專利名稱：用于檢測生物顆粒的方法、芯片、設(shè)備以及集成系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測生物顆粒的方法、芯片、設(shè)備和系統(tǒng)。本發(fā)明方法典型地包括從氣體樣品中收集生物顆粒，將生物顆粒與第一液體試劑接觸，從所收集的生物顆粒中提取生物材料和為目標(biāo)核酸序列的出現(xiàn)而分析生物材料。
背景技術(shù)：
為了便于快速檢測空氣傳播的能引起自然或人為流行病的病原體，重要的是收集帶有所述病原體或者由病原體組成的顆粒以便于快速檢測。直接從空氣中以適合進一步分析的形式收集含有生物材料的顆粒。通過空氣傳播的疾病對人類造成了嚴重的健康威脅。根據(jù)世界衛(wèi)生組織，2000年至2020年將有多達10億人會感染肺結(jié)核，其中大約1.5億人會生病，3600萬人會死于該疾病。21世紀第一個新的可空氣傳播的傳染性疾病是“嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥(SARS)”，該病(SARS)具有產(chǎn)生快速傳播傳染病的潛力。相類似情形是歐洲中世紀的令人恐怖的瘟疫(“黑死病”)的傳播，在當(dāng)時1347年至1352年間，大約2500萬人死亡。該瘟疫最致命的形式是通過吸入被病原體感染的氣溶膠，在該氣溶膠中，少至1-10個鼠疫桿菌(Yersinia pestis)細胞就足夠使人致病。該氣溶膠可由受感染人的呼吸引起，或者更危險得是由生物恐怖主義者人為釋放的鼠疫桿菌(Y.pestis)。
相關(guān)的生物戰(zhàn)劑(BW)有細菌孢子，如炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)(炭疽熱)、破傷風(fēng)芽孢梭菌(Clostridium tetani)(破傷風(fēng))和肉毒芽孢桿菌(Clostridium botulinum)(肉毒中毒)。孢子是由某些類型的革蘭氏陽性細菌為應(yīng)答饑餓而產(chǎn)生的，它是不生長的、耐熱的和脫水的，并且能抵制溫度、pH、干燥、輻射和化學(xué)試劑等極端條件，這種穩(wěn)定性使其成為生物戰(zhàn)劑武器應(yīng)用中一種有吸引力的工具。
被用來產(chǎn)生人為流行病的有潛力的其它微生物包括引起例如下列疾病的微生物天花(Smllpox)、埃博拉病毒(Ebola)、腦炎(Encephalitis)和Q熱(Q-fever)。同樣擔(dān)心的是空氣傳播的流感與致命的禽流感的重組，這些重組的病毒有引起全國流行的潛力，其可以通過空氣傳播至未知的區(qū)域。
US 5,674,742公開了一種集成的微制備的設(shè)備，它可以操作、反應(yīng)和檢測微升到皮升量的樣品。該設(shè)備適合進行生化反應(yīng)，特別是基于DNA的反應(yīng)，如聚合酶鏈反應(yīng)，這類反應(yīng)需要熱循環(huán)，因為這類設(shè)備固有的小尺寸有利于其快速循環(huán)次數(shù)。該設(shè)備的集成特性提供了準(zhǔn)確、無污染的工藝。該設(shè)備可包括試劑貯備器、攪拌器和混合器、加熱器、泵、和光或電動機械傳感器。超聲蘭姆波(Lambwave)設(shè)備可以用作傳感器、泵和攪拌器。
US 6,586,253公開了一種檢測細胞內(nèi)含物的方法，該方法包括以下步驟將細胞導(dǎo)入微芯片的通道內(nèi)；裂解細胞以釋放細胞內(nèi)含物至通道；移動細胞內(nèi)含物至檢測區(qū)；在檢測區(qū)檢測細胞內(nèi)含物。本專利還公布了一種檢測細胞內(nèi)含物的設(shè)備，該設(shè)備包括微芯片；在微芯片中形成的細胞移動通道，細胞移動通道有細胞導(dǎo)入端和檢測端；與細胞導(dǎo)入端可操作性相連的細胞移動器，該細胞移動器將細胞從細胞導(dǎo)入端移動至檢測端；在裂解區(qū)的細胞移動通道內(nèi)裂解細胞的設(shè)備，裂解區(qū)位于細胞導(dǎo)入端和檢測端之間；和檢測器，該檢測器安置在鄰近檢測器末端，安排檢測出現(xiàn)在檢測器末端的細胞內(nèi)含物，這些內(nèi)含物通過細胞移動器從裂解區(qū)移動到檢測端。
US 6,673,621公開了一種適合標(biāo)記所收集樣品的設(shè)備，它包括收集樣品的收集設(shè)備和至少一種可檢測的標(biāo)記物，該標(biāo)記物與至少部分收集器相連接。其中至少一種可檢測標(biāo)記物可以與樣品結(jié)合，其通過收集樣品以標(biāo)記所收集的樣品，其中通過將樣品與至少部分收集設(shè)備接觸來收集樣品，其中收集設(shè)備具有至少一種與其相連的可檢測的標(biāo)記物，并且其中所述的至少一種可檢測標(biāo)記物不是在收集之前出現(xiàn)在樣品中的組分，并且對于在收集之前出現(xiàn)在樣品中的任何組分是惰性的。該專利還公開了包括該設(shè)備的試劑盒、使用該設(shè)備標(biāo)記樣品的方法、確定標(biāo)記樣品完整性的方法，并提供了使用標(biāo)記物來測試實驗室和/或?qū)嶒炇胰藛T以達到認證、熟練程度測試或鑒定的目的。
發(fā)明概括本發(fā)明的一個目標(biāo)涉及提供用于進行快速檢測生物顆粒的方法、芯片、設(shè)備和系統(tǒng)。
本發(fā)明另一個目標(biāo)涉及提供用于進行靈敏檢測生物顆粒的方法、芯片、設(shè)備和系統(tǒng)。
本發(fā)明另一個目標(biāo)涉及提供適合進行分散的、并且優(yōu)選完全自動化的檢測生物顆粒的方法、芯片、設(shè)備和系統(tǒng)。
本發(fā)明另一個目標(biāo)涉及提供進行最少手工樣品處理的檢測生物顆粒的方法、芯片、設(shè)備和系統(tǒng)。
本發(fā)明另一個目標(biāo)涉及提供進行檢測生物顆粒的方法、芯片、設(shè)備和系統(tǒng)，其中該方法、芯片、設(shè)備和系統(tǒng)使用最低的能量進行檢測。
因此，本發(fā)明的一個目標(biāo)涉及提供從氣體樣品如空氣樣品直接收集生物顆粒。
本發(fā)明另一個目標(biāo)涉及提供從大量的氣體樣品濃縮生物顆粒至更小體積即增加生物顆粒的濃度的方法、芯片、設(shè)備和系統(tǒng)。
本發(fā)明另一個目標(biāo)涉及提供在相同結(jié)構(gòu)并且優(yōu)選在相同步驟中完成的收集和濃縮生物顆粒的方法、芯片、設(shè)備和系統(tǒng)。
本發(fā)明另一個目標(biāo)涉及提供容易允許進一步分析收集的生物顆粒的方法、芯片、設(shè)備和系統(tǒng)。
本發(fā)明進一步的目標(biāo)涉及提供容易允許進一步分析收集的生物顆粒的方法、芯片、設(shè)備和系統(tǒng)。
本發(fā)明的一個目標(biāo)也涉及提供以高捕獲率收集生物顆粒的方法、芯片、設(shè)備和系統(tǒng)。
當(dāng)閱讀以下描述和實施例后，本發(fā)明其它目標(biāo)將會比較清楚。
本發(fā)明的一個方面涉及從氣體樣品檢測生物顆粒的一種方法，該方法包括以下步驟(a)提供樣品室和第一電極以及第二電極，第一電極和第二電極以及樣品室被安置為，至少部分樣品室位于第一電極和第二電極之間，并且第一電極和第二電極之間的距離最多為20mm；(b)為樣品室提供氣體樣品；(c)將第一電勢應(yīng)用于第一電極，第二電勢應(yīng)用第二電極，因而在第一和第二電極之間產(chǎn)生電勢差和電場以輔助在樣品室從氣體樣品靜電收集生物顆粒；
(d)將所收集的生物顆粒與第一液體試劑接觸，從而得到反應(yīng)混合物；(e)在所述的樣品室中，將所述的反應(yīng)混合物暴露于交替電場中，所述的交替電場有足夠強度以能夠從生物顆粒提取生物材料；(f)進行目標(biāo)核酸序列的核酸擴增；(g)檢測所擴增目標(biāo)核酸序列的出現(xiàn)和/或者來自目標(biāo)核酸序列擴增的產(chǎn)物的出現(xiàn)，如果出現(xiàn)至少一種拷貝的所擴增目標(biāo)核酸序列，或者如果出現(xiàn)至少一種所擴增目標(biāo)核酸序列的產(chǎn)品，則可根據(jù)情況推測在樣品中已經(jīng)檢測到生物顆粒。
然而本發(fā)明進一步的一個方面涉及一種從氣體樣品中檢測生物顆粒的芯片，該芯片包括樣品室，如包括與周圍空氣流體連接的第一開口，和形成與設(shè)備流體連接的第二開口，樣品室包括氣體樣品。
本發(fā)明的另一個方面涉及一種從氣體樣品中檢測生物顆粒的設(shè)備，該設(shè)備包括芯片位點，芯片位于此處以便與該設(shè)備功能上相連；設(shè)備和芯片之間的電接口，以用于在芯片或設(shè)備的第一電極和第二電極之間施加交替電場；以及可編程的單元，它包括能夠使該設(shè)備實現(xiàn)進行從由下列所組成的組中選擇的一種或者多種動作的軟件將第一電勢應(yīng)用到第一電極，第二電勢應(yīng)用到第二電極，因而在第一電極和第二電極之間形成電勢差和電場以輔助在樣品室中靜電收集氣體樣品中的生物顆粒；將所收集的生物顆粒與第一液體試劑接觸；在所述的樣品室中，將反應(yīng)混合物暴露到交替電場下，所述的交替電場有足夠的強度以能夠提取生物材料；對目標(biāo)核酸序列進行核酸擴增，檢測擴增的目標(biāo)核酸序列的出現(xiàn)，和/或者來自目標(biāo)核酸序列擴增的產(chǎn)物的出現(xiàn)。
本發(fā)明的另一方面涉及一種從氣體樣品中檢測生物顆粒的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括這里所定義的芯片，其中該芯片與這里所定義的設(shè)備功能上相連。
圖形介紹以下結(jié)合圖形，對本發(fā)明的一些實施方式進行說明。


圖1是芯片的兩個典型的實施方式的截面；圖2表示實施例1的硅基底；圖3表示實施例1的絕熱層；圖4表示實施例1的加熱器層；圖5表示實施例1的接觸層1；圖6表示實施例1的電絕緣層1；圖7表示實施例1的鉑層1；圖8表示實施例1的接觸層2；圖9表示實施例1的電絕緣層2；圖10表示實施例1的平面化層1；圖11表示實施例1的間隔物；圖12表示實施例1的蓋子；和圖13表示實施例1的最終芯片。
本發(fā)明詳細描述本發(fā)明的一個方面涉及一種從氣體樣品中檢測生物顆粒的方法，該方法包括以下步驟(a)提供樣品室和第一電極以及第二電極，第一電極和第二電極以及樣品室被安置為，至少部分樣品室位于第一電極和第二電極之間，并且第一電極和第二電極之間的距離最多為20mm；(b)為樣品室提供氣體樣品；(c)將第一電勢應(yīng)用于第一電極，第二電勢應(yīng)用第二電極，因而在第一和第二電極之間產(chǎn)生電勢差和電場以輔助在樣品室從氣體樣品靜電收集生物顆粒；(d)將所收集的生物顆粒與第一液體試劑接觸，從而得到反應(yīng)混合物；(e)在所述的樣品室中，將所述的反應(yīng)混合物暴露于交替電場中，所述的交替電場有足夠強度以能夠從生物顆粒提取生物材料；(f)進行目標(biāo)核酸序列的核酸擴增；(g)檢測所擴增目標(biāo)核酸序列的出現(xiàn)和/或者來自目標(biāo)核酸序列擴增的產(chǎn)物的出現(xiàn)，如果出現(xiàn)至少一種拷貝的所擴增目標(biāo)核酸序列，或者如果出現(xiàn)至少一種所擴增目標(biāo)核酸序列的產(chǎn)品，則可根據(jù)情況推測在樣品中已經(jīng)檢測到生物顆粒。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“生物顆?！鄙婕鞍ɡ缥⑸锖?或病毒和/或其碎片的顆粒。
