專利名稱：肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的n－端片段的重組表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的包含N-端4個(gè)三環(huán)的片段的重組表達(dá)的方法。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF/SF)是由Nakamura，T.，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.22(1984)1450-1459鑒定和純化的多肽。還發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子與分散因子(scatter factor)(SF)相同，Weidner，K.M.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)7001-7005。HGF是涉及許多細(xì)胞表型的發(fā)展的糖蛋白，所述細(xì)胞表型包括增殖、細(xì)胞分裂發(fā)生、分支小管的形成并且在腫瘤細(xì)胞的情形中，包括侵入和轉(zhuǎn)移。對(duì)于情況綜述，見Stuart，K.A.，et al.，Int.J.Exp.Pathol.81(2000)17-30。
已經(jīng)對(duì)于大鼠HGF和人HGF進(jìn)行了測(cè)序和克隆(Miyazawa，K.et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.163(1989)967-973；Nakamura，T.，et al.，Nature 342(1989)440-443；Seki，T.，et al.，Biochem.and Biophys.Res.Comm.172(1990)321-327；Tashiro，K.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)3200-3204；Okajima，A.，et al.，Eur.J.Biochem.193(1990)375-381)。
HGF是與人纖維蛋白溶酶原具有高類似性的蛋白質(zhì)(38％的氨基酸序列同一性)。HGF和纖維蛋白溶酶原都作為單鏈多肽進(jìn)行合成，所述單鏈多肽被蛋白水解加工為二硫鍵連接的雜二聚體。HGF包含N端結(jié)構(gòu)域四個(gè)連續(xù)的三環(huán)結(jié)構(gòu)域和羧基端蛋白酶樣的結(jié)構(gòu)域。已經(jīng)描述了不同的截短的HGF變體。NK1是描述的最短的HGF變體。NK1包含氨基酸32-210，并且在第一個(gè)三環(huán)結(jié)構(gòu)域后被截短(Lokker，N.A.，和Godowski，P.J.，J.Biol.Chem.268(1993)17145-17150)。NK2由N-端氨基酸末端和三環(huán)1和三環(huán)2組成并且是備選剪接的HGF mRNA的天然存在的產(chǎn)物(Chan，A.M.，et al.，Science 254(1991)1382-1385)。此外，包含HGF的重鏈的部分(氨基酸1-494，包含來自氨基酸1-463的HGF的α-亞基)的HGF變體由Lokker，N.A.，EMBO J.11(1992)2503-2510)所述。
還發(fā)現(xiàn)由HGF/SF的N-端發(fā)夾序列結(jié)構(gòu)域和四個(gè)三環(huán)結(jié)構(gòu)域組成的稱為NK4的HGF/SF片段具有完全不同于HGF/SF的那些的藥理學(xué)性質(zhì)，是HGF/SF影響結(jié)腸癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和侵入的拮抗劑，并且此外，是抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的血管發(fā)生抑制劑(Parr，C.，et al.，Int.J.Cancer 85(2000)563-570；Kuba，K.，et al.，Cancer Res.60(2000)6737-6743；Date，K.，et al.，F(xiàn)EBS Lett.420(1997)1-6；Date，K.，et al.，Oncogene 17(1989)3045-3054)。
按照現(xiàn)有技術(shù)(Date，K.，et al.，F(xiàn)EBS Lett.420(1997)1-6)通過HGFcDNA在CHO細(xì)胞中的重組表達(dá)和隨后用胰腺?gòu)椥缘鞍酌高M(jìn)行消化來制備NK4。在大腸桿菌中產(chǎn)生分別編碼N-端結(jié)構(gòu)域和三環(huán)1，和N-端結(jié)構(gòu)域和三環(huán)1和2的HGF的兩種其它同種型(NK1和NK2)(Stahl，S.J.，Biochem.J.326(1997)763-772)。然而，該方法僅導(dǎo)致約一定量的HGF-衍生的蛋白質(zhì)，其是總蛋白質(zhì)的約10-20％。
發(fā)明概述本發(fā)明提供制備HGF的α-鏈或其片段(NK多肽)的方法，其通過在微生物宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所述NK多肽的核酸，分離包含以變性形式存在的所述NK多肽的內(nèi)含體，溶解內(nèi)含體并且使變性的NK多肽復(fù)性(naturation)來進(jìn)行，其特征在于在所述核酸中，選自由在位點(diǎn)33，35和36的密碼子組成的組的氨基酸的密碼子的至少其中之一是CGT。
氨基酸(aa)和密碼子編號(hào)按照在Swiss-Prot P14210中顯示的序列來進(jìn)行，其中aa(氨基酸)1-31指信號(hào)序列，aa 32-494指α鏈，aa 128-206三環(huán)1，aa 211-288三環(huán)2，aa305-383三環(huán)3和aa391-469三環(huán)4。
令人驚奇的是發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)33，35和36的DNA序列(密碼子33，35和36編碼精氨酸，編號(hào)按照M73239)的密碼子的至少其中之一的修飾導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)量增加約100％或更多。還優(yōu)選的是氨基酸32的密碼子從編碼Gln改變?yōu)榫幋aSer從而提高分離N-端甲硫氨酸。
