具有特異性的探針的制備.本領(lǐng)域技術(shù)人員將會認識到可以調(diào)節(jié)多種變量以優(yōu)化基因的兩種變異形式之間的區(qū)別，包括鹽濃度、溫度、pH的變化以及添加影響GC對AT堿基對差異親和性的各種化合物，如四甲基氯化按.(見CurrentProtocolsinMolecularBiologybyF.M.Ausubel，R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.G.Seidman,K.StruhlarxdV.B.Chanda(Editors)，JohnWiley&Sons,),因而，在優(yōu)選的實施方案中，檢測至少一種變異的存在或缺失包括將包括至少一個變異位故作多情的核酸序列與探針接觸，優(yōu)選核酸探針，其中與和在變異位點上具有非互補堿基的核酸序列形式的雜交相比所述探針優(yōu)選與在變異位點上包含互補堿基的核酸序列形式雜交，其中所述雜交在逸擇性雜交條件下進行.這種核酸雜交探針可以跨越兩個或多個變異位點.除非另外指定，核酸探針可以包括一種或多種核酸類似物，探針或其它取代物或部分，只要堿基配對功能得以保留，可以設(shè)計探針來結(jié)合到，例如，SEQIDNO:495，SEQIDNO:497，或SEQIDNO:499的刪除區(qū)兩側(cè)上的至少三個連續(xù)的核苷酸上.當在適當條件下雜交時，這種探針將結(jié)合到EGFR的變異形式上，但不會結(jié)合到野生型EGFR上，這些雜交探針是本領(lǐng)域公知的，(見，例如，Sambrook等，Eds.，(mostrecentedition)，MolecularCloning:ALaboratoryManual,(thirdedition,2001)，Vol.1-3，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.).嚴格的雜交條件一般將包括小于大約1M的鹽濃度，更通常地小于大約500mM和優(yōu)選地小于大約200mM.雜交溫度可以低至51C，但一般大于22TC，更一般地大于大約1C,優(yōu)選地大于大約37TC.較長的片段可能需要較高的雜交溫度進行特異性雜交.其它因素可能影響雜交的嚴謹度，包括堿基組成和互補鏈的長度，有機溶劑的存在和堿基錯配的程度；所用參數(shù)的組合比任何一個單獨參數(shù)的絕對測量更重要.其它可以控制的雜交條件包括緩沖液類型和濃度，溶液pH，封閉刑(例如，重復序列，CotlDNA,封閉性蛋白質(zhì)溶液)的存在和濃度以減少背景結(jié)合，去污刑類型和濃度，提高多核苷酸的相對濃度的分子如聚合物，金屬離子及其濃度，螯合劑及其濃度，和其它本領(lǐng)域已知或可發(fā)現(xiàn)的條件.可以使用公式預測完全互補序列對給定探針的優(yōu)化熔解溫度，但是在一組雜交條件下的探針的真實熔解濃度必須進行經(jīng)驗性確定.另外，必須相對于其精確互補體對探針進行測試以確定給定組條件下的精確熔解溫度，如在Sambrook等，"MolecularCloning,"3ndedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001中所述.利用與核苷酸相關(guān)聯(lián)的支持物可以對給定的雜交溶液系統(tǒng)性改變雜交溫度直到鑒定一個溫度范閨，其允許檢測在所需嚴謹度水平上的結(jié)合，可以在只有靶多核苷酸與高度互補體雜交的高度嚴謹度水平上，也可以在與探針具有互補區(qū)的其它靶多核苷酸可檢測地雜交的較低水平上，所述可檢測地雜交是在由非特異性結(jié)合到非互補性靶多核苷酸或支持物上而提供的背景水平之上進行的。當雜交在給定的條件組之下由潛在的靶多核苷酸在支持物上進行時，隨后在提高的嚴謹條件下洗滌支持物(一般為更低的鹽濃度和/或提高的溫度，但其它條件可以變化)直到背景結(jié)合降低到可以見到明顯的陽性信號的點上.這可以利用Geiger計數(shù)器作進行性監(jiān)測，其中探針進行放射性標記，使用熒光成像儀，或通過其它檢測探針結(jié)合的手段.