在文中用于“X和/或Y”的“和/或”應(yīng)該解釋為“X”或者“Y”，或者“X和Y”。
所述微生物可以是例如選自由古微生物、真核細菌微生物或者真核微生物所組成的組。
例如微生物可以選自由細菌、細菌孢子、病毒、真菌和真菌孢子所組成的組。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，生物細胞是空氣傳播的微生物。
本發(fā)明的生物顆粒也可包括植物孢子或者其碎片。
在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方式中，微生物是細菌孢子。
例如，細菌孢子可以由選自芽孢桿菌屬(Bacillus)和/或梭狀芽孢桿菌屬(Clostridia)的細菌形成。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，細菌孢子是由炭疽芽孢桿菌(Bacillus Anthracis)所形成的孢子。生物顆?？梢岳绨ㄊ怯商烤已挎邨U菌(Bacillus Anthracis)所形成的細菌孢子。同時，生物顆?？梢曰旧嫌梢环N或者多種由炭疽芽孢桿菌(BacillusAnthracis)所形成的細菌孢子組成。
術(shù)語“氣體樣品”涉及包括一種或多種氣體的樣品，可能也含有生物顆粒。氣體樣品可以如是氣體樣品，如周圍的空氣樣品；來自真空抽吸粉末狀材料如土、沙子、灰塵和未知的粉末的空氣樣品。待檢測的氣體樣品可以來源于人呼出的樣品，該呼出的樣品含有或易于含有微生物。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“樣品室”、“容器”和“反應(yīng)室”可以互換使用。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，樣品室包含在一個芯片里，也就是說，包含在一個小盒或生物芯片里。樣品室可以如包含在這里所定義的芯片里。
在一個優(yōu)選的實施方式中，第一和第二電極安置在樣品室中相對的兩側(cè)。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，第一電極和/或第二電極具有從由以下所組成的組中選擇的實質(zhì)形狀薄片狀、平板狀、圓盤狀、線狀、棒狀或其任意組合。目前優(yōu)選的是至少有一個電極是薄片狀，或更優(yōu)選的是第一電極和第二電極都是薄片狀。
在本發(fā)明的實施方式中，第一和第二電極被分開最多20mm的距離，優(yōu)選的是最多20mm，例如最多15mm、10mm、9mm、8mm、7mm、6mm、5mm或者最多4mm，更優(yōu)選的是最多3mm，更加優(yōu)選的是最多0.5mm例如最多0.3mm、0.2mm和0.1mm例如最多0.05mm。
例如第一和第二電極可以被分開0.05-20mm范圍內(nèi)的距離，例如在0.05-0.1mm、0.1-0.2mm、0.2-0.3mm、0.3-0.4mm、0.4-0.5mm、0.5-1mm、1-2mm、2-5mm、5-10或者10-15mm的范圍內(nèi)，例如15-20mm的范圍內(nèi)。
通常第一和第二電極被分開至少0.02mm的距離，例如至少0.03mm或者0.05mm。
在步驟c)中，從氣體樣品中收集一種或者多種生物顆粒。根據(jù)以下共同待批準(zhǔn)的專利所描述的方法和使用該申請專利所描述的芯片、設(shè)備和系統(tǒng)，進行收集生物顆粒的操作。該待申請的PCT專利“收集生物顆粒的方法，芯片、設(shè)備和系統(tǒng)”(Method，chip，device and system for collection of biological particles)的申請?zhí)朜o.XXXXXXX，這里將其引入作為參考。
在本發(fā)明的實施方式中，當(dāng)氣體樣品流經(jīng)樣品室時，從氣體樣品中收集生物顆粒。在另一個實施方式中，為了增加生物顆粒的捕獲效率，當(dāng)氣體樣品再流經(jīng)樣品室(即氣體樣品流經(jīng)樣品室多于一次)時，可從氣體樣品中收集生物顆粒。例如，當(dāng)氣體樣品再流經(jīng)時，氣體樣品可以流經(jīng)樣品室至少2次、3次、4次、5次、10次、15次、20次、30次、40次、50次或75次，如至少100次。氣體樣品可以如流經(jīng)樣品室的次數(shù)在2-200次范圍內(nèi)，如2-50次、50-100次或100-200次。
在本發(fā)明的實施方式中，在樣品室通過氣流的方式提供氣體樣品。在收集生物顆粒過程中，氣流典型的流速范圍優(yōu)選5-1000ml/min。
在本發(fā)明的實施方式中，在從氣體樣品中收集生物顆粒之前，氣流就已經(jīng)停止。
通常，樣品室中至少一部分氣體樣品是位于或者流經(jīng)第一電極和第二電極之間。例如，至少40％體積的氣體樣品是位于或流經(jīng)第一電極和第二電極之間的位置，如至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％、99.5％或99.9％體積的氣體樣品是位于或者流經(jīng)第一電極和第二電極之間的位置，如至少100％體積的氣體樣品是位于或者流經(jīng)第一和第二電極之間的位置。
本發(fā)明的另一個實施方式中，第一電極和第二電極之間電場可選擇為產(chǎn)生至少50％的有效長度為1-10μm顆粒的捕獲效率。
電場強度可以從以下組中選擇50V/mm、100V/mm、200V/mm、300V/mm、400V/mm、500V/mm、600V/mm、700V/mm、800V/mm、900V/mm、1000V/mm、1100V/mm、1200V/mm、1300V/mm、1400V/mm、1500V/mm、1600V/mm、1700V/mm、1800V/mm、1900V/mm和2000V/mm。
例如，電場強度可以在50-2000V/mm的范圍內(nèi)，如在50-100V/mm、100-200V/mm、200-300V/mm、300-400V/mm、400-500V/mm、500-750V/mm、750-1000V/mm、1000-1200V/mm和1200-1500V/mm的范圍內(nèi)，如在1500-2000V/mm的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，第一和第二電極分別帶負電和正電，或者相反。例如，如果兩電極間的電勢差是400V，帶負電的電極可能有相對地的電勢-200V，帶正電的電極可能有相對地的電勢200V。
在本發(fā)明的一個極其優(yōu)選的實施方式中，第一電極的第一電勢和第二電極的第二電勢，第一電極和第二電極間的電場都可選擇為，以致于產(chǎn)生產(chǎn)生至少50％的有效長度為1-10μm顆粒的捕獲效率％，如至少70％的捕獲效率，優(yōu)選的是至少80％、更優(yōu)選的是至少90％，如至少95％、97.5％、99％、99.5％或99.9％，如約為100％。
優(yōu)選地是，捕獲效率由實施例2中的標(biāo)準(zhǔn)方法來確定。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語顆粒的“有效長度”是指顆粒的空氣動力學(xué)半徑，如用激光散射法(O’Brien等，1986年)檢測。顆粒的空氣動力學(xué)半徑dpa可以由下式來估計dpa=dps·ρp]]>式中dps是Stoke半徑，μm；ρp是顆粒密度，g/cm3。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所收集樣品室的生物顆粒與第一液體試劑接觸?？梢詢?yōu)選的是，當(dāng)生物顆粒仍然位于第一電極和第二電極之間，生物顆粒被接觸。
在步驟d)中，所收集的生物顆粒與第一液體試劑接觸，得到的混合物被稱為反應(yīng)混合物。
第一液體試劑包括一種或多種試劑，其是進行核酸擴增所需要的試劑。
第一液體試劑包括一種或多種從由下列所組成的組中選擇的試劑引物、核酸、三磷酸核苷酸和核酸聚合酶。
第一液體試劑可進一步含有添加劑，如2-巰基乙醇，如濃度為10mM；牛血清蛋白(BSA)，如濃度為1mg/ml；和/或者一種清潔劑，如濃度為0.5％到0.6％(w/v)。清潔劑可以從以下組中選擇，該組包含Triton×-100，Triton×-114，NP-40，Tween20，Tween80和類似的非離子清潔劑。
在本文中，術(shù)語“核酸”、“核酸序列”或者“核酸分子”應(yīng)當(dāng)被廣義解釋，可以例如為核糖核酸(RNA)或者脫氧核糖核酸(DNA)及其模擬物的寡聚物或者多聚物。該術(shù)語包括含有自然出現(xiàn)的核苷、糖和共價核苷酸間鍵合(骨架)以及功能相似的具有非自然出現(xiàn)的核苷、糖和共價核苷酸間鍵合(骨架)的分子或其組合。這樣的被修飾和被取代的核酸可以比原始形式要優(yōu)選，因為其期望的性能諸如例如核酸目標(biāo)分子的增強的親和力，以及在有核酸酶和其它酶存在的情況下的提高的穩(wěn)定性，在本文中使用術(shù)語“核酸類似物”或者“核酸模擬物”來描述被修飾和被取代的核酸。核酸模擬物的優(yōu)選例子是含有肽核酸(PNA-)、鎖定核酸(Locked Nucleic Acid，LNA-)、木糖-LNA-(xylo-LNA-)、硫代磷酸、2’-甲氧基、2’-甲氧乙氧基、嗎啉和氨基磷酸酯的分子或者功能相似的核酸衍生物。
術(shù)語“核酸聚合酶”涉及依賴DNA-或者RNA-的DNA聚合酶，其優(yōu)選是熱穩(wěn)定性的，即該酶催化與模板互補的引物延伸產(chǎn)物的形成，并且在對于雙鏈模板核酸的變性所必要的提高的溫度下一段時間內(nèi)不會發(fā)生不可逆的變性。通常，在每條引物的3′末端開始合成并按照5′到3′的方向沿著模板鏈進行。已經(jīng)從嗜熱或者極端嗜熱菌株中分離了熱穩(wěn)定的聚合酶，例如Thermus flavus、T.ruber、T.thermophilus、T.aquaticus、T.lacteus、T.rubens、Thermococcus litoralis、Pyrococcus furiosus、Bacillusstearothermophilus和Methanothermus fervidus。但是盡管如此，不是熱穩(wěn)定的聚合酶也能夠用于核酸擴增中，只要進行補充該酶。
液體樣品還可以含有可以被5′-3′核酸外切酶降解的寡聚核酸探針，所述核酸探針的降解會導(dǎo)致釋放氧化還原活性組分。
氧化還原活性組分可以例如為金屬茂諸如例如二茂絡(luò)鐵。
在步驟e)中，反應(yīng)混合物暴露于交替電場中。交替電場可以由第一電極和第二電極提供，電極提供收集生物顆粒的電場，或電場可由另一套電極來提供。
根據(jù)一起待申請的PCT專利“用于生物材料提取的方法、芯片和設(shè)備以及系統(tǒng)(Method，chip，device and system for extraction of biological pmaterials)”(其申請?zhí)枮镹o.ZZZZZZZ)的方法和使用其芯片、設(shè)備和系統(tǒng)，來進行提取生物材料的操作，這里作為參考將其引入。
