專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物活性的檢測(cè)方法，更具體地說(shuō)是一種重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(recombinant human hepatocyte growth factor，rhHGP)生物活性檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
肝臟作為人體最重要的器官之一，承擔(dān)著人體“化工廠”的重任，它的損傷將對(duì)機(jī)體造成一系列的影響。我國(guó)是病毒性肝炎的高發(fā)區(qū)，現(xiàn)癥患者超過(guò)三千萬(wàn)，如何防治肝炎肝損傷，阻斷“肝炎—肝硬化—肝癌”的發(fā)展鏈，是醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與臨床工作者面臨的重大課題。
促進(jìn)肝細(xì)胞再生是防治肝損傷的關(guān)鍵，而肝細(xì)胞的再生受多種細(xì)胞因子的調(diào)控，其中rhHGF是促進(jìn)肝細(xì)胞增殖、修復(fù)肝損傷的一個(gè)重要因子。rhHGF的研究成為近十年肝病防治領(lǐng)域研究的一個(gè)熱點(diǎn)，rhHGF有希望開(kāi)發(fā)成治療肝病的新生物制品藥物。
與化學(xué)藥物不同，蛋白質(zhì)類(lèi)藥物的藥效體現(xiàn)于細(xì)胞因子的生物活性，具有生物活性的細(xì)胞因子才會(huì)有藥效，同時(shí)生物活性的大小也影響藥效的大小，所以細(xì)胞因子類(lèi)藥物的活性檢測(cè)是藥物質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)，目前已報(bào)道的rhHGF活性檢測(cè)方法主要包括(1)體內(nèi)檢測(cè)方法制作小鼠CCl4肝損傷模型。分組給藥后觀察動(dòng)物死亡率及肝臟病理改變，至少需耗時(shí)二周；(2)體外細(xì)胞同位素檢測(cè)方法制備原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞或傳代HTC(hepatocyte cancer)肝癌細(xì)胞，分組加藥培養(yǎng)后，加入H3-胸腺嘧啶(H3-TdR)進(jìn)行液閃計(jì)數(shù)。上述方法主要存在以下不足(1)體內(nèi)檢測(cè)方法操作復(fù)雜、結(jié)果變異大、耗時(shí)長(zhǎng)，不宜作為藥品活性檢測(cè)的常規(guī)方法；(2)體外細(xì)胞同位素檢測(cè)方法存在放射線污染、變異大等不足，操作也較復(fù)雜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)便易行、特異敏感的rhHGF活性檢測(cè)方法。
本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案是利用rhHGF對(duì)NIH3T3纖維細(xì)胞線粒體脫氫酶活性有促進(jìn)作用，利用測(cè)定NIH3T3纖維細(xì)胞線粒體脫氫酶活性從而測(cè)定rhHGF產(chǎn)品的生物活性的方案。即以線粒體脫氫酶活性方法來(lái)檢測(cè)rhHGF產(chǎn)品的生物學(xué)活性。
本發(fā)明技術(shù)方案的具體步驟為a復(fù)蘇凍存的NIH3T3纖維細(xì)胞株，接種于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)增殖；b以培養(yǎng)液調(diào)整培養(yǎng)增殖后NIH3T3纖維細(xì)胞濃度，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，如細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，棄培養(yǎng)液，按如下分組加入供試品(1)NIH3T3纖維細(xì)胞對(duì)照組(C組)每孔加含1-10％小牛血清的培養(yǎng)液；(2)陰性對(duì)照組加含1-10％小牛血清的培養(yǎng)液及rhHGF溶劑或等劑量?jī)龈杀Ｗo(hù)劑；(3)rhHGF組以含1-10％小牛血清的培養(yǎng)液配置不同濃度rhHGF；置培養(yǎng)箱培養(yǎng)一定時(shí)間后，棄上清液，洗滌，加顯色劑培養(yǎng)充分后吸盡培養(yǎng)液，加有機(jī)溶劑，振蕩至溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔A值；檢測(cè)波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)630nm；數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以t檢驗(yàn)比較差別的顯著性；當(dāng)樣本數(shù)n＝8時(shí)，t＞2.2有活性。
本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)一步可以為a復(fù)蘇凍存NIH3T3纖維細(xì)胞株，接種于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)增殖。
b培養(yǎng)增殖后NIH3T3纖維細(xì)胞，以含5％小牛血清的1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，鋪96孔板，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，如細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，棄培養(yǎng)液，按如下分組加入供試品(1)NIH3T3纖維細(xì)胞對(duì)照組(C組)每孔加5％小牛血清的1640培養(yǎng)液；(2)陰性對(duì)照組加5％小牛血清的1640培養(yǎng)液，及rhHGF溶劑或等劑量?jī)龈杀Ｗo(hù)劑；(3)rhHGF組以5％小牛血清的1640培養(yǎng)液配置，終濃度為0.01、0.1、0.2、0.5、1.0、5.0μg/ml。