在這些操作過程中不讓支持物干燥，或者探針可以進行可逆性結(jié)合甚至是結(jié)合到背景位置上.當探針產(chǎn)生有利的背景或假陽性時，采用封閉劑，或者使用探針的不同區(qū)域或不同探針直到可以將陽性信號與背景區(qū)分開.一旦發(fā)現(xiàn)條件在背景之上提供令人滿意的信號，就將提供陽性信號的靶多核苷酸分離出來并進一步作特征鑒定.可以對分離的多核苷酸進行測序；必要時，通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)獲得全長克隆；并且可以利用合適的栽體和宿主表達所述多核苷酸以確定鑒定的多核苷酸是否編碼這樣一種蛋白，其具有與衍生探針多核苷酸的蛋白具有相似活性.探針可以為10-50個核普酸.不過，還可以采用更大的探針，例如，50-500個核苷酸或更大.固相支持物本發(fā)明的固相支持物可以是任何適于支持核苷酸雜合和合成的固體材料和結(jié)構(gòu).優(yōu)選的，固相支持物至少含一個相當堅硬的表面，在此表面上可以固定寡核苷酸引物.該固相支持物可由以下材料構(gòu)成，例如，玻璃，合成聚合物，塑料，硬無孔尼龍或陶資制品.其他適宜的固體支持物材料是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并且可以輕易獲得的.固相支持物的尺寸可以是任意標準微陣列尺寸，對DNA微陣列技術(shù)是有用的，該尺寸可以適應用來進行本發(fā)明的反應的特定儀器.用來固定寡核苷酸的固相支持物的衍生方法和材料是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并在，例如，美國專利號5,919,523中描述，此發(fā)明的公開內(nèi)容此處作為參考被引用.固相支持物可以存在于包含液體容器中或是包含液體容器的一部分.例如，固相支持物可放置于一帶邊的小室中，其沿固相支持物的邊生成一個封口，以便容納在支持物上發(fā)生的聚合酶鏈反應(PCR).在一特定實施例中，小室在矩形支持物的每一側(cè)有壁，以確保PCR混合物保存于支持物上，也使得整個表面對于提供引物是用的.可以使用任何可利用的方式將本發(fā)明的寡核苷酸或寡核苷酸引物粘附、固定、提供和/或應用在固相支持物的表面上以便在固相支持物的特定位置上定位、固定、提供和/或應用寡核苷酸。例如，可使用影印法(Affymetrix，SantaClara，Calif)將寡核苷酸引物應用于芯片或固相支持物上的特定位置上，如在美國專利號US5,919,523，5,837,832，5，831，070和5，770，722，以上專利在此處作為參考被引用.可以將寡核苷酸引物應用到Brown和Shalon，美國專利號5,807,522(1998)中描述的固體支持物上.此夕卜，可以用機器人系統(tǒng)，如由GeneticMicroSystems(Woburn，Mass.),GeneMachines(SanCarlos,Calif)或CartesianTechnologies(Irvine,Calif)制造的系統(tǒng)將引物應用到固相支持物上.在本發(fā)明的一個方面，進行來自于一種生物樣品的靶多核苷酸的固相擴增，其中多組寡核苷酸引物固定于一固體支持物上.在一優(yōu)選的實施方案中，一組中的引物至少包括序列相同的笫一組引物，它與35靶多核苷酸的指定序列是互補的，能在適宜條件下與靶多核苷酸雜合，并適宜作為核酸合成(即，鏈延長或擴展)的起始引物.被選擇的覆蓋于參照序列的特定區(qū)域上的引物作為一個組固定于一固相支持物的非連續(xù)位置上.優(yōu)選地，組與組之間的距離比用來檢測擴增產(chǎn)物的方法的分辨率大.在一優(yōu)選的實施方案中，固定引物形成微陣列或芯片，其可通過自動的方式來處理和檢測.被固定的引物用于在適于核酸擴増方法的條件下進行靶多核苷酸的固相擴增.以此方式，在一種測定中可以測定erbBl基因的激酶結(jié)構(gòu)域中的多種潛在變異的存在或缺失.在測量生物學來源在erbBl基因的激酶結(jié)構(gòu)域里是否具有至少一種提高激酶活性的變異中，一群分離自健康個體的靶多核苷酸可以用作對照.或者，可以將分離自相同個體的健康組織的靶多核苷酸用作上面的對照.