在發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，對其進行進一步遺傳分析的部分所暴露的液體樣品，包括樣品室中液體樣品的至少20％，例如樣品室中液體樣品的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％、99.5％或者99.9％，例如樣品室中液體樣品的至少幾乎100％。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“提取”涉及釋放一種或者多種生物細胞的生物材料，也就是說例如使可以得到的生物材料進行液體樣品的進一步分析。術(shù)語“提取”還涉及例如將生物細胞的細胞壁或者細胞屏障打開和/或破碎。
從生物細胞中所提取的生物材料通常包括選自細胞器、遺傳材料以及蛋白質(zhì)所組成的組的組分。
遺傳物質(zhì)可以例如包括染色體DNA和/或質(zhì)粒DNA和/或任何類型的RNA。
蛋白質(zhì)可以例如選自由酶、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)、離子通道、毒素、激素以及受體所組成的組。
優(yōu)選地，生物材料包括DNA和/或RNA。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“交替電場”涉及隨時間變化的電場。交替電場可以例如為通過在正/負以及負/正之間周期性地改變兩個電極極性而出現(xiàn)的電場，即通過將交流電源連接到電極上。交替電場可以例如包括或者是交流電場。交替電場可以例如包括一個或者多個直流脈沖。
重要的是交替電場具有充分的強度并被施加充分的持續(xù)時間以提取生物材料。同時重要的是交替電場還具有充分的頻率以提取生物材料。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，交替電場的頻率為至少5kHz，優(yōu)選為至少20kHz，更優(yōu)選為至少50kHz。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，交替電場的頻率為至少100kHz，例如至少250kHz，更優(yōu)選為至少500kHz。
例如交替電場的頻率可以為至少5kHz，例如至少10kHz、20kHz、50kHz、100kHz、200kHz、300kHz或者400kHz，例如至少500kHz。也能夠預(yù)想到更高的頻率例如1000kHz、2000kHz或者5000kHz。
交替電場的頻率優(yōu)選為最多750kHz，例如最多500kHz。
因此，交替電場的頻率如可在5-750kHz的范圍內(nèi)，如在5-10kHz、10-20kHz，20-50kHz、50-100kHz、100-200kHz、200-300kHz、300-400kHz或400-500kHz的范圍內(nèi)，如在500-750kHz的范圍內(nèi)。優(yōu)選的交流電頻率如可在60-750kHz如70-750kHz、80-750kHz、90-750kHz或100-750kHz的范圍內(nèi)。
交替電場的強度即第一電極和第二電極之間的最大電勢差通常為最多30V，例如最多25V、20V、15V、10V、8V、6V、5V、4V、3V或2V例如最多1V。
交替電場的強度即第一電極和第二電極之間的最大電勢差可以例如在1-30V的范圍內(nèi)，例如在1-2V、2-3V、3-4V、4-5V、5-6V、6-8V、8-10V、10-15V、15-20V或者20-25V的范圍內(nèi)，例如在25-30V的范圍內(nèi)。
對生物材料提取產(chǎn)量的可用性測試是DNA/RNA釋放百分率?！癉NA/RNA釋放百分率”是樣品室中由于在步驟c)中暴露到交替電場中而釋放其染色體DNA和/或染色體RNA的生物細胞的百分率。DNA/RNA釋放百分率是根據(jù)實施例3中所描述的標(biāo)準(zhǔn)化的方法確定的。釋放百分率釋放百分率釋放百分率樣品室中的或者是包含有樣品室的芯片中的生物細胞的DNA/RNA釋放百分率和該細胞的提取強烈依賴于第一電極和第二電極間的設(shè)計和其間的距離、樣品室的結(jié)構(gòu)和材料以及應(yīng)用于第一電極和第二電極的電勢。
在樣品室或者帶有樣品室的芯片中的生物細胞的提取百分率或者DNA/RNA釋放百分率強烈依賴于第一電極和第二電極的設(shè)計和之間的距離、樣品室的結(jié)構(gòu)和材料以及施加到第一電極和第二電極上的電勢。
在本發(fā)明高度優(yōu)選的實施方式中，對第一電極的第一電勢、第二電極的第二電勢以及進而第一電極和第二電極之間的交替電場進行調(diào)節(jié)以得到至少30％的DNA/RNA釋放百分率，例如至少40％的DNA/RNA釋放百分率，優(yōu)選為至少50％，更優(yōu)選為至少60％，例如至少70％、80％、90％、95％、97.5％、99％、99.5％或者99.9％，例如大約100％。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方式中，對第一電極的第一電勢、第二電極的第二電勢以及進而第一電極和第二電極之間的交替電場進行調(diào)節(jié)以得到樣品室中細菌孢子的至少30％的DNA/RNA釋放百分率，例如樣品室中細菌孢子的至少40％的DNA/RNA釋放百分率，優(yōu)選為至少50％，更優(yōu)選為樣品室中細菌孢子的至少60％，例如至少70％、80％、90％、95％、97.5％、99％、99.5％或者99.9％，例如樣品室中細菌孢子的大約100％。
在優(yōu)選的實施方式中，通過調(diào)節(jié)兩個電極的極性來提供交替電場。
交替電場可以具有從由下列所組成的組中選擇的實質(zhì)形式矩形、正弦、鋸齒、不對稱三角形、對稱三角形或者其任何組合。
同時，頻域中的交替電場可以至少含有第一頻率分量和第二頻率分量。。
在本發(fā)明的實施方式中，將反應(yīng)混合物暴露到交替電場中的持續(xù)時間最多為3600秒，例如最多3000秒、2000秒、1000秒、500秒、250秒、100秒、50秒、40秒、30秒、20秒、10秒、5秒、4秒或者3秒，例如最多1秒。
例如，將反應(yīng)混合物暴露到交替電場中的持續(xù)時間為0.01-3600秒的范圍內(nèi)，例如在0.1-1秒、1-5秒、5-10秒、10-25秒、25-50秒、50-100秒、100-250秒、250-500秒、500-1000秒或者1000-2000秒的范圍內(nèi)，例如在2000-3600秒的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，反應(yīng)混合物被暴露到交替電場中最多250秒，優(yōu)選為最多100秒，例如最多30秒。
步驟f)中包括進行目標(biāo)核酸序列的核酸擴增。優(yōu)選地，目標(biāo)核酸序列被選擇為對于生物顆粒是特異的。
根據(jù)本發(fā)明，“目標(biāo)核酸”(TNAS)是指特定目標(biāo)的核酸序列，如用于分析或診斷目的。TNAS可以如是一個基因或基因片斷。
根據(jù)本發(fā)明，“核酸擴增”是指一種技術(shù)，在該技術(shù)中，一個模板如包括TNAS的核酸碎片被復(fù)制多份。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，步驟f)中核酸擴增是使用從以由下列所組成的組中選擇的擴增技術(shù)進行的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)、鏈置換擴增技術(shù)(SDA)、連接滾環(huán)擴增技術(shù)(L-RCA)和它們的組合/修改的技術(shù)。這些方法與PCR一樣都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，如Sambrook等人介紹的。
優(yōu)選地，步驟f)中的核酸擴增是PCR技術(shù)。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是核酸擴增中使用最普遍的技術(shù)之一。美國專利US.Nos.4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188公開了PCR的實施例。PCR典型地應(yīng)用兩個寡聚核苷酸引物，該寡聚核苷酸引物粘附在選擇的核酸模板上(如DNA或RNA)。引物可以采用傳統(tǒng)地方法從限制消化中提純，或者引物可以合成生產(chǎn)。對于最大擴增效率，引物優(yōu)選單鏈，但引物也可以是雙鏈。雙鏈引物首先被變性即被處理為將鏈分離。使雙鏈核酸變性的一種方法是加熱。
通過加熱使雙鏈核酸變性以后，將反應(yīng)混合物冷卻至某個溫度，該溫度可促使每一個包含TNAS的核酸序列引物退火。退火溫度一般在大約35℃到65℃。退火時間一般從大約1秒到1分鐘。接著將反應(yīng)混合物調(diào)整至一個溫度，在此溫度點聚合酶的反應(yīng)活性得到提升或者最優(yōu)化，即足以從退火的引物發(fā)生延伸以產(chǎn)生與模板核酸互補的產(chǎn)物的溫度。溫度應(yīng)該足夠從每個退火到核酸模板上的引物合成延伸產(chǎn)物，但是溫度不能高至使延伸產(chǎn)物從其互補的模板變性(如延伸產(chǎn)物的溫度一般在40℃到80℃之間)。正常的延伸時間一般從大約5秒(在芯片lab-on-chip的設(shè)置中)到5分鐘。
本發(fā)明中的“引物”涉及一種核酸序列，該核酸序列能夠如與TNAS雜交，與目標(biāo)序列附近的核酸序列雜交，或者與TNAS重疊的核酸序列進行雜交?；蛘呤?，引物可以與TNAS的互補核酸序列、在TNAS附近的核酸序列的互補序列，或者與TNAS重疊的核酸序列的互補序列的任一進行雜交。
引物典型地包括寡聚核苷酸，即核酸分子包括5-30個范圍內(nèi)的核苷酸，如在5-10個范圍內(nèi)的核苷酸，10-15個核苷酸、15-20個核苷酸、20-25個核苷酸、和25-30個核苷酸。也可以預(yù)計更長鏈的核苷酸分子用作引物。因此，引物可包括一個有30-50核苷酸的核酸分子，如在30-35個范圍的核苷酸、35-40個核苷酸、40-45個核苷酸和45-50個核苷酸。
例如，引物可以基本上由寡聚核苷酸組成，也就是說，核酸分子包含在5-30個范圍內(nèi)的核苷酸，如在5-10個核苷酸范圍內(nèi)、10-15個核苷酸、15-20個核苷酸、20-25個核苷酸和25-30個核苷酸。引物也可以是一個包含30-50個核苷酸的核酸分子，如在30-35個范圍內(nèi)的核苷酸、35-40個核苷酸、40-45個范圍內(nèi)的核苷酸以及45-50個范圍內(nèi)的核苷酸。
特別優(yōu)選的是，步驟f)中的核酸擴增是嵌套PCR，嵌套PCR使用至少兩對引物，也就是說，一對外部引物和一對內(nèi)部引物。在一對引物中，有義引物典型地被設(shè)計為能與包含TNAS鏈的核酸鏈雜交，另一個反義引物典型地被設(shè)計為能與包含TNAS鏈的核酸鏈的互補核酸鏈雜交。首先，涉及外部引物PCR技術(shù)操作，從而反應(yīng)混合物中增加包括TNAS或者碎片的核酸分子，減少反應(yīng)混合物的其它核酸序列的噪音。再次，涉及內(nèi)部引物的PCR技術(shù)操作，就是TNAS或者碎片的特定擴增。