每組8孔，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)后，棄上清液，洗1次。加四甲基偶氮唑鹽(3-(4，5-dimethylthiazal-2yl)2，5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT)，培養(yǎng)4-6小時(shí)后吸盡培養(yǎng)液，加二甲基亞砜，振蕩器振蕩5-10min，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔A值。檢測(cè)波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)630nm。
數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以x±s表示，以t檢驗(yàn)比較差別的顯著性。當(dāng)n＝8，t＞2.2時(shí)有活性，活性單位＝100×每瓶蛋白質(zhì)含量(μg)/[活性濃度(μg/ml)×0.1ml]。
本發(fā)明步驟b)也可以以含10％小牛血清DMEM-F12調(diào)整細(xì)胞濃度為0.5×105個(gè)細(xì)胞/ml；鋪96孔板，每孔100μl，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。
本發(fā)明步驟b)的分組同樣可以為分組(1)NIH3T3纖維細(xì)胞對(duì)照組(C組)以含1％小牛血清的培養(yǎng)液；分組(2)陰性對(duì)照組加含1％小牛血清的培養(yǎng)液，及rhHGF溶劑或等劑量?jī)龈杀Ｗo(hù)劑；本發(fā)明的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，無(wú)放射性污染，省時(shí)，變異小，重復(fù)性好，不需特殊儀器設(shè)備，克服了現(xiàn)存方法的不足之處。


圖1是rhHGF促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞增殖的量效關(guān)系圖。
具體實(shí)施例復(fù)蘇凍存NIH3T3纖維細(xì)胞株，接種于10ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)增殖。消化增殖后NIH3T3纖維細(xì)胞，以5％小牛血清的1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為0.5×105個(gè)細(xì)胞/ml，鋪96孔板，每孔100μl。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，如細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，棄培養(yǎng)液，按如下分組加入供試品(1)NIH3T3纖維細(xì)胞對(duì)照組(C組)每孔加100μl5％小牛血清的1640培養(yǎng)液；(2)陰性對(duì)照組加5％小牛血清的1640培養(yǎng)液，及rhHGF溶劑或等劑量?jī)龈杀Ｗo(hù)劑；
(3)rhHGF組5％小牛血清的1640培養(yǎng)液配置100μg/瓶rhHGF，終濃度為0.01、0.1、0.2、0.5、1.0、5.0μg/ml。
每組8孔，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)后，棄上清液，洗1次。加0.15mg/ml MTT0.1ml/孔，培養(yǎng)5小時(shí)后吸盡培養(yǎng)液，加二甲基亞砜0.1ml/孔，振蕩器振蕩5-10min，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔A值。檢測(cè)波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)630nm。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以x±s表示，以t檢驗(yàn)比較差別的顯著性，具體數(shù)值見(jiàn)表1，根據(jù)rhHGF促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞增殖的量效關(guān)系制作rhHGF促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞增殖的量效關(guān)系圖如圖1所示。
n＝8，t＞2.2時(shí)有活性，活性單位＝100×每瓶蛋白質(zhì)含量(μg)/[活性濃度(μg/ml)×0.1 ml]＝100×100/(10×0.1)＝10000(單位)表1 rhHGF對(duì)NIH3T3纖維細(xì)胞線粒體脫氫酶活性的影響(x±s，n＝8)濃度(μg/ml) A值Control 0.355±0.007rhHGF5.0 0.441±0.009**1.0 0.440±0.012**0.5 0.422±0.015**0.2 0.408±0.007**0.1 0.379±0.010**0.01 0.366±0.019與對(duì)照組比較，**P＜0.0權(quán)利要求
1.一種重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子生物活性檢測(cè)方法，其特征在于利用測(cè)定NIH3T3纖維細(xì)胞線粒體脫氫酶活性從而測(cè)定rhHGF產(chǎn)品的生物活性。