在微陣列上的原位型PCR反應可以基本上如在例如Embretson等，Nature362:359-362(1993);Gosden等，BioTechniques15(1):78-80(1993);He函rd等,Nuc.AcidRes.21(14):3159-3166(1993);Long等，Histochemistry99:151-162(1993);Nuovo等，PCRMethodsandApplications2(4):305-312(1993);Patterson等，Science260:976-979(1993)中所述的那樣進行.或者，可以通過固相技術(shù)測定erbBl基因的激酶結(jié)構(gòu)域中的變異，而不會在支持物上進行PCR。多種寡核苷酸探針，每種都在erbBl的激酶結(jié)構(gòu)域中含有不同的變異，以一式兩份，一式三份或一式四份的形式，可以結(jié)合到固相支持物上.通過本領(lǐng)域已知的和上述的選擇性雜交技術(shù)可以檢測測試生物學樣品中變異的存在或缺失.質(zhì)譜分析在另一個實施方案中，利用質(zhì)譜分析測定在erbBl基因的激酶結(jié)構(gòu)域中提高激酶活性的核酸變異的存在或缺失.為了得到合適量的核酸分子用于進行質(zhì)譜，擴增可能是必須的.可用于本發(fā)明的合適的擴增方法的實例包括克隆(Sambrook等，《分子克隆實驗室手冊》(MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)、聚合酶鏈反應(PCR)(C.R.Newton和A.Graham，《PCR》，BIOSPublishers,(1994))，連接酵鏈反應36(LCR)(Wiedma肌M等，(1994)《PCR方法應用》》(PCRMethodsAppl.)，巻3,5744頁；F.Barany，《美國國家科學院學報》(Proc.Natl.Acad.Sd.USA)，1991年88巻189-93頁)、鏈置換擴增(SDA)(G.TerranceWalker等，《核酸研究)>》(NucleicAcidsRes.)，l"4年22巻2670-77頁)和變更方法如RT-PCR(Higuchi等，《生物/技術(shù)》(Bio/Technology)1993年11巻1026-1030頁)、等位基因特異擴增(ASA)和基于轉(zhuǎn)錄的方法.為了方便質(zhì)譜分析，含有待測序列的核酸分子可固定到固相支持物上.合適的固相支持物的實例包括球珠(如硅膠、可控多孔玻璃、磁珠、S印hadex/S印harose,纖維素)、平臺表面或嵌片(如玻璃纖維濾器、玻璃表面、金屬表面(鋼、金、銀、鋁、銅和硅)、毛細管、塑料(如聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚二氣乙二烯膜或微量滴定板))；或者用包括球珠或平臺表面相似材料做成的釘或梳子、或?qū)⑶蛑橹萌肫脚_表面的凹點中如墊片(例如硅墊片).固定化可利用雜交法來完成，例如，基于已固定到固相支持物上的捕獲核酸序列與也包含在含有待測核酸序列的核酸分子中的互補核酸序列之間的雜交，從而互補的核酸分子間的雜交不會被支持物妨礙，捕獲核酸分子在固相支持物和捕獲核酸序列間可含一至少5核苷酸長的間隔區(qū)，在激光脈沖影響下形成的二聚體可被斷裂且解吸附可被激發(fā).固相支持物結(jié)合的堿基序列可通過天然的寡聚核糖核酸或寡聚脫氧核糖核酸及其類似物(例如疏基修飾的褲酸二醋或磷酸三癍骨架)或使用寡核苷酸模擬物如PNA類似物(參見例如Nielsen等，Science,254，1497(1991))提供，它們可降低堿基序列對酶促降解的敏感性，因而提高固相支持物結(jié)合的捕獲堿基序列的總體穩(wěn)定性，在質(zhì)譜分析前，"修飾"核酸分子可能是有用的，例如可降低汽化所需的激光能量和/或?qū)⑵位饔媒抵磷畹统潭?修飾優(yōu)選適用于固定化的靶檢測位點.修飾的一個實例是核酸分子中磷酸二酯骨架的修飾(例如陽離子交換)，這可用于消除由于每核苷酸單位上結(jié)合的陽離子的不均一性導致的峰加寬現(xiàn)象.