典型地，外部引物的熔解溫度(Tm)至少比內(nèi)部引物的熔解溫度高2℃，通過保持退火溫度比內(nèi)部引物的熔解溫度高，使PCR技術(shù)的操作只與外部引物相關(guān)，這種熔解溫度Tm的不同使其變?yōu)榭赡堋Ｓ嘘P(guān)內(nèi)部引物的PCR的觸發(fā)可以通過降低退火溫度至內(nèi)部引物的熔解溫度Tm以下來進行。
例如，單管嵌套PCR可以通過下述步驟的方法來操作1)循環(huán)至少兩次，其在第一變性溫度和第一退火溫度以及第一延伸溫度之間的反應(yīng)混合物的溫度，第一退火溫度與外部引物的最低熔解溫度Tm相似或者低，但比內(nèi)部引物的最高熔解溫度Tm高，和2)循環(huán)至少兩次，其在第二變性溫度和第二退火溫度以及第二延伸溫度之間的反應(yīng)混合物的溫度，第二退火溫度類似于或低于內(nèi)部引物對的最低熔解溫度Tm。
根據(jù)一起待申請的PCT專利“用于增強嵌套式PCR的方法、試劑盒和系統(tǒng)(Method，kit and system for enhanced nested PCR)”(其申請?zhí)枮镹o.YYYYYYY)的方法和使用其所述的試劑盒，可以進行單管嵌套PCR技術(shù)和檢測，這里作為參考將其引入。
步驟g)涉及檢測擴增的目標(biāo)核酸序列的出現(xiàn)和/或檢測來自擴增目標(biāo)核酸序列的產(chǎn)物的出現(xiàn)。如果出現(xiàn)擴增核酸序列的至少一個拷貝，和/或者如果出現(xiàn)至少來自擴增目標(biāo)核酸序列的產(chǎn)品，則可以根據(jù)情況推斷出在樣品中檢測到生物顆粒。
本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，步驟g)的檢測包括電化學(xué)檢測，如安培計檢測或者使伏安法檢測。
本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方式中，伏安法檢測可以使用差值脈沖伏安法的檢測電極來檢測，或者減弱對照信號以提高信噪比增加的其它檢測方法。
優(yōu)選地，伏安法檢測時通過使用位于樣品室中的檢測電極進行的。對照信號可以如從距離樣品室較遠的另一室得到。
伏安法檢測優(yōu)選是可被5′-3′酸外切酶降解的寡聚核苷酸探針來進行，所述核酸探針的降解可以導(dǎo)致釋放可檢測的組分例如氧化還原性活性組分。
氧化還原性活性組分可以包括如金屬茂合物，如二茂鐵。在伏安法檢測中，這些金屬茂合物可以被高敏感性和特異性地檢測。
氧化還原活性組分優(yōu)選金屬茂合物基團，更優(yōu)選是二茂鐵基團。探針的代表性氧化還原活性組分是二茂鐵和金屬茂合物，更有利的是N-取代的二茂鐵或者是金屬茂合酰胺化合物。二茂鐵或者金屬茂合物環(huán)構(gòu)成標(biāo)記的一部分，可以是未取代的。上述氧化還原活性組分和其它有用的氧化還原活性組分在本領(lǐng)域是熟知的，如在專利WO 03/074 731和EP 1 481 083中都有描述，這兩個專利都被引入作為參考。
在溶液中，由于不同的氧化還原活性，聚集的被消化的探針可以區(qū)別于未消化的探針。因此該方法還包括檢測探針特定的電壓峰值的出現(xiàn)和缺失，其使用一個基于伏安法分析氧化還原活性的檢測系統(tǒng)本發(fā)明優(yōu)選實施方式中，步驟g)中的測試包括一種光測試，例如熒光測試或者化學(xué)發(fā)光測試。光測試的使用可以需要樣品室如芯片的樣品室，樣品室包含有對于相關(guān)波長是透明的窗戶。
有許多不同被很好描述的熒光技術(shù)，例如被稱為Taqman的熒光測試應(yīng)用，該方法在專利US.5,723,591中有描述。
本發(fā)明的另一方面涉及檢測生物顆粒(如除孢子之外)的方法，該方法包括所述的步驟a)，b)，c)，d)，f)，g)和取代步驟e)的取代步驟e1)，取代步驟e1)包含通過加熱處理反應(yīng)混合物從生物顆粒中提取生物材料，加熱溫度的范圍在80℃-105℃，例如在90℃-100℃。熱處理持續(xù)時間典型地在5秒到3小時范圍，例如5分鐘到60分鐘。
本發(fā)明地另一方面涉及從生物顆粒中提取生物材料，該方法包括上述步驟a)，b)，c)，d)，e)和f)。
本發(fā)明進一步方面涉及涉及從氣體樣品中檢測生物顆粒的芯片，該芯片包括樣品室，如包括和周圍空氣流體連結(jié)的第一開口，和形成與設(shè)備流體聯(lián)結(jié)的第二開口，樣品室包括氣體樣品。
樣品室如芯片的樣品室，典型地是一個微尺度的樣品室。在本發(fā)明的實施方式中，樣品室的體積至多為500μl如至多為400μl、300μl、200μl、100μl、50μl、25μl、15μl、10μl、5μl、4μl、3μl或至多2μl如至多1μl。例如，樣品室的體積可以至多是500nl，如至多400nl、300nl、200nl、100nl、50nl、25nl、15nl、10nl、5nl、4nl、3nl或者至多2nl，如至多1nl。
典型地，樣品室的體積至少是10nl。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，樣品室的體積在1μl-50μl的范圍內(nèi)，如5μl-30μl。
在本發(fā)明的一個實施方式中，一對相對的壁之間的最小距離至多為20mm，如至多為15mm、10mm、8mm、6mm、4mm、3mm或2mm如至多1mm。例如，一對相對的壁之間的距離至多為600μm、500μm、400μm、300μm、200μm、100μm、50μm、25μm、15μm、10μm、5μm、4μm、3μm或至多2μm如至多1μm。
典型地，一對相對的壁之間的最小距離至少為5μm，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，一對相對的壁之間的最小距離為50μm-500μm范圍內(nèi)，如100μm-400μm和150μm-350μm。
在本發(fā)明的一個實施方式中，樣品室如芯片樣品室的長度，在1mm-50mm的范圍內(nèi)，如在1mm-10mm、10mm-20mm、20mm-30mm、30mm-40mm或40mm-50mm的范圍內(nèi)。在一個優(yōu)選的實施方式中，樣品室的長度在2mm-8mm范圍內(nèi)，如3mm-7mm或4mm-6mm。例如樣品室的長度可以約為4.5mm。
在本發(fā)明的實施方式中，樣品室如芯片樣品室的寬度為0.2mm-10mm范圍內(nèi)，如在0.2mm-1mm、1mm-3mm、3mm-5mm、5mm-7mm或7mm-10mm的范圍。在優(yōu)選的實施方式中，樣品室的寬度在0.2mm-2mm的范圍內(nèi)，如在0.5mm-1.5mm和0.75mm-1.25mm內(nèi)。例如樣品室寬度可為約1mm。
在本發(fā)明的實施方式中，樣品室如芯片樣品室的高度，為50μm-2mm的范圍內(nèi)，如在100μm-1mm、200μm-900μm、300μm-800μm和500μm-700μm的范圍內(nèi)。在一個優(yōu)選的實施方式中，樣品室的高度是為100μm-400μm如為200μm-300μm。
在本發(fā)明的一個實施方式中，樣品室如芯片樣品室的長度，約為4.5mm，樣品室的寬度約為1mm，樣品室的高度約為300μm。
在本發(fā)明的實施方式中，芯片進一步包括第一和第二電極。
第一和/或第二電極可以有不同的形狀或維度。例如，第一和/或第二電極可以有一個從如下組中選擇的實質(zhì)形狀薄片狀、平板狀、圓盤狀、線狀、棒狀或其任意組合。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，第一電極和第二電極可以是如薄片狀。
在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方式中，第一電極和第二電極是相互面對的，例如它們放置在樣品室中相對的兩側(cè)。
第一電極和/或第二電極可以如放置在樣品室內(nèi)，不附著樣品室或者附著在樣品室的一個或多個壁。
第一和/或第二電極可以植入樣品室的壁中，例如，第一和第二電極可以植入樣品室中的壁中。或者，第一和/或者第二電極可以被安置在芯片的外表面。
優(yōu)選的是，第一電極和第二電極安置在樣品室相對的兩邊。
電極，如第一電極和/或第二電極可以由許多種不同的材料構(gòu)成。典型地，電極是由金屬或合金構(gòu)成。第一電極和第二電極可以例如包含從由下列金屬所組成的組中選擇的金屬銀、金、鉑、銅、碳、鐵、石墨、鉻、鎳、鈷、鈦、水銀或者其合金。
也可以預(yù)想到，電極可包含一種導(dǎo)電的液體，甚至基本上由一種導(dǎo)電的液體組成。導(dǎo)電的液體可以是例如水銀。
電極的維度或/和結(jié)構(gòu)典型地依賴于樣品室的維度和/或結(jié)構(gòu)。電極的長度和寬度與樣品室的長度和寬度具有相同的數(shù)量級。
電極可以由小至幾個原子層的表面的導(dǎo)電材料構(gòu)成。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，電極如第一和/或第二電極的厚度為0.001μm-2000μm范圍內(nèi)，如0.001μm-1μm、1μm-20μm、20μm-200μm、200μm-2000μm。
在本發(fā)明的一個實施方式中，芯片的樣品室還包括一組檢測電極如兩個或者三個檢測電極，用于檢測氧化還原活性組分的出現(xiàn)或者缺失，該氧化還原活性組分可以是如從探針中釋放出來的。兩個檢測電極可分別作為工作電極和反電極。該組檢測電極還可以包括一個參比電極。通常，檢測電極是由金屬或合金構(gòu)成。電極可以如包括從有下列所組成的組中選擇的材料碳、銀、金或鉑。檢測以后，在電極表面會有膜形成。為了允許進一步檢測所消化的探針，可以在芯片的樣品室內(nèi)安置更多組檢測電極。
在本發(fā)明優(yōu)選的一個實施方式中，第一電極和第二電極可以是檢測電極組。
在本發(fā)明優(yōu)選的一個實施方式中，芯片還包括一種溫度敏感元件，其例如可以是溫度敏感的金屬基的電阻器(電熱調(diào)節(jié)器)，具有正溫度系數(shù)(PTC)，即隨著環(huán)境溫度的增加，電熱調(diào)節(jié)器表現(xiàn)出電阻增加；隨著環(huán)境溫度的降低，電熱調(diào)節(jié)器的電阻減小。
電熱調(diào)節(jié)器可以是例如從包含下列材料的組中選出的銅、鎳、鐵、鋁、鉑或其合金。
電熱調(diào)節(jié)器可以有不同的形狀或維度，例如，電熱調(diào)節(jié)器可以有從以下組中選擇的一個實質(zhì)的形狀，改組中的形狀包括薄片、平板狀、圓盤狀、線狀或者棒狀。
電熱調(diào)節(jié)器可以是，如線狀的電極。
加熱電極可以有不同的形狀或者維度，例如，加熱電極可以有從下組中選擇的實質(zhì)的形狀薄片狀、平板狀、圓盤狀、線狀或者棒狀。
在本發(fā)明的優(yōu)選的一個實施方式中，加熱電極可以是，如薄片狀電極。本發(fā)明中的一個優(yōu)選實施方式中，加熱電極可以被安置成能夠從反應(yīng)室的至少一邊進行加熱。