按照本發(fā)明的NK多肽由aa 32-494或其N-端片段(總是以aa32開始)，優(yōu)選地片段aa 32-478組成，最小的片段是aa 32-207。按照本發(fā)明的所有的NK多肽在按照實(shí)施例4的分散測(cè)定中顯示活性。
本發(fā)明還提供編碼NK多肽的核酸，所述NK多肽由aa 32-494或其N-端片段組成，以aa32開始，優(yōu)選地是片段aa 32-x，其中x是介于207和478之間的數(shù)字，并且x優(yōu)選地是207或478，其特征在于選自由位點(diǎn)33，35和36的密碼子組成的組的氨基酸的密碼子的至少其中之一是CGT。優(yōu)選地，在位點(diǎn)33，35和36的所有密碼子是CGT。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，aa 32從谷氨酰胺改變?yōu)榻z氨酸從而提高蛋白質(zhì)的同質(zhì)性(N-端甲硫氨酸的裂解)。
還優(yōu)選的是將兩個(gè)翻譯終止密碼子(TAA，TAG和/或和TGA)引入編碼NK多肽的核酸的末端從而在等價(jià)于需要的多肽的末端的位點(diǎn)終止翻譯。
發(fā)明詳述人HGF是二硫鍵連接的雜二聚體，其可以通過在氨基酸R494和V495之間的裂解，在463個(gè)氨基酸的α-亞基和234個(gè)氨基酸的β-亞基中裂解。α-鏈的N-端的前面是以甲硫氨酸基團(tuán)開始的31個(gè)氨基酸。該片段包括31個(gè)氨基酸的信號(hào)序列。α-鏈開始于氨基酸32，并包含四個(gè)三環(huán)結(jié)構(gòu)域。所謂的“發(fā)夾序列結(jié)構(gòu)域”由氨基酸70-96組成。三環(huán)1結(jié)構(gòu)域由氨基酸128-206組成。大致上，三環(huán)2結(jié)構(gòu)域由α-鏈的氨基酸211-288組成，三環(huán)3結(jié)構(gòu)域由α-鏈的氨基酸305-383組成，且三環(huán)4結(jié)構(gòu)域由α-鏈的氨基酸391-469組成。存在這些序列的各種變化，其基本上不影響NK多肽的生物學(xué)性質(zhì)(基本上不影響其對(duì)HGF拮抗的活性和其抗生血管的活性)，其變化描述在，例如WO 93/23541中。此外，NK多肽的長(zhǎng)度可以在數(shù)個(gè)氨基酸內(nèi)變化，只要其生物學(xué)性質(zhì)不受影響。
NK1由HGF/SFα-鏈的aa 32到206-210組成，NK2由aa32到288-305組成并且NK4由aa 32到447(resp.469-494)組成。此外，由按照本發(fā)明的核酸編碼的并且按照本發(fā)明重組制備的NK多肽描述于WO 93/23541中并且例如是32-207，32-303，或32-384。NK多肽具有導(dǎo)致對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、血管發(fā)生和/或轉(zhuǎn)移的抑制的體內(nèi)生物學(xué)活性。
可以在原核生物中通過重組方式來制備NK多肽。對(duì)于在原核宿主細(xì)胞中的表達(dá)，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法來將核酸整合到適合的表達(dá)載體中。這樣的表達(dá)載體優(yōu)選地包含可調(diào)節(jié)的/可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。接著將重組載體引入以在適合的宿主細(xì)胞諸如，例如大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，并且將被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在容許異源基因表達(dá)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在發(fā)酵后，分離包含變性的NK多肽的內(nèi)含體。
例如，埃希氏菌屬(Escherichia)，沙門氏菌屬(Salmonella)，鏈霉菌屬(Streptomyces)或芽孢桿菌屬(Bacillus)適合作為原核宿主生物。對(duì)于NK多肽的制備，將包含按照本發(fā)明的并且編碼NK多肽的DNA的載體以常規(guī)方式轉(zhuǎn)化原核生物，并且隨后以常規(guī)方式進(jìn)行發(fā)酵。然而，使用NK多肽的最初的DNA序列(GenBank M73239)在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)量非常低。
在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)內(nèi)含體，因?yàn)榇磉_(dá)的基因不包含信號(hào)序列。這些內(nèi)含體在細(xì)胞裂解后，例如通過離心分離自其它的細(xì)胞成分。
通過在pH 7-9的磷酸緩沖液中，加入變性劑如6M的鹽酸胍或8M的尿素(優(yōu)選地以0.1-1.0M的濃度，例如0.4M)，優(yōu)選地在DTT(二硫-1，4-蘇糖醇)存在的情況下來溶解內(nèi)含體。將溶解物(solubilisate)在存在GSH/GSSG(優(yōu)選地2-20mM，谷胱甘肽)和以非變性濃度存在的變性劑(例如，2M的鹽酸胍或4M的尿素)，或優(yōu)選地取代鹽酸胍或尿素，以約0.3到1.0M濃度存在的精氨酸，優(yōu)選地以約0.7M的濃度存在的精氨酸的情況下稀釋于磷酸緩沖液pH 7-9中。復(fù)性優(yōu)選地在約4℃的溫度下進(jìn)行，并且進(jìn)行約48到160小時(shí)。
按照現(xiàn)有技術(shù)，在溶解和復(fù)性的過程中使用Tris緩沖液導(dǎo)致相當(dāng)大量(約50％)的副產(chǎn)物，所述副產(chǎn)物由本發(fā)明人鑒定為主要由GSH-修飾的NK多肽組成。相反，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)使用pH范圍在7和9之間，優(yōu)選地在pH 8和9之間的磷酸鉀緩沖液導(dǎo)致NK多肽的產(chǎn)量和純度的相當(dāng)大量的提高。