將核酸分子與烷基化試劑如烷基硤、硤乙醜胺、J3-碘乙醇或2，3-環(huán)氧乙烷-l-丙醇接觸，核酸分子的單硫磷酸二醋鍵可轉(zhuǎn)換為磷酸三醋鍵.同樣地，利用氯化三烷基硅可將磷酸二酯鍵轉(zhuǎn)換為無電荷的衍生物，進一步的修飾包括摻入降低脫噪呤37(MS中的片段化作用)敏感性的核苷酸如N7-或N9-脫氮嚷呤核苷酸或RNA元件，或使用寡聚核苷酸三酴或摻入烷基化的硫代磷酸酯官能團或摻入寡聚核苷酸模擬物如PNA.對于某些應用，同時檢測位于一特異被捕獲核酸片段(在陣列上的一個點上)上超過一個(突變的)位點或用不同固相支持物上寡聚核苷酸或寡聚核苷酸模擬物陣列排列來實行并行檢測可能是有用的."多路檢測"可由幾種不同的方法來獲得.例如，通過使用相應的檢測(探針)分子(如寡聚核苷酸或寡聚核苷酸模擬物)，在一粑序列上的幾個突變可被同時檢測.然而，檢測核苷酸D1、D2和D3的分子量差異必須足夠大，同時檢測(多路檢測)才有可能.這種差異可通過序列本身(組成或長度)或在檢測寡聚核苷酸中引入質(zhì)量修飾官能團Ml-M3來獲得.本發(fā)明中用到的優(yōu)選的質(zhì)諉檢測方式是基質(zhì)輔助激光解吸附離子化(MALDI),電噴霧(ES),離子回旋共振(ICR)和傅立葉變換.進行質(zhì)詳分析的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且在MethodsofEnzymology，Vol.193:"MassSpectrometry"(J.A.McCloskey，editor)，1990，AcademicPress,NewYork中進行了描述.測序在其它的優(yōu)選實施方案中，測定至少一種提高激酶活性的核酸變異的存在或缺失包括對至少一和核酸序列進行測序.所述測序包括對包括至少一個變異位點，并且可能包括多個這種位點的erbBl的激酶結(jié)構(gòu)域的一部分或多部分進行測序.優(yōu)選地，所述部分為500個核苷酸或更少的長度，更加優(yōu)選地為100個核苷酸或更少，最優(yōu)選地為45個核苷酸或更少的長度.這種測序可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所認知的各種方法進行，包括雙脫氧終止法(例如，使用染色標記的雙脫氧核苷酸)，和使用質(zhì)詳分析法.免疫檢測在一個實施方案中，測定至少一種提高激酶活性的核酸變異的存在或缺失包括測定EGFR下游靶標的激活狀態(tài).本發(fā)明的發(fā)明人比較了EGFR的主要下游靶標的磷酸化狀態(tài).例如，已經(jīng)檢查了EGF-誘導的通過Ras的Erkl和Erk2的激活，通過PLCy/PI3K的Akt，以及通過JAK2的STAT3和STAT5的激活.通過Ras的Erkl和Erk2，通過PLCyPI3K的Akt,以及通過JAK2的STAT3和STAT5是介導EGFR的致癌作用的基本下游途徑(R.N.Jorissen等，Exp.CellRes.284，31(2003)),本發(fā)明的發(fā)明人顯示EGF誘導的Erk激活在表達野生型EGFR和兩種活化性EGFR突變體的任一種之間無法區(qū)別.相反地，Akt和STAT5的褲酸化作用在表達兩種突變EGFR的任一種的細胞中基本上得以提高..在表達突變EGFRs的細胞中類似地觀察到STAT3的磷酸化作用.因而，在EGFR突變體內(nèi)C末端酪氨酸殘基的選擇性EGF誘導的自體礴酸化與下游信號途徑的選擇性激活密切相關(guān).在本發(fā)明的一個實施方案中，EGFR突變的存在可以利用本領(lǐng)域公知的免疫學技術(shù)進行測定，例如，抗體技術(shù)如免疫組織化學，免疫細胞化學，F(xiàn)ACS掃描，免疫印跡，放射性免疫測定，蛋白質(zhì)印跡，免疫沉淀，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，利用針對EGFR激活的下游耙標的抗體的衍生技術(shù).這些靶標的例子包括，例如，磷酸化STAT3，磷酸化STAT5，和磷酸化Akt.利用轔特異性抗體，可以測定STAT3，STATS，和Akt的激活狀態(tài)，STAT3，STAT5,和Akt的激活可以用作活化性EGFR突變的診斷指標.