在另一個實施方式中，一個或者多個補充的加熱電極可以被安置在反應(yīng)室的對邊上。
加熱電極由電導(dǎo)材料制成，優(yōu)選地從下組中選取的材料鎳鉻合金(NiCr)、鐵鉻鋁合金(FeCrAl)、鐵鎳鉻合金(FeNiCr)或者其它加熱元素合金。
本發(fā)明優(yōu)選的一個實施方式中，芯片包括一個或者多個導(dǎo)電接觸襯墊，該襯墊與芯片的電極電接觸。芯片可包括與芯片的第一電極電接觸的導(dǎo)電接觸襯墊。芯片可包括與芯片的第二電極電接觸的導(dǎo)電接觸襯墊。芯片可包括與加熱電極的每個末端電接觸的兩個導(dǎo)電接觸襯墊。芯片可包括兩個或三個導(dǎo)電接觸襯墊，并且與該組檢測電極的每個電極電接觸。
在圖1中，表示了兩個代表性的芯片實施方式。在圖1A)中，芯片(1)包含樣品室(2)、第一電極(3)和第二電極(4)。第一電極(3)附著到芯片的上部(5)，第二電極(4)附著到在芯片的下部(6)。第一電極和第二電極都被電絕緣層(7)覆蓋，以防止樣品室(2)中的液體成分的不必要電解。加熱電極被植入第二電極頂部的絕緣層。通過間隔部分(9)形成樣品室，間隔部分被夾在芯片(1)的第一部分(5)和第二二部分(6)的中間。檢測電極和溫度敏感元件在圖1中沒有被示出。
芯片可以含有大批不同的材料。可以例如包括有機聚合物如塑料，金屬和半導(dǎo)體(如硅、玻璃和陶瓷)等。
關(guān)于圖1，第一部分和第二部分可能如包括諸如塑膠、半導(dǎo)體(如硅、玻璃和陶瓷)的材料。第一電極和第二電極可以例如含有金屬如金或銅。絕緣層可以例如是二氧化硅或聚酰亞胺的薄膜。加熱電極可以例如是NiCr電極，間隔層可以例如是聚二甲基硅氧烷(PDMS)彈性體的鑄件。
圖1B)中，第一電極和第二電極并不被包括在芯片里，但可以如包括在操作芯片的設(shè)備中。
芯片典型的厚度在0.5mm-50mm范圍，優(yōu)選范圍為2mm-8mm。
芯片典型的長度在10mm-500mm范圍，優(yōu)選范圍為40mm-200mm。
芯片典型的寬度在5mm-200mm范圍，優(yōu)選范圍為20mm-100mm。
芯片可以僅包括一個樣品室或者可以包括多個樣品室。
本發(fā)明另一方面涉及從氣體樣品中檢測生物顆粒的設(shè)備，該設(shè)備包括芯片位點，芯片位于此處以便功能上與該設(shè)備相連；設(shè)備和芯片之間的電接口，以用于在芯片或設(shè)備的第一電極和第二電極之間施加交替電場；以及可編程的單元，它包括能夠使該設(shè)備實現(xiàn)進行從由下列所組成的組中選擇的一種或者多種動作的軟件將第一電勢應(yīng)用到第一電極，第二電勢應(yīng)用到第二電極，因而在第一電極和第二電極之間形成電勢差和電場以輔助在樣品室中靜電收集氣體樣品中的生物顆粒；將所收集的生物顆粒與第一液體試劑接觸；在所述的樣品室中，將反應(yīng)混合物暴露到交替電場下，所述的交替電場有足夠的強度以能夠從生物顆粒提取生物材料；對目標(biāo)核酸序列進行核酸擴增；檢測擴增的目標(biāo)核酸序列的出現(xiàn)，和/或者來自目標(biāo)核酸序列擴增的產(chǎn)物的出現(xiàn)。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“功能上相連”意思是芯片和設(shè)備相連接，因此設(shè)備可以進行一個或多個實現(xiàn)芯片動作的操作。
在本發(fā)明的實施方式中，當(dāng)設(shè)備能影響樣品室中物體的電場時，芯片與設(shè)備功能上相連。
在本發(fā)明的實施方式中，當(dāng)設(shè)備能控制至少芯片的一個電極的電勢時，芯片與設(shè)備功能上相連，例如，當(dāng)設(shè)備能控制第一電極和/或第二電極的電勢時，芯片與設(shè)備功能上相連。
功能上相連還包括芯片的樣品室與流速控制設(shè)備進行流體交流。
在本發(fā)明的實施方式中，設(shè)備包括第一電極和第二電極。當(dāng)芯片與第一和第二電極之間的電場功能上相連時，在樣品室中幫助從氣體樣品收集生物顆粒。在該實施方式中，芯片不必包括第一電極和第二電極。
設(shè)備也可以包括一個接受和/或儲藏第一試劑的第一試劑室。典型地，第一試劑室有至少一個開口，當(dāng)芯片與設(shè)備功能性相連時，該開口與樣品室流體地相連接?；蛘?，第一試劑室的至少一個開口與樣品室是流體連接如通過使用控制流速的手段。在貯存期間，第一試劑室可以通過一個可移動的障礙物來關(guān)閉。當(dāng)設(shè)備使用時，所述的障礙物可逆的或者不可逆的移去。
設(shè)備還可以包括一個提供電能的電能供應(yīng)器和第一電極以及第二電極，如為產(chǎn)生流動提供電能，和/或為可編程單元提供電能。
在本發(fā)明的實施方式中，芯片是通過芯片位點與該設(shè)備功能上相連的。芯片位點可以例如包括一個塑料界面，該塑料界面既可以當(dāng)作連接材料，也可以當(dāng)作襯墊，該襯墊保證芯片口和裝置口緊密連接，以消除漏氣和漏液現(xiàn)象。芯片位點可以如包括表面和/或接受芯片的支架。通常，芯片位點包括至少一個導(dǎo)電的接觸襯墊。優(yōu)選的是，芯片位點包括至少一個導(dǎo)電的接觸襯墊，該接觸襯墊提供與芯片第一電極的電接觸，和提供與第二電極的電接觸。
可編程的單元包含指令，優(yōu)選計算機可以讀取的，如可適合利于控制、監(jiān)視的軟件，和/或在操作之前、在操作中和/或操作后調(diào)控設(shè)備的軟件。
可編程單元優(yōu)選包括至少一個在所連接的存儲設(shè)備上儲存了一個或多個計算機程序的計算機，該計算機可適合用于控制該設(shè)備。本發(fā)明中的可編程單元可以是從以下非詳盡組中選擇通用計算機、個人計算機(PC)、可編程的邏輯控制單元(PLC)、軟程序的邏輯控制單元(soft-PLC)、硬程序邏輯控制單元(hard-PLC)、工業(yè)個人計算機或一個專用的微處理器。
本發(fā)明也涉及計算機程序產(chǎn)品，該產(chǎn)品適合使具有至少一個在其連接的存儲設(shè)備上儲存了計算機程序的計算機的計算機系統(tǒng)能控制、監(jiān)視，和/或在操作之前、在操作中和/或操作后調(diào)控該設(shè)備。本發(fā)明還涉及一種計算機可讀取的存儲了一套工藝路線的媒介，該套工藝路線適應(yīng)性使計算機系統(tǒng)能控制、監(jiān)視，和/或在操作之前、在操作中和/或操作后調(diào)控該設(shè)備，該計算機系統(tǒng)包括至少一個在其連接的存儲設(shè)備上儲存了計算機程序的計算機。
在操作之前、在操作中和/或在操作后，用于控制、監(jiān)控和/或調(diào)控該設(shè)備的程序單元，優(yōu)選能適應(yīng)在惡劣的條件下操作，如北方氣候、熱帶氣候和戰(zhàn)斗環(huán)境，特別是，遭受原子、生物和/或化學(xué)戰(zhàn)(ABC-戰(zhàn)爭)攻擊的戰(zhàn)斗地區(qū)。優(yōu)選的是，可編程的單元應(yīng)遵照該單元的相關(guān)軍事說明書。
在本發(fā)明的一個實施例中，可編程的單元包括軟件，如果芯片與設(shè)備功能上相連的話，該軟件還可實現(xiàn)設(shè)備檢查。
包括軟件的程序單元還可以影響設(shè)備進行一個或者多個從以下組中選出的動作的操作，如2，3，4，5或6個動作，該組動作包括在樣品室中提供氣體樣品；應(yīng)用第一電勢在第一電極上，應(yīng)用第二電勢在第二電極上，因此在第一電極和第二電極之間出現(xiàn)電勢差和電場，在樣品室中幫助靜電收集氣體樣品中的生物顆粒；使收集的生物顆粒和第一液體試劑接觸；在所述的樣品室，使反應(yīng)混合物暴露于交替電場之中，所述的交替電場有一個足夠的強度能提取生物顆粒中的生物材料；目標(biāo)核酸序列進行核酸擴增操作；檢測擴增的目標(biāo)核酸的出現(xiàn)，和/或檢測由于目標(biāo)核酸序列擴增而得到的產(chǎn)物。
包括軟件的可編程單元可以如通過提供氣體樣品的產(chǎn)生流動設(shè)備的操作來實現(xiàn)設(shè)備在樣品室中提供氣體樣品。
包括軟件的可編程單元可以如實現(xiàn)設(shè)備應(yīng)用第一電勢在第一電極上和第二電勢應(yīng)用在第二電極上。
包括軟件的可編程單元可以如通過操作一個為提供液體試劑的產(chǎn)生流動的設(shè)備和/或操作控制流速的設(shè)備，來實現(xiàn)設(shè)備使收集的生物顆粒與第一液體試劑接觸。
包括軟件的可編程單元可以如通過調(diào)節(jié)至少兩個電極的電勢，例如第一電極和第二電極，來實現(xiàn)設(shè)備使反應(yīng)混合物暴露于所述樣品室中的交替電場中。
包括軟件的可編程單元可以如通過所述的加熱電極實現(xiàn)設(shè)備使目標(biāo)核酸序列進行核酸擴增。
包括軟件的可編程單元可以如通過操作微分脈沖伏安法的檢測電極，來實現(xiàn)設(shè)備檢測擴增的目標(biāo)核酸序列的出現(xiàn)和/或檢測由于擴增目標(biāo)核酸序列所得到的產(chǎn)物的出現(xiàn)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，該設(shè)備還包括設(shè)備和芯片之間的電接口，以用于在樣品室的電極之間施加交替電場。
設(shè)備另外可檢測對照信號，即來自于包括沒有生物細胞的樣品或包括確定量的給定生物細胞的樣品的信號。該對照信號可以例如被從距樣品室較遠的另一個室中得到，例如位于芯片另一個位置的室或者位于另一個芯片的室。
設(shè)備還可以包括一個內(nèi)部的能量供應(yīng)器。
內(nèi)部的能量供應(yīng)可以例如包括電池。在PCR反應(yīng)期間使用的能量，可以根據(jù)加熱一定體積的水所需熱量來估計，該體積的水應(yīng)等同于在PCR循環(huán)中最小和最大溫度之間的流體樣品的量。溫度的差別大約為50K，因此對于30μl的樣品，每個循環(huán)的轉(zhuǎn)移的熱量大約為6焦耳。例如運行60個循環(huán)，一個PCR反應(yīng)的總能量消耗達到60×6＝360焦耳。使用與商業(yè)熱循環(huán)器(即每秒2℃)相差不大的等變率(ramping time)，能量需要量為360×2/50＝14.4W。
電池電壓被認為是電池的定額電壓，如每個鎳-鉻(NiCr)和鎳-金屬氫(NiMH)電池電壓為1.2伏，每個鋰離子(Li離子)電池電壓為3.6伏。電池的蓄電量通常以毫安-小時(mAh)為單位，并且稱為電池的C-定額(C-rating)。例如，一個具有C-定額1200mA-小時的電池的負載電流1C，就是指1200毫安。當(dāng)電池電量耗盡至負載電流低于0.1C時(Linden D.1984，電池和燃料電池手冊，紐約McGraw-Hill)，一個電池可以看作是理想的(即保持固定的電容量)。因而，當(dāng)釋放出14.4W的能量如用一個電池釋放10.8V時，該電池的C-定額應(yīng)該在14.4/(10.8*0.1)＝13300mAh范圍，以避免劇烈減小電池容量的峰值電量消耗。