在復(fù)性終止后，將所述溶液優(yōu)選地針對(duì)磷酸緩沖液pH 7-9(優(yōu)選地以0.1-1.0M的濃度，例如0.3M)進(jìn)行透析達(dá)至少24小時(shí)，優(yōu)選地達(dá)24-120小時(shí)。
可以在按照本發(fā)明的方法重組制備和復(fù)性水不溶性的變性多肽(內(nèi)含體)后，優(yōu)選地通過層析法方法，例如通過親和層析法，疏水相互作用層析法，免疫沉淀法，凝膠過濾，離子交換層析法，層析聚焦，等電聚焦，選擇性沉淀，電泳等來純化NK多肽。優(yōu)選通過疏水相互作用層析法，優(yōu)選地在pH 7-9，在存在磷酸緩沖液的情況下和/或通過使用丁基或苯基瓊脂糖來純化NK多肽。
提供下面的實(shí)施例，參考文獻(xiàn)，圖和序列表來協(xié)助理解本發(fā)明，在后附的權(quán)利要求中提出的真正范圍。要理解的是可以在不背離本發(fā)明的精神的前提下，在提出的方法中進(jìn)行改進(jìn)。
附圖描述

圖1 以生物量和分離的內(nèi)含體(IB)存在的NK4蛋白質(zhì)的SDS-凝膠(10％NuPAGE-SDS，5μl/泳道，從左到右編號(hào))泳道1標(biāo)準(zhǔn)物泳道2生物量泳道3在離心后的上清液泳道4在進(jìn)一步離心后的上清液泳道5IB制備物泳道6在洗滌后的IB制備物序列的描述SEQ ID NO1編碼HGF的α-鏈的氨基酸序列和DNA序列，按照GenBankM73239的初始序列(沒有信號(hào)序列)SEQ ID NO2HGF的α-鏈的蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO3按照本發(fā)明的編碼NK4的氨基酸序列和DNA序列(氨基酸序列包括N-端甲硫氨酸，DNA序列包括兩個(gè)終止密碼子)SEQ ID NO4NK4的蛋白質(zhì)序列實(shí)施例1NK多肽的重組表達(dá)將由HGF的氨基酸位點(diǎn)32到478組成的NK4多肽用于克隆并且在大腸桿菌中重組表達(dá)。描述用作DNA源的初始的DNA序列(數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)識(shí)符“gbM73239”)。進(jìn)行PCR從而擴(kuò)增和同時(shí)修飾編碼NK4(Seq ID No1)的DNA。所有的方法在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行。
與NK4的初始的DNA序列相比，引入下列變化-去除真核信號(hào)肽序列并且融合鄰近NK4的氨基酸位點(diǎn)32的ATG起始密碼子-將氨基酸位點(diǎn)32(在Seq ID No2中的位點(diǎn)2)從Gln改變到Ser從而改變蛋白質(zhì)產(chǎn)物的同質(zhì)性(無Met)-修飾氨基酸的密碼子的DNA序列，在位點(diǎn)33(AGG到CGT)，35(AGA到CGT)，和36(AGA到CGT)從而提高在大腸桿菌中的基因表達(dá)-修飾密碼子的DNA序列，在位點(diǎn)477(ATA到ATC)和478(GTC到GTT)從而有利于PCR產(chǎn)物向載體插入-將兩個(gè)翻譯終止密碼子引入位點(diǎn)479(TAA)和480(TAG)從而在等價(jià)于NK4蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的末端的位點(diǎn)來終止翻譯。
用限制性內(nèi)切核酸酶NdeI和BanII來處理PCR-擴(kuò)增的DNA片段，并且連接于修飾的pQE載體(Qiagen)(消除His-標(biāo)記以及DHFR編碼區(qū)域)，所述pQE載體用NdeI和BanII進(jìn)行適當(dāng)?shù)靥幚?。表達(dá)質(zhì)粒pQE-NK4-Ser(質(zhì)粒大小4447bp)的元件是T5啟動(dòng)子/lac操縱子元件，NK4編碼區(qū)域，λ到轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域，rrnB T1轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域，復(fù)制的ColE1起點(diǎn)和β-內(nèi)酰胺酶編碼序列。
將連接反應(yīng)用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，例如具有表達(dá)輔助質(zhì)粒pUBS520的大腸桿菌菌株C600(EP 0 373 365)。分離大腸桿菌菌落并且關(guān)于它們的質(zhì)粒的限制性和序列分析進(jìn)行特征鑒定。在存在適當(dāng)?shù)目股厍闆r下，于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組細(xì)胞后，且在通過添加IPTG(1mM)誘導(dǎo)基因表達(dá)后，通過NK4蛋白質(zhì)含量的分析來進(jìn)行克隆的選擇。通過PAGE來比較細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)圖譜。選擇顯示最高比例的NK4蛋白質(zhì)的重組大腸桿菌克隆來進(jìn)行制備過程(production process)。在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行發(fā)酵并且分離內(nèi)含體。產(chǎn)量130g/l的細(xì)胞的凈重，其中30％-40％總蛋白質(zhì)的NK4NK1和NK2可以以類似方式進(jìn)行重組制備。
實(shí)施例2溶解和復(fù)性將內(nèi)含體在緩沖液中溶解過夜，所述緩沖液包含6M的鹽酸胍，0.1M的磷酸鉀pH 8.5(用10M KOH來滴定)，1mM EDTA，0.01mM DTT。通過Biuret測(cè)定來確定溶解的蛋白質(zhì)的濃度并且最終在室溫調(diào)節(jié)到25mg總蛋白/ml的濃度。