在本發(fā)明的一個實施方案中，激活的(磷酸化的)STAT5，STAT3,或Akt的存在顯示EGFR靶向性治療可能有效.本發(fā)明提供了一種通過免疫組織化學或免疫細胞化學方法篩選測試樣品中erbBl基因的激酶結(jié)構(gòu)域中變異的方法.例如，可以利用免疫組織化學("IHC")和免疫細胞化學("ICC")技術(shù).IHC是免疫化學對組織切片的應用，而ICC是免疫化學是在細胞或組織標記進行過特定的細胞學制備如，例如基于液體的制備后對它們的應用，免疫化學是一族基于特異性抗體使用的利用，其中使用抗體特異性靶向細胞內(nèi)部或細胞表面上的分子.抗體一般包含一種標記物，其在遇到耙分子后將進行生化反應，由此經(jīng)歷變化顏色.在一些情況下，可以將信號擴增并入特定的方案中，其中在應用特異性一抗后使用包括標記染色的二抗.免疫組織化學測定是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(例如，見Jalkanen，等，J.Cell.Biol.101:976-985(1985);Jalkanen，等，J.Cell,Biol.105:393087-3096(1987).多克隆或單克隆的抗體，可以購自多家商業(yè)供應商，或可以利用公知的方法進行生產(chǎn)，例如，如在Harlow等，Antibodies:ALaboratoryManual,2ndEd;CoMSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1988)中所述的那樣.一般，可用于本發(fā)明的抗體的例子包括抗-褲-STAT3，抗-磷-STAT5，和抗-砩-Akt抗體.這些抗體可以購自，例如,UpstateBiotechnology(LakePlacid,NY)，NewEnglandBiolabs(Beverly,MA)，NeoMarkers(Fremont,CA).一般，對于免疫組織化學來說，組織切片獲自患者并且通過合適的固定刑如乙醇、丙酮和多聚甲醛進行固定，抗體與所述固定刑反應。進行免疫組織化學的常規(guī)方法在Harlow和Lane(eds)(l988)，在"AntibodiesALaboratoryManual",ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NewYork;Ausbeletal(eds)(1987)，在CurrentProtocolsInMolecularBiology,JohnWileyandSons(NewYork,NY)中進行描述.適于這些檢測測定的生物學樣品包括，但不限于，細胞、活檢組織、全血、血漿、血清、痰、腦脊液、乳腺抽吸物、胸水、尿等等.對于直接的標記技術(shù)，使用標記的抗體.對于間接的標記技術(shù)，將樣品進一步與標記的物質(zhì)反應.或者，可以利用免疫細胞化學.一般，細胞獲自患者并且通過合適的固定劑如乙醇、丙嗣和多聚甲搭進行固定，抗體與所述固定劑反應.人樣品的免疫細胞學染色的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且，例如，在Brauer等，2001(FASEBJ，15，2689-2701)，Smith-Swintosky等，1997中進行描述.本發(fā)明的免疫學方法是有利的，因為它們只鶯要小量的生物學材料.這些方法可以在細胞水平上進行并且因而需要最少一個細胞.優(yōu)選地，從具有或處于發(fā)生癌癥危險中的患者中獲得幾個細胞并根據(jù)本發(fā)明的方法進行測定.其它的診斷方法用于檢測突變型EGFR蛋白質(zhì)的試劑是能夠結(jié)合到突變型EGFR蛋白質(zhì)上的抗體，優(yōu)選地為具有可檢測標記的抗體.抗體可以是多克隆的，或更優(yōu)選地，是單克隆的.可以使用完整的抗體，或其片段(例如，F(xiàn)ab或F(ab)2).關(guān)于探針或抗體，術(shù)語"標記的"意在包括通過將可檢測的物質(zhì)偶聯(lián)(即，物理性連接)到探針或抗體上的探針或抗體的直接標記，以及通過與另一種直接標記的試刑的反應進行的探針或抗體的間接標記.