為了使能量消耗和電量釋放，以及進一步確保真正的可攜帶，可充電池是優(yōu)選的。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，可充電池可以從由下列所組成的組中選擇鎳金屬氫(NiMH)類電池和鋰離子(Li離子)類電池。
同時，內(nèi)部的電量供應(yīng)可以包括發(fā)電機例如可攜帶的發(fā)電機。可攜帶的發(fā)電機可以用作外部的能量供應(yīng)?？蓴y帶的發(fā)電機可以是日光模塊、電池充電器(例如交流或者汽車電池充電器)、燃料燃燒發(fā)電機等進行充電或者只是由其所組成。
可以替換的是，來自外部能量供應(yīng)的電能可被提供到該設(shè)備，例如使用備用電池進行補充。
在本發(fā)明的實施方式中，設(shè)備還包括一個流動產(chǎn)生裝置，如為提供芯片樣品室中的氣體樣品，和當(dāng)芯片插入設(shè)備中時，與樣品室的第二開口流體連接。
流動產(chǎn)生裝置可包括泵，如活塞泵、膜泵或者正排量泵。
在本發(fā)明的實施方式中，在選擇加樣(在10ml/min-500ml/min的范圍內(nèi))的過程中，泵能夠釋放適量的氣流通過芯片。優(yōu)選的是，泵應(yīng)該按照以下一個或者多個標(biāo)準(zhǔn)來選擇尺寸小、重量輕、沒有脈沖流動、通過改變馬達的極性使媒介可逆流動、通過控制電壓可調(diào)節(jié)流量。在本發(fā)明的實施方式中，流動產(chǎn)生裝置可以包括用于制造小滴試劑的噴射分配器，或者是類似的微分配設(shè)備。
在本發(fā)明的實施方式中，能夠以通過芯片的被動流提供氣體樣品。這將要求在芯片和作為樣品的周圍氣體之間的一個流速差。例如芯片可以被移動通過空氣，如按第一開口與周圍空氣是流動相連的方式安裝在飛機上，最佳的是與飛行方向相反?？梢蕴鎿Q的是，如果空氣在芯片周圍移動，芯片與空氣相比沒有速度，如安置在出氣口，會發(fā)生這種情況。
在本發(fā)明的實施方式中，設(shè)備還包括用于控制的裝置，如通過樣品室的流動。
流動可以是，如液體流動或者氣體流動。
控制流動的裝置通常包括一個或者是多個閥。閥可以是，如從由下列所組成的組中選擇單向閥、兩路閥、多位置閥和夾管閥。
閥可以是例如微型組裝的閥，在實施方式中閥被集成在芯片上。
在本發(fā)明的實施方式中，第一試劑液體能夠使用噴墨微分配工藝進行釋放。噴墨色帶盒含有一個或多個隔間，隔間里包含有第一液體試劑或者第一液體試劑的分開組分，噴墨色帶盒以這樣一種方式安裝，該種方式能使液體微分配到反應(yīng)室中。
本發(fā)明的另一個實施方式中，將第一液體試劑或者其分開的各個組分裝入塑料聚合物組成的密封的封套。塑料聚合物封套配置有一個內(nèi)置的加熱電極，可以通過使用適當(dāng)?shù)碾娏魇顾芰暇酆衔锶诨?，接著將封套里的液體釋放到芯片中。在另一個實施方式中，從密封的塑料聚合物封套中釋放液體，能夠通過機械的或者物理方式破裂封套如用尖的東西刺破來進行。
在本發(fā)明的一個實施方式中，設(shè)備可以裝備一個視覺上讀出結(jié)果的顯示器，顯示器可以是光發(fā)射源形式的(LED，燈泡或者類似物)、顯示屏、數(shù)字的讀取器或者是上述的任何組合。在本發(fā)明的另一個實施方式中，讀取器可以以聲音信號來交流。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，設(shè)備包括可以允許無線通訊的組件。無線通訊的例子是802.11移動無線局域網(wǎng)，蜂窩通訊、藍牙(Bluetooth)、全球定位系統(tǒng)(GPS)、和超寬頻帶。通訊可以是單向的如從設(shè)備傳輸數(shù)據(jù)或者是給設(shè)備傳輸數(shù)據(jù)，或者是通訊可以是組合的如雙向的。建立的通訊可進一步擴展為互聯(lián)網(wǎng)和設(shè)備之間的通訊，如建立一個ad-hoc網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)可以使一個設(shè)備觸發(fā)另一個設(shè)備的樣品，因此有利于監(jiān)控如氣霧云的進程。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，設(shè)備為重量輕和/或可攜帶的設(shè)備。
在本發(fā)明的實施方式中，設(shè)備重量至多10kg，如至多8kg、6kg、4kg、3kg或2kg，如至多1kg。甚至更為優(yōu)選的設(shè)備的重量至多800g、如至多600g、500g、400g、300g、200g、150g、100g、80g、60g、50g、40g、30g、20g、10g或5g，如至多1g。
通常，設(shè)備總重量在20g-1kg的范圍，如20g-50g、50g-100g、100g-250g、250g-500g或500g-1000g。
然而本發(fā)明另一個方面涉及從氣體樣品中檢測生物顆粒的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括與這里所述設(shè)備功能上相連的所述芯片。
在本發(fā)明的實施方式中，系統(tǒng)的芯片和設(shè)備被集成在一起，并且不意味著互相物理上分開。在本發(fā)明的實施方式中，系統(tǒng)的芯片和設(shè)備被集成在一起以便他們不能夠被相互物理上分開而不損壞芯片或者設(shè)備。
在本發(fā)明重要的實施方式中，該設(shè)備是一次性系統(tǒng)例如只能使用一次。
在另一個實施方式中，系統(tǒng)的芯片是一次性的，但是該設(shè)備可以被重復(fù)使用。
本發(fā)明一個特定方面涉及設(shè)備，該設(shè)備的目標(biāo)是監(jiān)測空氣傳播的傳染性疾病和適合監(jiān)控低氣溶膠濃度，其直接暗示是流行病的監(jiān)控。該設(shè)備含有三個集成的在同一個容器中(體積從10納升到10毫升)進行的工藝，該工藝允許對生物氣溶膠進行取樣、提取基因材料樣品制備物而后DNA或cDNA的擴增。通過普通的氣體和液體輸入輸出，來補給容器。首先，空氣流經(jīng)容器，該氣流是由輸入端的高壓或者輸出端的真空而產(chǎn)生。容器裝備可促進靜電沉淀的電極，電極典型地形成為兩相對的薄片，空氣從其間通過。然而，其它形狀如單薄片的電極結(jié)合單一或者一套點電極，也可用來將所取樣的顆粒導(dǎo)入容器的指定地點。為了防止電打火，電極間在最短距離處所測試的電場低于1000V/mm。攜帶自然電荷的生物顆粒在電場中被捕獲，因此它們經(jīng)過容器的運動被中斷，它們被引到其所沉淀的電極。捕獲機制是有效的，并且捕獲效率80％或者以上是可以達到的。通過外部設(shè)備來控制電極表面電壓，靜電沉淀時間可以很容易設(shè)置。當(dāng)電壓關(guān)掉時，沉淀就會停止。一旦所想要量的空氣經(jīng)處理進入容器，就會停止泵入空氣，容器充滿包含擴增DNA/cDNA所需要的試劑的液體。
所收集的和濃縮的生物顆?，F(xiàn)在可以進行樣品制備。我們已經(jīng)說明了，眾所周知，革蘭氏陽性細菌的能生孢子對機械的、化學(xué)的和熱降解處理具有特別的抵抗力。當(dāng)它被暴露于通過容器的振蕩電場中，它會釋放出染色體和質(zhì)粒體DNA。如果頻率在10kHz以上，DNA釋放發(fā)生在幾秒鐘內(nèi)，并且頻率在100kHz左右，可以達到最大釋放。振蕩電場作用就是破壞孢子的完整性，它是通過以下方式來實現(xiàn)的直接膜崩潰、在內(nèi)生孢子壁形成孔、或由于孢子的生化退化，伴隨的緩沖的二價離子如Mg2+和Ca2+的活化，而導(dǎo)致的突然滲透腫脹。革蘭氏陽性細菌的內(nèi)生孢子壁是在細菌、病毒或者真菌類中發(fā)現(xiàn)的最穩(wěn)定的封閉結(jié)構(gòu)，它保護有機體和并允許其在極其惡劣的條件下休眠幾十年。在從細菌細胞和孢子中釋放遺傳材料方面，使用振蕩電場的樣品制備工藝是有效的。振蕩電場可以由與靜電沉淀電極相同的電極來誘導(dǎo)。
緊接著最初的電樣品制備，樣品被暴露于加熱和冷卻的循環(huán)中，其通過快速加熱樣品到變性溫度，隨后又冷卻。溫度循環(huán)介導(dǎo)細胞、孢子和病毒的進一步崩潰，特別是病毒，它不受振蕩電場的影響釋放遺傳材料。病毒一般是植入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的遺傳材料，在較高溫下很快變性?？焖俚臏囟日袷?加熱速率達到＞40℃/s，冷卻速率＞15℃/s)可以通過設(shè)計容器最優(yōu)的熱交換來實現(xiàn)。熱設(shè)計是基于材料總的熱時間常數(shù)與容器中水的總熱時間常數(shù)的關(guān)系來設(shè)計。在能夠?qū)崿F(xiàn)溫度快速振蕩中，以下都是很重要的因素容器周圍材料總的熱容量、這些材料之間相互耦合以及材料與外部安裝的散熱設(shè)備的耦合。熱量是通過容器頂端和底端的導(dǎo)電薄膜例如金或鉑薄膜來供熱的。為了取得快速的加熱和冷卻，在加熱器之間液體形成一個平的薄片是很重要的。
薄膜通過導(dǎo)電材料的電流而被加熱。溫度通過監(jiān)控一個四線的惠斯登橋(Wheatstone bridge)熱傳感器設(shè)置來控制，允許溫度在容器內(nèi)設(shè)置的精確度為±0.1℃。如果在容器中出現(xiàn)合適的生化條件，溫度的振蕩進一步有利于DNA或cDNA的擴增。
本發(fā)明中設(shè)備代表了獨特和新穎的方法學(xué)組合，它允許將快速取樣、樣品制備和DNA或cDNA單分子的擴增都集成到一個設(shè)備中。
此處使用的術(shù)語“流體”是指任何流體，包括空氣、氣體或者液體，包括水和水溶液。
本發(fā)明一個特定方面涉及用于收集生物顆粒、提取遺傳材料和引導(dǎo)依賴溫度的生化反應(yīng)的微尺度設(shè)備，該設(shè)備包括反應(yīng)室，反應(yīng)室在取樣的空氣和反應(yīng)室之間有一個提供氣流量的進入口，和在反應(yīng)室和反應(yīng)室外部之間有一個提供氣流量的出口，進口或出口與吸引氣體樣品從進口通過反應(yīng)室到出口的氣流產(chǎn)生設(shè)備相連接，所述反應(yīng)室有引入生化上限定的溶劑到反應(yīng)室的能力，并有從反應(yīng)室中移除依賴于溫度的生化反應(yīng)的產(chǎn)物的能力，還有快速和準(zhǔn)確的控制反應(yīng)室溫度的能力，安裝在反應(yīng)室中進口和出口之間的位置收集和電解部件，所述的收集和電解部件包括兩個或多個平行安放的電極，并有表面或至少一部分表面涂覆有或包含有能導(dǎo)電流的材料。
在本發(fā)明的一個特定實施方式中，平行的電極能產(chǎn)生傾斜的電場或者垂直于通過設(shè)備的氣流，有利于使出現(xiàn)在取樣空氣中的顆粒帶靜電荷，因此可被帶正電或者負電的電極吸附而被捕獲。
在本發(fā)明的一個特定實施方式中，在引入所述的生化上限定的溶劑之后，電極施加一個高頻率的交流電解場在所述捕獲的生物顆粒上。
在本發(fā)明的一個特定實施方式中，溶劑包括能引導(dǎo)聚合酶鏈反應(yīng)或者PCR的試劑。
在本發(fā)明的一個特定實施方式中，溶劑包括能引導(dǎo)連接酶鏈反應(yīng)或LCR的試劑。
在本發(fā)明的一個特定實施方式中，溶劑包括能引導(dǎo)基于轉(zhuǎn)錄的擴增的試劑。
在本發(fā)明的一個特定實施方式中，溶劑包括能引導(dǎo)基于限制性的擴增的試劑。