將該NK4-溶解物在緩沖液中稀釋到0.4mg/ml的濃度，所述緩沖液包含0.7M的精氨酸，0.1M的磷酸鉀pH 8.5(用濃HCl滴定)，10mM GSH，5mM GSSG和1mM EDTA。于4℃，將該復(fù)性測(cè)定溫育介于2和8天之間。在獲得最大復(fù)性有效性后，使用切向流(tangential flow)過濾裝置(MW截留值10kDa，Sartorius)來將復(fù)性測(cè)定的15升體積濃縮到3升。隨后，對(duì)著包含0.3M的磷酸鉀的pH 8.0的50升緩沖液將其透析3次達(dá)至少3×24小時(shí)，最優(yōu)共進(jìn)行5天。
實(shí)施例3純化純化通過肝素-瓊脂糖層析來進(jìn)行。
緩沖液條件緩沖液A50mM Tris pH 8.0緩沖液B50mM Tris pH 8.0，2M NaCl梯度 5-25％ 緩沖液B，2柱體積25-55％ 緩沖液B，16柱體積55-100％緩沖液B，0.7柱體積100％ 緩沖液B，2柱體積將在0.1M的磷酸鉀pH 8.0中的1M硫酸銨加入洗脫物質(zhì)中，并且于4℃溫育過夜。將樣品進(jìn)行離心并且將上清液上載到苯基瓊脂糖柱(150ml)上。用1柱體積的1M硫酸銨，50mM的磷酸鉀pH 8.0來洗滌所述柱。
洗脫條件緩沖液A1M硫酸銨，50mM磷酸鉀pH 8.0緩沖液B50mM磷酸鉀pH 8.0，40％乙二醇0-100％緩沖液B，20柱體積實(shí)施例4活性的測(cè)定a)分散測(cè)定將MDCK細(xì)胞亞匯合地(subconfluently)培養(yǎng)在組織培養(yǎng)板中。用HGF(10ng/ml)或用HGF和NK4的組合處理細(xì)胞。在這些實(shí)驗(yàn)中，通過加入10到1000倍摩爾過量的NK4來抑制所述HGF-誘導(dǎo)的細(xì)胞分散至少達(dá)90％及更多，顯示功能活性。
b)增殖測(cè)定如在Nakamura，T.，et al.，1989中所述，通過在原初培養(yǎng)物中測(cè)量成年大鼠肝細(xì)胞的DNA合成來確定NK4對(duì)HGF的促有絲分裂活性的抑制。在這些實(shí)驗(yàn)中，通過添加10-1000倍摩爾過量的NK4來抑制HGF-誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖至少達(dá)90％及更多，顯示功能活性。
c)侵入測(cè)定在該測(cè)定中，分析了腫瘤細(xì)胞的侵入潛能。使用HT115細(xì)胞，基本上如在Albini，A.，et al.，Cancer Res.47(1987)3239-3245中所述進(jìn)行該測(cè)定。此外，HGF-誘導(dǎo)(10ng/ml)的細(xì)胞侵入可以被10-1000倍摩爾過量的NK4抑制至少達(dá)90％及更多，顯示功能活性。
實(shí)施例5體內(nèi)活性模型 Lewis肺癌裸鼠腫瘤模型將1×106Lewis肺癌細(xì)胞皮下(s.c.)植入雄性裸鼠中(BALB/cnu/nu)。
處理 4天后，在2-4周時(shí)期內(nèi)，每日施用pegylated的NK4一次劑量 1000μg/小鼠/日300μg/小鼠/日100μg/小鼠/日安慰劑結(jié)果 用NK4進(jìn)行的處理顯示對(duì)原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的劑量依賴型的抑制，而在安慰劑處理組中沒有觀察到作用。
參考文獻(xiàn)列表Albini，A.，et al.，Cancer Res.47(1987)3239-3245Chan，A.M.，et al.，Science 254(1991)1382-1385Date，K.，et al.，F(xiàn)EBS Lett.420(1997)1-6Date，K.，et al.，Oncogene 17(1989)3045-3054EP 0 373 365Kuba，K.，et al.，Cancer Res.60(2000)6737-6743Lokker，N.A.，and Godowski，P.J.，J.Biol.Chem.268(1993)17145-17150Lokker，N.A.，EMBO J.11(1992)2503-2510Miyazawa，K.et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.163(1989)967-973Nakamura，T.，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.22(1984)1450-1459Nakamura，T.，et al.，Nature 342(1989)440-443Okajima，A.，et al.，Eur.J.Biochem.193(1990)375-381Parr，C.，et al.，Int.J.Cancer 85(2000)563-570Seki，T.，et al.，Biochem.and Biophys.Res.Comm.172(1990)321-327Stahl，S.J.，Biochem.J.326(1997)763-772Stuart，K.A.，et al.，Int.J.Exp.Pathol.81(2000)17-30Tashiro，K.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)3200-3204Weidner，K.M.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)7001-7005WO 93/23541