2.如權(quán)利要求1所述的重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子生物活性檢測(cè)方法，其特征在于其步驟為a復(fù)蘇凍存NIH3T3纖維細(xì)胞株，接種于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)增殖；b培養(yǎng)增殖后NIH3T3纖維細(xì)胞，以含1-10％小牛血清的培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，如細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，棄培養(yǎng)液，按如下分組加入供試品(1)NIH3T3纖維細(xì)胞對(duì)照組(C組)每孔加含1-10％小牛血清的培養(yǎng)液；(2)陰性對(duì)照組加含1-10％小牛血清的培養(yǎng)液，及rhHGF溶劑或等劑量?jī)龈杀Ｗo(hù)劑；(3)rhHGF組以含1-10％小牛血清的培養(yǎng)液配置系列濃度；c置培養(yǎng)箱培養(yǎng)一定時(shí)間后，棄上清液，洗滌，加顯色劑培養(yǎng)充分后吸盡培養(yǎng)液，加有機(jī)溶劑，振蕩至溶解，d用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔A值；檢測(cè)波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)630nm；e對(duì)數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以t檢驗(yàn)比較差別的顯著性；當(dāng)n＝8，t＞2.2時(shí)有活性。
3.如權(quán)利要求2所述的重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子生物活性檢測(cè)方法，其特征在于步驟b)的分組(1)NIH3T3纖維細(xì)胞對(duì)照組(C組)每孔加含1％小牛血清的培養(yǎng)液；步驟b)的分組(2)陰性對(duì)照組加含1％小牛血清的培養(yǎng)液，及rhHGF溶劑或等劑量?jī)龈杀Ｗo(hù)劑；
4.如權(quán)利要求2所述的重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子生物活性檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟b)以含5％小牛血清的1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，所述的置培養(yǎng)箱培養(yǎng)為鋪96孔板，每孔100μl，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。
5.如權(quán)利要求2所述的一種重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子生物活性檢測(cè)方法，其特征在于所述的步驟b)以含10％小牛血清1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為0.5×105個(gè)細(xì)胞/ml；所述的置培養(yǎng)箱培養(yǎng)為鋪96孔板，每孔100μl，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。
6.如權(quán)利要求2或4或5所述的任一重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子生物活性檢測(cè)方法，其特征在于所述的步驟b)的分組為(1)所述的NIH3T3纖維細(xì)胞對(duì)照組中每孔加含1-10％小牛血清的1640培養(yǎng)液；(2)陰性對(duì)照組加含1-10％小牛血清的1640培養(yǎng)液，及rhHGF溶劑或等劑量?jī)龈杀Ｗo(hù)劑；(3)rhHGF組以含1-10％小牛血清的1640培養(yǎng)液配置系列濃度；
7.如權(quán)利要求5所述的重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子生物活性檢測(cè)方法，其特征在于所述的步驟c)為置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)后，棄上清液，洗1次；加MTT，培養(yǎng)4-6小時(shí)后吸盡培養(yǎng)液，加二甲基亞砜，振蕩器振蕩5-10min至溶解；所述的步驟e)的活性單位計(jì)算公式為活性單位＝100×每瓶蛋白質(zhì)含量(μg)/[活性濃度(μg/ml)×0.1ml]。
8.如權(quán)利要求5所述的重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子生物活性檢測(cè)方法，其特征在于所述的步驟b)分組所述的(3)rhHGF組培養(yǎng)液配置終濃度為0.01、0.1、0.2、0.5、1.0、5.0μg/ml。
9.如權(quán)利要求6所述的重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子生物活性檢測(cè)方法，其特征在于所述的分組試品每組8孔，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)后，棄上清液，洗1次；加0.15mg/ml MTT 0.1ml，培養(yǎng)4-6小時(shí)后吸盡培養(yǎng)液，加二甲基亞砜0.1ml/孔，振蕩器振蕩5-10min。
10.如權(quán)利要求2或3所述的任一重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子生物活性檢測(cè)方法，其特征在于所述的步驟c)有機(jī)溶劑可以為異丙醇或二甲基亞砜。
全文摘要
一種重組人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子生物活性檢測(cè)方法，所采用的技術(shù)方案是應(yīng)用NIH3T3纖維細(xì)胞株，以線粒體脫氫酶活性方法檢測(cè)rhHGF產(chǎn)品的生物學(xué)活性，提供了一種簡(jiǎn)便易行、特異敏感的rhHGF活性檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)C12Q1/32GK1521267SQ0311371
公開(kāi)日2004年8月18日 申請(qǐng)日期2003年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月30日
發(fā)明者李茹冰, 王妍, 柴向東, 萬(wàn)華印, 孔祥平 申請(qǐng)人:深圳市海王英特龍生物技術(shù)股份有限公司, 深圳市海王英特龍生物技術(shù)股份有限公