在本發(fā)明的一個特定實施方式中，反應(yīng)室適應(yīng)包含范圍大約為0.1μL-500μL的流體。
在本發(fā)明的一個特定實施方式中，反應(yīng)室適應(yīng)包含范圍大約為1.0μL-5μL的流體。
在本發(fā)明的一個特定實施方式中，反應(yīng)室有大約尺寸為4.5mm×1mm×300μm或者成比例的縮小。
在本發(fā)明的一個特定實施方式中，設(shè)備可再度使用的，并從含有以下材料的組中的材料來制備，該組材料包含有聚合物、二氧化硅、玻璃、金屬和陶瓷。
在本發(fā)明的一個特定實施方式中，設(shè)備可任意使用的，可以從由以下所組成的組中的材料制備聚合物、二氧化硅、玻璃、金屬和陶瓷。
在本發(fā)明的一個特定實施方式中，設(shè)備可任意使用的，可以從由以下所組成的組中的材料制備聚合物、二氧化硅、玻璃、金屬和陶瓷。
在本發(fā)明的一個特定實施方式中，電極包括至少一個平板電極，用于引導(dǎo)電流，從而次年古城電場。
在本發(fā)明的一個特定實施方式中，電極包括至少一個線狀電極，用于引導(dǎo)電流，從而創(chuàng)造電場。
在本發(fā)明的一個特定實施方式中，傾斜的或垂直于通過設(shè)備的空氣流的電極之間的距離在0.01mm-4mm。
在本發(fā)明的一個特定實施方式中，兩電極之間應(yīng)用的靜電場在100V/mm到1600V/mm之間。
在本發(fā)明的一個特定實施方式中，方法還包括應(yīng)用高頻率的交替電場誘導(dǎo)細胞裂解的操作。
在本發(fā)明的一個特定實施方式中，交流電流應(yīng)用的頻率在8000Hz-200,000Hz之間。
本本發(fā)明的一個特定實施方式中，應(yīng)用的脈沖序列在1秒到60秒之間。
在本發(fā)明的一個特定實施方式中，本發(fā)明設(shè)備進一步包括傳送所述生化反應(yīng)結(jié)果報告的工具。
在本發(fā)明的一個特定實施方式中，傳送工具是通過有線連接的、無線電的、紅外傳輸?shù)摹⑽⒉▊鬏數(shù)?、無線電話、GSM模塊或者計算機網(wǎng)絡(luò)。
本發(fā)明的另一個特定方面涉及微生物的監(jiān)視系統(tǒng)，它包括此處所述的設(shè)備，所述的微生物監(jiān)視系統(tǒng)包括一個各分開設(shè)備的網(wǎng)絡(luò)。
在本發(fā)明的一個特定實施方式中，監(jiān)視網(wǎng)絡(luò)是一個集成的網(wǎng)絡(luò)。
在本發(fā)明的一個特定實施方式中，設(shè)備的位置如網(wǎng)絡(luò)中的設(shè)備，是由全球定位系統(tǒng)設(shè)備來確定。
在本發(fā)明的一個特定實施方式中，該方法建立了檢測或者診斷化驗。
在本發(fā)明的一個特定實施方式中，檢測化驗包括一個可變的或可編程的時間器，來決定檢測診斷的頻率。
應(yīng)該指出的是，根據(jù)本發(fā)明，文中描述的本發(fā)明的一個方面的實施方式和特征也適用于本發(fā)明的其它方面。
實施例實施例1芯片制備的代表性實施例本設(shè)計具體實施的容器或者反應(yīng)室的尺寸(或者按尺寸的比例)為4.5mm×1mm×300μm，建議的設(shè)備結(jié)構(gòu)遵循所述的概念性設(shè)計的基本框架。
硅基底涂覆有耐熱層以限定設(shè)備的熱性能。隨后低阻抗的耐加熱層開始鋪墊，接觸襯墊沉積并且制上圖案。加熱器統(tǒng)一圖案，用來加熱通道的基底。下一個介電層沉積使加熱器與隨后的一層絕熱隔離。然后是鉑膜沉積，制上圖案并在其上提供溫度傳感器和電極。溫度傳感器選擇性地與樣品隔離。硅晶片制備是由任何層的處理完成的，所述層需要以槽/加蓋的形式焊接和密封。
蓋子由玻璃制成的，以提供本性上的熱絕緣。堆積鉑電極膜并且制上圖案。如果需要，它可以是絕緣的，或者它配有溫度傳感器。制上圖案的步驟基本上是硅晶片制備所用的一部分。然后流體進入端口可在蓋子上形成，工藝范圍是可能的，但是這可能基本上是傳統(tǒng)的機械方法。流體界面部件組分，如Luer fittings，該部件可在組裝過程中方便的階段粘附在端口上。
在鉑電極形成之前，通過將通道蝕刻進蓋子對其進行限定。只有在蓋子上的電極是相對粗糙的允許普通制備圖案的幾何形狀，這才有可能?？梢蕴鎿Q的是，蓋子保留一個平坦的部件，通道在300微米厚的間隔層形成，該間隔層既與硅基底粘結(jié)又與玻璃蓋子粘結(jié)。
逐步的層處理在這個分段中，我們限定了在構(gòu)造設(shè)備中使用的層的順序。我們簡要描述設(shè)備中層的功能性作用，給出如何獲得設(shè)備的幾種選擇，并且列出各種選擇的優(yōu)缺點。
第一步，見圖2硅基底。這是一個500μm厚的硅晶片，優(yōu)選雙面拋光的晶片，因為它有利于與反應(yīng)室后面熱接觸。如果通過一個被表面深RIE(back surface deepRIE)處理可以達到側(cè)面的熱隔離，然后任一個晶片厚度應(yīng)該合理接近地限定，或者蝕刻深度的變化來補償晶片厚度的差別。這樣的晶片可以容易地從大量原料中獲得。
步驟2，見圖3熱絕緣層。為了控制熱損失與熱冷卻的比例，這層是沉積在硅的上表面，從而需要一定的能量維持溫度和加熱樣品。對于所需要的PCR循環(huán)次數(shù)和能量水平，這將會需要20μm厚的聚酰亞胺層。有各種聚酰亞胺可以使用，BCB(苯并環(huán)丁烯)是可以替代的聚合體介電材料。
步驟3，見圖4加熱層。這一層是傳統(tǒng)的耐熱材料形成的，在熱模型峰值能量中(thermalmodel peak power)，需要4W的加熱器的消散。所需要的阻抗大小依賴于期望的驅(qū)動電壓和電流。數(shù)量級為100mA到1A的電流被認為是合理的，相應(yīng)的電壓范圍從40V到4V，因此所需要的電阻在400Ω到4Ω的范圍。加熱器電阻器的幾何形狀可以便利地仿照反應(yīng)室的幾何形狀，反應(yīng)室的幾何形狀是一個覆蓋在整個基底上的簡單矩形平板。因此電阻器長度大約為4.5square，顯示膜的電阻率大約范圍1-100Ω/m。這個電阻率可以通過普通的薄膜工藝很容易達到。NiCr電阻器可以通過濺射或蒸發(fā)沉積制備而成，并由濕蝕刻法來制作圖案。滿足需求的NiCr電阻器處理工藝是可廣泛得到的。
步驟4，見圖5接觸層1。這一層是緊接著NiCr沉積層沉積而成，并且用作與NiCr電阻器接觸。典型地，該層是金薄膜，它是由是蝕刻來限定的。顯然，圖案往往是這樣的，在金下面總是NiCr。但是在NiCr之上可能不是金。典型的順序是照相平板印刷面層，定義一個假設(shè)的“金或者NiCr”層，蝕刻金然后蝕刻NiCr，重新覆蓋“金”層和再蝕刻金層。(似乎基本上NiCr膜沒有被基于碘的金蝕刻劑腐蝕)?？梢詮V泛得到合適的工藝。
步驟5，見圖6電絕緣層1。該層是用作把加熱器層與隨后的電導(dǎo)層進行電絕緣。最可能使用的材料是PECVD氧化物。用一個標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)離子蝕刻工藝，需要的開口或者接觸開口能夠在氧化物中制成圖案。PECVD和RIE兩種工藝都是可以廣泛得到。
步驟6，見圖7鉑1。該層用作形成彎曲結(jié)構(gòu)和形成電極，該彎曲結(jié)構(gòu)用作溫度傳感器，該電極用作捕獲孢子和DNA檢測技術(shù)。可以設(shè)想，薄膜通過升離照相平板印刷(lift-off photolithography)制作圖案，并且用電子束沉積技術(shù)沉積而成，可以替換的是，可能使用濺射沉積和濺射后蝕刻或者反應(yīng)離子蝕刻。然而，可能更容易得到升離工藝。
步驟7，見圖8接觸2。第二接觸層材料需要有利于與鉑膜進行線連接。
步驟8，見圖9電絕緣層2。這一層用作把溫度傳感器與樣品絕緣開。與步驟5基本一樣，可以設(shè)想PECVD氧化物沉積和制成圖案。
步驟9，見圖10平面化層1。如果蓋子的附著需要一個特別的平面，那么就必須沉積整個一層，在該層上，除了蓋子粘附區(qū)域以外被移出其它物之前，該層可以拋光至高度平的平面。如此平面化工藝是日益普通并且最有效，例如，硅顯示工業(yè)中的液晶是使用這種工藝的，它允許在密集的集成電路上形成光學(xué)質(zhì)量的鏡面。
步驟10，見圖11和12為了本階段的完全性，我們顯示了“圖形框架”的間隔層和設(shè)備蓋子，這些在下面討論。蓋子假設(shè)采用全部是鉑層或者鈦金層。在框架的邊墻裁開的凹口允許接觸從蓋子到主要的硅基底的鉑薄膜，這是用注入的導(dǎo)電材料來取得的，如裝滿的環(huán)氧樹脂。
最終設(shè)備如圖13所示。
其它的工藝信息玻璃覆蓋物的制備玻璃覆蓋物是優(yōu)選的，因為在已證實的材料中，它可提供一個有效的熱障礙。需要定義在這個蓋子上的鉑結(jié)構(gòu)和流體進出口，輕微的復(fù)雜性被引入，但是這點復(fù)雜并非超出普通。
關(guān)鍵的設(shè)計決定是是否包括溫度感應(yīng)和蓋子上加熱。如果包括這些，工藝流程就會更復(fù)雜。
僅有一個暴露的用于捕獲孢子的鉑電極的簡單覆蓋物可通過簡單的濺射或者電子束蒸發(fā)鉑在整個玻璃基底上來生產(chǎn)。如果加熱器和溫度傳感器合并進來，則從硅基底處理工藝的步驟3-9的工藝流程將會使用。與硅基底相比，適應(yīng)玻璃的流程步驟有很少的細節(jié)變化。
一旦制備薄膜，流體進出口將會用玻璃進行機械加工。對于這一工藝，各種手段可用，如使用高速旋轉(zhuǎn)微碾磨機械。其它工藝路線包括電火花腐蝕、超聲碾磨和噴砂處理。
形成通道和組裝設(shè)備使用粘附在硅和玻璃上的間隔層，可形成通道。許多工藝路線可能形成該層并粘附著該層。我們優(yōu)選的工藝路線是具有粘性的膜和有活性的或簡單夾住的PDMS?？商娲ǖ佬纬傻挠幸韵聨追NA.帶粘性的粘結(jié)在最簡單可能的水平上，可能的形成通道的有沖模、激光切割成300μm厚的膜粘合劑。對于在醫(yī)學(xué)化驗設(shè)備，該粘合劑廣泛大量使用。然而，對于目前的應(yīng)用，還得考慮長期可靠性。如果設(shè)備可任意使用的，使用粘結(jié)帶是可能的。
PDMS模板和等離子體輔助焊接在這步工藝中，襯墊是用硅樹脂橡膠由模具鑄造而成。使用可便宜制造的原型，這樣的模制是容易制造適中數(shù)量的產(chǎn)品。模制工藝允許保持很精細的細節(jié)。用氧等離子體活化硅樹脂來粘結(jié)硅樹脂橡膠到玻璃上的工藝在很多課題組已經(jīng)被接受。它很容易形成長效的有良好粘結(jié)力的粘結(jié)典型地，在與玻璃粘結(jié)失敗以前，硅樹脂橡膠材料通過撕裂會失去粘性。因為硅制備以PECVD氧化物層完成，PDMS襯墊能用來連接兩部分和形成密封。
如果包裝和設(shè)備設(shè)計在一起，則使用夾子密封可能會比較吸引人。最有可能的是PDMS。這個可以用激光或者用沖模從模制成邊界厚度超過所期望300μm的精密薄片上切下。組裝中的精密間隔層將被用于限制密封壓縮，因此限制側(cè)邊的壓縮中的偏離。
B.玻璃-玻璃熔接如果兩個表面是很平并且很干凈，玻璃組分的熔接是可能的。這一工藝路線的主要限制條件是所需溫度被證明是太高以致在設(shè)備中不能允許有任何聚合物材料。