序列表<110>霍夫曼-拉羅奇有限公司<120>肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的N-端片段的重組表達(dá)的方法<130>22388 WO<150>EP 04004951.2<151>2004-03-03<160>4<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1389<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)..(1389)<223>編碼肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的α-鏈的DNA序列<400>1caa agg aaa aga aga aat aca att cat gaa ttc aaa aaa tca gca aag48Gln Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys1 5 10 15act acc cta atc aaa ata gat cca gca ctg aag ata aaa acc aaa aaa96Thr Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys20 25 30gtg aat act gca gac caa tgt gct aat aga tgt act agg aat aaa gga 144Val Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly35 40 45ctt cca ttc act tgc aag gct ttt gtt ttt gat aaa gca aga aaa caa 192Leu Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln50 55 60tgc ctc tgg ttc ccc ttc aat agc atg tca agt gga gtg aaa aaa gaa 240Cys Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu65 70 75 80ttt ggc cat gaa ttt gac ctc tat gaa aac aaa gac tac att aga aac 288Phe Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn85 90 95
tgc atc att ggt aaa gga cgc agc tac aag gga aca gta tct atc act 336Cys Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr100 105 110aag agt ggc atc aaa tgt cag ccc tgg agt tcc atg ata cca cac gaa 384Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu115 120 125cac agc ttt ttg cct tcg agc tat cgg ggt aaa gac cta cag gaa aac 432His Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn130 135 140tac tgt cga aat cct cga ggg gaa gaa ggg gga ccc tgg tgt ttc aca 480Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr145 150 155 160agc aat cca gag gta cgc tac gaa gtc tgt gac att cct cag tgt tca 528Ser Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser165 170 175gaa gtt gaa tgc atg acc tgc aat ggg gag agt tat cga ggt ctc atg 576Glu Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met180 185 190gat cat aca gaa tca ggc aag att tgt cag cgc tgg gat cat cag aca 624Asp His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr195 200 205cca cac cgg cac aaa ttc ttg cct gaa aga tat ccc gac aag ggc ttt 672Pro His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe210 215 220gat gat aat tat tgc cgc aat ccc gat ggc cag ccg agg cca tgg tgc 720Asp Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys225 230 235 240tat act ctt gac cct cac acc cgc tgg gag tac tgt gca att aaa aca 768Tyr Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr245 250 255tgc gct gac aat act atg aat gac act gat gtt cct ttg gaa aca act 816Cys Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr260 265 270gaa tgc atc caa ggt caa gga gaa ggc tac agg ggc act gtc aat acc 864Glu Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr275 280 285att tgg aat gga att cca tgt cag cgt tgg gat tct cag tat cct cac 912Ile Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His290 295 300gag cat gac atg act cct gaa aat ttc aag tgc aag gac cta cga gaa 960Glu His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu305 310 315 320