間接標記的例子包括利用熒光標記的二抗檢測一抗和用生物素標記DNA探針從而可以用熒光標記的鏈審抗生物素對它進行檢測.術(shù)語"生物學樣品"意在包括分離自受試者的組織、細胞和生物液，以及存在于受試者體內(nèi)的組織、細胞和液體.即，本發(fā)明的檢測方法可以用于在體外以及體內(nèi)檢測生物學樣品中的突變型EGFRmRNA，蛋白質(zhì)，或基因組DNA,例如，檢測突變型EGFRmRNA的體外技術(shù)包括RNA印跡雜交和原位雜交.檢測突變型EGFR蛋白的體外技術(shù)包括醉聯(lián)免疫吸附測定(ELISAs),蛋白質(zhì)印跡，免疫沉淀，和免疫熒光.用于檢測突變型EGFR基因組DNA的體外技術(shù)包括向受試者體內(nèi)導入標記的抗突變型EGFR蛋白抗體，例如，所述抗體可以用放射性標記進行標記，其在受試者中的存在和定位可以通過標記的成像技術(shù)進行檢測.在一個實施方案中，所述生物學樣品包含來自試驗受試者的蛋白質(zhì)分子.或者，所述生物學樣品可以包含來自試驗受試者的mRNA分子或來自試驗受試者的基因組DNA分子.在另一個實施方案中，所述方法進一步包括從對照受試者獲得對照生物學樣品，將對照樣品一能夠檢測突變型EGFRmRNA，蛋白質(zhì)，或基因組DNA的化合物或試劑接觸，從而在生物學樣品中檢測突變型EGFRmRNA，蛋白質(zhì)，或基因組DNA的存在，并將對照樣品中的突變型EGFRmRNA,蛋白質(zhì)，或基因組DNA的存在與測試樣品中的突變型EGFRmRNA,蛋白質(zhì)，或基因組DNA的存在相比較.在不同的實施方案中，診斷測定是針對突變型EGFR活性.在具體的實施方案中，所述突變型EGFR活性是酪氡酸激酶活性，一種這樣的診斷測定是檢測至少一種EGFR底物的EGFR介導的磷酸化作用?？梢詫τ?，例如，各種突變型EGFR多肽，各種包含突變型EGFR的組織，來自懷疑具有至少一種突變型EGFR的癌組織的活檢組織等等測定EGFR活性的水平。任選地可以進行在這些各種細胞、組織或其提取物中的EGFR活性水平的比較.在一個實施方案中，在癌組織中高水平的EGFR活性水平可以診斷可能易受用一種或多種酪氨酸激酶抑制劑進行治療的影響的癌癥.在相關(guān)的實施方案中，可以在治療和未治療的活檢組織樣品，細胞系，轉(zhuǎn)基因動物，或任何這些的提取物之間測定EGFR活性水平抑制劑，以便與未治療的對照相比來確定給定治療對于突變型EGFR活性的影響.治療患者的方法在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種通過測定erbBl基因的激醉結(jié)構(gòu)域中至少一種提髙激酶活性的核酸變異的存在或缺失來選擇對于患有癌癥或處于形成癌癥的危險之中的患者的治療的方法.在另一個實施方案中，所述變異是多種變異，其中多種可以包括來自一個、兩個、三個或多個基因位點的變異.在某些實施方案中，至少一個變異的存在是所述治療將在患者中有效或有益(或更可能是有益)的指征.聲明所述治療將是有效的方法，即有益治療效果的可能性比在erbBl基因的激酶結(jié)構(gòu)域中不具有特定的提高激酶活性的核酸變異的適當存在的個人中更大.所述治療將包括施用輅氨酸激酶抑制劑.所述治療可以包括治療組織，包括，但不限于輅氨酸激酵抑制刑組合以其它酪氨酸激酶抑制刑，化療，放療等.因而，與施用酪氨酸激酶抑制劑相關(guān)，"有效對抗"癌癥的藥物表明以臨床上適當?shù)姆绞浇o藥導致對于患者的至少統(tǒng)計學上顯著的部分的有益效果，如癥況的改善，治愈，疾病負擔的減輕，腫瘤質(zhì)量或細胞數(shù)目的減小，生命的延長，生命質(zhì)量的改善，或其它被熟悉治療特定類型的疾病或狀況的醫(yī)生一般性認為是積極的效果.在優(yōu)選的實施方案中，所述化合物是苯氨基喹唑啉或合成的苯氨基喹唑啉.歐洲專利發(fā)明者B·E·約翰遜,D·A·哈伯,D·W·貝爾,J·E·塞特爾曼,J·G·佩茨,M·邁耶森,P·A·賈恩,R·索德拉,T·J·林奇,W·R·塞勒斯申請人:綜合醫(yī)院公司;達納-法伯癌癥協(xié)會有限公司