C.冷焊接一個有趣的可能性是形成一個限定在薄玻璃中的通道的框架，或許由蝕刻進蓋子來界定通道。一個鍍金屬薄膜沉積并制成圖案來限定密封區(qū)域，以及電鍍一層銦。該層在25μm數(shù)量級的厚度，與電鍍在其它部件的密封區(qū)域?qū)酉嗨?。為了裝配該部件，銦層被清洗掉表面氧化物層，典型地是用稀鹽酸，然后用溶劑漂洗。兩個干凈的銦表面相互接觸并冷焊接在一起。
實施例2確定捕獲效率的方法標(biāo)準(zhǔn)的生物顆粒的制備將含有大約109個孢子/g的100毫克Biobit蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthurigiensis)亞種kurstaki(Valent BioSciences Corp，Libertyville，USA)懸浮在1ml去離子水中，并在12000rpm下離心90秒。去上清。重復(fù)該步驟4次。在最后一次重懸浮之前，取出一個樣品來確定每毫升的CFU數(shù)，試管留下來進行脫水干燥如真空干燥。
系列稀釋涂布在LB瓊脂平板上(Luria Bertani培養(yǎng)基；10.0g胰蛋白胨、5.0g酵母提取物、10.0g氯化鈉、15.0g瓊脂，在pH＝7.0的1.0L水中重懸浮，高壓滅菌)，在30℃孵育過夜，并檢查可看見的菌群。CFU數(shù)能夠確定粉末中的孢子數(shù)。
捕獲效率測試沖洗和干燥的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thurigiensis)孢子在合適的氣溶膠室中進行氣溶膠化，其結(jié)果孢子濃度大約為104-105個孢子/升。確定捕獲效率的芯片/取樣室與設(shè)備相連，因而功能性連接。芯片/取樣室與氣溶膠室相連，并且氣溶膠吸入并以氣流速大約50ml/min通過芯片的樣品室。顆粒計數(shù)器(如analyzer model 3321，來自TSI Inc.，500 Cardigan Road，Shoreview，MN55126-3996，USA)是與芯片出口相連的，并且計算尺寸在1-10μ的離開芯片的孢子數(shù)。
首先，當(dāng)設(shè)置第一和第二電極對地的電勢時，通過吸入氣溶膠來測試25mL氣溶膠中的孢子數(shù)。所測試的孢子數(shù)用作對照值Nc。
然后，將選擇的電勢應(yīng)用與第一和第二電極，將另外的25mL氣溶膠吸入通過芯片。當(dāng)吸入過程中，測量排出芯片的孢子數(shù)，這個值稱作Ns。
通過(Nc-Ns)/Nc*100％，計算在所選擇的電勢下，芯片/取樣室的捕獲效率。
實施例3確定DNA/RNA釋放百分率將含有大約109CFU/g的100mg Biobit蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthurigiensis)亞種kurstaki(Valent BioSciences Corp，Libertyville，USA)懸浮在1ml去離子水中，接著在70℃下用巴氏法滅菌5分鐘，接著對溶液進行離心(5000xg，5分鐘)。去上清。再重復(fù)該步驟(Tyndalisation)2次。最終的1ml溶液含有大約108個孢子。
將該溶液稀釋成105個孢子/ml的最終濃度，這樣得到了儲藏溶液。
使用儲藏溶液的樣品填充樣品室，并將樣品暴露到交流電場中，所述交流電場具有選定的頻率、強度和持續(xù)時間。
為了確定樣品生物細胞的DNA/RNA釋放百分率，將所暴露的樣品和含有存儲溶液的對照都使用熒光染料4’，6-二咪基-2-聯(lián)苯基吲哚(DAPI)處理。DAPI是廣泛應(yīng)用的DNA染料，其在結(jié)合到雙鏈DNA小凹陷中富含A-T的序列時會形成熒光復(fù)合物。染料溶液是含有2.0μg/ml DAPI的水溶液。而且，DAPI限制了細胞的滲透性，并且因此對于顯示遺傳物質(zhì)的細胞釋放是最佳的。
使用一定體積的染料溶液對樣品室進行洗脫，其體積是樣品室體積的三倍。將來自樣品室的洗脫液在室溫下孵育5分鐘。
在是對照體積大約3倍體積的染色溶液中，將與所暴露樣品體積相當(dāng)?shù)捏w積的對照分別染色5分鐘。
接著將適當(dāng)體積的對照和適當(dāng)體積的所暴露樣品在相差顯微鏡和熒光顯微鏡(配有DAPI過濾器)下進行觀察。使用相差顯微鏡對于對照和所暴露的樣品計算孢子的數(shù)目，表示所釋放的染色體DNA分子(可以看到的藍點)的孢子的數(shù)目通過熒光顯微鏡計算。接著按照下式確定DNA/RNA釋放百分率 其中ds是所計算的藍色DNA點的數(shù)目，Ss是孢子的總數(shù)。
也可以確定背景DNA/RNA釋放百分率作為對照，如果表示背景釋放高于5％，則建議所確定的被認為無效，需要對生物細胞的新儲藏溶液進行重復(fù)。
參考文獻美國專利US.5,723,591國際專利WO 03/074,473歐洲專利EP 1 481 083O’brien等人O’brien D，Baron P，Willeke K.(1986)Size and concentrationmeasurement of an industrial aerosol.(工業(yè)氣溶膠的尺寸和濃度的檢測)AmInd Hyg Assoc J.47386-92Linden，D.Linden，David.(1984).(電池和燃料電池手冊)紐約McGraw-Hill
權(quán)利要求
1.一種從氣體樣品中檢測生物顆粒的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)提供樣品室和第一電極以及第二電極，第一電極和第二電極以及樣品室被安置為，至少部分樣品室位于第一電極和第二電極之間，并且第一電極和第二電極之間的距離最多為20mm；(b)為樣品室提供氣體樣品；(c)將第一電勢應(yīng)用于第一電極，第二電勢應(yīng)用第二電極，因而在第一和第二電極之間產(chǎn)生電勢差和電場以輔助在樣品室從氣體樣品靜電收集生物顆粒；(d)將所收集的生物顆粒與第一液體試劑接觸，從而得到反應(yīng)混合物；(e)在所述的樣品室中，將所述的反應(yīng)混合物暴露于交替電場中，所述的交替電場有足夠強度以能夠從生物顆粒提取生物材料；(f)進行目標(biāo)核酸序列的核酸擴增；(g)檢測所擴增目標(biāo)核酸序列的出現(xiàn)和/或者來自目標(biāo)核酸序列擴增的產(chǎn)物的出現(xiàn)，如果出現(xiàn)至少一種拷貝的所擴增目標(biāo)核酸序列，或者如果出現(xiàn)至少一種所擴增目標(biāo)核酸序列的產(chǎn)品，則可根據(jù)情況推測在樣品中已經(jīng)檢測到生物顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，第一電極和第二電極被安置在樣品室相對的兩側(cè)。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求任何一項所述的方法，其特征在于，第一液體試劑包括一種或者多種進行核酸擴增操作所需的試劑。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求任何一項所述的方法，其特征在于，第一液體試劑包括一種或者多種從由以下所組成的組中選取的試劑引物、三磷酸核苷酸和聚合酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任何一項所述的方法，其特征在于，第一液體試劑還包括可被5′-3′核酸外切酶降解的寡聚核酸探針，所述核酸探針的降解導(dǎo)致釋放氧化還原活性組分。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，氧化還原活性組分是金屬茂合物諸如例如二茂絡(luò)鐵。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求任何一項所述的方法，其特征在于，步驟f)的核酸擴增時通過使用從由下列所組成的組中選擇的擴增技術(shù)進行的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)、鏈置換擴增(SDA)，連接滾環(huán)擴增(L-RCA)以及它們的組合/修改。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟f)的核酸擴增技術(shù)是PCR。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟f)的核酸擴增技術(shù)是嵌套PCR，優(yōu)選單管嵌套PCR。
10.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，步驟g)的檢測包括伏安法檢測。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，伏安法檢測是使用差值脈沖伏安法或者其它用于減弱參照信號以提高信噪比的方法來完成測試。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的方法，其特征在于，伏安法檢測是通過使用安置在樣品室的檢測電極來進行的。
13.一種從氣體樣品中檢測生物顆粒的芯片，其特征在于，該方法包括以下步驟樣品室，該樣品室有與周圍空氣流體連接的第一開口和形成與設(shè)備流體連接的第二開口，樣品室含有氣體樣品；第一電極和第二電極，其被安置在樣品室相對的兩側(cè)；加熱電極；溫度傳感元件；檢測電極。
14.一種從氣體樣品中檢測生物顆粒的設(shè)備，其特征在于，該設(shè)備包括芯片位點，芯片位于此處以便功能上與該設(shè)備相連；設(shè)備和芯片之間的電接口，以用于在芯片或設(shè)備的第一電極和第二電極之間施加交替電場；以及可編程的單元，它包括能夠使該設(shè)備實現(xiàn)進行從由下列所組成的組中選擇的一種或者多種動作的軟件將第一電勢應(yīng)用到第一電極，第二電勢應(yīng)用到第二電極，因而在第一電極和第二電極之間形成電勢差和電場以輔助在樣品室中靜電收集氣體樣品中的生物顆粒；將所收集的生物顆粒與第一液體試劑接觸；在所述的樣品室中，將反應(yīng)混合物暴露到交替電場下，所述的交替電場有足夠的強度以能夠從生物顆粒提取生物材料；對目標(biāo)核酸序列進行核酸擴增；檢測擴增的目標(biāo)核酸序列的出現(xiàn)，和/或者來自目標(biāo)核酸序列擴增的產(chǎn)物的出現(xiàn)。
15.一種檢測生物顆粒的系統(tǒng)，其特征在于，該系統(tǒng)包括根據(jù)權(quán)利要求13所述的芯片，其與根據(jù)權(quán)利要求14所述的設(shè)備功能上相連。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測生物顆粒的方法、芯片、設(shè)備和系統(tǒng)。本發(fā)明的方法典型地包括從氣體樣品中收集生物顆粒，將生物顆粒與第一液體試劑接觸，從所收集的生物顆粒中提取生物材料，分析生物材料以目標(biāo)核酸序列的出現(xiàn)。
文檔編號C12Q1/24GK1947011SQ200580006150
公開日2007年4月11日 申請日期2005年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月26日
發(fā)明者格特·博蘭德·詹森, 拉爾斯·湯姆森, 厄恩·羅伯特·韋爾特曼 申請人:湯姆森生物公司