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Cys Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu65 70 75 80Phe Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn85 90 95Cys Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr100 105 110Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu115 120 125His Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn130 135 140Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr145 150 155 160Ser Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser165 170 175Glu Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Lau Met180 185 190Asp His Thr Glu ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr195 200 205Pro His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe210 215 220Asp Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys225 230 235 240Tyr Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr245 250 255Cys Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr260 265 270Glu Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr275 280 285
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<223>編碼NK4的dna<220>
<221>CDS<222>(1)..(1350)<400>3
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<223>NK的蛋白質(zhì)序列<400>4Met Ser Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala1 5 10 15Lys Thr Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys20 25 30Lys Val Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys35 40 45Gly Leu Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys50 55 60Gln Cys Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys65 70 75 80Glu Phe Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lyg Asp Tyr Ile Arg85 90 95Asn Cys Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile100 105 110Thr Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His115 120 125Glu His Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu130 135 140
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1.一種編碼肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的α-鏈或其N-端片段的核酸，其特征在于在所述核酸中，選自由在位點(diǎn)33，35和36的密碼子組成的組的氨基酸的密碼子的至少其中之一是CGT。
2.按照權(quán)利要求1的核酸，其特征在于在位點(diǎn)33，35和36的氨基酸的密碼子是CGT。
3.制備肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的α-鏈或其N-端片段(NK多肽)的方法，其通過在微生物宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所述NK多肽的核酸，分離包含以變性形式存在的所述NK多肽的內(nèi)含體，溶解內(nèi)含體并且使變性的NK多肽復(fù)性來進(jìn)行，其特征在于在所述核酸中，選自由在位點(diǎn)33，35和36的密碼子組成的組的氨基酸的密碼子的至少其中之一是CGT。
4.按照權(quán)利要求3的方法，其特征在于在位點(diǎn)33，35和36的氨基酸的密碼子是CGT。
全文摘要
一種制備肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的α－鏈或其N－端片段(NK多肽)的方法，導(dǎo)致了提高的表達(dá)產(chǎn)量，所述方法通過在微生物宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所述NK多肽的核酸，分離包含以變性形式存在的所述NK多肽的內(nèi)含體，溶解內(nèi)含體并且使變性的NK多肽復(fù)性來進(jìn)行，其特征在于在所述核酸中，選自由在位點(diǎn)33，35和36的密碼子組成的組的氨基酸的密碼子的至少其中之一是CGT。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1926236SQ200580006678
公開日2007年3月7日 申請(qǐng)日期2005年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月3日
發(fā)明者J·奧爾, A·帕帕季米特里烏, C·尚茨, S·澤貝爾 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司